CRISPR Sistemi için Tek Kılavuzlu RNA DNA Şablonlarının Hızlı Sentezi İçin Tek Adımlı Örtüşen PCR

Yao Yao; Jia Li; Lili Duan; Jun Chen; Guoqing Li; Zheng Hu

doi:10.3791/70369

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

CRISPR Sistemi için Tek Kılavuzlu RNA DNA Şablonlarının Hızlı Sentezi İçin Tek Adımlı Örtüşen PCR

221 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70369

⸱

24 Nisan 2026

Yao Yao¹^,² , Jia Li² , Lili Duan² , Jun Chen² , Guoqing Li¹^,³ , Zheng Hu¹^,²

¹Institute of Cytology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China, ²Translational Medicine Institute, the First People's Hospital of Chenzhou, Hengyang Medical School, University of South China, ³National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Prevention & Ministry of Education Key Lab of Rare Pediatric Diseases, Institute of Cell Biology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China

Bu makalede

Özet

Dört primer kullanılarak tek aşamalı örtüşen PCR yöntemi, in vitro sgRNA transkripsiyonu için hızlı ve düşük maliyetli DNA şablonları üretimini sağlar. Optimize edilmiş primer oranı (50:5:1:50), 5 saat içinde yüksek kaliteli sgRNA'lar üretir ve fonksiyonel doğrulama in vitro testler ve HEK293T hücrelerde düzenleme faaliyetleriyle gösterilir.

Özet

CRISPR–Cas sistemi genom düzenlemesinde devrim niteliğinde bir değişim yaratmıştır; ancak tek kılavuzlu RNA (sgRNA) üretimi için geleneksel yöntemler genellikle zaman alıcı klonlama adımları veya pahalı ticari sentez kitleri içerir. In vitro sgRNA transkripsiyonu için DNA şablonlarının hızlı ve maliyet etkin sentezi için optimize edilmiş tek adımlı örtüşen PCR stratejisi sunulmaktadır. T7 promotör, hedefe özgü rehber dizisi ve sgRNA iskeletini kapsayan dört kısmen örtüşen primer kullanılarak, tam boy şablonlar klonlanmadan tek bir PCR reaksiyonunda birleştirilir. Sistematik deneysel optimizasyon, agaraoz jel elektroforezi ile doğrulandığı gibi, spesifik olmayan yan ürünleri en aza indirirken tam boy ürün verimini maksimize eden optimal primer oranı (AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50) belirlemiştir. Bu yaklaşım, Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) ötesinde sistemler arası uygulanabilirlik gösteren Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9) sgRNA için şablonlar oluşturmak üzere başarıyla genişletilmiştir. SgRNA'ların doğrudan kimyasal sentezi, yüksek saflık, kararlılığı artırmak için kimyasal modifikasyonlar ve hedef dışı etkileri azaltması gibi avantajlar sunsa da, yüksek verimli uygulamalar veya çok sayıda sgRNA gerektiren büyük ölçekli ekranlar için hâlâ aşırı pahalıdır. In vitro bölünme testleri, bu yöntemle üretilen rehber RNA'ların geleneksel plazmid tabanlı klonlama ile elde edilenlerle karşılaştırılabilir düzenleme verimliliği sağladığını göstermiştir. Ayrıca, bu sgRNA'larla birleştirilen ve elektroporasyon yoluyla HEK293T hücrelere iletilen ribonükleoprotein kompleksleri, hedef lokusunda tespit edilebilir indel oluşumuna yol açarak işlevselliği in vivo doğrulamaktadır. Maliyet analizi, bu yöntemin şablon hazırlama maliyetlerini ticari sentez kitlerine kıyasla önemli ölçüde azalttığını ve teslim süresini günlerden saatlere indirdiğini göstererek, genetik araştırma yapan laboratuvarlar için erişilebilir ve ölçeklenebilir bir yaklaşım sağladığını göstermektedir.

Giriş

Bakteriler ve arkeelerde adaptif bağışıklık mekanizmasından türeyen CRISPR–Cas sistemi, çeşitli organizmalar arasında hassas genom düzenlemesini mümkün kılarak genetik mühendisliği devrim niteliğinde^{değiştirmiştir} ^1,2. Önemli bir bileşen, Cas çekirdeklerini belirli genomik lokuslara yönlendiren kimerik bir RNA olan tek kılavuzlu RNA'dır (sgRNA); modüler tasarımı, yaklaşık 20 nükleotidli protospacer^{dizisi 3'ün} modifiyasyonuyla yeniden hedefleme imkanı sağlar. SpCas9'un ötesinde, farklı özelliklere sahip diğer Cas çekirdekleri yaygın olarak benimsenmiştir....