CAR T Hücrelerinin Fonksiyonel Profilini Çıkarmak için Boncuk Tabanlı Multipl Akım Sitometresi Analizi

Summary

Bu makale, kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücre türevi süpernatantlardan en fazla 12 sitokin ve efektör molekülü kantitasyonu için multipl boncuk tabanlı akış sitometrisi ölçümünü tanıtmakta, bu sayede mühendislik geçirmiş T hücre işlevselliğinin hızlı, tekrarlanabilir analizini küçük numune hacimleri ile sağlamaktadır.

Abstract

CAR T hücrelerinin profilini çıkarmak, heterojenlikleri, karmaşık bağışıklık tepkileri ve sınırlı numune kullanılabilirliği nedeniyle zorluklar sunar. Multipleks analizleri, sitokinler, kemokinler ve sitotoksik medyatorlar dahil olmak üzere geniş bir efektör molekül yelpazesinin eşzamanlı tespit edilmesini sağlayarak fonksiyonel değerlendirmeyi mümkün kılar. Burada, akış sitometrisi ile uyumlu boncuk tabanlı bir multipleks analizini, insan şematik antijen reseptörü (CAR)-T hücreleri tarafından salgılanan efektör moleküllerin analizi için açıklıyoruz. CAR T hücre süpernatantları, analit-spesifik antikorlar ile eşleştirilmiş çoklu floresan kodlu popülasyonlardan oluşan bir yakalayan boncuk karışımı ile inkübe edilir. Bu boncuklar, numunede çözünür hedeflere bağlanarak boncuk-analit kompleksleri oluşturur ve bu kompleksler daha sonra etiketli tespit antikorları kullanılarak tespit edilir. Analiz, interferon (IFN)-γ, interlökin (IL)-2, tümör nekroz faktörü (TNF)-α, IL-6, IL-10, granülosit-makrofaj koloni stimülasyon faktörü (GM-CSF) ve Granzim B gibi bir dizi bağışıklık aracıcısını içerir. Önceden tanımlanmış standartların kullanımı, tek bir örnekten çoklu analitin kantitatif ölçümünü sağlar. Veri toplama ve analizi, cihazla ilişkili veya web tabanlı yazılım araçları tarafından sağlanan otomatik kapsama yaklaşımları kullanılarak gerçekleştirilebilir ve bu da veri işlemeyi kolaylaştırır. Sonuç olarak, sunulan multipleks analiz, CAR T hücre fonksiyonelliğinin çok boyutlu analizini sağlar ve araştırma, kalite kontrol testleri, mekanizmatik çalışmalar ve fonksiyonel karakterizasyon gibi bağlamlarda uygulanabilir.

Introduction

Kamusal karakterizasyon, Kimerik Antijen Resepsitörü (CAR) T hücre testlerinde gereklidir çünkü bu tedavilerin gücü, güvenliği ve etki mekanizmaları hakkında bilgi sağlar. Sitokin ve sitotoksik medyator imzalarının anlaşılması, terapötik etkinliğin ve potansiyel advers etkilerin değerlendirilmesine yardımcı olur, bu da güvenli ve etkili tedavilerin geliştirilmesini sağlar. Enzim-bağlı immünosorban testleri (ELISA) gibi geleneksel tek-çoğaltma testleri, yüksek numune hacmi gerektirme, uzun işleme süreleri ve her analit için ayrı çalışmalar gibi sınırlamalara sahipken, bireysel numunelerde sınırlı bir dinamik aralık sunar^1,2. Buna karşın, çoklu boncuklu testler, çoklu çözünür medyatorların eşzamanlı tespit edilmesini sağlayarak, işleme süresini ve numune gereksinimlerini azaltırken dinamik aralığı artırır^1,2. Bu verimlilik ve analiz derinliği, çoklu testleri CAR T hücre araştırma ve geliştirme için değerli araçlar haline getirir^3,4,5.

Bu çalışmada sunulan çoklu test, analitleri yakalayan boncuklar kullanır, bu boncuklar floresein izotiyosiyanat (FITC) ve fikoeritrin (PE) kanallarında tanımlanmış floresan profiller gösterir ve çözünür analitlere karşı spesifik antikorlarla kaplanır. Numune ile inkübasyon sırasında, bu boncuklar çözeltiden hedef analitlerini seçici olarak bağlar. Analit yakalanmasından sonra, analit-spesifik sandviç kompleksleri oluşturmak için tespit antikorları eklenir. Bu antikorlar ya doğrudan alofikokiyanin (APC) (doğrudan tespit) ya da biyotine (dolaylı tespit) eşleştirilir. Dolaylı tespit için, APC-konjuge anti-biyotin antikoru ile ardışık inkübasyon gereklidir (Şekil 1). Elde edilen kompleksler - yakalanan boncuklar, analitler ve tespit antikorları - analit konsantrasyonlarını kantitatif olarak belirlemek için akış sitometrisi ile analiz edilir. Çoklu test, analit-spesifik standart eğrileri oluşturmak için kullanılan önceden tanımlanmış standartları içeren bir plak tabanlı teknolojidir^1,2.

Şekil 1: Sitokin teknolojisi prensibi ve test iş akışı. Test, analit-spesifik antikorlarla eşleştirilmiş 12 floresan kodlu Yakalama boncuğu popülasyonuna dayanır. Numune inkübasyonu sonrasında, belirli tespit antikorları kullanılarak akış sitometrisi ile tespit edilebilen boncuk-analit kompleksleri oluşturulur. Test iş akışı 1) bir filtre plak üzerinde analit standartlarının ve ilgili numunelerin hazırlanmasını, 2) Yakalama boncuklarla inkübasyonu, 3) sandviç kompleksleri oluşturmak için biyotin etiketli anti-analit antikorları ile inkübasyonu, 4) APC etiketli anti-biyotin antikorları ile inkübasyonu, 5) ölçüm için tamponda yeniden süspansiyonu ve 6) numune alımını içerir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışmada açıklanan çoklu test, mavi (örn. 488 nm; FITC ve PE kanalları) ve kırmızı lazer (örn. 635 nm; APC kanalı) ile donatılmış standart akış sitometlerle uyumludur. Akış sitometreler araştırma laboratuvarlarında, klinik ortamlarda ve kalite kontrol ortamlarında yaygın olarak mevcut olduğundan, bu uyumluluk ek özel enstrümantasyon gerektirmeden uygulamayı kolaylaştırır⁵. CAR T hücre fonksiyonelliği testi bağlamında, bu yaklaşım, yaygın olarak kullanılabilen analitik iş akışları içinde fonksiyonel yanıtların çok boyutlu değerlendirilmesini sağlar⁶. Test, CAR T hücre araştırması için önemli avantajlar sunarak anahtar analitleri aynı anda nicellemeyi sağlar, bunlar arasında GM-CSF, Granzim B, interferon (IFN)-γ, interlökin (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, monosit kemotaktik protein-1 (MCP-1), Perforin ve tümör nekroz faktörü (TNF)-α (insan sitotoksisite paneli) bulunmaktadır. Bu medyatorlar, CAR T hücre aktivasyonu, efektör fonksiyonu ve güvenlikle ilgili sitokin salınımını anlamak için kritiktir^4,5,7,8.

Test iş akışı, enstrümanla ilişkili yazılım ve enstrümandan bağımsız, web tabanlı analiz araçları kullanarak otomatik geçiş ve veri analizi seçeneklerini içerir⁵. Bu özellikler, CAR T hücre efektör molekül profilleme verilerinin akıcı işlenmesini destekler ve elle müdahalenin kapsamını azaltarak veri işlemeyi kolaylaştırır. Otomatik analiz kullanımı, veri işleme konusunda daha iyi tutarlılığa katkıda bul

Protocol

Tüm insan örnekleri, yazılı bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra sağlıklı anonim gönüllülerden toplanmıştır. Tüm prosedürler, Nordrhein Hekimler Odası Etik Kurulu (#2020272) tarafından onaylanmış ve gerekli etik ve biyogüvenlik düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. CAR T hücre eş kültürü

1. Mühendislik yapılmış insan CAR T hücrelerinin hücre kültürünü, belirli antijenin yokluğunda ve varlığında, örneğin antijen sunan tümör hücreleri ile 2.5:1 oranında (efektör: hedef hücreler) hazırlayın.
2. Salınan sitokinleri analiz etmek için süpernatant toplama için bir veya birden fazla zaman noktasını tanımlayın, tek bir kez veya belirli bir zaman dilimi boyunca sitokinlerin hareketini analiz edin, örneğin 4, 8, 16, 24 ve 48 saatte.
   NOT: Süpernatantlar doğrudan kullanılabilir veya daha sonra kullanmak üzere dondurulabilir.

2. Standart ve numune hazırlığı

1. Analit standartını, pelete 200 μL tampon veya hücre kültürü ortamı ekleyerek yeniden oluşturun ve hafifçe karıştırın. Altı reaktif tüp hazırlayın ve yeniden oluşturulan standardın 1:5 seyreltme serisini, 3.2 pg/mL veya 0.6 pg/mL'ye kadar (analit tipine bağlı olarak) yapın ve bir boşluk hazırlayın.
2. CAR T eş kültürü süpernatantlarını, örneğin eş kültürden 16 saat veya 24 saat sonra toplayın. İsteğe bağlı olarak, paralel fenotipleme için akış sitometrisi kullanarak CAR T hücrelerini hasat edin.
3. Numuneleri 4 °C'de 10.000 × g ile 10 dakika süreyle santrifüjleyin. Standart eğri aralığına uyacak şekilde süpernatantları saf olarak veya seyreltin.

3. Test iş akışı

1. Yakalama boncuk karışımını tamamen yeniden askıya almak için vortexleyin. 96 kuyuluk filtre plakasının kuyularına 50 μL standart veya numune ile birlikte 20 μL önceden seyreltilmiş boncuk ekleyin.
2. Karanlıkta 450 rpm'de çalkalayın ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin. Kuyuları vakum manifoldu veya santrifüj kullanarak 200 μL tampon ile iki kez yıkayın.
3. 1:50 oranında önceden seyreltilmiş tespit reaktifi 1'i (tambonda) 100 μL ekleyin. Karanlıkta 450 rpm'de çalkalayın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin. İki kez yıkayın.
4. 1:50 oranında önceden seyreltilmiş tespit reaktifi 2'yi (tambonda) 100 μL ekleyin. Karanlıkta 450 rpm'de çalkalayın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Bir kez yıkayın.
5. Alım için, numuneleri tamponun 200 μL'sinde yeniden askıya alın. Test iş akışının bir genel görünümü Şekil 1'de gösterilmiştir.

4. Alım ve veri analizi

1. Verileri, mavi ve kırmızı lazerlerle donatılmış bir akış sitometreyi kullanarak alın (PE, FITC ve APC kanalları gereklidir). MACSQuant akış sitometreleri ile çalışırken, tamamen otomatik kapılama ve veri analizi için Express Mode şablonlarını kullanın.
2. Alternatif olarak, FSC veya MQD veri dosyalarını web tabanlı InspectoR aracına yükleyin, bu araç otomatik kantitatif sitokin ölçümü gerçekleştirir ve kullanılan cihazdan bağımsız olarak hazır-ihraç sonuçları sağlar.
3. FITC ve PE kanalında 12 farklı yakalayan boncuk popülasyonunun uygun şekilde ayrıldığından emin olun.
4. Sitoksin konsantrasyonlarını hesaplamak için standart eğri uygulayın ve sonuçları dışa aktarın ve görselleştirin.
5. MACSQuant akış sitometresinde veri alımı için, yakalanan boncukların vialinin 2D barkodunu kullanın, bu barkod tüm ilgili alım ayarlarını içerir.
   1. Yazılıma giriş yaptıktan sonra, numune rafı olarak MACSPlex Filtre Plakasını seçin ve araç çubuğundaki Barkod düğmesini tıklayarak 2D kod okuyucusunu etkinleştirin.
   2. Viali okuyucuya sunun, kodun yanıp sönen ışığa karşı optimal 0.5-2.5 cm mesafede olduğundan emin olun.
   3. Autolabel sekmesinde, Yakalama Boncukları (MPx Cyt T-NK,h) ve NoLabel'ı atayın. Sitotoksik T/NK hücre standartının seri seyreltmeleri için grup pozisyonlarını tanımlayın ve Ayarlar sekmesinde Express Mode'u seçin ve Tip: Analiz ve Mod: MACSPlex_Standard, gerektiğinde hafif karıştırma uygulayın.
   4. Bilinmeyen numuneler de benzer şekilde atanır, pozisyonları tanımlanır, isteğe bağlı gruplama ve Express Mode, Tip: Analiz ve Mod: MACSPlex_Sample'ı Ayarlar sekmesinde seçin, isteğe bağlı numune kimlikleri ve a

Results

12 çözünür analitleri kodlayan temsili Yakalama boncuk popülasyonlarının tanımlanması

Yakalama boncuk popülasyonları, akış sitometrisinin FITC ve PE kanalları kullanılarak tanımlanmıştır. Bireysel analitler temsil eden farklı boncuk kümeleri, biaksiyel grafiğe göre açıkça çözülmüştür, bunlar arasında IL-10, Granzym B, MCP-1, IL-17A, Perforin, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, IL-21, IL-4 ve GM-CSF bulunmaktadır (Şekil 2). Her bir popülasyon, çok yönlü algılama ve ölçülen sitokinlerin ve etken moleküllerin net ayrımını doğrulayan benzersiz bir floresan imzası sergilemektedir.

Şekil 2: Temsili çok yönlü yakalayan boncuk popülasyonlarının tespiti. Yakalama boncukları, farklı analit-spesifik popülasyonları ayırt etmek için kullanılan doğal floresan yoğunluklarına sahiptir. Dağılım grafiği, FITC (B1) ve PE (B2) kanallarındaki floresan yoğunluğuna göre analit-spesifik sinyallerin ayrımını göstermektedir. Resimde, GM-CSF, Granzym B, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, MCP-1 (CCL2), Perforin ve TNF-α'yi kodlayan 12 Yakalama boncuk popülasyonunun temsili bir profili gösterilmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tümör hücreleri ile eş kültür sonrası CAR T hücrelerinin temsili sitokin konsantrasyon profili

CAR T hücrelerinin tümör hedef hücreleri ile eş kültür edilmesinin ardından sitokin konsantrasyonları, çok yönlü tahlili insan sitotoksisite paneli kullanılarak ölçülmüştür (Şekil 3). CAR T hücreleri, tümör etkileşimine yanıt olarak güçlü aktivasyon ve sitotoksik etken işlevini gösteren yüksek düzeyde Granzym B (49.950,2 pg/mL), IFN-γ (48.367,8 pg/mL), TNF-α (7.055,2 pg/mL) ve GM-CSF (6.653,5 pg/mL) salgılamıştır. IL-2 seviyeleri üst tespit sınırını aşmıştır (>10.000 pg/mL), bu da güçlü çoğalma sinyali ile tutarlıdır. Numune daha fazla seyreltilmemiş veya tekrar ölçülmemiştir. Buna karşılık, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21 ve MCP-1'i içeren düzenleyici veya alternatif yardımcı T hücre yanıtları ile ilişkili sitokinler, düşük veya neredeyse tespit edilemeyen seviyelerde bulunmuştur. Bu sonuçlar, CAR T hücrelerinin çoğunlukla tip 1 (Th1/sitotoksik) bağışıklık yanıtına sahip olduğunu ve bu yanıtın yüksek etken aktivitesi ve sınırlı immünosupresif sitokin üretimi ile karakterize edildiğini göstermektedir.

Şekil 3: Tümör hücreleri ile eş kültür sonrası CAR T hücrelerinin temsili sitokin profili. Mühendislik yapılmış Kimerik Antijen Resepsitörü (CAR) T hücreleri, JeKo-1 tümör hücreleri ile bir gece eş kültür edilmiştir. Hücre kültür süpernatantları, 16 saatlik inkübasyondan sonra hasat edilmiş ve partikülleri çıkarmak için santrifüjlenmiştir. Seyreltilmiş örnekler, çok yönlü tahlili insan sitotoksisite paneli kullanılarak analiz edilmiştir. İki standart eğri çizilmiş ve tüm 12 analit için konsantrasyonlar belirlenmiştir. Akış sitometrisinin Express Modu kullanılarak analiz ve analit-spesifik konsantrasyonların hesaplanması için temsili bir veri çıktısı gösterilmektedir. Çubuk grafiği ve buna eşlik eden tablo, 12 etken molekülün hesaplanmış seviyelerini (pikogram/mililitre) göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Antijen-spesifik stimülasyon sonrası CAR T hücrelerinin sitokin salgılama kinetiği

CAR T hücrelerinin, özantijeni taşıyan (Antijen⁺) veya taşımayan (Antijen⁻) hedef hücrelerle eş kültür edilmesinin ardından sitokin salgısı, çok yönlü tahlili insan sitotoksisite paneli kullanılarak zaman içinde izlenmiştir. CAR T hücreleri, Antigen⁺ hedeflerini tanıyarak hızlı ve güçlü sitokin salgılaması göstermiştir, Antigen⁺ hedeflerinin tanınması sonrasında Granzym B, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF ve IL-2'nin güçlü bir şekilde yükselmesi 8-24 saat içinde gerçekleşmiş ve 48 saatte zirveye ulaşmıştır (Şekil 4). Bu model, antijen bağlanması

Discussion

Multipleks analiz, CAR T hücre eş kültürlerinde çözünür bağışıklık aracı tepkilerini analiz etmek için kullanıldı. Antijen pozitif hedef hücrelerle eş kültürlenen CAR T hücreleri, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, Granzim B ve IL-2 salgılanmasında artış gösterdi ve bu da efektör aktivasyonu ve sitotoksik fonksiyonla tutarlıdır^4,5,8. Buna karşılık, antijen negatif kontroller düşük sitokin üretimi gösterdi ve bu da test edilen koşullar altında analizın antijene özgü tepkileri ayırt etme kabiliyetini gösterdi^5,8. Bu sonuçlar, analizın CAR T hücre işlevselliğini değerlendirmede uygulanabilirliğini desteklemektedir, bu da güçle ilgili analizler, güvenlikle ilgili profilleme ve mekanizmasal araştırmaların kullanımını içerir.

Sabit 12 analit paneli CAR T bağışıklık aktivitesinin geniş bir genel görünümünü sağlasa da, tüm uygulamalarda tam analit aralığını yakalamak pratik olmayabilir. CAR T hücre ürünlerinin analiz doğruluğu veya kalite kontrol (QC) testi gibi odaklanmış iş akışları için, panel azaltılmış bir alt kümeyle (örn. IL-2, IFN-γ ve TNF-α) düşürülebilir, böylece analiz hızlandırılırken fonksiyonel hassasiyet korunur^1,2.

Protokolün kritik aşamaları, CAR T hücre eş kültürünün tasarımını ve uygun örnekleme koşullarının seçimini içerir. Özellikle, eş kültür süresi ve efektör hücre sayısı (E:T oranı) doğrudan sitokin büyüklüğünü belirler ve analiz kurulum sırasında tanımlanmalıdır^5,6. Ayrıca, analit konsantrasyonlarının analizın dinamik aralığı içinde olmasını sağlamak için örnek seyreltmesi ayarlanmalıdır^1,2. Bu nedenle, sorun giderme standart eğri performansını doğrulamaya ve sinyaller nicel aralık dışında kaldığında eş kültür koşullarını veya seyreltme faktörlerini ayarlamaya odaklanmalıdır^1,2.

Geleneksel tek analitler ELISA'lara kıyasla, akış sitometrisi tabanlı multiplex platform, minimal numune hacminden yüksek yoğunluklu, çok analitler veri setleri oluşturur. Tek bir örnekte birden fazla analitin eş zamanlı ölçümünü sağlayarak, multiplexing, toplam reaktif tüketimini azaltabilir, numune verimini artırabilir ve birden fazla tek analitler analizini gerçekleştirmeye göre analiz süresini kısaltabilir^1,2. Otomatik elde etme ve standartlaştırılmış analiz seçenekleri, deneysel veya üretim ortamlarında kullanıcıya bağlı değişkenliği azaltabilir ve tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği destekleyebilir^5,8. Standart ELISA tespit hassasiyeti tipik olarak 16 ila 2000 pg/mL arasındadır (yüksek hassasiyetli kitler daha düşük olabilir)⁷. Bu çalışmada sunulan platformda en düşük tespit edilebilir konsantrasyonlar, en hassas analitler için 0.05 pg/mL'den, daha düşük analiz hassasiyetli olanlar için yaklaşık 93.8 pg/mL'ye kadar değişir. Dahili değerlendirmelerde, ölçülen analitlerin %74'ünden fazlası 5 pg/mL altında tespit limitlerine sahipti ve %38'i 1 pg/mL altında tespit edilebilirdi, bu da sistemin genel hassasiyetini vurgulamaktadır. Multiplex hassasiyeti sitokin başına değişebileceğinden, potansiyel epitop rekabeti önemli bir husus olmaya devam etmektedir. Böylece, analiz her bir analit için yakalama ve tespit için üst üste binmeyen epitoplar kullanır, bu da rekabetle ilgili önyargıyı azaltır ve multiplex koşullarında ölçüm güvenilirliğini artırır.

Multipleks analiz performansı, analiz hassasiyetine ve biyolojik bağlamına bağlı olarak analitlere göre değişebilir ve belirli koşullar altında analit konsantrasyonları tespit sınırının üst sınırına yaklaşabilir ve bu nedenle analiz kurulum sırasında değerlendirilmelidir. Buna karşılık, bazı analitler (bu çalışmada MCP-1 ve IL-4 gibi) deneysel koşullara bağlı olarak tespit edilemeyebilir. Ayrıca, örnek işleme gibi analiz öncesi faktörler sitokin ölçümlerini etkileyebilir ve karşılaştırılabilirliği sağlamak için tutarlı işleme koşulları korunmalıdır.

Genel olarak, bu multiplex yaklaşım, CAR T hücre işlevselliğinin verimli ve kantitatif karakterizasyonunu sağlar. Mevcut çok analitler sitokin tespit platformlarına göre, analiz standart akış sitometrilerle uyumludur ve veri elde etme ve analizi kolaylaştıran bir cihazla ilişkili yazılım aracı içerir. Diğer bağışıklık ortamlarında çok analitler sitokin tespiti kullanılmış olsa da, şu çalışma CAR T hücre işlevsel profillemesine uygulamasını standart bir iş akışı içinde gösterir. Boncuk tabanlı format, tek analitler yöntemlerine kıyasla daha yüksek verimlilik sağlayan birden fazla analitin eş zamanlı

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, human	Miltenyi Biotec	130-125-800	Akım sitometrisi için boncuk bazlı multipl sitokin tayini
MACSPlex InspectoR Tool	Miltenyi Biotec	\	MACSPlex verilerinin otomatik kapsam ve analizi için web tabanlı araç
MACSQuant Analyzer 10 Akım Sitometre	Miltenyi Biotec	130-096-343	Multipl veri ölçümü için akış sitometrisi aracı
MACSQuant Analyzer 16 Akım Sitometre	Miltenyi Biotec	130-109-803	Multipl veri ölçümü için akış sitometrisi aracı
MACSQuant Express Modu	Miltenyi Biotec	\	Otomatik kapsam ve analiz için yazılım
TexMACS Ortamı	Miltenyi Biotec	130-097-196	İnsan ve fare T hücrelerinin kültürü ve genişletilmesi için geliştirilmiş optimize edilmiş serumsuz hücre kültür ortamı