Prostatit Tedavisinde Ermiao Tozunun Mekanizması: Ağ Farmakolojisi ve Deneysel Doğrulamaya Dayalı Bir Çalışma

Özet

Ağ farmakolojisi yaklaşımı kullanarak, bu çalışma Ermiao Powder'ın prostatite karşı terapötik etkilerini inflamatuar faktörleri ve ilişkili sinyal yollarını inhibe ederek uyguladığını ortaya koydu. Sonraki in vitro deneyler, onun sulu ekstraktının LPS kaynaklı prostat epitel hücreleri modelinde önemli inflamatuar sitokinlerin ifadesini önemli ölçüde bastırdığını göstermiştir.

Özet

Bu protokol, prostatit tedavisinde Ermiao Tozu (EMP) etki mekanizmasını incelemek için birleşik ağ farmakolojisi ve deneysel doğrulama yaklaşımı sunmaktadır. İş akışı aşamalı bir tasarım izler: (i) aktif bileşiklerin ve hedeflerin veritabanı odaklı taraması, (ii) etkileşim ağlarının inşası ve analizi, ve (iii) in vitro deneysel doğrulama. İlk olarak, EMP'nin aktif bileşenleri ve ilgili hedefleri TCMSP veritabanından alındı, prostatitle ilgili hedefler ise GeneCards veritabanından alındı. EMP hedefleri ile hastalık hedeflerinin kesişimi, temel terapötik hedeflerin belirlenmesinde kullanıldı. İkinci olarak, Cytoscape kullanılarak "İlaç–Aktif Madde–Hedef–Hastalık" ağı oluşturuldu. Ana hedefler üzerinde protein-protein etkileşimi (PPI) analizi ve Kyoto genler ve genomlar ansiklopedisi (KEGG) yol zenginleştirmesi yapıldı; bu da IL6 ve TNF gibi inflamatuar faktörlerin ana hedefler olarak kullanıldığını, PI3K/AKT ve MAPK gibi yolların da önemli ölçüde zenginleştiğini ortaya koydu. Son olarak, prostat epitel hücrelerinin LPS indükleyen inflamatuar modeli kullanılarak in vitro doğrulama yapıldı. EMP ile tedavi, LPS ile tedavi edilen gruba kıyasla pro-inflamatuar faktörler IL-6 ve TNF-α salınımını anlamlı şekilde azalttı (p < 0.05), bu da EMP'nin anti-enflamatuar etkinliğini doğruladı. Bu bütünleşik yaklaşım, diğer çok bileşenli terapötik sistemleri incelemek için uyarlanabilecek tekrarlanabilir bir çerçeve sağlar. Sonuç olarak, bu çalışma EMP'nin prostatit karşıtı etkilerini çok bileşenli, çok hedefli ve çok yollu bir mekanizma aracılığıyla gösterdiğini, bu mekanizma inflamatuar yanıtların bastırılmasıyla yakından ilişkili olduğunu ve böylece klinik uygulaması için bilimsel bir temel sağladığını ön planda açıklamaktadır.

Giriş

Prostatit, özellikle kronik bakteriyel olmayan prostatit, karmaşık etiyoloji ve son derece etkili tedavilerin eksikliğiyle karakterize edilen yaygın bir ürolojik bozukluktur ve hastaların yaşam kalitesine önemli bir yük^{oluşturur 1,2,3}. Prostatitin mevcut klinik yönetimi, antibiyotikler, α-reseptör blokerleri ve non-steroid anti-inflamatuar ilaçlar ^4,5,6 dahil olmak üzere entegre bir yaklaşım kullanmaktadır. Başlıca zorluklar arasında, etiyolojiye özgü tedavilerin olmaması ve psikolojik faktörler ile fiziksel semptomlar arasındaki karmaşık etkileşim yer alır; bunlar birlikte tatmin edici olmayan tedavi sonuçlarına ve sık^{tekrara katkıda bulunur 7}. Son yıllarda, akupunktur ve bitkisel tıp gibi bütünleştirici tıp yaklaşımları prostatit yönetiminde yaygın olarak uygulanmış ve umut vadeden etkililik göstermiştir. Bu terapötik yaklaşımların güvenliği ve etkinliği, yüksek kaliteli araştırma^{kanıtları serisiyle doğrulanmıştır} 8,9,10,11,12.

Bu bağlamda, anti-inflamatuar ve detoksifleyici özellikleriyle bilinen Ermiao Tozu (EMP) gibi geleneksel Çin tıbbı (TCM) formülasyonları, umut verici alternatif bir tedavi yaklaşımı^sunar 13,14,15. Ancak, EMP'nin prostatite karşı etkinliğinin altında yatan kesin farmakolojik mekanizmalar, esas olarak çok bileşenli doğası nedeniyle tam olarak açıklanmamıştır. Ağ farmakolojisinin ortaya çıkışı, TCM^formülleri 16,17'nin karmaşık "çok bileşenli, çok hedefli, çok yollu" eylem biçimini çözmek için güçlü bir araç sağlar. Stratejimiz, EMP'nin aktif bileşenlerini ve potansiyel hedeflerini belirlemeyi, ardından ana hedefleri ve yolları belirlemek için ağ analizini içeriyordu. Sonraki deneyler, anti-inflamatuar etkileri ve temel mekanizmaları biyolojik olarak doğrulamak amacıyla gerçekleştirildi ve EMP'nin uygulanması için bilimsel bir temel oluşturmayı amaçladı. Bu çalışma, çok bileşenli tedavilerin mekanik yorumunu geliştiren birleşik ağ farmakoloji-deneysel doğrulama çerçevesini tanıtmaktadır

Protokol

Bu çalışma için etik onay gerekmemiştir, çünkü insan katılımcılar veya klinik örnekler dahil edilmiyordu. Hücre hatlarını içeren tüm prosedürler kurumsal biyogüvenlik yönergeleri ve yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan prostat epitel hücre hattı, sertifikalı bir ticari tedarikçiden temin edilmiştir.

NOT: Bu çalışmada kullanılan tüm reaktifler, aletler ve yazılımlar Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir. Bu çalışmanın akış şeması Şekil 1'de sunulmaktadır.

1. Aktif bileşenlerin taraması

1. TCMSP veritabanına erişin.
2. Arama kutusundan "Herb name" seçeneğini seçin, "Huangbo" yazın ve "Ara"ya tıklayın.
3. "OB" filtresine tıklayın, "≥30" ayarlayın ve uygulan.
4. "DL" filtresine tıklayın, "≥0.18" ayarlayın ve uygulan.
5. Filtrelenen sonuçları bir Excel tablosuna kopyalayın.
6. "Cangzhu"nun aktif bileşenlerini elde etmek için aynı tarama yöntemini uygulayın.
7. Tüm veri setlerini Microsoft Excel (2019 sürümü) içine aktararak ve bileşik listeleri Excel formatında birleştirerek tekrarlanan aktif bileşenleri kaldırın.
8. Bileşik isimlerini standartlaştırarak ve aynı girişleri belirleyerek tekrarlanan aktif maddeleri ortadan kaldırın. Aynı bileşiğe birden fazla kayıt karşılık geldiğinde, yalnızca bir temsilci kayıt tutulurdu.
9. "Huangbo", "Cangzhu" ve aktif maddeler arasında ilişkiler kurun.

2. Aktif maddelere karşılık gelen hedefleri elde edin

1. TCMSP veritabanına erişin.
2. Arama kutusunda "Kimyasal ad" seçeneğini seçin, aktif bileşenleri girin ve "Ara"ya tıklayın.
3. Her aktif bileşene karşılık gelen Hedef adını kopyalayın.
4. Tekrarlanan Target isimlerini kaldırın ve aktif içeriklerle Target isimleri arasında ilişki kurun.
5. UniProt veritabanına (https://www.uniprot.org/)¹⁸ erişin, her Target isminin resmi gen sembollerini alın ve sistematik olarak değiştirin.

3. Hastalık hedeflerinin edinilmesi

1. GeneCards veritabanına erişin (https://www.genecards.org)¹⁹.
2. Arama alanına "Prostatit" yazıyıp ilgili gen listesini elde etmek için arama simgesine basın.
3. Genleri Önemlilik puanına göre azalan sırayla sıralayın.
4. İlgili genleri Excel formatında dışa aktarın.
5. ≥1 puanına sahip hedefler prostatitle ilgili hedefler olarak seçildi.

4. İlaç-aktif bileşen-hedef-hastalık düzenleyici ağı oluşturma için hazırlık

1. Aktif bileşenlerle ilgili hedefler ile prostatitle ilgili hedefler arasındaki kesişimi elde edin ve bunu prostatitin tedavisinde EMP'nin hedefleri olarak tanımlayın.
2. Prostatit için EMP'nin aktif bileşenleri ile terapötik hedefleri arasındaki ilişkiyi ortaya koymak.
3. İlk üç sütunu "Node1", "Node2" ve "Net" olarak adlanarak "Network" adlı bir Excel dosyası oluşturun.
4. EMP ile ilaç arasındaki ilişkileri "Node1" ve "Node2" sütunlarına yapıştırın, tüm satırlar için "Net" sütununa ise "drug" girin.
5. İlaç-aktif madde ilişkilerini "Node1" ve "Node2" sütunlarına yapıştırın, tüm satırlar için "Net" sütununa ise "ingredient" yazın.
6. "Node1" ve "Node2" sütunlarını, prostatitin tedavisinde EMP hedefleri için aktif bileşen-hedef çağrışımlarıyla doldurun; "hedef" kelimesi "Net" sütununa girilecektir.
7. Prostatit için EMP'nin terapötik hedeflerini "Node1" sütununa yapıştırın, tüm satırlar için "Node2" sütununa "prostatitis" ve "Net" sütununa "disease" girin.
8. Excel dosyası "Network"i txt formatı dosyası olarak kaydedin.
9. İlk iki sütunun "Node" ve "Type" adıyla "Type" adlı bir Excel dosyası oluşturun.
10. "Node" sütununu "EMP" ile doldurun, "Type" sütununa "formula" girilmiştir.
11. "Düğüm" sütununa "Huangbo" ve "Cangzhu" yazın; Tüm satırlar için "Type" sütununa "drug" yazın.
12. Tüm ilgili satırlar için "Düğüm" sütununa aktif bileşenleri girin, "Type" sütununa ise "ingredient" yazın.
13. "Node" sütununu prostatit için EMP'nin terapötik hedefleriyle doldurun, "Tip" sütununa "hedef" girin.
14. Prostatitle ilgili hedefleri "Node" sütununa girin, tüm ilgili satırlar için "Type" sütununa ise "disease" yazın.
15. Excel dosyası "Type"ı .txt formatlı bir dosya olarak kaydedin.

5. Cytoscape tarafından "İlaç-Aktif Bileşen-Hedef-Hastalık" düzenleyici ağının görselleştirilmesi

1. Cytoscape'i fırlat.
2. "File > Import > Network from File System" sayfasına gidin ve "network.txt" dosyasını açın.
3. "Stil" panelini açın. "Shape" seçeneğini seçin, "Column" açılır menüsünden "Type"ı seçin ve "Mapping Type"ı "Discrete Mapping" olarak ayarlayın.
4. Aşağıdaki kategorilere farklı düğüm şekilleri atayın: formül, ilaç, bileşen, hedef, hastalık.
5. "Fill Color" seçeneğini seçin, "Column" açılır menüsünden "Type"ı seçin ve "Mapping Type"ı "Discrete Mapping" olarak ayarlayın.
6. Aşağıdaki kategorilere farklı düğüm renkleri atayın: formül, ilaç, bileşen, hedef, hastalık.
7. "Yükseklik" ve "Genişlik" seçeneğini seçin, "Column" açılır menüsünden "Type"ı seçin ve "Mapping Type"ı "Discrete Mapping" olarak ayarlayın.
8. Aşağıdaki kategorilere farklı düğüm boyutları atayın: formül, ilaç, bileşen, hedef, hastalık.
9. "Label Font Size"i seçin, "Column" açılır menüsünden "Type"ı seçin ve "Mapping Type"ı "Discrete Mapping" olarak ayarlayın.
10. Aşağıdaki kategorilere farklı etiket yazı tipi boyutları atayın: formül, ilaç, bileşen, hedef, hastalık.
11. Ağ düzenini optimize etmek için düğümleri manuel olarak yeniden konumlandırın.
12. "File > Export > Network Image to File" bölümüne gidin ve ağı bir görüntü olarak kaydedin.

6. PPI ağ analizi ve görselleştirme

1. https://cn.string-db.org/ erişin ve "Çoklu Proteinler" modülüne gidin.
2. Arama kutusuna hedef gen listesini girin, organizma olarak "Homo sapiens"i seçin ve "Ara"ya tıklayın.
3. Sonuçlar yüklendikten sonra "Devam et" seçeneğine tıklayın.
4. "Ayarlar" panelini açın, "minimum gerekli etkileşim puanı"nı "yüksek güven (0.700)" olarak ayarlayın ve "ağdaki bağlantısı kopuk düğümleri gizlemek" seçeneğini işaretle.
5. "Güncellemee"ye tıklayın, ardından PPI ilişkilendirme verilerini "Dışa Aktar" menüsünden TSV formatında dışa aktarın.
6. Cytoscape'i başlatın, Dosya menüsüne gidin ve TSV dosyanızı açmak için "File System'den Ağ İçe Aktar" seçeneğini seçin.
7. "Araçlar" menüsüne gidin, ardından "NetworkAnalyzer > Network Analysis > Network Interpretation > Ağa yönlendirilmeyen olarak ele alın" seçeneğini seçin.
8. "Dosya" menüsüne gidin, "Dosyaya Tabloyu Dışa Aktar" sistemini seçin ve ağ verilerini dışa aktarın.
9. "Stil" paneline gidin ve "Şekil", "Dolgu Rengi", "Yükseklik" ve "Genişlik" özelliklerini yapılandırın.
10. PPI ağ düzenini düğümleri yeniden konumlandırarak ayarlayın.
11. "Dosya" menüsüne gidin, "Network Image to File" seçeneğini seçin ve görselleştirilen ağı bir görüntü olarak dışa aktarın.
12. Dışa aktarılan PPI ağ verilerini WPS ile açın ve "Derece" sütununa göre azalan sırayla sıralayın.
13. En üst 20 sıralanmış hedefi seçin, bir çubuk grafik oluşturun ve grafiği bir görsel olarak kaydedin.

7. KEGG yolu zenginleştirme analizi

1. Bir terminal veya komut istemi açın, R yazın ve Enter tuşuna basın.
2. R konsolunda, aşağıdaki komutları teker teker çalıştırın:
   install.packages(c("RSQLite", "colorspace", "stringi", "BiocManager"))
   BiocManager::install(c("org. Hs.eg.db", "DOSE", "clusterProfiler", "pathview"))
3. Prostatit tedavisinde EMP hedeflerinin gen sembollerini org kullanarak Entrez ID'lerine dönüştürün. Hs.eg.db.
4. Entrez ID'lerini okuyun ve clusterProfiler paketiyle KEGG zenginleştirme analizi yapın; parametreler şunlardır: organizma = "var", pvalueCutoff = 0.05, qvalueCutoff = 0.05.
5. Elde edilen KEGG zenginleştirme analizi sonuçlarından insan hastalığı ve metabolizmaya bağlı yolları çıkardıktan sonra, kalan yolları zenginleştirilmiş genlerin sayısına göre sıralayın.
6. En iyi 15 sinyal yolu ile hedefler arasındaki ilişkiyi kurun.
7. "Pathway" ve "target" çağrışımlarıyla iki sütunlu bir dosya hazırlayın, ardından "File > File from File" üzerinden Cytoscape'e > Network'e aktarın.
8. "Style" panelini kullanarak hedeflerden yolları ayırt etmek için düğüm şekilleri ve renkleri ayarlayın.
9. Düzeni manuel olarak ayarlayın ve ağı bir görüntü olarak dışa aktarın.

8. Farmasötik hazırlık

NOT: EMP formülasyonu 15 g Phellodendri Chinensis Cortex (Huangbo) ve 15 g Atractylodis Rhizoma (Cangzhu) içerir. Sonraki hücre tabanlı deneyler için ekstraktı elde etmek amacıyla su ekstraksiyonu ve alkol çökeltme^{yöntemi kullanıldı 20}.

1. İlacı 10 kat kütleli suya 1 saat batırın.
2. 1 saat decoct yapın, ardından gazlı bezden filtreleyerek decoction elde edilir.
3. İlaca tekrar 10 kat su kütlesi ekleyin, 30 dakika dekokt yapın ve gaz bezinden filtreleyerek demi elde edin.
4. İlaca tekrar 10 kat su kütlesi ekleyin, 30 dakika dekokt yapın ve gaz bezinden filtreleyerek kaynatmayı elde edin.
5. Üç filtrelenmiş demi birleştirin, ardından karışımı filtre kağıdından geçirin.
6. Karışımı, orijinal hacminin %10'una düşürülmüş basınç altında yoğunlaştırın.
7. Konsantreyi soğutun, yavaşça etanol ekleyerek %75'e kadar karıştırın, ardından mühürleyip 4 °C'de 12 saat boyunca depolayın.
8. Karışımı santrifüjle yapın ve süpernatantı toplayın.
9. Düşük basınçta damıtmaya devam edin.
10. Son olarak, ürünü vakumlu dondurucu kurutucu ile liyofilize edin.
    NOT: Liyofilize toz -20ºC'de 3 aya kadar saklanabilir, bu da güvenli bir duraklama noktası olarak hizmet eder. Devam etmek için, tozu gerektiğinde uygun bir çözücüde yeniden yapılandırın.

9. Hücre eritmesi ve kültürü

NOT: Satın alınan hücreler kuru buz üzerinde laboratuvara teslim edildi. Deneyin başlangıcından önce, Keratinosit Serum Serbest Ortamı (K-SFM) önceden hazırlanmış, insan rekombinant epidermal büyüme faktörü (rEGF) ile son konsantrasyona 5 ng/mL, sığır hipofiz ekstraktı ile 50 μg/mL nihai konsantrasyona ve %1 Penisillin-Streptomisin eklenmiştir.

1. Su banyosunu aktive edin ve sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın.
2. Hücreleri kuru buzdan çıkarın ve tamamen eriyene kadar hemen su banyosunda karıştırın.
3. Hücrelere 5 mL K-SFM ekleyin. Nazikçe karıştırın ve ardından karışımı santrifüj yapın (4 °C, 500 × g, 5 dakika).
4. Üst malzemeyi çıkarın ve pelleti tam K-SFM ile yeniden askıya alın.
5. Hücreleri bir T-25 şişesine aktarın ve hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.
   NOT: Hücre kültürü kuluçka makinesinin çevresel parametreleri 37 °C, %5 CO₂ ve %95 bilgili nemde ≥ tutuldu.

10. Hücre alt kültürü

NOT: Alt kültürleme, hücreler %80–90 birleşimine ulaştığında ve alt kültür oranı 1:2 ile 1:3 arasında gerçekleşmiştir.

1. Kültür ortamı süpernatantı aspire edilir, ardından kalsiyum ve magnezyum olmadan PBS ile hücreleri iki kez yıkamak yapılır.
2. 2 mL tripsin-EDTA ekleyin ve hücreleri enzimatik ayrıştırma için 3 dakika bekletin.
   DIKKAT: Bu protokol, lipopolisakkarit (LPS), kloroform, etanol ve TRIzol reaktifi dahil olmak üzere tehlikeli reaktiflerin kullanımını içerir. Tehlikeli kimyasallarla ilgili tüm işlemler, uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması) takıldığında sertifikalı kimyasal duman davlumonunda yapılmalıdır. Biyolojik malzemeler, kurumsal biyogüvenlik yönergelerine uygun olarak ele alınmalıdır.
3. Sindirimi sonlandırmak için %10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş K-SFM ortamı ekleyin.
4. Hücre karışımını 15 mL'lik santrifüj tüpüne, santrifüje (4 °C, 500 × g, 5 dakika) aktarın ve süpernatantı çıkarın.
5. Hücre pelleti tam K-SFM ile yeniden süspansiyona getirildi ve ardından yeni kültür şişelerine aktarıldı.

11. MTS testi ile maksimum ilaç tedavi konsantrasyonunun belirlenmesi

NOT: Her ilaç konsantrasyonu 5 teknik kopya ile test edildi.

1. RWPE-1 hücrelerini logaritmik büyüme aşamasında sindirin.
2. Hücreleri tam K-SFM ortamında yeniden süsle alın, ardından sayarak hücre konsantrasyonunu belirleyin.
3. Hücre süspansiyonunu tam K-SFM ortamıyla 1 ×^{10 5} hücre/mL yoğunluğuna ayarlayın.
4. Hücre süspansiyonunu 100 μL yakıt başına 96 kuyu içeren bir plakaya dağıtın.
5. 96 kuyu tabakası yetiştirmek üzere hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirildi.
6. 24 saat sonra, hücreler tamamen yapıştıktan sonra, kültür ortamı aspirasyon edilip atıldı.
7. Ortamı, farklı EMP çözeltisi konsantrasyonları içeren tam K-SFM ortamla değiştirin.
8. Plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine tekrar yerleştirin ve 24 saat daha kuluçka için.
9. Ortamı aspire edin, ardından hücreleri PBS ile iki kez durulayın.
10. Her kuyuya 100 μL tam K-SFM ortamı ekleyin, ardından plakayı hücre kültüründeki kuluçkada 4 saat daha kuluçka edin.
11. Her kuyuya 10 μL MTS çözeltisi verildi ve 1 saatlik kuluçkadan sonra 490 nm oranında OD belirlendi.
12. Boş kontrol grubu (LPS stimülasyonu veya ilaç tedavisi olmadan tam ortamda kültürlenen hücreler) başlangıç olarak kullanılarak, her tedavi konsantrasyonu altında hücre çoğalması hesaplandı.
    NOT: Hücre çoğalma üzerinde anlamlı etki göstermeyen en yüksek konsantrasyon yüksek doz tedavi olarak tanımlandı; ardından orta doz tedavi olarak yarım konsantrasyon, düşük doz tedavi olarak ise çeyrek konsantrasyon geldi.

12. Hücresel müdahale

1. RWPE-1 hücrelerini logaritmik büyüme aşamasında sindirin.
2. Hücreler tam K-SFM ortamında yeniden süspansiyona getirildi ve hücre konsantrasyonu hücre sayımı ile belirlendi.
3. Hücre süspansiyonu, tam K-SFM ortamı kullanılarak 5 ×^{10 5 hücre} /mL yoğunluğuna ayarlandı.
4. Hücre süspansiyonu, her kuyu başına 2 mL kapasitede 6 kuyu bir plakaya yerleştirildi.
5. Plaka, kültür kuluçka makinesine yerleştirildi ve hücre yapışmasını sağlamak için 12 saat kuluçka edildi.
6. Hücreler sırasıyla düşük (150 μg/mL), orta (300 μg/mL) ve yüksek dozlu (600 μg/mL) EMP konsantrasyonlarıyla tedavi edildi.
7. 1 saat sonra, kültür ortamına 10 μg/mL LPS çözeltisi eklendi.
8. 24 saatlik tedavinin ardından, süpernatan ELISA için toplandı ve hücreler RT-PCR analizi için toplandı.
   NOT: LPS, prostat epitel hücrelerinde pro-inflamatuar sinyal yollarını aktive etme yeteneği nedeniyle inflamatuar yanıt tetiklemek için seçilmiştir; konsantrasyon (10 μg/mL) daha önce güçlü sitokin indüksiyonu gösteren çalışmalara dayanarak seçildi.

13. Toplam RNA'nın izolasyonu

NOT: RNA bozulmasını önlemek için deneysel işlem boyunca eldiven ve maske takıldı, RNase içermeyen pipet uçları ve santrifüj tüpleri kullanıldı.

1. Müdahaleden sonra hücreleri PBS ile iki kez durulayın.
2. Hücrelere 1 mL Trizol reaktifi ekleyin ve homojenleşmeyi sağlamak için pipetle tekrar tekrar karıştırın.
   DIKKAT: Tüm işlemleri uygun kişisel koruyucu ekipman takarak kimyasal bir duman davlumonunda yapılıyor.
3. Lizat 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya bırakın.
4. Sonrasında, 0,2 mL kloroform ekleyin ve örneği güçlü bir şekilde vortex edin.
5. Oda sıcaklığında 5 dakika bekletildikten sonra, örneği 10.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 15 dakika santrifüjle yapın.
6. Santrifüjlemeden sonra, üst renksiz sulu fazı dikkatlice yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
7. Eşit miktarda önceden soğutulmuş izopropanol ekleyin, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın.
8. Numuneyi bir kez daha santrifüjle edin (4 °C, 10.000 × g, 10 dakika), ardından sıvı fazını atıp çökeltiyi tutun.
9. Pelleti 1 mL önceden soğutmuş %75 etanol ile durulayın ve pipetle nazikçe tekrar süsleyin.
10. Son santrifüjü 4 °C ve 7.500 × g sıcaklıkta 10 dakika boyunca gerçekleştirin, ardından süpernatı çıkarın ve RNA pelletinin biyogüvenlik kabininde hava kurumasına izin verin.
11. Arıtılmış RNA'yı 50 μL DEPC ile arıtılmış suda çözür.
12. RNA konsantrasyonunu, A260/A280 oranını ve A260/A230 oranını, NanoDrop spektrofotometresi kullanarak belirleyerek RNA saflığını değerlendirin ve aşağı akış analizlerinden önce minimum protein ve çözücü kontaminasyonunu garanti edin.

14. RT-PCR

1. 20 μL'lik ters transkripsiyon reaksiyon sistemi hazırlamak için toplam RNA'dan 1 μg kullanın.
2. Reaksiyon sistemini 42 °C'de 15 dakika kuluçkalayın, ardından 5 dakika 95 °C'de inkubasyon yapın, ardından 4 °C'ye soğutun.
3. Ortaya çıkan cDNA'yı damıtılmış su ile 10 kat seyreltin.
4. Sulandırılmış cDNA kullanarak 20 μL PCR reaksiyon sistemi hazırlayın.
5. Termal döngüleyiciyi programlayın ve başlangıçta 95 °C'ye 60 saniye ayarlayın, ardından 15 saniye için 95 °C ve 60 saniye boyunca 60 °C ile 40 döngü ayarlayın.
6. Erime eğrisi analizi yapın ve tamamlandıktan sonra tüm hedef genler ve referans genler için BT değerlerini kaydedin.
7. Hedef genlerin normalize edilmiş ifade seviyelerini belirlemek için 2^(-ΔΔCT) yöntemini kullanın.

15. ELISA testi

NOT: ELISA kitini depodan alın ve kullanmadan önce oda sıcaklığında 30 dakika dengede bırakın.

1. Standart çözeltiyi üreticinin talimatlarına göre hazırlayın ve standartlar, biyotinile antikorlar, enzim konjugatları ve yıkama tamponu için uygun seyreltmeler yapın.
2. Toplanan hücre kültürü süpernatantını (4 °C, 10.000 × g, 10 dakika) santrifüj edin ve süpernatantı toplayın.
3. Standart seyreltmelerden 100 μL ve test örneklerini önceden kaplanmış kuyulara aktarın.
4. Kuyular yapışkan şeritle kapatın ve plakayı 37 °C'de 90 dakika kuluçka yapın.
5. Kuyulardan sıvıyı atın ve plakayı otomatik bir plaka yıkama makinesiyle yıkayın.
   NOT: Otomatik çamaşır makinesi parametrelerini şu şekilde ayarlayın: her kuyuda 350 μL yıkama tamponu (her kuyu) ile aspirasyon arasında 15 saniyelik bekleme süresi, 5 tam döngü.
6. Her kuyuya 100 μL biyotinile edilmiş antikor çalışma çözeltisi verin. 37 °C'de 60 dakika kuluçkaya bırakın.
7. Çözeltiyi atın ve plakayı 15.5'te tarif edildiği gibi yıkayın.
8. Her kuyu başına 100 μL enzim konjuge çalışma çözeltisi pipetleyin, ardından 37 °C'de 60 dakika kuluçka yapın.
9. Çözeltiyi atın ve plakayı 15.5'te tarif edildiği gibi yıkayın.
10. Her kuyuya 100 μL kromojenik substrat ekleyin. Tışıktan koruyarak 15 dakika boyunca 37 °C'de kalın.
11. Her kuyu başına 100 μL stop çözeltisi pipetleyin, sonra nazikçe karıştırın.
12. Hemen 450 nm'de optik yoğunluğu (OD) ölçün.
13. Curve Expert yazılımı kullanarak ortalama OD değerlerini standart konsantrasyonlara karşı çizerek standart bir eğri oluşturun.
14. Her örnekin konsantrasyonunu, standart eğriden OD değeri kullanılarak interpolasyon yoluyla belirleyin.

16. İstatistiksel analiz

1. SPSS yazılımını (Sürüm 20.0) çalıştırın.
2. Veri setini SPSS İstatistikleri'ne aktarın ve değişkenleri uygun şekilde tanımlayın. Analiz > Betimleyici İstatistikleri Kullanın> Ortalama ve standart sapmayı (SD) hesaplamak için keşfet.
3. Birden fazla grup karşılaştırması için Analyze > Compare Means > One-Way ANOVA kullanın.
4. P-değerlerini doğrudan test çıktı tablolarından alın ve buna göre raporlayın.
5. Tüm sonuçları ortalama SD ± olarak sunun ve p 0,05 < farkları istatistiksel olarak anlamlı olarak değerlendirin.

Sonuçlar

Aktif bileşiklerin tanımlanması ve hedef tahmini

Bu sonuçlar, entegre ağ farmakolojimiz ve in vitro yaklaşımımızın prostatitte EMP'nin terapötik hedeflerini belirleme ve doğrulama etkinliğini göstermektedir. TCMSP veritabanında yapılan bir arama, EMP'nin bileşenlerinden 46 biyoaktif bileşen tespit edildi ve bunlar 178 potansiyel hedefe karşılık geldi. Genecards veritabanından 13.960 prostatitle ilgili hedef tespit edildi. Her iki sett...

Tartışma

Bu protokol, ağ farmakolojisini deneysel doğrulama ile bütünleştirerek çok bileşenli terapötik mekanizmaların incelenmesi için sistematik bir çerçeve sağlar. Kritik adımlar arasında, tanımlanmış eşikler (OB ≥ %30, DL ≥ 0.18) kullanılarak aktif bileşiklerin doğru taraması, güvenilir ağ inşası ve deneysel doğrulama modellerinin uygun seçimi yer alır. Biyobiltik analizlerde dikkatli parametre seçimi ve deneysel koşulların sıkı kontrolü, tekrarlanabilirliği sağlamak için gereklidir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
İnsan IL-6 ELISA Kiti	4Abio	CHE0009
İnsan TNF-α ELISA KUŞU	4Abio	CHE0019
K-SFM takviyeleri	Procell	CM-0200
Lipopolisakkaridler	Solarbio	L8880
MTS	Promega	G1111
Ters Transkripsiyon Sistemi	Promega	A3500
RWPE-1	Procell	CL-0200	RRID:CVCL_EQ24
RWPE-1 Hücre Tam Ortamı	Procell	CM-0200
SYBR Yeşil Gerçek Zamanlı PCR Master Karışımı	Toyobo	QPK-201
Trizol reaktifi	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	15596026
tripsin-EDTA	Gibco (Termo Balıkçı)	25200072