Method Article

Formalin sabitli parafinle gömülü fare embriyonik dokusunda erken diş morfogenezinin mekansal transkriptomiki

DOI:

10.3791/70340

⸱

March 13th, 2026

 , 
1Section on Craniofacial Genetic Disorders, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), 2Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 3Department of Surgery, Harvard Medical School, 4Shriners Hospital for Children

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, fare embriyolarının E13.5 ve E15.5 kraniofasiyal bölgelerinden formalin sabitli, parafinle gömülü kesitlerin kullanılmasını ve mekansal transkriptomik kullanarak farklı gen ifade profillerini analiz etmesini açıklamaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gelişen diş, doğru form ve işlevi korumak için birlikte çalışan çeşitli ve son derece uzmanlaşmış hücre popülasyonlarından oluşur. Bu hücreler ve çevresindeki mikro ortamlar arasındaki etkileşimleri aydınlatmak, normal diş gelişiminin altında yatan düzenleyici mekanizmaları anlamak için kritik öneme sahiptir. Bu süreçlerdeki bozulmalar, diş agenezi, dentinogenezis imperfecta ve amelogenesis imperfecta gibi doğuştan gelen bozukluklara yol açabilir. Tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq) sayesinde hücresel heterojenliği ortaya koymada önemli ilerleme sağlanmasına rağmen, dokular içindeki hücrelerin mekansal bağlamını korumaz ve gen ifadesini doku mimarisiyle ilişkilendirme yeteneğini sınırlar. Mekânsal transkriptomik teknolojiler, yüksek çözünürlüklü gen ekspresyonu profilini doğal doku mimarisinin korunmasıyla entegre ederek bu sınırlamayı giderir ve moleküler imzaların yerinde lokalizasyonunu mümkün kılar. Burada, fare embriyonik kraniofasiyal dokunun toplanması, fiksasyonu ve parafin gömülmesi için adım adım bir protokolü tanımlıyoruz; bu protokol aşağı akış mekansal transkriptomik uygulamalar için uygundur. İş akışı, formalin sabitli, parafinli dokunun optimize edilmiş kesitlenmesi ve işlenmesini detaylandırır; böylece yüksek çözünürlüklü mekansal analiz için RNA bütünlüğü ve doku morfolojisi korunur. Bu yöntem, dizileme ve görüntü tabanlı uzamsal transkriptomik platformlarla uyumludur ve fare embriyolarında erken diş morfogenezinin tekrarlanabilir mekansal transkriptomik profillenmesini sağlar. Bu yaklaşım, hem gelişimsel hem de patolojik durumlarda kraniofasiyal yapıların mekansal organizasyonu ve fonksiyonel dinamikleri hakkında güçlü içgörüler sunar ve moleküler mekanizmaların doku morfolojisine bağlanması için kritik bir çerçeve sunar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diş gelişimi, erken embriyonik büyüme sırasında morfogenetik süreçlerin son derece koordineli bir dizisinedayanır 1,2,3,4. Genetik ve gelişimsel çalışmalarla birçok temel gen ve sinyal yolu tespit edilmiş olsa da, bu faktörlerin bireysel kraniofasiyal yapıları şekillendirmek için nasıl etkileştiğine dair anlayışımız sınırlıdır. Özellikle, belirli genetik varyantların hem sindromik hem de sindromik olmayan diş hastalıklarıyla ilişkilendirilmesinde önemli ilerlemelere rağmen, yapıya özgü morfogenezi temel alan....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan prosedürleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (ACUC) tarafından Hayvan Çalışması Protokolü #21-031 kapsamında onaylanmıştır.

1. Deneysel hayvanın hazırlanması ve doku toplanması

  1. Sağlıklı, verimli erkek ve dişi Mus musculus çiftleri için zamanlı çiftleşmeler yapın. Hamile dişi fareleri, embriyonik gün (E) 0.5 olarak adlandırılan vajinal tıkaç bulunmasıyla tanımlayın.
  2. Hamile dişi fareleri CO₂ inhalasyonu ve ardından servikal dislokasyon yoluyla ötenazi yapın. Hayvanın sırt üstü kısmı....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem, yeni diseksiyon edilmiş fare embriyon başlarının işlenmesini ve gelişmekte olan diş dahil olmak üzere kraniofasiyal dokulardan FFPE örnekleri üretmesini ve mikrotomla kolayca kesitlenerek RNA bütünlüğünü korumasını öngörür (Şekil 1). Bu protokol, yüksek çözünürlüklü görüntü tabanlı (Şekil 2) ve dizileme tabanlı uzamsal transkriptomik (Şekil 3) bölgeleri için E13.5 (embriyonik gün 13.5), E.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, fare embriyonik başlarının FFPE bloklarının hazırlanması için yüksek çözünürlüklü uzamsal RNA görüntüleme platformlarıyla optimize edilmiş ayrıntılı bir protokol sunuyoruz; bunlar arasında dizileme ve görüntüleme tabanlı uzamsal transkriptomikler de bulunmaktadır. Bu protokolün temel hedeflerinden biri, özellikle gelişmekte olan kraniofasiyal bölgeye odaklanarak, tüm baş kesitlerinde hem doku morfolojisini hem de nükleik asit bütünlüğünü korumaktır. Bu koruma seviyesinin sa.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Sergey L. Leikin, Dr. Elena Makareeva (Fiziksel Biyokimya Bölümü, NICHD/NIH) ve Dr. Jeremie Oliver Piña'ya (Kemik ve Diş Moleküler Biyolojisi Bölümü, NIDCR/NIH) deneylerin tasarımı ve teknik yardımıyla ilgili tavsiyeleri için içtenlikle teşekkür ediyoruz. Dizileme tabanlı uzamsal transkriptomik çalışması için teknik destek sağladıkları için Dr. Iben James ve Dr. Vivek Mahadevan'a (Moleküler Genomik Çekirdeği, NICHD/NIH) teşekkür ediyoruz. Dr. Gustaf Wigerblad'a (Sistemik Otobağışıklık Şubesi, Ulusal Artrit ve Kas-iskelet ve Cilt Hastalıkları Enstitüsü, NIAMS/NIH) görüntü tabanlı mekansal transkriptomik için teknik destek verdiği i....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSTermo Fischer10010023Use  iş akışı sırasında yıkama yapmak
50 mL konik tüpler (Ambion) RNAse içermeyenTermo FischerAM12502Farklı çözeltilerde örnekleri saklamak için kullanım
İleri yörünge sallayıcısıVWR6683-470İnkubasyon sırasında fiksasyon çözeltisinde dokuları silkelemek için kullanılır
Alkol, %70, Fisherbrand, HistoPrepFisher ScientificHC-1000-1GLTüm çalışma alanını temizlemek ve dezenfekte etmek için kullanılır
Otomatik vakum doku işlemciLeica BiosystemsASP300SNumunelerin temizlenmesi, dehidrasyonu, yeniden hidrasyonu ve mum infiltrasyonu için kullanılır
Kaplama Camı Kalınlığı 1.5, 25 mm x 25 mm ve nbsp;Corning2850-25Visium HD iş akışında sürgü montajı için kullanım
Dako Bluing Buffer, Kullanıma HazırAgilant TechnologiesCS70230-2H& için kullanım E boyama
Eozin-Y ve floksinFisher Scientific22050198H& için kullanım E boyama
Hematoksilin, Mayer's, Kullanıma hazır sulu çözeltiAgilant TechnologiesS330930-2H& için kullanım E boyama
HistoCore Su Banyosu Leica BiosystemsHIS2326Bölümleri 40-43 derece ve derecede yüzdürmek için kullanılır; C FFPE bölümlerinden kırışıklıkları gidermek için 
Loupe tarayıcı  9.0.010X Genomics, Inc. Visium HD verilerini analiz etmek için kullanılır 
Düşük Profilli Tek Kullanımlık Bıçaklar DB80LXLeica Biosystems14035843496FFPE bloklar  bölümlerine almak için kullanın;
Nötr Tamponlu Formalin %10Azer ScientificNBF-4-GDokuları düzeltmek için kullanın
RNaseZap RNase Dekontekromasyon ÇözeltisiTermo FischerAM9782RNase temizlemek ve çıkarmak için kullanılır
Yarı Otomatik Döner MikrotomLeica BiosystemsRM2245Kılavuzlarda bildirildiği gibi FFPE bloklarını kesimlendirmek için kullanın.
Kapaklı Kaydırma IsıtıcıPremiere XH2004Farklı sıcaklıklarda slaytların kuluçka aşamasında kullanımı
Superfrost Plus Slaytları Fisher Scientific12-550-15 Vsium HD için bölüm bağlamak için kullanılır
Cerrahi bıçak No. 11Integra Miltex4-311FFPE dokularının puanlanması için kullanım
Cerrahi ParaplastLeica Biosystems39601006doku infiltrasyonu ve dokuların gömülmesi için kullanılır
TISsue kültürü TABAK 100X20MM 500/CSFisher Scientific8772221x PBS'de örnekleri toplamak ve disseksiya etmek için kullanım
UltraPure GlycerolTermo Fischer15514011CytAssist'ten önce coverglass'ın Visium HD sürgü montajı için kullanım
Visium CytAssist10X Genomics, Inc. PN-1000442Visium HD iş akışı deneyleri için kullanım
Visium HD Uzaysal RNA dizileme10X Genomics, Inc. 1000676Mekansal transkriptomik deneyler yapmak için kullanım
Ksenyum 5K Yerinde RNA Yerelleştirmesi 10X Genomics, Inc. PN-1000724Mekansal transkriptomik deneyler yapmak için kullanım
Ksenyum Analizörü10X Genomics, Inc. PN-1000481Xenium ve Xenium 5K RNA görüntüleme uygulamak;
Xenium Explorer 410X Genomics, Inc. Xenium verilerini analiz etmek için kullanılır 
Ksenyum In Situ RNA Lokalizasyonu10X Genomics, Inc. 1000672Mekansal transkriptomik deneyler yapmak için kullanım

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thesleff, I. From understanding tooth development to bioengineering of teeth. Eur J Oral Sci. 126 (1), 67-71 (2018).
  2. Bei, M. Molecular genetics of tooth development. Curr Opin Genet Dev. 19 (5), 504-510 (2009).
  3. Roth, D. M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spatial TranscriptomicsTooth MorphogenesisMouse Embryonic TissueFormalin Fixed TissueParaffin EmbeddingCraniofacial DevelopmentRNA IntegrityTissue MorphologyGene Expression ProfilingSingle Cell RNA Sequencing

Related Articles