CAR T hücresi karakterizasyonu için kurutulmuş rekombinant antikor panelleri kullanılarak standart akış sitometri testi

Özet

Bu protokol, kurutulmuş rekombinant antikor panellerinin, değişkenliği azaltarak ve iş akışlarını basitleştirerek Kimerik Antijen Reseptörü T (CAR T) hücre karakterizasyonunu nasıl kolaylaştırdığını göstermektedir. Kritik kalite özelliklerinin tekrarlanabilir değerlendirilmesini sağlar; bunlar arasında Chimeric Antigen Receptor T hücrelerinin mutlak nicelenmesi de vardır ve farklı akış sitometri platformlarında uyumludur.

Özet

Akış sitometrisi, Chimeric Antigen Receptor T (CAR T) hücrelerinin canlı yaşama, fenotip ve transdüksiyon verimliliği dahil kritik kalite özelliklerini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Geleneksel sıvı reaktif iş akışları, operatöre bağlı kullanımda değişkenlik ve farklılıklar getirebilen birden fazla hazırlık aşaması gerektirir. Ön formüle edilmiş kurutulmuş rekombinant antikor panelleri, rekombinant antikor teknolojisini kullanıma hazır bir konfigürasyonla birleştiren alternatif bir format sunar. Rekombinant antikorlar belirgin özbaşlılık ve lotlar arasında azalan değişkenlik sunarken, kurutulmuş format hazırlık aşamalarını azaltır ve reaktif kullanımını kolaylaştırır. Burada, kurutulmuş rekombinant antikor panelleri kullanılarak CAR T hücresi analizi için adım adım bir iş akışını sunuyoruz. Protokol, örnek boyama, veri toplama ve analiz işlemlerini içerir ve iş akışının şematik bir özetiyle birlikte sunulur. Panel uygulamasını göstermek için temsilli boyama sonuçları gösterilir ve geleneksel sıvı reaktif iş akışına kıyasla uygulamalı zaman farkları vurgulanır. Verilen örnekler, bu panellerin CAR T hücrelerinin çok parametrik karakterizasyonunu kolaylaştırmak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Genel olarak, bu çalışma, akış sitometrisine dayalı CAR T hücresi analizinde kurutulmuş rekombinant antikor panellerinin uygulanması için pratik bir çerçeve sunmaktadır.

Giriş

CAR T hücre tedavileri, özellikle hematolojik kanserler için kanser tedavisinde önemli bir ilerleme olarak ortaya çıkmıştır. Bu yaklaşım, hastanın kendi bağışıklık sistemini kullanarak T hücrelerini kimerik antijen reseptörlerini (CAR) ifade edecek şekilde modifiye eder; bu reseptörler kanser hücrelerini tanıyor ve hedefliyor¹. Ancak, CAR T hücrelerinin üretimi için gereken son derece karmaşık altyapı ve emek yoğun üretim süreçleri, hem ürün kalitesi hem de hasta güvenliği için titiz, standartlaştırılmış karakterizasyonu vazgeçilmez kılar. CAR T tedavisinin toplam maliyetinin önemli bir kısmı, manuel, çok aşamalı iş akışlarını içeren kapsamlı laboratuvar çalışmaları ve kalite kontrol (QC) prosedürlerinden kaynaklanmaktadır. Bu bağlamda, transdüksiyon verimliliği ve kimlik testi gibi temel karakterizasyon parametreleri, değiştirilmiş hücrelerin terapötik potansiyelini değerlendirmek için kritik^{öneme sahiptir 2}. Bu değerlendirmelerde yaygın olarak kullanılan akış sitometrisinde geleneksel sıvı boyama yöntemleri çeşitli zorluklar barındırır. Pipetlemedeki değişkenlik, reaktif kararlılığı sorunları ve operatör önyargısı, verilerde tutarsızlıklara ve yanlışlıklara yol açabilir ve sonuçların güvenilirliğini potansiyel olarak^{zayıflatabilir 3}.

Akış sitometrisi, CAR T hücrelerinin karakterizasyonu ve kalite kontrolü için temel bir teknolojidir ve birden fazla hücre parametrelerinin ayrıntılı analizini mümkün kılar. Ancak, bu süreçte sıvı reaktiflerin geleneksel kullanımı potansiyel tuzaklarla doludur ^4,5. Pipetleme değişkenliği, özellikle küçük hacimler ve birden fazla reaktifle ilgilenirken önemli hatalara yol açabilir. Ayrıca, sıvı reaktifler zamanla bozulmaya hassastır; bu da kararlılıklarını bozabilir ve tutarsız boyama sonuçları^{verebilir 6}. Manuel hazırlık ve kullanım kaynaklı operatör önyargısı, bu sorunları daha da kötüleştirir ve laboratuvarlar arasında ve hatta aynı laboratuvardaki çalışmalarda sonuçlarda değişkenliğe yol açabilir. Hücre canlılığı, transdüksiyon frekansı, CD3⁺ sayısı ve kimlik gibi kritik kalite özellikleri, CAR T ürünlerinin güvenli şekilde serbest bırakılması için gereklidir. Bu ölçümlerin doğruluğunu ve tutarlılığını sağlamak hayati öneme sahiptir, çünkü doğrudan CAR T hücrelerinin terapötik etkinliği ve güvenliğini^{etkiler 1}. Örneğin, transdüksiyon frekansının doğru değerlendirilmesi, CAR'ı ifade edecek şekilde başarılı şekilde modifiye edilen T hücrelerinin oranını belirlemek için kritik öneme sahiptir; CD3⁺ sayısı ve yüzdesi ise T hücresi popülasyonunun genel bileşimi ve saflığı hakkında içgörüler sağlar.

Kurutulmuş antikor panelleri, tutarlı reaktif teslimatı sağlayarak ve kurulum süresini ve hata riskini azaltarak bu zorluklara umut verici bir çözüm sunar. Bu paneller, önceden karıştırılmış kokteyllerden kurutulmuş birden fazla antikordan oluşmaktadır. Kuruduktan sonra bu paneller stabil ve kullanıma hazır hale gelir, karmaşık hazırlık adımlarına gerek kalmaz ve insan hatası olasılığını en aza^{indirir 6,7}. Önemli olarak, bu kurumuş panelleri kullanmadan önce yeniden yapılandırmaya gerek yoktur—hücre süspansiyonları doğrudan kurutulmuş antikor karışımına eklenebilir. Rekombinant antikorların bu kuru formatlara dahil edilmesi, geleneksel poliklonal veya hibritoma kaynaklı reaktiflere kıyasla çeşitli avantajlar sunar. Moleküler olarak tanımlanmış yapıları, yüksek arste tutarlılık ve tekrarlanabilirlik sağlar, deneyler ve laboratuvarlar arasındaki değişkenliği azaltır. İnsan IgG1'e dayalı mühendislik ürünü bir Fc-bölgesi, çapraz reaktivite ve arka plan boyamasını en aza indirir. Sonuç olarak, Fc-bloklama zorunlu değildir ve bu da akış sitometrik testinin yapılması için gereken süreyi daha da azaltır. Kurutulmuş format, reaktiflerin bozulmadan korunmasını sağlar ve etkilerini zamanla ve partiler arasında korur. Bu tutarlılık, akış sitometrisi testlerinde güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için^{kritik öneme sahiptir 8}.

Kurutulmuş reaktif formatlarının uygulanabilirliği, CAR T hücre tedavisi geliştirme ve izlemesinin çeşitli aşamalarını kapsar. Üretim kalite kontrolünde, kurutulmuş reaktifler kapalı sistem numunesini kolaylaştırır ve sterillik ve tutarlılık sağlar. Bu özellikle, örneğin bütünlüğünün korunmasının en önemli olduğu klinik ortamda^önemlidir. Ürün karakterizasyonu için, kurutulmuş reaktifler, mutlak sayıların ve bağışıklık alt kümelerinin doğru değerlendirilmesini sağlar ve bu da CAR T hücrelerinin terapötik kalitesini belirlemek için kritik öneme sahiptir. Ayrıca, araştırma ortamlarında kurutulmuş reaktifler uzun süreli hasta izleme için paha biçilmezdir ve CAR T hücresinin kalıcılığının zaman içinde tutarlı şekilde izlenmesini sağlar; bu da tedavinin uzun vadeli etkinliği ve güvenliğini anlamak için kritik öneme sahiptir.

Kurutulmuş antikor panellerinin akış sitometrisinde kullanılmasının avantajları çok fazladır; en önemlilerinden biri, bireysel reaktiflerin manuel olarak yeniden süspansiyon ve birleştirilmesini gerektirmek yerine tamamen önceden yapılandırılmış bir panel sağlayarak pipetleme hatalarını azaltma yetenekleridir. Tek kurutulmuş antikorların aksine—ki bunlar hâlâ yeniden oluşturulması ve pipetlenmesi gerekiyor, bu nedenle esas olarak uzun raf ömrü sunar—önceden monte edilmiş kurutulmuş paneller birden fazla manuel hazırlık adımını ortadan kaldırır. Bu, iş akışını kolaylaştırır ve operatöre bağlı değişkenlik fırsatlarını önemli ölçüde en aza indirir. Sonuç olarak, genel süreç daha az hata yapmaya yatkın, daha az zaman alıcı ve kapsamlı teknik eğitime daha az bağımlı hale gelir; böylece daha geniş bir laboratuvar yelpazesine erişilebilir^{hale gelir 10}. Ayrıca, kurutulmuş rekombinant antikor panellerinin stabil ve kullanıma hazır formatı, operatörler ve konumlar arasında tutarlı ve güvenilir test performansını^{sağlar 9}.

Kurutulmuş reaktif teknolojisinin akış sitometrisindeki potansiyelini tam olarak gerçekleştirmek için, kullanımı için adım adım bir protokol geliştirmek gereklidir. Bu, kurutulmuş panel boyama, satın alma ve otomatik analiz için rehberleri içeriyor; böylece sürecin tüm yönleri standartlaştırılıyor ve doğruluk ve verimlilik açısından optimize ediliyor. Açık ve kapsamlı bir protokol sağlayarak laboratuvarlar tutarlı ve güvenilir sonuçlar elde edebilir, böylece CAR T hücresi ürünlerinin güvenli ve etkili^{salınımını kolaylaştırır 2}. Burada, kurutulmuş antikor panellerinin avantajlarından yararlanarak geleneksel sıvı boyama yöntemlerinin sınırlamalarını gideren bir protokol sunuyoruz; böylece güvenilirlik, verimlilik ve tekrarlanabilirliği artırıyor—bunlar güvenli ve etkili CAR T hücre tedavilerini sağlamak için temel özelliklerdir (Şekil 1).

Protokol

Tüm insan örnekleri, yazılı bilgilendirilmiş onay alındıktan sonra sağlıklı ve anonim gönüllülerden toplanmıştır. Tüm prosedürler Ärztekammer Nordrhein Etik Komitesi (#2020272) tarafından onaylanmış ve gerekli etik ve biyogüvenlik yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Örnek toplama ve hazırlanma

1. Üretim kalite kontrolü için işleme torbalarından aseptik olarak Kimerik Antijen Reseptörü T (CAR T) hücre örnekleri toplamak.
2. Hücrelerin canlı kalma kapasitesini korumak için örnekleri hızlıca işleyin. Örnekleri 2–8 °C sıcaklıkta, ışıktan korunarak boyana kadar saklayın.
3. Her numunenin hücre sayısını boyamadan önce belirleyin.
4. Her örneği fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS)/2 mM EDTA/%0,5 BSA tamponu, pH 7,2 kullanarak 100 μL başına 10⁶ çekirdekli hücreye kadar konsantrasyona ayarlayın.
   1. Gerekirse, örnekleri 300 × g. ile 5 dakika boyunca santrifüjle yapın. Süpernatantı tamamen aspire edin.
   2. Hücreleri uygun konsantrasyona yeniden süzüldürün.

2. Kuru panel boyama

NOT: Örnekleri boyamak için iki önceden formüle edilmiş kurutulmuş antikor paneli kullanılır: insan için kurutulmuş rekombinant Bağışıklık Hücresi Bileşimi (ICC) Kokteyli ve insan için kurutulmuş rekombinant CAR T Transdüksiyon Kokteyli. CAR T Transdüksiyon paneli için CAR boyama kritik öneme sahiptir. Transdüksiyon frekansının doğru belirlenmesi için CAR-negatif ve CAR-pozitif hücrelerin güvenilir şekilde ayrılması gereklidir. Yıkama, santrifüj ve aspirasyon sırasında hücre kaybı nedeniyle hücre toparlanmasını azaltabilir. Bu nedenle, doğru hücre konsantrasyonu gerektiğinde genellikle yıkamama protokolleri tercih edilir.

1. ICC Kokteyli (yıkama protokolü)
   1. Hazırlanan hücre süspansiyonundan 100 μL doğrudan kurutulmuş ICC antikor tüpüne ekleyin. Pipetle yukarı aşağı ve/veya kısa bir girdabla karıştırarak peleti tamamen çözer. Oda sıcaklığında (19–25 °C) karanlıkta 10 dakika kuluçka yapın.
   2. Kurutulmuş antikor pelletinin tamamen çözündüğünü doğrulayın. Yıkamadan doğrudan satın alma sürecine geçin.
2. CAR T transdüksiyon kokteyli (yıkama protokolü)
   1. Hazırlanan hücre süspansiyonundan 100 μL kurutulmuş CAR T transdüksiyon tüpüne ekleyin.
   2. Uygun CAR algılama reaktifi hacmini ekleyin (örneğin, 2 μL). Pipetle yukarı aşağı ve/veya kısa bir girdabla karıştırarak peleti tamamen çözer. Oda sıcaklığında (19–25 °C) karanlıkta 10 dakika kuluçka yapın. Kurutulmuş antikor pelletinin tamamen çözündüğünü doğrulayın.
   3. Hücreleri 1 mL tampon ekleyerek yıkayın. Santrifüj 300 × g. 5 dakika boyunca kullanın. Üst maddeyi tamamen çıkarın.
3. İkincil boyama (gerekirse)
   1. Serbest biotin-konjuge reaktifi çıkarmak ve arka plan boyamasını azaltmak için biotin-etiketli CAR algılama reaktifleri için ikinci bir yıkama (bkz. adım 2.2.3) gerçekleştirilir.
   2. Hücreleri 98 μL tamponla yeniden askıya alın. 2 μL fikoeritrin (PE) etiketli ikincil antikor ekleyin. Kısa bir süreliğine Vortex karıştırıyor. Oda sıcaklığında (19–25 °C) karanlıkta 10 dakika kuluçka yapın.
   3. Hücreleri yıkarak bağlanmamış ikincil antikoru çıkarın (bkz. adım 2.2.3).
4. Satın alma için son hazırlık
   1. Tüm boyalı örneklerin (CAR T Transduksiyon Kokteyli ve ICC Kokteyli) hacmini tampon ile 300–500 μL olarak ayarlayın. Örnekleri ışıktan koruyun ve 2–8 °C sıcaklıkta kalın.
   2. Florofor stabilitesini korumak ve hücre canlılığını korumak için 1 saat içinde alım gerçekleştirin.

3. Akış sitometrik alımı ve veri analizi

1. Akış sitometresini hazırlayıp astarlayın, böylece kalibrasyon ve cihaz ayarları optimize edilmiştir.
2. Lazerleri açın ve akışkan sistemi durulayın. Optik tezgahın ısınması için en az 30 dakika bekleyin.
3. Isınma sırasında, %1 hipoklorit çözeltisi içeren bir temizlik programı çalıştırın.
4. Lazer ayarlarını ayarlamak için kalibrasyon boncukları kullanın.
5. Eşleşen antikor setleri kullanarak telafi için tek boyalı kontroller hazırlayın.
   1. Boncuklar için: uygun miktarda pozitif ve negatif kontrol boncukları ekleyin.
   2. Hücreler için: 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin.
   3. Biotin-konjuge reaktifler için: 98 μL tampon ve 2 μL PE etiketli ikincil antikor içeren bir tüp ekleyin.
   4. Telafi reaktiflerinin antikor kokteyli (lot numaraları) ile eşleşip eşleşmediğinden emin olun.
6. 10–20 saniye kontrol kuluçka, 5 saniye girdap ve ardından 19–25 °C sıcaklıkta karanlıkta 10 dakika kuluçka yapın.
7. Örnekleri 600 μL tampon ile seyreldin ve iyice karıştırın.
8. Tek boyalı kontrollerle kompensasyon kurun.
9. FSC ve SSC voltajlarını ayarlayın ve eşikleri tanımlayarak enkaz dışlayın.
10. Her örnek başına en az 50.000–100.000 canlı lenfosit edinin.
11. Geçerlilik, CD3 ifadesi ve CAR ifadesini değerlendirmek için kapı kapatma işlemi yapın.
12. Mutlak nicelendirme için, CAR-pozitif T hücrelerinin (f₍CAR T₎) kesimini belirleyin.
13. Toplam lökositleri (N₍total₎) döküntü dışlandıktan sonra tek hücreli CD45⁺ olarak kullanılabilir olarak tanımlayın.
14. Toplam lökosit sayımları, cihaz tarafından destekleniyorsa veya sayma boncukları veya hematoloji analizörü kullanılarak ICC boyalı örneklerden doğrudan sayarak ölçün.
15. CAR T hücre konsantrasyonu hesaplayın:
    
    NOT: Şekil 2 ve Şekil 3'ten alınan değerlerle örnek hesaplama
    ​
    
16. Bu yöntemi, farklı cihazlar ve iş akışları arasında CAR T hücresi niceliklendirmesi için uygulayın.

Sonuçlar

Kurutulmuş rekombinant antikor panelleri, akış sitometrisi boyama iş akışlarını göstermek için CAR⁺ T hücre örneklerine uygulandı. Şekil 1'de gösterildiği gibi, geleneksel sıvı reaktif iş akışlarını önceden formüle edilmiş kurutulmuş antikor panelleriyle değiştirmek, tüp etiketleme (panelin antikor bileşimini belirtmek için; her tüp yine uygun örnek kimliğini gerektirir), reaktif birleştirme ve manuel karıştırma gibi birkaç hazırlık adımını ortadan kaldırır. Tüpler, uyumlu sitometrelerle taranabilir veya manuel olarak okunabilen bir etiket içerir; bu da örnek tanımlama için esnek seçenekler sunar.

Temsilci örnekler, kurutulmuş bağışıklık hücresi bileşim panelinin anahtar lökosit alt kümelerinin tanımlanmasını mümkün kıldığını (Şekil 2), kurutulmuş CAR T transdüksiyon panelinin ise CAR eksprese eden T hücrelerinin görselleştirilmesine ve transdüksiyonun değerlendirilmesine olanak tanıdığını göstermektedir (Şekil 3). Bu paneller için Fc bloklaması zorunlu değildir ve paneldeki tüm antikorlar için yalnızca tek bir izotip kontrolü yeterlidir. Bu örnekler, CAR T hücrelerinin çok parametrik analizi için kurutulmuş panellerin uygulanmasını vurguluyor ve iş akışının daha az uygulamalı adımlarla nasıl verimli uygulanabileceğini gösteriyor. Bu çalışmada kullanılan kurutulmuş antikor panellerinin bileşimi Tablo 1'de verilmiştir.

Şekil 4 , kurutulmuş paneller kullanılarak hem daha az deneyimli hem de deneyimli kullanıcılar için temsilli bir deneyin hazırlık süresinin azalmasını göstermektedir. Kuru format, boyama prosedürlerini kolaylaştırır, manuel kullanımı en aza indirir ve iş akışı uygulaması ve eğitimi için pratik rehberlik sağlar. Önemli olarak, kurutulmuş antikor kokteyllerinin kullanımı, geleneksel sıvı kokteyllerle elde edilenlerle karşılaştırılabilir bağışıklık hücresi alt kümesi frekansları sağlamıştır (Şekil 5). Ayrıca, kurutulmuş antikor panelleri oda sıcaklığında stabildir ve bir yıllık raf ömrü boyunca ortam koşullarında saklanabilir; geleneksel sıvı antikorlar ise genellikle soğuk depolama gerektirir. Bu istikrar, tekrar edilen kullanımı, uzun vadeli çalışmaları ve basitleştirilmiş envanter yönetimini destekler.

Sonuç olarak, verilen örnekler, kurutulmuş rekombinant antikor panellerinin CAR T hücrelerinin çok parametrik karakterizasyonunu kolaylaştırmak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Genel olarak, bu çalışma, akış sitometrisine dayalı CAR T hücresi analizinde kurutulmuş antikor panellerinin uygulanması için pratik bir yaklaşım sunar; basitleştirilmiş işleme, azaltılmış hazırlık adımları ve uyarlanabilir panel konfigürasyonları sunar.

Şekil 1: Manuel boyama iş akışı ile kurumuş rekombinant antikor panellerinin karşılaştırılması. Geleneksel manuel iş akışı (üstte) tüp etiketleme, reaktiflerin birleştirilmesi ve karıştırılması ile örneklerin eklenmesi gibi birden fazla hazırlık adımını içerir; bu da uygulamalı çabayı artırabilir. Buna karşılık, kurutulmuş rekombinant antikor panel iş akışı (altta) yalnızca örnek eklenmesini gerektiren önceden karıştırılmış, kurutulmuş paneller kullanır. Bu sadeleştirilmiş yaklaşım, manuel adımları azaltır ve boyama sürecini basitleştirir; bu da iş akışı verimliliğini ve pratik uygulamayı gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kurutulmuş rekombinant antikor paneli "Bağışıklık Hücresi Kompozisyon Kokteyli" ile boyanmış lökaferez örneğinin akış sitometrik analizi. (A) Tüm hücreleri kapsayacak şekilde FSC ile SSC arasındaki kapı ile döküntü dışlanmıştır. (B) Çift silindirler FSC-A ile FSC-H kapısı kullanılarak çıkarıldı. (C) Lökositler, CD45⁺ hücrelerinde kapalı olarak tanımlandı, bu da kalıntı eritrositlerin dışlanmasına izin verdi. (D) Ölü hücreler 7-AAD boyama ile dışlandı. (E,F) CD3⁺ hücreleri tanımlandı ve CD56 ekspresyonuna göre (E) T hücreleri ve (F) NKT hücreleri olarak sınıflandırıldı. (G) T hücreleri daha sonra CD4⁺ ve CD8⁺ alt kümelerine ayrıldı. (H) CD3^– popülasyonu içinde, monositler CD14 ekspresyonu, B hücreleri ise CD19 ekspresyonuyla tanımlanmıştır. (I) Kalan CD14^–/CD19^– hücreleri SSC yüksek/CD16^– eozinofiller, SSC yüksek/CD16⁺ nötrofiller ve SSC düşük/CD56⁺/CD16⁺ hücrelerine bölündü. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kurutulmuş rekombinant antikor paneli "CAR T Transdüksiyon Kokteyli" ile boyanmış CD19 CAR T hücrelerinin (FMC63) akış sitometrik analizi. (A) Tüm hücreleri kapsayacak şekilde FSC ile SSC arasındaki kapı ile enkaz hariç tutuldu. (B) Çift silindirler FSC-A ile FSC-H kapısı kullanılarak çıkarıldı. (C) Lökositler, CD45⁺ hücrelerinde kapı ile tanımlandı. (D) Ölü hücreler 7-AAD⁻ boyama temelinde dışlandı. (E,F) CD3⁺ hücreleri tanımlandı ve ardından CAR⁺ ve ^CAR− popülasyonlarına ayrıldı. (G) ^CAR+ ve (H) ^CAR− hücreleri ayrıca CD4⁺ ve CD8⁺ T hücre alt kümelerine ayrılmıştır. (I) CD3⁻ popülasyonu içinde, kalıntı monositler CD14 ekspresyonuyla tanımlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Kurutulmuş antikor panelleriyle deneyim seviyeleri arasında elde edilen zaman tasarrufu. Deneyimsiz (solda) ve deneyimli kullanıcılar (sağda) için, deneyin başından kuluçka başlamasına kadar reaktif işleme, pipetleme ve dokümantasyon dahil olmak üzere akış sitometrik deneyi (kurutulmuş rekombinant antikor paneli "Bağışıklık Hücre Kompozisyon Kokteyli", teknik üçlükler) kurulması için süre değerlendirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Lizlenmiş tam kanın akış sitometrisi analizi, kurutulmuş rekombinant antikor paneli "Bağışıklık Hücre Kompozisyon Kokteyli" (mavi) ile boyanmış bir örnek ve aynı antikorlarla boyanmış bir numunenin sıvı formatta (turuncu) üzerine örtülmesi. (A) Tüm hücreleri kapsayacak şekilde FSC ile SSC arasındaki kapı ile döküntü dışlanmıştır. (B) Çift silindirler FSC-A ile FSC-H kapısı kullanılarak çıkarıldı. (C) Lökositler, CD45⁺ hücrelerinde kapalı olarak tanımlanmış, böylece kalıntı eritrositler hariç tutulmuştur. (D) Ölü hücreler 7-AAD boyama ile dışlandı. (E) CD3⁺ hücreleri tespit edildi. (F) Bu hücreler CD56 ekspresyonu temelinde T hücreleri ve NKT hücreleri olarak sınıflandırıldı. (G) T hücreleri daha sonra CD4⁺ ve CD8⁺ alt kümelerine ayrıldı. (H) CD3^– popülasyonu içinde, monositler CD14 ekspresyonu, B hücreleri ise CD19 ekspresyonuyla tanımlanmıştır. (I) Kalan CD14^–/CD19^– hücreleri SSC yüksek/CD16^– eozinofiller, SSC yüksek/CD16⁺ nötrofiller ve SSC düşük/CD56⁺/CD16⁺ hücrelerine bölündü. (J) Sıvı antikorlar ve kurutulmuş reaktif panellerle elde edilen frekanslar karşılaştırıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Amaç	V1 VioBlue	V2 VioGreen	B1 FITC	B2 PE	B3 7-AAD PerCP-Vio 700	B4 PE-Vio770	R1 APC	R2 APC-Vio770
Bağışıklık hücrelerinin hücre yaşamalılığı ve bileşiminin belirlenmesi	CD45	CD4	CD3	CD56/CD16	7-AAD	CD19	CD14	CD8
CAR T hücrelerinin transdüksiyon verimliliğinin belirlenmesi	CD45	CD4	CD3	CAR algılama reaktifi	7-AAD	/	CD14	CD8

Tablo 1: CAR T hücre analizi için kullanılan kurutulmuş rekombinant antikor panellerinin bileşimi. Bu tablo, her kurutulmuş panelde yer alan antikorları listeler; hedef antijen, klon, florokrom ve tüp başına tipik miktarı belirtir. İki panel gösterilmiştir: ana lökosit alt kümelerinin tanımlanması için "İmpün Hücre Bileşimi" paneli ve CAR ekspresyonu ile T hücre alt kümesi karakterizasyonunun tespiti için "CAR T Transduksiyonu" paneli. Bu bilgiler, iş akışı uygulaması ve ek sıvı konjuge antikorlarla isteğe bağlı adaptasyon için bir referans sağlar.

Tartışma

Kurutulmuş rekombinant antikor panelleri, laboratuvarda CAR T hücresi karakterizasyonu için daha sade ve pratik bir iş akışı sağlar. Önceden formüle edilmiş format, hazırlık adımlarını azaltır ve kullanımı basitleştirir; operatöre bağlı değişkenliği sınırlamaya ve çok parametrik akış sitometri prosedürlerinin tutarlı yürütülmesini^{destekler 8}. Temsilci örnekler, bu panellerin lökosit alt kümelerini tanımlamak, CAR ifadesini tespit etmek ve T hücresi alt kümelerini değerlendirmek için kullanıldığını gösterir. Paneller ayrıca ek sıvı ile konjuge edilmiş antikorlarla desteklenerek ekstra belirteçler veya bağışıklık alt kümeleri dahil edilebilir; böylece belirli deneysel ihtiyaçlara veya daha yüksek parametreli analizlere esnek uyum sağlanabilir.

Doğru CAR algılama, transdüksiyon^{frekansı 1'in} güvenilir şekilde belirlenmesi için kritiktir. CAR negatif ve CAR pozitif popülasyonların net ayrımı, özellikle CAR ekspresyon seviyeleri değiştiğinde, uygun optimize edilmiş boyama koşullarına bağlıdır. Floresans-eksi bir (FMO) örnekleri gibi kontroller, doğru gadingi destekleyebiliyor. Bazı durumlarda, yıkama adımları bağlanmamış antikorları çıkararak ayrımcılığı artırabilir; ancak bu adımlar, santrifüj ve aspirasyon sırasında hücre kaybı nedeniyle hücre iyileşmesini azaltabilir. Bu nedenle, doğru hücre nicelenmesi gerektiğinde yıkamasız iş akışları tercih edilebilir.

Yaklaşım ideal olarak mühendislik CAR'ın ekstrahücresel alanını tanıyan bir CAR spesifik tespit reaktifi kullanırken, antijen bağlanma ve sinyal alanları arasındaki korunmuş bağlantıcı bölgeleri hedefleyen antikorlar gibi alternatif reaktifler de kullanılabilir. Bu alternatifler, CAR eksprese eden hücrelerin tespit edilmesini sağlar ve uygun optimizasyonla CAR'a özgü reaktiflerin bulunmadığı yerlerde iş akışlarına dahil edilebilir.

Express Mode dahil olmak üzere otomatik satın alma ve analiz sistemleriyle entegrasyon, veri toplama ve analiz etmeyi daha da kolaylaştırabilir, uygulamalı zamanı azaltır ve operatörler arasında iş akışlarının tutarlı şekilde yürütülmesini sağlar.

Bu çalışma yöntemi gösterse de, düzenlenmiş üretim veya serbest bırakma testleri için resmi test doğrulaması yapılmamıştır. Çok merkezli doğrulama henüz yapılmadı, bu nedenle laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirlik henüz^{doğrulanmamıştır 5}. Yaklaşım, son derece özel uygulamalar için esnekliği sınırlayabilecek önceden formüle edilmiş panellere dayanır. Ancak, özel kurutulmuş panel seçenekleri belirli işaretleyiciler veya kombinasyonlar içerecek şekilde tasarlanabilir, böylece özel iş akışları sağlanabilir ve standart panellerin sınırlamalarını aşabilir. Maliyet hususları, büyük ölçüde daha az uygulamalı çalışma ve daha verimli prosedürlerle dengelenir; bu da yüksek verimli iş akışlarında özellikle avantajlı olabilir.

Gelecekteki çalışmalar, nicel performans değerlendirmeleri, düzenlenmiş kullanım için resmi doğrulama ve laboratuvarlar arasında iş akışı tutarlılığını değerlendirmek için çok merkezli çalışmalara genişletilmesine odaklanabilir. Özel panel tasarımı, belirteç kapsamını genişletmek, benzersiz deneysel soruları ele almak veya boylamasına immünomonitör çalışmalarına uyum sağlamak için pratik bir yol sunar.

Özetle, kurutulmuş rekombinant antikor panelleri, CAR T hücresi akış sitometrisi için esnek ve pratik bir platform sağlar. Hazırlık adımlarını azaltır, iş akışlarını basitleştirir ve özel panel konfigürasyonları dahil esnek deneysel tasarımı destekler.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
(Opsiyonel) Biotin Antikoru, PE, REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-951	Yalnızca Biotin konjuge CAR Algılama Reaktifi kullanılıyorsa gereklidir.
(Opsiyonel) CAR T Hücre Ekspres Mod Paketi	Miltenyi Biotec	160-002-376	MACSQuant Analiz Cihazları için yazılım eklentisi; otomatik kapsama ve veri analizini sağlar, ancak manuel analiz de mümkündür.
PE kanalında tespit edilebilen istediğiniz CAR Algılama Reaktifi, örn., CD19 CAR Algılama Reaktifi, insan, Biotin	Miltenyi Biotec	130-129- 550	Alternatif seçenekler: CD19 CAR FMC63 İdiyotip Antikoru, PE, REAfinity (130-127-342); CD22 CAR Algılama Reaktifi, insan, Biotin (130-126-727); BCMA CAR Algılama Reaktifi, insan, PE (130-133-888)
Akış sitometri cihazı, örn. MACSQuant Analiz Cihazı 16	Miltenyi Biotec	130-109-803	StainExpress tüpleri tüm standart akış sitometri cihazlarıyla uyumludur.
StainExpress CAR T Transdüksiyon Kokteyli, insan	Miltenyi Biotec	130-127-638	Özel kurutulmuş antikor paneli yapılandırmaları, yerel Miltenyi Biotec temsilciniz veya teknik destek ekibi aracılığıyla talep edilebilir.
StainExpress Bağışıklık Hücresi Kompozisyon Kokteyli, insan	Miltenyi Biotec	130-127-637	Özel kurutulmuş antikor paneli yapılandırmaları, yerel Miltenyi Biotec temsilciniz veya teknik destek ekibi aracılığıyla talep edilebilir.