Araştırma makalesi

CAR T Hücrelerinin Fonksiyonel Profillenmesi için Boncuk Tabanlı Çoklu Akış Sitometrisi Testi

DOI:

10.3791/70344

⸱

10 Temmuz 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Miltenyi Biotec, 2Lehrstuhl für Zelluläre Immuntherapie, Medizinische Klinik und Poliklinik II, Universitätsklinikum Würzburg, 3Außenstelle Zelluläre Immuntherapie, Fraunhofer Institut für Zelltherapie und Immunologie (IZI), 4IRCCS Bambino Gesù Children's Hospital

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücresinden türetilen süpernatantlardan 12 sitokin ve efektör molekülün nicelendirilmesini sağlayan çoklu boncuk tabanlı akış sitometri testini tanıtıyor; böylece küçük örnek hacimleriyle mühendislik edilmiş T hücresi işlevselliğinin hızlı ve tekrarlanabilir analizini mümkün kılmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CAR T hücrelerinin profillenmesi, heterojenlikleri, karmaşık bağışıklık yanıtları ve sınırlı örnek bulunabilirlikleri nedeniyle zorluklar taşır. Multiplex testler, sitokinler, kemokinler ve sitotoksik aracılar dahil olmak üzere geniş bir efektör molekül yelpazesinin eşzamanlı olarak tespit edilmesini sağlayarak fonksiyonel değerlendirmeyi mümkün kılar. Burada, insan kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücreleri tarafından efektör molekül salgılanmasının analizi için akış sitometrisiyle uyumlu boncuk tabanlı bir çoklu analiz tanımlıyoruz. CAR T hücresi süpernatantları, çoklu floresans kodlu popülasyonları içeren ve analit-spesifik antikorlarla birleşen yakalama boncuklarının karışımıyla kuluçka edilir. Bu boncuklar, örnekteki çözünür hedeflere bağlanır ve ardından etiketlenmiş tespit antikorları kullanılarak tespit edilen boncuk-analiz kompleksleri oluşturur. Test, interferon (IFN)-γ, interleukin (IL)-2, tümör nekroz faktörü (TNF)-α, IL-6, IL-10, granulosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ve Granzyme B gibi bir bağışıklık aracı panelini içermektedir. Önceden tanımlanmış standartların kullanımı, tek bir örnekten birden fazla analizin nicel ölçülmesine olanak tanır. Veri toplama ve analiz, enstrümanla ilişkili veya web tabanlı yazılım araçları tarafından sağlanan otomatik kapı yaklaşımları kullanılarak gerçekleştirilebilir ve veri işlemeyi kolaylaştırabilir. Sonuç olarak, sunulan çoklu analiz CAR T hücresi işlevselliğinin çok parametrik analizini mümkün kılar ve araştırma, kalite kontrol testleri, mekanik çalışmalar ve fonksiyonel karakterizasyon gibi bağlamlarda uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fonksiyonel karakterizasyon, Kimerik Antijen Reseptörü (CAR) T hücresi testlerinde bu tedavilerin potensiyesi, güvenliği ve etki mekanizmalarına dair içgörüler sağladığı için önemlidir. Sitokin ve sitotoksik arabulucu imzalarını anlamak, terapötik etkinliğin ve olası yan etkilerin değerlendirilmesine yardımcı olur ve güvenli ve etkili tedavilerin geliştirilmesini sağlar. Enzim bağlantılı immünosorbent testler (ELISA) gibi geleneksel tekli analizler, yüksek örnek hacmleri, uzun işlem süreleri ve her analit için ayrı denemeler gerektirmek, ayrıca bireysel örneklerde sınırlı bir dinamik aralıksunmak gibi sınırlamalara sahiptir 1,2. Buna karşılık, çoklu boncuk tabanlı testler, birden fazla çözünür aracının eşzamanlı olarak tespit edilmesini sağlar; bu da işlem süresini ve örnek gereksinimlerini azaltırken, dinamik aralığı 1,2'yi artırır. Bu verimlilik ve analiz derinliği, çoklu testleri CAR T hücresi araştırma ve geliştirme için değerli araçlaryapar 3,4,5.

Bu çalışmada sunulan çoklu test, floressein izotiosiyanat (FITC) ve fikoeritrin (PE) kanallarında belirgin floresans profilleri sergileyen ve çözünür analitlere karşı spesifik antikorlarla kaplanmış yakalama boncuklarını kullanır. Bir numuneyle kuluçka sırasında, bu boncuklar çözelti hedef analitlerini seçici olarak bağlar. Analit yakalamasının ardından, tespit antikorları eklenerek analit-spesifik sandviç kompleksleri oluşturulur. Bu antikorlar ya doğrudan allofikosiyanin (APC) (doğrudan tespit) ya da biotin (dolaylı tespit) ile konjuge edilir. Dolaylı tespit için, APC ile konjuge edilmiş antibiyotin antikoru ile sonraki bir kuluçka gereklidir (Şekil 1). Ortaya çıkan kompleksler – yakalama boncukları, analitler ve algılama antikorlarından oluşuyor – akış sitometrisiyle analiz edilip analit konsantrasyonları nicelendirilir. Çoklu test, analitlere özgü standarteğriler oluşturmak için kullanılan önceden tanımlanmış standartları içeren plaka tabanlı bir teknolojidir 1,2.

figure-introduction-1
Şekil 1: Sitokin teknolojisi prensibi ve analiz iş akışı. Test, 12 floresans kodlu Capture boncuk popülasyonu ve analit spesifik antikorlara dayanmaktadır. Örnek kuluçkası sırasında, spesifik algılama antikorları kullanılarak akış sitometrisi yoluyla tespit edilebilen boncuk-analiz kompleksleri oluşur. Analiz iş akışı, 1) analiz plakasında analit standartlarının ve ilgi çekici örneklerin hazırlanmasını, 2) Yakalama boncuklarıyla kuluçka, 3) biotin etiketli anti-analit antikorlarıyla sandviç kompleksleri oluşturmak için kuluçka, 4) APC etiketli antibiyotin antikorlarıyla kuluçka, 5) ölçüm için tampon içinde yeniden süspansiyon ve 6) örnek toplama işlemlerini içerir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışmada tanımlanan çoklu analiz, mavi (örneğin, 488 nm; FITC ve PE kanalları) ile kırmızı bir lazer (örneğin, 635 nm; APC kanalı). Akış sitometreleri araştırma laboratuvarlarında, klinik ortamlarda ve kalite kontrol ortamlarında yaygın olarak bulunduğundan, bu uyumluluk, ek özel enstrümantasyon gerektirmeden uygulamayı kolaylaştırır5. CAR T hücresi işlevsellik testi bağlamında, bu yaklaşım, yaygın olarak mevcut analitik iş akışları içinde fonksiyonel yanıtların çok parametrik değerlendirmesinimümkün kılar 6. Bu test, GM-CSF, Granzyme B, interferon (IFN)-γ, interleukin (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, monosit kemoattraksiyon proteini-1 (MCP-1), Perforin ve tümör nekroz faktörü (TNF)-α (insan sitotoksisite paneli) dahil olmak üzere anahtar analitlerin eşzamanlı nicelendirilmesini sağlayarak CAR T hücresi araştırmaları için önemli avantajlar sağlar. Bu aracılar, CAR T hücresi aktivasyonunu, efektör fonksiyonunu ve güvenlikle ilgili sitokinsalınımını 4,5,7,8'i anlamak için kritik öneme sahiptir.

Analiz iş akışı, enstrümantla ilişkili yazılım kullanılarak otomatik kapı ve veri analizi seçenekleri ile enstrümandan bağımsız, web tabanlı analiz araçlarıiçerir 5. Bu özellikler, manuel müdahalenin boyutunu azaltarak CAR T hücresi efektör molekül profilleme verilerinin daha verimli işlenmesini destekler. Otomatik analizin kullanımı, veri işlemede tutarlılığın artmasına ve fonksiyonel okumaların daha verimli değerlendirilmesinikolaylaştırabilir 8.

Mevcut protokol, CAR T hücresi bağışıklık aracı profili için tekrarlanabilir, ölçeklenebilir bir çoklu yöntem sunmaktadır. Tek bir örneklemde 12 farklı analit ölçüyerek, bu yaklaşım özellikle mekanik araştırmalar, erken aşama araştırmalar ve eşlik çalışmaları için geçerlidir. CAR T hücre tedavisinin sonraki aşamalarında, özellikle ilaç salınım testi için düzenlenmiş, zamana duyarlı kalite kontrol (QC) ortamında ölçülen sitokinlerin sayısının azaltılması faydalı olabilir. Bu amaçla, sunulan panelden 1 ila 7 sitokin, mühendislik edilmiş T hücresi analitiği için doğrulanabilecek özel bir sitokin testi tasarlamak üzere birleştirilebilir. Bu durum, tanımlanan protokolü, CAR T hücre tedavisinin erken ve geç aşamalarında hem araştırma hem de kalite kontrol ortamlarında çeşitli uygulamalar için ideal bir şekildeuygun hale getirir 3,4,5,9.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm insan örnekleri, yazılı bilgilendirilmiş onay alındıktan sonra sağlıklı ve anonim gönüllülerden toplanmıştır. Tüm prosedürler Ärztekammer Nordrhein Etik Komitesi (#2020272) tarafından onaylanmış ve gerekli etik ve biyogüvenlik yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. CAR T hücresi ortak kültürü

  1. Benzer antijen, örneğin, antijen sunan tümör hücreleri, örneğin, 2.5:1 oranında (efektör: hedef hücreler) yokluğunda ve varlığında mühendislik ürünü insan CAR T hücrelerinden oluşan bir hücre kültürü hazırlamak.
  2. Süpernatant toplama için bir veya birden fazla zaman noktası tanımlanarak salgılanan sitokinleri bir kez analiz etmek veya sitokin kinetiklerini belirli bir zaman diliminde, örneğin 4, 8, 16, 24 ve 48 saatte tanımlamak.
    NOT: Süpernatantlar doğrudan kullanılabilir veya daha sonra kullanılmak üzere dondurulabilir.

2. Standart ve örnek hazırlığı

  1. Analit standardını 200 μL tampon veya hücre kültürü ortamı ekleyerek pelete yeniden yapılandırın ve nazikçe karıştırın. Altı reaktif tüpü hazırlayın ve yeniden oluşturulmuş standardın 1:5 seyreltme serisini uygulayın; bu seri 3,2 pg/mL veya 0,6 pg/mL (analite bağlı olarak) indirin, ardından bir blank hazırlanır.
  2. Örneğin, 16 saat veya 24 saat sonra, CAR T ortak kültür süpernatantlarını toplayın. İsteğe göre, akış sitometrisi kullanarak paralel fenotipleme için CAR T hücreleri toplanabilir.
  3. Örnekleri 10.000 × g sıcaklığında 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjlendirin. Üst yüzeyleri düzenli kullanın veya standart eğri aralığına uyacak şekilde seyreltin.

3. Test iş akışı

  1. Yakalama boncuk karışımını iyice tekrar süzülmek için vortex yapın. 96 kuyuyuk filtre plakasının yuvalarına 50 μL standart veya örnek ile birlikte 20 μL önceden seyreltilmiş boncuk ekleyin.
  2. Oda sıcaklığında 2 saat kuluçka, 450 rpm'de sarsarak, karanlıkta kullanın. Kuyular 200 μL tampon ile vakum manifold veya santrifüj kullanılarak iki kez yıkayın.
  3. 100 μL 1:50 önceden seyreltilmiş algılama reaktifi 1 (tamponda) ekleyin. Oda sıcaklığında, 450 rpm'de sarsarak, karanlıkta 1 saat kuluçka yapın. İki kez yıkayın.
  4. 100 μL 1:50 önceden seyreltilmiş algılama reaktifi 2 (tamponda) ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka, 450 rpm'de sallayarak karanlıkta kullanın. Bir kez yıkan.
  5. Alım için, örnekleri 200 μL tamponla yeniden askıya alın. Test iş akışının genel bir görünümü Şekil 1'de gösterilmiştir.

4. Edinim ve veri analizi

  1. Mavi ve kırmızı lazerlerle donatılmış bir akış sitometresinde veri edinin (PE, FITC ve APC kanalları gereklidir). MACSQuant akış sitometreleriyle çalışırken, tam otomatik kapı ve veri analizi için Express Mode şablonlarını kullanın.
  2. Alternatif olarak, FSC veya MQD veri dosyalarını web tabanlı InspectoR aracına yükleyebilirsiniz; bu araç otomatik nicel sitokin ölçümü gerçekleştirir ve kullanılan cihazdan bağımsız olarak ihracata hazır sonuçlar sağlar.
  3. FITC ve PE kanalındaki 12 farklı yakalama boncuk popülasyonunun doğru şekilde ayrıldığını mutlaka doğrulayın.
  4. Sitokin konsantrasyonlarını hesaplamak için standart eğriyi uygulayın, sonuçları dışa aktarıp görselleştirin.
  5. MACSQuant akış sitometresinde veri toplamak için, tüm ilgili alım ayarlarını içeren yakalama boncuk şişesinin 2D barkodu kullanılır.
    1. Yazılıma giriş yaptıktan sonra, örnek rafı olarak MACSPlex Filtre Plakasını seçin ve araç çubuğundaki Barkod butonuna tıklayarak 2D kod okuyucuyu etkinleştirin.
    2. Şişeyi okuyucuya sunarak kodun yanıp sönen ışığa doğru 0,5–2,5 cm optimal mesafede olmasını sağlar.
    3. Otomatik etiketleme sekmesinde Capture Beads (MPx Cyt T-NK,h) ve NoLabel'ı atayın. Sitotoksik T/NK hücre standardının seri seyreltmeleri için, grup pozisyonlarını tanımlayın ve Ayarlar sekmesinde Type: Analysis ve Mode: MACSPlex_Standard ile Express Mode'u seçin, gerektiğinde nazik karıştırma uygulanır.
    4. Bilinmeyen örnekler de benzer şekilde atanır; konumları tanımlanır, isteğe bağlı gruplanır ve Ayarlar sekmesinde Express Mode, Type: Analysis ve Mode: MACSPlex_Sample seçimleri bulunur; isteğe bağlı örnek kimlikleri ve açıklamalar da dahildir.
    5. Deneme tablosunda rack tanımlarının doğru olduğundan emin olun, filtre plakası kuyruklarında doğru sıvı seviyelerinin olduğundan ve ardından ölçüme başlayın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

12 çözünür analit kodlayan temsil Capture boncuk popülasyonlarının tanımlanması

Yakalama boncuk popülasyonları, akış sitometresinin FITC ve PE kanalları kullanılarak tanımlandı. Bireysel analitleri temsil eden farklı boncuk kümeleri, IL-10, Granzyme B, MCP-1, IL-17A, Perforin, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, IL-21, IL-4 ve GM-CSF gibi iki eksenli grafikte açıkça çözülmüştür. Her popülasyon, ölçülen sitokinler ve efektör moleküllerin başarılı çoklu algılanmasını ve net bir farklılaşmasını doğrulayan benzersiz bir floresans imzası sergilemiştir.

figure-results-1
Şekil 2: Temsil eden çoklu kaplayan boncuk popülasyonlarının tespiti. Yakalama boncukları, farklı analit spesifik popülasyonları ayırt etmek için kullanılabilecek doğal floresans yoğunluklarına sahiptir. Saçılım grafiki, FITC (B1) ve PE (B2) kanallarındaki floresans yoğunluğuna dayalı analiz-spesifik sinyallerin ayrılmasını gösterir. Görsel, GM-CSF, Granzyme B, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, MCP-1 (CCL2), Perforin ve TNF-α kodlayan 12 Capture boncuk popülasyonunun temsilci profilini göstermektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tümör hücreleriyle birlikte kültür yapıldıktan sonra CAR T hücrelerinin temsilci sitokin konsantrasyon profili

CAR T hücrelerinin tümör hedef hücreleriyle birlikte kültürlenmesinin ardından, sitokin konsantrasyonları çoklu testin insan sitotoksisite paneli kullanılarak nicelendirilmiştir (Şekil 3). CAR T hücreleri, yüksek seviyelerde Granzyme B (49.950.2 pg/mL), IFN-γ (48.367.8 pg/mL), TNF-α (7.055.2 pg/mL) ve GM-CSF (6.653.5 pg/mL) salgılamış; bu da tümör etkileşimine yanıt olarak güçlü aktivasyon ve sitotoksik efektör fonksiyonunu göstermektedir. IL-2 seviyeleri, güçlü proliferatif sinyal ile uyumlu olan üst tespit sınırını (>10.000 pg/mL) aşmıştır. Örneklem daha fazla seyreltilmedi veya yeniden ölçülmedi. Buna karşılık, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21 ve MCP-1 dahil olmak üzere düzenleyici veya alternatif yardımcı T hücre yanıtlarıyla ilişkili sitokinler düşük veya neredeyse tespit edilemez seviyelerde bulunuyordu. Bu sonuçlar, CAR T hücrelerinin ağırlıklı olarak tip 1 (Th1/sitotoksik) bir bağışıklık yanıtı oluşturduğunu ve yüksek efektör aktivite ile sınırlı immünosupresif sitokin üretimiyle karakterize olduğunu göstermektedir.

figure-results-2
Şekil 3: CAR T hücrelerinin tümör hücreleriyle birlikte kültürlendikten sonra temsil sitokin profili. Mühendislik Kimerik Antijen Reseptörü (CAR) T hücreleri, JeKo-1 tümör hücreleriyle gece boyunca birlikte yetiştirildi. Hücre kültürü süpernatantları, 16 saatlik kuluçkadan sonra toplanıp partiküllerin giderilmesi için santrifüjlenerek kullanıldı. Sulandırılmış örnekler, çoklu testin insan sitotoksisite paneli kullanılarak analiz edildi. İki standart eğri yapıldı ve tüm 12 analitin konsantrasyonları belirlendi. Akış sitometresinin Ekspres Modu kullanılarak analiz ve hesap olarak analiz edilen analiz ve hesap verisi için temsilli bir veri çıktısı gösterilmektedir. Bar grafik ve eşlik eden tablo, 12 efektör molekülün hesaplanan seviyelerini (pikogram/mililitre) gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

CAR T hücrelerinin antijen-spesifik stimülasyon üzerine sitokin salgısı kinetiği

CAR T hücrelerinin hedef hücrelerin (Antijen⁺) veya eksik (Antijen⁻) ilişkili antijenle birlikte kültürlenmesinin ardından, sitokin salgılanması multipleks testinin insan sitotoksisite paneli kullanılarak zaman içinde izlendi. CAR T hücreleri, Antijen⁺ hedeflerinin tanınmasıyla hızlı ve güçlü sitokin salınımı sergilemiş, Granzyme B, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF ve IL-2'nin 8–24 saat içinde güçlü bir şekilde yukarı regülasyonu göstermiş ve 48 saat içinde zirve seviyelere ulaşmıştır (Şekil 4). Bu desen, antijen etkileşiminden sonra güçlü aktivasyon ve sitotoksik efektör fonksiyonunu gösterir. IL-6, IL-17A ve IL-21'de orta düzeyde artışlar gözlemlenmiş, IL-4, IL-10, MCP-1 ve Perforin ise düşük veya orta düzeyde yükselmiştir. Buna karşılık, Antijen⁻ hedefleriyle birlikte kültürlerde tüm analitlerde minimum sitokin indüksiyonu görüldü (Şekil 4). Bu veriler birlikte, CAR T hücresi aktivasyonu ve efektör sitokin üretiminin özellikle antijen tanıma yanıtında gerçekleştiğini ve zamanla yoğunlaştığını göstermektedir.

figure-results-3
Şekil 4: Antijen-pozitif veya antijen negatif hedef hücrelerle birlikte kültürlenen CAR T hücrelerinin efektör molekül salgılanma kinetiği Mühendislik Kimerik Antijen Reseptörü (CAR) T hücreleri, 4, 8, 16, 24 ve 48 saat boyunca CAR T hücresi antijenini eksprese eden (Antijen⁺) veya eksik (Antijen⁻) hedef hücrelerle birlikte kültürlendi. Her zaman noktasında, kültür süpernatanları toplandı ve çoklu analizin insan sitotoksisite paneli kullanılarak analiz edildi; böylece zaman içinde çözünür efektör analitlerin geniş bir paneli nicelendirildi. 12 analit için sitokin kinetikleri gösterilmiştir (pikogram/mililitre). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çoklu test, CAR T hücresi ko-kültürlerinde çözünür bağışıklık aracı yanıtlarının profillenmesinde kullanıldı. Antijen pozitif hedef hücrelerle birlikte kültürlenen CAR T hücreleri, efektör aktivasyonu ve sitotoksik fonksiyon 4,5,8 ile uyumlu olarak IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, Granzyme B ve IL-2 salgılanmasının arttığını gösterdi. Buna karşılık, antijen-negatif kontroller düşük sitokin üretimi gösterdi ve testin test edilen koşullar altında antijen-spesifik yanıtları ayırt etmeyeteneğini gösterdi 5,8. Bu sonuçlar, CAR T hücresi işlevselliğinin değerlendirilmesini, potensi ile ilgili analizler, güvenlikle ilgili profilleme ve mekanik araştırmalar dahil olmak üzere değerlendirme testinin uygulanabilirliğini desteklemektedir.

Sabit 12-analit paneli, CAR T bağışıklık aktivitesinin geniş bir genel görünümünü sunsa da, tüm uygulamalarda tüm analit yelpazesini yakalamak pratik olmayabilir. CAR T hücresi ürünlerinin analiz doğrulaması veya kalite kontrolü (QC) testi gibi odaklı iş akışları için, panel daha azaltılmış bir alt kümeye (örneğin IL-2, IFN-γ ve TNF-α) küçültülerek analizi kolaylaştırırken fonksiyonelduyarlılık 1,2 korunur.

Protokolteki kritik adımlar arasında CAR T hücresi ortak kültürünün tasarımı ve örnekleme koşullarının uygun seçimi yer alır. Özellikle, ortak kültür süresi ve efektör hücre sayısı (E:T oranı) doğrudan sitokin büyüklüğünü belirler ve testkurulumu 5,6 sırasında tanımlanmalıdır. Ayrıca, örnek seyreltme, analiz konsantrasyonlarının testin dinamikaralığı 1,2 içinde olmasını sağlamak için ayarlanmalıdır. Bu nedenle sorun giderme çalışması, standart eğri performansını doğrulamaya ve sinyaller ölçülebilir 1,2 aralığının dışına çıkarsa ortak kültür koşullarını veya seyreltme faktörlerini ayarlamaya odaklanmalıdır.

Geleneksel tek plex ELISA'larla karşılaştırıldığında, akış sitometrisi tabanlı çoklu platform, minimum örnek hacimlerinden yüksek yoğunluklu, çok analizli veri setleri üretir. Tek bir örnek içinde birden fazla analizin eşzamanlı ölçümünü mümkün kılarak, çoklu analiz 1,2 ile karşılaştırıldığında genel reaktif tüketimini azaltabilir, örnek verimliliğini artırabilir ve test süresini kısaltabilir. Otomatik edinim ve standartlaştırılmış analiz seçenekleri, kullanıcıya bağlı değişkenliği potansiyel olarak azaltabilir ve deneysel veya üretim ortamlarında tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirliğidestekleyebilir 5,8. Standart ELISA algılama hassasiyeti genellikle 16 ile 2000 pg/mL arasında değişir (yüksek hassasiyetli kitler için daha düşük olabilir)7. Bu çalışmada sunulan platformda, en düşük tespit edilebilir konsantrasyonlar en hassas analitler için 0,05 pg/mL'den, doğası gereği daha düşük analiz hassasiyetine sahip olanlarda yaklaşık 93,8 pg/mL'ye kadar değişmektedir. İç değerlendirmelerde, ölçülen analizlerin %74'ünden fazlası 5 pg/mL'nin altında tespit sınırları gösterdi ve %38'i 1 pg/mL'nin altında tespit edilebilirdi; bu da sistemin genel hassasiyetini vurguladı. Çoklu hassasiyet sitokine göre değişebildiğinden, potansiyel epitop rekabeti önemli bir faktör olarak kalmaktadır. Bu tür bir paraziti en aza indirmek için, test, her analitin yakalanması ve tespiti için örtüşmeyen epitoplar kullanır; böylece rekabetle ilgili önyargı azalır ve çoklanan koşullarda ölçüm güvenilirliğini artırır.

Multiplex test performansı, analiz hassasiyeti ve biyolojik bağlama bağlı olarak analitler arasında değişebilir ve belirli koşullar altında analit konsantrasyonları tespit sınırının üst sınırına yaklaşabilir ve bu nedenle analiz kurulumu sırasında değerlendirilmelidir. Buna karşılık, bazı analitler (örneğin, bu çalışmada MCP-1 ve IL-4) deneysel koşullara bağlı olarak tespit edilemez kalabilir. Ayrıca, örnek işleme gibi analiz öncesi faktörler sitokin ölçümlerini etkileyebilir ve karşılaştırılabilirliği sağlamak için tutarlı işleme koşulları sağlanmalıdır.

Genel olarak, bu çoklu yaklaşım CAR T hücresi fonksiyonelliğinin verimli ve nicel karakterizasyonunu sağlar. Mevcut çoğu çoklu sitokin tespit platformlarına kıyasla, test standart akış sitometreleriyle uyumludur ve veri toplama ve analizini kolaylaştıran enstrümantla ilişkili bir yazılım aracı içerir. Multiks sitokin tespiti diğer bağışıklık ortamlarında da kullanılmış olsa da, mevcut çalışmalar standart bir iş akışı içinde CAR T hücresi fonksiyonel profillemesinde uygulanmasını göstermektedir. Boncuk tabanlı format, birden fazla analizin eşzamanlı olarak tespit edilmesini sağlar ve tekli yöntemlere kıyasla daha yüksek veri verimliliğini destekler. Potansiyel uygulamalar arasında, ilaç ürününün fonksiyonel değerlendirmesi, örneğin CAR bağlayıcı değerlendirmesi, vektör optimizasyonu ve süreç geliştirme yer alır. Testin ölçeklenebilirliği ve otomatik analiz yetenekleri, CAR T hücresi davranışını ve işlevselliğini anlamaya yönelik potensi testler, güvenlik profilleme ve mekanik çalışmaları da destekler 5,7,8.

Sitokin salgılanma profilleri, CAR T hücresi aktivasyonu ve fonksiyonel potensi in vitro hakkında değerli bilgiler sağlasa da, hastalarda terapötik etkinliği belirleyen karmaşık biyolojiyi tam olarak kopyalayamazlar. Tümör mikro ortamı, antijen yoğunluğu, bağışıklık regülasyonu ve in vivo kalıcılık gibi faktörler, kontrollü testlerdeölçülenemeyecek kadar CAR T hücre performansını etkiler 6,8,10. Buna rağmen, çoklu sitokin profilleme gibi sağlam ve standart fonksiyonel testlerin oluşturulması, ilaç ürünü 3,4'ün fonksiyonel karakterizasyonuna doğru önemli bir adımdır. Sitokin desenleri sadece CAR T hücresi aktivitesinin göstergesi olmakla kalmaz, aynı zamanda sitokin salınım salgılama sendromu (CRS) ve bağışıklık efektör hücre ilişkili nörotoksisite sendromu (ICANS) gibi toksisite fenomenleriyle de yakından ilişkilidir.3,6,7. Şu anda, ölçüm yöntemleri ve raporlamadaki değişkenlik, çapraz deneme karşılaştırılabilirliğini sınırlamaktadır ve standartlaştırılmış, tekrarlanabilir bağışıklık aracıprofilleme 1,2,3 gerekliliğini vurgulamaktadır. Analitik teknolojiler ve klinik veri setleri ilerlemeye devam ettikçe, nihai amaç, hem terapötik potansiyeli hem de hasta güvenliğini güvenilir şekilde yansıtan öngörücü salgı imzalarını tanımlamak, preklinik potensi testler ile klinik etkinlik arasındaki boşluğu kapatmaktır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.L. ve M.H., patent başvurusu WO2021/058811A1'de mucit olarak listelenmiştir. M.H., patent başvurularında mucit olarak listelenmiştir ve CAR T teknolojileriyle ilgili patentler verilmiş ve Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi, Seattle, WA ile Almanya'nın Würzburg Üniversitesi tarafından başvurulmuştur. M.H., Almanya'nın Würzburg kentindeki T-CURX GmbH'nin kurucu ortağı ve hisse sahibidir. M.H. Celgene/BMS, Janssen, Kite/Gilead tarafından onurlandırıldı. J.J, A.R. ve C.E., Miltenyi Biotec çalışanlarıdır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Yenilikçi İlaçlar Girişimi 2 Ortak Girişimi tarafından 945393 numaralı T2EVOLVE hibe anlaşması kapsamında finanse edilmiştir. Bu Ortak Girişim, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı, Avrupa İlaç Endüstrileri ve Dernekleri Federasyonu (EFPIA) ve Avrupa Hematoloji Derneği (EHA) (M.H., C.Q., M.L.), ERA-NET TRANSCAN-3 (EK ortak fonlu çağrı 2021, SmartCAR-T M.H. ve M.L.'ye), Wilhelm-Sander-Stiftung (M.L.'ye hibe numarası 2022.134.1), destek almaktadır. Paula & Rodger Riney Vakfı (M.H. ve M.L.'ye), IZKF Würzburg (S-511, C-543 M.L.'ye), Alman Araştırma Vakfı (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG, TRR 221 (alt proje A03 ve A06 M.H. ve M.L.'ye); SFB-TRR 338/3 2026–452881907 (alt projeler A02 M.H. ve C04 M.L.) ve CRC1525 (M.L.'ye tohum hibesi), Bavyera Kanser Araştırma Merkezi (BZKF; TANGO M.H. ve M.L.'ye), Novartis tarafından INCA Ödülü (M.L.'ye)

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, humanMiltenyi Biotec130-125-800Akış sitometrisi için boncuk tabanlı multipl sitokin analizi
MACSPlex InspectoR ToolMiltenyi Biotec\MACSPlex verilerinin otomatik kapılama ve analizi için web tabanlı araç
MACSQuant Analyzer 10 Akış SitometrisiMiltenyi Biotec130-096-343Multipl veri ölçümünün akış sitometrisi cihazı
MACSQuant Analyzer 16 Akış SitometrisiMiltenyi Biotec130-109-803Multipl veri ölçümünün akış sitometrisi cihazı
MACSQuant Express ModuMiltenyi Biotec\Otomatik kapılama ve analiz için yazılım
TexMACS OrtamıMiltenyi Biotec130-097-196İnsan ve fare T hücrelerinin kültürü ve çoğaltılması için geliştirilmiş optimize edilmiş serumsuz hücre kültürü ortamı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Biery, D. N., Turicek, D. P., Diorio, C., Schroeder, B. A., Shah, N. N. Need for standardization of cytokine profiling in CAR T cell therapy. Mol Ther. 32 (9), 2979-2983 (2024).
  2. Boulch, M., et al. A cross-talk between CAR T cell subsets and the tumor microenvironment is essential for sustained cytotoxic activity. Sci Immunol. 6 (57), eabd4344(2021).
  3. Teachey, D. T., et al. Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discov. 6 (6), 664-679 (2016).
  4. Liu, C., et al. Cytokines: From clinical significance to quantification. Adv Sci. 8 (15), 2004433(2021).
  5. Leng, S. X., et al. ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (8), 879-884 (2008).
  6. Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls. Proteomics Clin Appl. 9 (3–4), 406-422 (2015).
  7. Wang, X., et al. Artificial targets: a versatile cell‑free platform to characterize CAR T cell function in vitro. Front Immunol. 15, 1254162(2024).
  8. Ren, Y., et al. An in vitro co‑culture model with CAR‑T cells, antigen‑presenting cells, and tumor cells to evaluate CAR‑T cell‑induced cytokine release syndrome. Front Cell Infect Microbiol. 16, 1721114(2026).
  9. Lock, D., et al. Automated, scaled, transposon-based production of CAR T cells. J Immunother Cancer. 10 (9), e005189(2022).
  10. Bethke, M., et al. Identification and characterization of fully human FOLR1-targeting CAR T cells for the treatment of ovarian cancer. Cells. 13 (22), 1880(2024).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Immunology and InfectionChimeric Antigen Receptor T Cell TherapyCytokinesChemokinesGranzyme BImmunophenotypingMultiplex AssayHuman
Video yakında

İlgili makaleler