Yöntem makalesi

CRISPR Sistemi için Tek Kılavuzlu RNA DNA Şablonlarının Hızlı Sentezi İçin Tek Adımlı Örtüşen PCR

193 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70369

⸱

24 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cytology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China, 2Translational Medicine Institute, the First People's Hospital of Chenzhou, Hengyang Medical School, University of South China, 3National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Prevention & Ministry of Education Key Lab of Rare Pediatric Diseases, Institute of Cell Biology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China

Bu makalede

Özet

Dört primer kullanılarak tek aşamalı örtüşen PCR yöntemi, in vitro sgRNA transkripsiyonu için hızlı ve düşük maliyetli DNA şablonları üretimini sağlar. Optimize edilmiş primer oranı (50:5:1:50), 5 saat içinde yüksek kaliteli sgRNA'lar üretir ve fonksiyonel doğrulama in vitro testler ve HEK293T hücrelerde düzenleme faaliyetleriyle gösterilir.

Özet

CRISPR–Cas sistemi genom düzenlemesinde devrim niteliğinde bir değişim yaratmıştır; ancak tek kılavuzlu RNA (sgRNA) üretimi için geleneksel yöntemler genellikle zaman alıcı klonlama adımları veya pahalı ticari sentez kitleri içerir. In vitro sgRNA transkripsiyonu için DNA şablonlarının hızlı ve maliyet etkin sentezi için optimize edilmiş tek adımlı örtüşen PCR stratejisi sunulmaktadır. T7 promotör, hedefe özgü rehber dizisi ve sgRNA iskeletini kapsayan dört kısmen örtüşen primer kullanılarak, tam boy şablonlar klonlanmadan tek bir PCR reaksiyonunda birleştirilir. Sistematik deneysel optimizasyon, agaraoz jel elektroforezi ile doğrulandığı gibi, spesifik olmayan yan ürünleri en aza indirirken tam boy ürün verimini maksimize eden optimal primer oranı (AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50) belirlemiştir. Bu yaklaşım, Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) ötesinde sistemler arası uygulanabilirlik gösteren Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9) sgRNA için şablonlar oluşturmak üzere başarıyla genişletilmiştir. SgRNA'ların doğrudan kimyasal sentezi, yüksek saflık, kararlılığı artırmak için kimyasal modifikasyonlar ve hedef dışı etkileri azaltması gibi avantajlar sunsa da, yüksek verimli uygulamalar veya çok sayıda sgRNA gerektiren büyük ölçekli ekranlar için hâlâ aşırı pahalıdır. In vitro bölünme testleri, bu yöntemle üretilen rehber RNA'ların geleneksel plazmid tabanlı klonlama ile elde edilenlerle karşılaştırılabilir düzenleme verimliliği sağladığını göstermiştir. Ayrıca, bu sgRNA'larla birleştirilen ve elektroporasyon yoluyla HEK293T hücrelere iletilen ribonükleoprotein kompleksleri, hedef lokusunda tespit edilebilir indel oluşumuna yol açarak işlevselliği in vivo doğrulamaktadır. Maliyet analizi, bu yöntemin şablon hazırlama maliyetlerini ticari sentez kitlerine kıyasla önemli ölçüde azalttığını ve teslim süresini günlerden saatlere indirdiğini göstererek, genetik araştırma yapan laboratuvarlar için erişilebilir ve ölçeklenebilir bir yaklaşım sağladığını göstermektedir.

Giriş

Bakteriler ve arkeelerde adaptif bağışıklık mekanizmasından türeyen CRISPR–Cas sistemi, çeşitli organizmalar arasında hassas genom düzenlemesini mümkün kılarak genetik mühendisliği devrim niteliğindedeğiştirmiştir 1,2. Önemli bir bileşen, Cas çekirdeklerini belirli genomik lokuslara yönlendiren kimerik bir RNA olan tek kılavuzlu RNA'dır (sgRNA); modüler tasarımı, yaklaşık 20 nükleotidli protospacerdizisi 3'ün modifiyasyonuyla yeniden hedefleme imkanı sağlar. SpCas9'un ötesinde, farklı özelliklere sahip diğer Cas çekirdekleri yaygın olarak benimsenmiştir. Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9) daha küçüktür, adeno-ilişkili virüs (AAV) teslimatını kolaylaştırır ve böylece ulaşım seçeneklerinigenişletir 4. Her sistem özel rehber RNA mimarileri gerektirir, bu da çok yönlü bir sentez yöntemini son derece arzuedilen bir hale getirir 3.

Fonksiyonel rehber RNA'lar üretmek için geleneksel yöntemler arasında plazmid bazlı klonlama, ticari sgRNA sentez kitleri veya sgRNA'ların doğrudan ticarisentezi yer alır 5,6. Plazmid tabanlı klonlama, genellikle 48 saatten fazla süren 2,4,6 (2,4,6) kısıtlama sindirimi, ligasyon, dönüşüm ve koloni taraması gibi birçok emek yoğun aşamayı gerektirir. Ticari sgRNA kitleri, sade bir iş akışı (<5 saat) sunarken, yüksek verimli uygulamalar için genellikle 35–45 dolar maliyetli olup, her reaksiyon maliyeti son derece pahalıdır. SgRNA'ların doğrudan kimyasal sentezi, yüksek saflık, kararlılığı artırmak için kimyasal modifikasyonlar ve hedeften uzak etkileri azaltma gibi avantajlarsunar 7; ancak yüksek verimli uygulamalar veya yüzlerce sgRNA gerektiren büyük ölçekli ekranlar için genellikle sgRNA başına 200–280 dolar tutar ve aşırı pahalıdır.

Buna karşılık, burada tarif edilen tek adımlı örtüşen PCR yöntemi, standart primerlerle şablon sentezini yaklaşık 5–8 dolar maliyetle tamamlar ve bu da hem zaman hem de malzeme maliyetinde önemli bir azalma sağlar. Ayrıca, bu yöntemle üretilen sgRNA'lar, in vitro bölünme testleriyle doğrulandığı gibi, plazmid tabanlı klonlama ile üretilenlerle karşılaştırılabilir düzenleme verimliliklerine ulaşır. Bu yaklaşımların karşılaştırması Şekil 1'de gösterilmiştir.

Örtüşme Genişletme PCR (OE-PCR), DNA parçalarını birleştirmek için hızlı, ligaz bağımsız bir stratejisağlar 8. Bu yaklaşım, üst üste binen primerler kullanılarak sgRNA şablon sentezi için uyarlanmıştır. Dört kısmen üst üste binen primer kullanılarak tek aşamalı bir reaksiyonda, rekabetçi bağlanma gerçekleşir: dış primerler (AF1 ve Tracr-R) amplifikasyon sınırlarını belirlerken, iç primerler (AF2 ve AF3) her iki uçtan merkeze doğru düzenli bir uzanma sağlamak için seyreltilmelidir. Bu teorik çerçeveye rağmen, montaj verimliliğini etkileyen kritik bir parametre—optimal primer oranı—sistematik olarak incelenmemiştir. Ayrıca, bu OE-PCR yöntemlerinin farklı CRISPR sistemleri arasında daha geniş uygulanabilirliği hâlâ yeterince araştırılmamıştır.

Bu sınırlamaları gidermek için, sgRNA şablon sentezi için tek aşamalı örtüşen PCR yöntemini optimize etmek ve doğrulamak amacıyla bir çalışma tasarlandı. Optimal primer oranı, tek, doğru boyutlu bir ürün veren koşulları belirlemek için kullanılan agaroz jel elektroforezi kullanılarak yapılandırılmış deneysel tasarımla belirlendi. Optimizasyonun ardından, yöntemin çok yönlülüğü yaygın olarak kullanılan iki CRISPR sisteminde (SpCas9 ve saCas9) değerlendirildi ve her iki şablon da başarılı şekilde amplifikasyon yapıldı. In vitro bölünme testleriyle yapılan fonksiyonel doğrulama, bu yöntemle üretilen sgRNA'ların plazmid tabanlı klonlama ile elde edilenlerle karşılaştırılabilir verimliliklere ulaştığını gösterdi.

Hücresel bağlamda işlevselliği daha iyi değerlendirmek için, SpCas9 sgRNA, Cas9 proteini ile kompleksleştirilerek ribonükleoprotein (RNP) kompleksleri oluşturuldu ve elektroporasyon yoluyla HEK293T hücrelere iletildi. Endogen bir lokustaki genom düzenlemesi, T7 Endonukleaz I (T7EI) testi kullanılarak değerlendirildi ve agaroz jellerindeki bölünme desenleri in vivo algılanabilir indel oluşumunu gösterdi. Bu bulgular toplamında, bu yöntemin güvenilir şekilde yüksek kaliteli, işlevsel sgRNA şablonları ürettiğini göstermektedir. Aşağıdaki protokol, SpCas9'u temsil eden bir örnek olarak kullanılan ayrıntılı prosedürü ve diğer Cas nükleazlarına uyum için primer şablonları sunularak ayrıntılı olarak tanımlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Ticari olarak mevcut HEK293T hücre hattı (ATCC CRL-3216) kullanımı, Güney Çin Üniversitesi Chenzhou Şehri İlk Halk Hastanesi Etik Komitesi'nin insan kaynaklı hücre hatlarının kullanımı yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Kullanılan reaktifler, yazılım ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. sgRNA hedef dizilerinin tasarımı

  1. Hedef genomik bölgeyi yerleşik çevrimiçi araçlar (örneğin, CRISPRscan, CHOPCHOP veya Broad Institute CRISPick) kullanarak belirlemek.
  2. CHOPCHOP web sunucusuna https://chopchop.cbu.uib.no/ 3,9 numaralı telefondan erişin.
  3. Hedef gen bilgilerini girin ve uygun CRISPR/Cas sistemini seçin (örneğin, CRISPR/Cas9 için EGFR) (Şekil 2A).
  4. Çıktı tablosunu inceleyin; sıralama, hedef dizisi, genomik konum, zincir, GC içeriği (%), kendi kendini tamamlama, tahmin edilen hedef dışı siteler (MM0, MM1, MM2, MM3) ve verimlilik puanı (Şekil 2B).
  5. Yüksek hedefe uygun verimliliğe ve düşük tahmin edilen hedef dışı aktiviteye sahip bir rehber RNA dizisi seçin.
  6. Asal tasarımı için nihai sgRNA hedef dizisini kaydedin (örneğin, EGFR hedef dizisi: "CTTAATTCCTTGATAGCGACGG") (Şekil 2B).

2. Dört üst üste binen primerin sentezi ve hazırlanması

  1. Aşağıdaki gibi örtüşen bölgelerle dört oligonukleotid primer (AF1, AF2, AF3, Tracr-R) tasarlayın (Şekil 3A):
    AF1: 5′–TTCTAATACGACTCACTATAG
    [hedef seqeri] GTTTTAGAGCTAGAAATAG–3′
    AF2: 5′–GTTTTAGAGCTAGAAAAATAGCAAGT
    TAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC–3′
    AF3: 5′–GGCTAGTCCGTTATCAACTTG
    AAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTT–3′
    Tracr-R: 5′–AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC–3′
    NOT: AF1 primerinde [hedef dizisi] yerine 1.6. adımda elde edilen dizi ile değiştirin.
  2. Primerleri standart tuz arıtma arıtma ile 25 nmol ölçekte sentezleyin.
  3. Kurutulmuş primerleri nükleazsız suya 100 μM stok konsantrasyonuna kadar yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 5000 × g sıcaklıkta 1 dakika boyunca santrifüj yapın.

3. Primer konsantrasyonu optimizasyonu ve sgRNA şablon sentezi için tek aşamalı örtüşme PCR

  1. Tablo 1'e göre değişken AF2 ve AF3 konsantrasyonlarına sahip primer karışımları hazırlayın. AF1 ve Tracr-R'yi 10 μM'de tutun.
  2. Tablo 2'ye göre 0.2 mL nükleaz içermeyen tüplerde PCR reaksiyonları hazırlanın. Yüksek isabetli DNA polimeraz kullanın.
  3. Beş kez pipetle nazikçe karıştırın. Girdap yapmayın. 5000 × g 1 dakika boyunca santrifüj yapın.
  4. PCR'yi, Tablo 3'te açıklanan döngü koşullarıyla çalıştırın.

4. DNA şablonlarının elektroforez ve geri kazanımı

  1. 2 g agarozu 100 mL 1× TAE tamponunda çözerek %2 agaroz jeli hazırlayın. 50–60 °C'ye kadar soğutun, 5 μL nüklein asit leke ekleyin ve jel dökün.
  2. Jelin oda sıcaklığında 30 dakika sertleşmesine izin verin.
  3. 10 μL PCR ürünü 2 μL 6× yükleme tamponuyla karıştırın. 100 bp'lik bir DNA merdiveni ekleyin.
  4. 100 V'da elektroforezi 30–40 dakika çalıştırın.
  5. UV aydınlatması altında görselleştirin. Durum 9'un (AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50) tek bir ~120 bp bant oluşturduğunu doğrulayın (Şekil 4A).
  6. Optimize edilmiş primer konsantrasyonları kullanın: AF1 10 μM, AF2 1 μM, AF3 0.2 μM, Tracr-R 10 μM.
  7. Hedef bandı steril bir bistürle çıkarın. UV maruziyetini ≤30 saniye ile sınırlayın.
    NOT: Jel dilimlerini −20 °C'de 1 haftaya kadar saklayın veya hemen başlayın.

5. DNA şablonlarının arındırılması

  1. Üreticinin talimatlarına göre jel ekstraksiyon kiti kullanarakDNA'yı arındırın. 10.
  2. 20–30 μL önceden ısıtılmış (60 °C) nükleaz içermeyen suda elüt DNA'yı kullanın.
  3. DNA konsantrasyonu ölçün. Tipik verim: 15–50 ng/μL; A260/A280: 1.8–2.0.
    NOT: Temizlenmiş DNA'yı −20 °C'de 1 yıla kadar saklayabilirsiniz.

6. In vitro transkripsiyon ve sgRNA'nın arındırılması

  1. Transkripsiyon reaksiyonunu bir T7 RNA sentez kiti kullanarak birleştirin (Tablo 4). Buz üzerindehazırlanın 11.
    NOT: RNase içermeyen malzemeler kullanın ve tüm yüzeyleri dezinfekte edin.
  2. 37 °C'de 16 saat kuluçka yapın.
  3. 1 μL DNaz I ekleyin ve 37 °C'de 15 dakika kuluçka yapın.
  4. RNA temizleme kiti ile sgRNA'yıarındırın 12.
  5. 30–50 μL nükleazsız suda elütasyon yapın.
  6. sgRNA'yı nicelikle ölçe. Beklenen verim: 700–900 ng/μL; A260/A280: 1.9–2.1.
    NOT: sgRNA'yı −80 °C'de 1 yıla kadar sakla.

7. SgRNA aktivitesini doğrulamak için in vitro bölünme testi

  1. Hedef DNA'yı hazırlayın ve arındırın. Konsantrasyonu 60 ng/μL 13'e ayarlayın.
  2. Bölünme reaksiyonunu bir araya getirin (Tablo 5)—DNA olmadan 25 °C'de 30 dakika önceden kuluçka yapın. Negatif bir kontrol ekleyin.
  3. 1 μL hedef DNA ekleyin.
  4. 37 °C'de 2 saat kuluçka yapın.
  5. Reaksiyonu durdurmak için 4 μL 6× yükleme tamponu ekleyin.
  6. Ürünleri %2 agaroz jeli üzerinde 100 V'da 30–40 dakika çalıştırın.
  7. UV ışığı altında görselleştirin. Bölünmeyi doğrulayın (örneğin, 617 bp → 414 bp + 203 bp) (Şekil 4C).

8. sgRNA yönlendirmeli Cas9 düzenlemesinin hücresel doğrulaması

  1. Cas9 proteini ve sgRNA'yı 1:2 molar oranda karıştırarak ribonükleoprotein (RNP) kompleksini hazırlayın. 10 μL Cas9 (4 mg/mL), 280 μL sgRNA (60 ng/μL) ve 200 μL DMEM birleştirin. 15 dakika kuluçka yapın.
  2. Kültür HEK293T hücreleri %80 birleşime indirin. Hasat yapın ve her örnek başına 3 × 10-6 hücreye ayarlayın.
  3. RNP kompleksini hücrelerle birleştirin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın.
  4. 2 mm elektroporasyon küvetine aktarın. 115 V, 4 ms, bir darbe (575 V/cm) elektroporatı yapın. Hemen 10 mL tam ortam ekleyin ve 6 kuyuyuk bir plakaya aktarın.
  5. %5CO2 ile 37 °C'de 48 saat kuluçka yapın.
  6. İşlenmiş ve kontrol hücrelerinden genomik DNA çıkarın. Konsantrasyonu ölçün.
    NOT: DNA'yı −20 °C'de 6 aya kadar sakla.
  7. Hedef lokusu PCR ile güçlendirin (Tablo 6 ve Tablo 7).
    NOT: Beklenen ürün boyutu: EGFR için 617 bp.
  8. PCR ürünlerini %2 agaroz jel üzerinde doğrulayın. Doğru bandı arındırın ve DNA'yı niceleyin.
  9. Heterodupleks oluşumunu gerçekleştirin (Tablo 8 ve Tablo 9).
  10. 1 μL T7 Endonükleaz I ekleyin ve 37 °C'de 15 dakika kuluçka yapın. 85 °C'de 10 dakika inaktive edin.
  11. Yükleme tamponu ekleyin ve %2 agaroz jeli üzerinde çalıştırın.
  12. UV ışığı altında görselleştirin. İndel oluşumunu onaylayın (617 bp → 414 bp + 203 bp) (Şekil 4D).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tek adımlı örtüşen PCR protokolünün başarılı uygulanması, agaroz jel elektroforezi ile analiz edildiğinde beklenen boyutta tek, keskin bir DNA bandı üretir.

Özellikle aşırı iç primer konsantrasyonu (AF2 ve AF3) olanlar, düşük optimal primer oranları, beklenen üründen daha büyük ek bantlara yol açar; bu da spesifik olmayan amplifikasyon veya primer-dimer oluşumunu gösterir ve eksik montaj ara maddelerine karşılık gelen soluk bantlar ile birlikte bulunur (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tek adımlı örtüşen PCR stratejisiyle sgRNA DNA şablonlarının sentezlenmesi için sadeleştirilmiş ve ekonomik bir protokol tanımlanır. Bu yöntem, plazmid yapım ve klonlama ihtiyacını ortadan kaldırır ve şablon hazırlama süresini birkaç günden yaklaşık 5 saate indirir. Bu yaklaşımın önemli bir yönü, primer oranının sistematik olarak optimize edilmesidir; bu oran 50:5:1:50 (AF1:AF2:AF3:Tracr-R) olarak belirlenmiştir; bu oran sırasıyla 10 μM, 1 μM, 0.2 μM ve 10 μM çalışma konsantrasy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Hunan Eyalet Sağlık Komisyonu'nun Sağlık Araştırma Projesi (hibe numarası W20243264), Hunan Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (hibe numarası 2023JJ50368), Hunan Eyaleti Eğitim Bakanlığı'nın Ana Araştırma Projesi (hibe numarası 24A0607) ve Chenzhou İlk Halk Hastanesi'nin Yenilikçi Ekip Projesi (hibe numarası CX202103) tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100 bp DNA LadderTIANGENMD109Elektroforez için DNA boyut işaretleyici
2Taq Plus MasterMixCWBIOCW2849MPCR amplifikasyon reaktifi
50 bp DNA LadderTIANGENMD108Küçük fragmanlar için DNA boyut işaretleyici
6DNA yükleme tamponuTIANGEN1109565Elektroforez için numune yükleme tamponu
Agarose Jel DNA Kurtarma KitiTIANGENDP219Agarose jelden DNA saflaştırma
Agarose I Thermo Scientific 17850Agarose jel hazırlama
Broad Institute CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/publicsgRNA tasarım aracı
SantrifüjHENGNUO2-16RNumune santrifüjasyonu
Sertifikalı Bakır Fetal Boğa SerumuUmedium, Beijing BioTopped Technology Co., Ltd3023AHücre kültürü takviyesi
CH3CO2HShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdA758682TAE tampon çözeltisi hazırlama reaktifleri
CHOPCHOPhttps://chopchop.cbu.uib.no/sgRNA tasarım aracı
CO2 inkübatörThermo Scientific51032874Memeli hücre kültürü inkübasyonu
CRISPRscanhttps://www.crisprscan.org/sgRNA tasarım aracı
DMEM (Dulbecco's Modifiye Kartal Ortamı)KeyGEN BioTECHKGL1211-500Hücre kültürü ortamı
dsDNaseThermo Scientific EN0771Transkripsiyon sonrası DNA şablonunun kaldırılması
ECM 830 Kare Dalga Elektroporasyon SistemiBTXECM830Hücrelerin elektroporasyonu
EDTA Na2BioSharpBS108TAE tampon çözeltisi hazırlama reaktifleri
Elektrikli termostatik su banyosuSHANGHAI SUMSUNG LABORATORY INSTRUMENT CO.,LTDDKD8Sıcaklık kontrollü inkübasyon
Elektroforez Cihazı TrophoresisLIUYIDYCP-31BNAgarose jel elektroforezi
Jel Görüntüleme analiz sistemiShanghHai JiaPengZF-258Jel görselleştirme ve görüntüleme
GenCRISPR SpCas9GenScriptZ03624-GMP-2.5Genom düzenleme için Cas9 nükleaz
Genomik DNA ekstraksiyon kitiTIANGENYDP304Genomik DNA izolasyonu
HiScribe T7 Yüksek Verimli RNA Sentez KitiNEBE2040SsgRNA'nın in vitro transkripsiyonu
MiniAmp TermosikllerThermo Scientific A37834PCR amplifikasyonu
NanoDrop 2000c SpektrofotometreThermo Scientific 2000cNükleik asit kantitasyonu
Nükleik asit boyası (örn., GeneRed)TIANGENRT211Agarose jelde DNA görselleştirme
PCR Using Q5 Quick-Load High-Fidelity 2X Master MixNEBM0578Yüksek sadakatli PCR amplifikasyonu
Primers (AF1, AF2, AF3, Tracr-R)GenScriptsgRNA şablon montajı için oligonükleotidler
Tris-bazBioSharpBS083TAE tampon çözeltisi hazırlama reaktifleri
VAHTS RNA Temiz BoncuklarıVAHTSN412-01RNA saflaştırma

Kaynaklar

  1. Tamura, R., Kamiyama, D. CRISPR-Cas9-mediated knock-in approach to insert the GFP(11) tag into the genome of a human cell line. Methods Mol Biol. 2564, 185-201 (2023).
  2. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  3. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  4. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  5. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  6. Graf, R., Li, X., Chu, V. T., Rajewsky, K. sgRNA sequence motifs blocking efficient CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Cell Rep. 26 (5), 1098 (2019).
  7. Hendel, A., et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat Biotechnol. 33 (9), 985-989 (2015).
  8. Brunetti, L., et al. Highly efficient gene disruption of murine and human hematopoietic progenitor cells by CRISPR/Cas9. J Vis Exp. (134), e57278 (2018).
  9. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  10. Bien, H. . Qiagen QIAquick gel extraction kit (28704 and 28706), centrifuge processing. , (2015).
  11. MalagodaPathiranage, K., Banerjee, R., Martin, C. T. A new approach to RNA synthesis: immobilization of stably and functionally co-tethered promoter DNA and T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Res. 52 (17), 10607-10618 (2024).
  12. Xiao, G., et al. Direct detection from sputum for drug-resistant Mycobacterium tuberculosis using a CRISPR-Cas14a-based approach. BMC Microbiol. 25 (1), 188 (2025).
  13. Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).
  14. Hu, Z., et al. Customized one-step preparation of sgRNA transcription templates via overlapping PCR using short primers and their application in vitro and in vivo gene editing. Cell Biosci. 9 (1), 25 (2019).
  15. Pan, C., et al. A new method to synthesize multiple gRNA libraries and functional mapping of mammalian H3K4me3 regions. Nucleic Acids Res. 51 (9), e52 (2023).
  16. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  17. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  18. Nageshwaran, S., et al. CRISPR guide RNA cloning for mammalian systems. J Vis Exp. (140), e57998 (2018).
  19. Basila, M., Kelley, M. L., Smith, A. V. B. Minimal 2'-O-methyl phosphorothioate linkage modification pattern of synthetic guide RNAs for increased stability and efficient CRISPR-Cas9 gene editing avoiding cellular toxicity. PLoS One. 12 (11), e0188593 (2017).
  20. Kratschmer, C., Levy, M. Effect of chemical modifications on aptamer stability in serum. Nucleic Acid Ther. 27 (6), 335-344 (2017).
  21. Maio, G., et al. Systematic optimization and modification of a DNA aptamer with 2'-O-methyl RNA analogues. ChemistrySelect. 2 (7), 2335-2340 (2017).
  22. Pasternak, A., et al. A chemical synthesis of LNA-2,6-diaminopurine riboside, and the influence of 2'-O-methyl-2,6-diaminopurine and LNA-2,6-diaminopurine ribosides on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 35 (12), 4055-4063 (2007).
  23. Shang, Z., et al. CRISPR/Cas12a with Universal crRNA for Indiscriminate Virus Detection. Molecules. 29 (24), 5842 (2024).
  24. Wang, Z., et al. crRNA scaffold remodeling controls CRISPR–Cas12a activity for enhanced performance. Nucleic Acids Res. 54 (5), 2310-2325 (2026).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

DNA Kal p SenteziIn Vitro TranskripsiyonPrimer OptimizasyonuAgaroz Jel ElektroforeziRibon kleoprotein KompleksiElektroporasyonGenom D zenleme

İlgili makaleler