Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Koroner Endarter Baypas Grefti Hastalarının Koroner Endarterektomi Dokusundan Tek Çekirdek İzolasyonu

699 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70382

⸱

3 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biotechnology, Gujarat Biotechnology University, 2U. N. Mehta Institute of Cardiology and Research Centre

Bu makalede

Özet

Koroner endarterektomi doku örnekleri, optimize edilmiş bir dissosiyasyon protokolü kullanılarak tek çekirdekleri izole etmek için işlendi. İzole çekirdeklerin bütünlüğü üç tamamlayıcı yaklaşımla doğrulandı: zar bütünlüğünü değerlendirmek için tripan mavisi dışlama boyama, nükleer morfolojiyi doğrulamak için DAPI tabanlı konfokal mikroskopi ve nükleer verim ile saflığı nicelikten ölçemek için akış sitometrisi.

Özet

Ateroskleroz, arter duvarlarında plak birikmesiyle karakterize edilen, kronik, ilerleyici bir iltihap durumdur. Plak oluşumunun ilerlemesi sırasında, bazı lezyonlar yüksek riskli plaklar olarak adlandırılan kararsız hale gelir ve miyokard enfarktüsüne (MI) neden olma potansiyeline sahiptir. Aterosklerotik plak, düz kas hücreleri, endotel hücreleri, bağışıklık hücreleri, yağ hücreleri ve nekrotik hücrelerden oluşur; bunların herhangi biri plak yırtılmasına neden olabilir. Aterosklerotik plaklar içindeki hücresel heterojenliği incelemek, plak instabilitesinin altında yatan mekanizmaları daha iyi anlamak için çok önemlidir. Koroner arter bypass grefti (CABG) ameliyatı geçiren hastalardan alınan insan koroner endarterektomi dokusundan çekirdeklerin izole edilmesi ve doğrulanması için kolayca tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. Tüm dokular, hasat öncesi hücresel bütünlüğü korumak için Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamında ıslak buz üzerinde tutulur. Doku örnekleri ince doğranır ve ardından liz tamponunda mikro tokmakla nazikçe bozularak hücreleri parçalayıp çekirdekleri serbest bırakır. İzole çekirdekler, bileşik ters mikroskopta trypan blue dışlama testi kullanılarak bütünlük ve verim açısından değerlendirilir. DAPI boyama, konfokal mikroskopi ile sağlam çekirdeklerin görselleştirilmesini sağlar ve akış sitometrisi, nükleer izolasyon verimini değerlendirmek ve nükleer popülasyonu doğrulamak için floresans tabanlı nicelik sağlar. Tek hücre ayrıştırma yoluyla geleneksel izolasyon yöntemlerinin aksine, nükleer izolasyon hücresel stresi azaltır ve doğal transkriptomik ortamı korur, böylece gen ifadesindeki değişiklikleri önler. Bu yöntemle elde edilen yüksek kaliteli nükleer hazırlık, tek çekirdekli RNA dizileme (snRNA-seq) gibi sonraki uygulamalarla uyumludur.

Giriş

Aterosklerotik kardiyovasküler hastalık (ASCVD), dünyanın önde gelen ölüm ve engellilik nedenidir ve büyük terapötik gelişmelere rağmen yükü azalmamıştır1. Ateroskleroz, çeşitli hücre popülasyonları arasındaki karmaşık ve dinamik etkileşimlerle tetiklenen ve erken subklinik hastalıktan hayatı değiştiren kardiyovasküler (CV) olaylarına sessiz ilerlemeyi organize eden arteral duvarın kronik bir inflamatuarhastalığıdır 2.

Orta ve büyük arterlerde, makrofajlarda kolesterol birikiminin birikimiateroskleroz 3'ün bir özelliğidir. Aterosklerotik plak, yağ asitleri, kolesterol, inflamatuar hücreler, kalsiyum, fibrin, düz kas hücreleri, endotel hücreleri ve subendotel 4 içindeki hücresel kalıntılardan oluşur. Aterosklerotik plaklar iki tipe ayrılır: düşük riskli ve yüksek riskli. Yüksek riskli plaklar, genellikle plak erozyonu veya yırtma gibi mekanizmalar yoluyla sonraki kardiyovasküler olayları tetiklemeeğilimleriyle tanımlanır.

Yüksek riskli plakların özellikleri arasında büyük lipid çekirdekleri, birkaç iltihap hücresi, daha az düz kas hücresi, ince lifli kapalı, mikrokalsifikasyon, plak içi kanama, neo damarlar ve nekrotik çekirdekbulunur 6. Yüksek riskli plakların tespiti, invaziv olmayan ve invaziv görüntüleme yöntemleri olan koroner bilgisayar tomografisi anjiyografi (CCTA) ve optik koherens tomografi (OCT) ile klinik olarakgerçekleştirilir; sırasıyla 7,8. Kardiyovasküler görüntülemede çok sayıda ilerleme olmasına rağmen, miyokard enfarktüsüne (MI) neden olan aterosklerotik plak yırtılmasını tahmin etmek hâlâ zordur ve klinik ortamlarda her zaman faydalıdeğildir 9.

Onlarca yıllık araştırmalara rağmen, yüksek riskli plak fenotiplerini özel olarak belirleyebilen güvenilir dolaşımda biyobelirteçlere hâlâ eksiklik var ve bu da aterosklerozun klinik yönetiminde kritik bir boşluk bırakıyor. Bu, bu plakları daha temel biyolojikseviyede karakterize edebilecek moleküler stratejilere olan ihtiyacı vurgulamaktadır 7,10. Bu bağlamda, RNA tabanlı belirteçler, plak mikro ortamında gerçekleşen karmaşık transkripsiyonel aktiviteyi yakalayabildikleri için önemli ilgigörmüştür. Tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq) konusundaki son gelişmeler özellikle güçlü olmuştur; aterosklerotik plaklar içindeki bireysel hücreleri profillemek ve plak açıklığının altında yatan farklı hücre popülasyonlarını, gen ifade desenlerini ve moleküler yolları ortaya çıkarmak için eşi benzeri görülmemiş bir çözüm sunmaktadır12,13. Bu gelişmelere rağmen, ateroskleroz gelişiminde rol oynayan çeşitli hücre tiplerinin düzenleyici süreçleri, etkileşimleri ve işlevsel önemi hakkında çok az bilgibulunmaktadır 14.

Aterosklerotik yük ağır ve yaygın olduğunda, cerrahi revaskülarizasiya kesin tedavi stratejisi haline gelir. Koroner endarterektomi (CE), koroner arter bypass grefti (CABG) cerrahisi için cerrahi bir ek yöntemdir ve burada aterosklerotik plak yaygın hastalıklı koroner arterlerden mekanik olarak alınarak bypass greftini mümkün kılır ve tam miyokardiyal revaskülarizasiyasağlanır 15,16. Aterosklerotik plaklar ve endarterektomi örnekleri, bol miktarda nekrotik doku, lipid birikintileri, fibrin ve kalsifikasyon içerdikleri için çalışmak özellikle zordur. Bu dokular analiz için parçalandığında, filtreleri ve mikrofluidik sistemleri tıkayan önemli bir kalıntı oluşturur ve canlı tek hücrelerin izolasyonunu son derecezorlaştırır 17,18. Aslında, bir karotis plak çalışması, canlı hücrelerin doku işlemeden sonra tüm parçacıkların %1'inden azını oluşturduğunu buldu; geri kalan ise sadece plaka enkazı18'di.

Bu zorluğu daha da artıran bir nokta, aterosklerotik plakların kronik metabolik ve oksidatif stres durumunda bulunmasıdır; burada hücreler apoptoz, yaşlanma ve diğer dejeneratif süreçlerden geçen hücreler hücre zarlarını giderek daha kırılgan ve bozulmaya açık hale getirir; bu da canlı tek hücrelerin izolasyonunu son derecezorlaştırır 18,19,20 . ScRNA-seq için örneklerin hazırlanmasında gereken mekanik ve enzimatik sindirim, zaten zayıf olan hücrelere zarar verir, bu da canlılığı daha da azaltır ve hücre yakalama oranlarının düşmesine yol açar. Bu süreç ayrıca, hassas veya nadir hücre popülasyonlarını seçici olarak kaybetme eğilimindedir ve bu da hem transkriptomik verilere hem de nihai sonuçlarda temsil edilen hücre tiplerine önemli bir önyargı getirir. Bu sorun, dokuyu parçalamak için gereken zorlu işleme koşullarının hücre canlılığına ek zarar verdiği kalsifleşmiş veya ağır hastalıklı plaklarda daha da belirginhale gelir 18,21,22.

Buna karşılık, çekirdek bu olumsuz koşullar altında bile yapısal olarak sağlamkalır 23. Bunun başlıca nedeni, nükleer laminlerle (Lamin A/C ve Lamin B) güçlendirilmiş çift lipid çift katmanlı nükleer zarfdır ve plazmazarını kolayca bozan osmotik, enzimatik ve fiziksel gerilimlere karşı mekanik rijitlik ve direnç sağlar. Nükleer lamina, çevredeki sitoplazma ciddi şekilde bozulduğunda bile nükleermorfolojiyi korur 26. Bu da tek çekirdekli RNA dizilemesini (snRNA-seq), aterosklerotik doku27 profili için tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq) yerine daha pratik ve güvenilir bir alternatif haline getirir. Tüm hücreler yerine sağlam çekirdeklerden transkripsiyon bilgisi yakalayarak, snRNA-seq zayıf hücre canlılığı ve yüksek debris içeriğinin getirdiği sınırlamaları aşarak plak mikroçevresinin daha doğru ve kapsamlı transkriptomikprofillenmesini sağlar 18.

Bu nedenle, bu çalışmada, koroner endarterektomi dokusu için özel olarak geliştirilmiş optimize edilmiş bir çekirdek izolasyon protokolü sunuyoruz; bu protokol, iyonsuz deterjan bazlı lizis ve doku kalsifikasyon derecesine göre ampirik olarak ayarlanmış liz süresini içeriyor; böylece koruyucu yapısal ve RNA bütünlüğüne sahip yüksek kaliteli çekirdekler elde ediliyor; böylece sonraki snRNA-seq analizine uygun yüksek kaliteli çekirdekler elde edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Mevcut çalışma, U. N. Mehta Kardiyoloji ve Araştırma Enstitüsü İnsan Etik Komitesi'nin (EC/Onay/26/Kardiyo/14/12/2024) ve Gujarat Biyoteknoloji Üniversitesi (GBU_IHEC/2023/006) İnsan Etik Komitesi'nin rehberlerine uygun olarak ve onayla gerçekleştirilmiştir. Örnek toplamadan önce tüm katılımcılardan bilgilendirilmiş onay alındı. Koroner arter bypass grefti ameliyatı yapılan hastalar mevcut çalışma için seçildi. Cerrahi çıkarmanın ardından, endarterektomi dokusu hemen serumsuz RPMI ortamına kondu, 4 °C'de tutuldu ve yaklaşık 12 saat içinde bir kriyoviyal içinde laboratuvara taşındı. Aşağıdaki protokolde kullanılan tüm malzemelerle ilgili detaylar için Materyal Tablosu'na bakınız.

1. Çekirdek izolasyonu

NOT: Tüm adımları buz üzerinde yapın ve steril malzemeler kullanın. Tüm tamponları taze hazırlayın.

  1. Kan lekelerini ve parçalarını çıkarmak için dokuyu serumsuz RPMI ortamıyla bir veya iki kez yıkayın. Steril forseps kullanarak dokuyu steril bir petri kabına aktarın ve ağırlığı kaydedin.
  2. Cerrahi bir bıçak (no. 10) kullanılarak dokuyu ∼1 mm3 boyutunda küçük parçalara indirin.
  3. 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 (her bileşen için 1 M stok çözeltileriyle), %0.1 (v/v) Nonidet P-40'ı nükleazsız suda birleştirerek 1 mL lizis tamponu hazırlayın. Bileşenleri sıralı olarak şu sırayla ekleyin: önce nukleazsız su, ardından Tris-HCl, NaCl, MgCl₂ ve NP-40 en son olarak, köpüklenmemeyi önlemek için.
    NOT: Liz tamponu kullanım gününde taze hazırlanmalı ve her zaman buz üzerinde soğutulmuş tutulmalıdır. Donma.
  4. Dokuya 5 mL mikrosantrifüj tüpünde soğutulan 1 mL liz tamponu ekleyin.
  5. Mikro tokmakla dokuyu buz üzerinde nazik ve tutarlı bir kuvvet uygulayarak ve mikro tokmağı saat yönü, saat yönünün tersine dönüşümlü olarak döndürerek parçalayın. Lizisi yaklaşık 30 dakika boyunca devam ettirin, böylece numune tüm süre boyunca soğuk kaldığından emin olun.
    NOT: Dokuyu bulanık hale gelene kadar lize edin. 1000 μL uçla pipetle nazikçe karıştırın.
  6. Çözeltiyi 100 μm gözenek büyüklüğünde bir süzgeçle 15 mL'lik santrifüj tüpüne filtreleyerek kalıntıları ve doku parçalarını çıkarabilirsiniz.
    NOT: Filtrat, süzgeçte görünür kalıntılar kalmış gibi görünerek daha az bulanık görünmelidir.
  7. Çekirdekleri 500 x g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de sallanan bir kovalı rotorla santrifüjleyin.
    NOT: Tüpün tabanında görünür bir pelet oluşmalıdır.
  8. Süpernatantı, pelleti rahatsız etmeden normal delikli pipet ucu ile çıkarın.
  9. Çekirdek yıkama ve yeniden süspansiyon tamponu hazırlanır; %1 sığır serum albümini (BSA) (%10 stok çözeltisi kullanılarak), 0.2 U/μL RNase inhibitörü (20 U/μL stok çözeltisi kullanılarak) 1X Dulbecco fosfat tampon tuzlu sümükle (DPBS) birleştirilir. Bileşenleri sıralı olarak şu sırayla ekleyin: önce DPBS, sonra BSA ve son olarak RNase inhibitörü.
    NOT: Tampon kullanım gününde taze hazırlanmalı ve her zaman buz üzerinde soğutulmuş tutulmalıdır. Donma.
  10. Pelleti çekirdek yıkama ve yeniden süspansiyon tamponu içinde yeniden askıya alın. Kullanmadan önce tamponu buzda soğutun.
  11. 5 μL tripan mavisi ile boyanarak ve hemositometrede sayarak liz verimliliğini ve hücre canlılığını değerlendirin.
    NOT: Eğer canlı hücreler hâlâ mevcutsa, 500 x g ile 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın, ardından 3-10 bölümleri tekrarlayın.
  12. Çözeltiyi 30 μm gözenek büyüklüğünde bir süzgeçle 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne filtreleyerek kirıntı ve kümeleri temizleyin.
  13. Çekirdekleri 500 x g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de sallanan bir kovalı rotorla santrifüjleyin.
  14. Süpernatantı normal delikli pipet ucu ile çıkarın, ardından pelleti 1 mL çekirdek yıkama ve yeniden süspansiyon tamponu içinde tekrar askıya alın.

2. İzole çekirdeklerin karakterizasyonu

  1. Çekirdeklerin bütünlüğünü değerlendirmek için trypan mavisi boyama.
    1. İzole çekirdeklerin 15 μL'sini 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde alın.
    2. 5 μL tripan mavi boya (%0,4 w/v) ekleyin ve pipetle nazikçe karıştırın.
    3. Doğru boyama için oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın.
    4. Boyalı karışımdan 10 μL hemositometreye yüklenin.
    5. Morfolojiyi incelemek ve çekirdek sayısını saymak için bileşik ters mikroskop altında gözlemleyin.
  2. Tek çekirdekli süspansiyonun akış sitometrisi analizi
    1. 1 mL izole çekirdek süspansiyonu alın ve çekirdek süspansiyonunu 500 x g sıcaklığında 4 °C'de 5 dakika boyunca salıncak kovalı rotor kullanarak santrifüj yapın.
    2. Üst yüzeyi normal delikli pipet ucu ile çıkarın ve pelleti 200 μL FACS Buffer'da (1X PBS ve %1 BSA) tekrar askıya alın.
    3. 200 μL yeniden askıya alınmış çekirdekleri iki aliquot'a ayırın: 100 μL'yi lekelenmemiş kontrol olarak kalın, 100 μL'yi boyalı örnek olarak kullanın.
    4. Boyalı numuneye 1 μL 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1 mg/mL stok) ekleyerek nihai konsantrasyon 10 μg/mL elde edilir. Akış sitometrik analizinden önce nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında karanlıkta 5 dakika kuluçka yapın.
    5. Bu çalışmada kullanılan akış sitometresinde, 405 nm'de mor lazeri kullanın ve 448/45 nm ile tespit yapın. Önce lekelenmemiş kontrol örneğini inceleyin ve toplam popülasyondan en az 10.000 olay alın.
    6. Gerilimi ileri saçılma (FSC) için 183 V, yan saçılma için 300 V (SSC) ve V450 için 400 V (DAPI Lazer) olarak ayarlayın. FSC için eşik değerini 10.000 olarak ayarlayın.
      NOT: Tüm enstrüman voltajı ve kazanç ayarları tutarlılığı sağlamak için örnekler arasında sabittir.
    7. Tekletleri çiftlerden ve agregatlardan ayırt etmek için ileri saçılma alanı (FSC-A) ile ileri saçılma yüksekliği (FSC-H) çizimini yapın. Doğrusal bir ilişki gösteren olayların etrafına bir kapı çizerek sadece singlet çekirdeklerini kalın.
    8. FSC-A ile yan saçılım alanı (SSC-A) arasında çift değişkenli bir grafik oluşturun. İzole çekirdekler genellikle farklı alt popülasyonlar olmadan heterojen bir saçılım profili sergilediği için, tüm saçılım popülasyonunu kapsayan geniş bir kapı uygulanır.
    9. SSC-A ile Violet 450 nm-alan (V450-A) arasında 2B yoğunluk (sahte renk) bir grafik oluşturun. Arka plan floresansını tanımlamak ve kapı yerleştirmesini kesin şekilde yönlendirmek için lekesiz kontrolü kullanın. Sağlam çekirdeklere karşılık gelen farklı DAPI⁺ popülasyonunu tespit edip kaplayın.
      NOT: Tek bir florokrom (DAPI) kullanıldığı için floresans telafisi gerekmez.
  3. İzole çekirdeklerin konfokal mikroskopi ile görüntülenmesi
    1. 50 μL çekirdek süspansiyonu alın ve boyalı numuneye 1 μL DAPI (1 mg/mL) ekleyin, böylece nihai konsantrasyon 10 μg/mL elde edilir, nazikçe karıştırın ve konfokal görüntülemeden önce oda sıcaklığında karanlıkta 5 dakika kuluçka yapın.
    2. 5 μL boyalı çekirdek süspansiyonunu temiz bir cam sürgüye monte edin ve örtü ile örtün.
      NOT: Nükleer morfolojiyi korumak için fiksasyondan kaçının.
    3. Çekirdekleri ters konfokal mikroskopla görselleştirin. Konfokal mikroskop yazılımını açın ve önce 10X parlaklık alanda gözlemleyin, sonra 40X parlak alana geçin.
    4. Spektral dedektör ve hedeflerle donatılmış lazer taramalı konfokal mikroskop kullanılarak konfokal görüntüler alın PLAN APO λD 40X (NA 0.95, RI 1.0). DAPI'yi 405 nm lazer kullanarak uyarın ve 429-474 nm arası emisyon toplayın.
    5. Görüntüleme parametreleri şu şekildeydi:
      1. Dedektör modu: Çok kanallı (GaAsP)
      2. Tarayıcı: Galvano tek yönlü
      3. Tarama modu: Bant
      4. Çizgi ortalaması: 2X
      5. Çözünürlük: 1024 × 1024 piksel
      6. Bekleme süresi: 2.0 μs
      7. İğne deliği boyutu: 47,7 μm
      8. Lazer gücü: %0,1-9,3 (alan yoğunluğuna bağlı olarak)
      9. Dedektör kazancı: %37,8-45,9
      10. Zoom: 1.0X
      11. Kalibrasyon: 0.43-0.58 μm/piksel
    6. Tüm görüntüleri AX kamera ile minimal çapraz konuşma moduyla aynı optik konfigürasyonlarda alın ve z-düzlem stabilitesini korumak için görüntüleme sırasında mükemmel odak sistemi (PFS) aktif olmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İnsan koroner endarterektomi dokusu, CABG ameliyatı geçiren hastalardan toplandı. Doku çekirdek izolyasyonu için tartıldı ve işlendi, ayrıca izole edilmiş çekirdekler akış sitometrisi ve konfokal mikroskopi ile doğrulandı (Şekil 1).

Trypan Blue çekirdek izolasyon kalitesi değerlendirmesi
RPMI ortamında tutulan doku tartıldı ve 247,8 mg ölçüldü. Doku doğranmış, ardından nükleer izolasyon için mikro tahrik kullanılarak lizis tamponu içinde homoje...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İnsan koroner endarterektomi dokusundan çekirdeklerin izole edilmesi için optimize edilmiş bir iş akışı mevcut protokolde tanımlanmaktadır. Burada tanımlanan nükleer izolasyon protokolü, gelişmiş koroner aterosklerotik plaklardan canlı ve sağlam hücreler elde etme konusundaki kritik sınırlamaları aşmak için özel olarak tasarlanmıştır. Sert enzimatik sindirim ve mekanik ayrışmaya dayanan geleneksel scRNA-seqyaklaşımlarının aksine,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklaması gereken bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Hindistan Tıbbi Araştırmalar Konseyi (ICMR) (EM/Dev/SG/34/01106/2024) ve Ahmedabad'daki BM Mehta Kardiyoloji ve Araştırma Enstitüsü iş birliğiyle desteklenmiştir. Khushi Jani, Hindistan Hükümeti Üniversite Hibe Komisyonu (UGC) ve Bilimsel ve Endüstriyel Araştırma Konseyi'ne (CSIR), Ortak CSIR-UGC NET yeterliliğini (NTA Referans No.: 241620143543) verdikleri için teşekkür etmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100 μ M süzgeciMiltenyi Biotech 130-098-463
30 μ M süzgeciMiltenyi Biotech 130-098-458
Sığır Serum AlbüminiHiMediaTC546-25G
SantrifüjMPWNAhttps://mpw.pl/en/offer/mpw-352r
Bileşik MikroskopNikonNA Nikon Eclipse Ts2 ters mikroskobu (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ts2)
Konfokal Mikroskop NikonNANikon Ti2-E ters konfokal mikroskop (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series)
Kapak SlipleriHiMediaBG011C
CRYOCHIL Geniş Ağızlı Numune ŞişesiTarsons883191
DAPISigmaD9542-5MG
DPBSGibco (Thermofischer)10010-023
Santrifüj Tüpü (15 mL)Tarsons546021
Akış sitometresi BD Biosciences663029BD FACSLyric (3L12C Enstrüman CEIVD)
HemositometreAxibioCCB 100
Mikrosantrifüj Tüpü (1.5 mL)Tarsons500010C
Mikrosantrifüj Tüpü (5 mL)Tarsons500050
MgCl2SigmaM1028-100ML
Mikro havanTarsons160020
NaClSigmaS9888-500G
NP-40HiMediaMB143-100ML
Nukleazsız suGibco (Thermofischer)W4502-1L
RNase inhibitörüSigma333540201
RPMI 1640Gibco (Thermofischer)11875093
Slide Riviera72910135
Tris-HÇLSigmaT2194-100ML
Trypan blue Sigma302643-25G

Kaynaklar

  1. Roth, G. A., et al. Global burden of cardiovascular diseases and risk factors- 1990-2019. J. Am. Coll. Cardiol. 76 (25), 2982-3021 (2020).
  2. de Winther, M. P. J., et al. Translational opportunities of single-cell biology in atherosclerosis. Eur. Heart J. 44 (14), 1216-1230 (2023).
  3. Mohebbati, R., Momeni-Moghaddam, M. A. The role of red blood cells in cholesterol accumulation and atherosclerotic plaque instability: a perspective on atherosclerosis. Curr. Cardiol. Rev. 21 (5), (2025).
  4. Ajoolabady, A., et al. Inflammation in atherosclerosis: pathophysiology and mechanisms. Cell Death Dis. 15 (11), 817(2024).
  5. Dawson, L. P., Layland, J. High-risk coronary plaque features: a narrative review. Cardiol. Ther. 11 (3), 319-335 (2022).
  6. Tong, W., et al. Highly sensitive magnetic particle imaging of vulnerable atherosclerotic plaque with active myeloperoxidase-targeted nanoparticles. Theranostics. 12 (17), 7641-7641 (2022).
  7. Lu, G., et al. Coronary computed tomography angiography assessment of high-risk plaques in predicting acute coronary syndrome. Front. Cardiovasc. Med. 8, (2021).
  8. Kinoshita, D., et al. High-risk plaques on coronary computed tomography angiography. JACC Cardiovasc. Imaging. 17 (4), 382-391 (2024).
  9. Canu, M., et al. Non-invasive multimodality imaging of coronary vulnerable patient. Front. Cardiovasc. Med. 9, (2022).
  10. Liu, X., et al. Assessment of coronary computed tomography angiography-derived plaque features in the diagnosis of optical coherence tomography-defined vulnerable plaques. Quant. Imaging Med. Surg. 15 (3), 2029-2041 (2025).
  11. Chiorescu, R. M., et al. Vulnerable atherosclerotic plaque: is there a molecular signature. Int. J. Mol. Sci. 23 (21), 13638(2022).
  12. The applications of single-cell RNA sequencing in atherosclerotic disease. Front. Cardiovasc. Med. Slenders, L., Tessels, D. E., van der Laan, S. W., Pasterkamp, G., Mokry, M. 9, (2022).
  13. Adam, C. A., et al. Novel biomarkers of atherosclerotic vascular disease-latest insights in the research field. Int. J. Mol. Sci. 23 (9), 4998(2022).
  14. Ye, W., Chen, Z., Xia, Z., Li, D. Single-cell RNA sequencing in human atherosclerotic plaques reveals a novel smooth muscle cell subtype that possesses multi differentiation potential and shapes the microenvironment. Clin. Exp. Med. 25 (1), 251(2025).
  15. Kelly, J. J., et al. Coronary endarterectomy: analysis of the society of thoracic surgeons adult cardiac surgery database. Ann. Thorac. Surg. 114 (3), 667-674 (2022).
  16. Ghatanatti, R. Coronary endarterectomy: recent trends. J. Clin. DIAGNOSTIC Res. , (2017).
  17. Li, Y., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic cell populations and differential gene expression patterns in control and aneurysmal human aortic tissue. Circulation. 142 (14), 1374-1388 (2020).
  18. Alsaigh, T., Evans, D., Frankel, D., Torkamani, A. Decoding the transcriptome of calcified atherosclerotic plaque at single-cell resolution. Commun. Biol. 5 (1), 1084(2022).
  19. Iqbal, F., Lupieri, A., Aikawa, M., Aikawa, E. Harnessing single-cell RNA sequencing to better understand how diseased cells behave the way they do in cardiovascular disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 41 (2), 585-600 (2021).
  20. Ahmad, H., et al. Single cell RNA sequencing of haematopoietic cells in fresh and frozen human atheroma tissue. Cardiovasc. Res. 121 (3), 396-404 (2025).
  21. Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circ. Res. 127 (11), 1437-1455 (2020).
  22. Williams, J. W., et al. Single cell RNA sequencing in atherosclerosis research. Circ. Res. 126 (9), 1112-1126 (2020).
  23. Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. -A., Lee, H. -O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J. Pathol. Transl. Med. 57 (1), 52-59 (2023).
  24. Gruenbaum, Y., Foisner, R. Lamins: Nuclear intermediate filament proteins with fundamental functions in nuclear mechanics and genome regulation. Annu. Rev. Biochem. 84 (1), 131-164 (2015).
  25. Zwerger, M., Ho, C. Y., Lammerding, J. Nuclear mechanics in disease. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13 (1), 397-428 (2011).
  26. Dechat, T., et al. Nuclear lamins: major factors in the structural organization and function of the nucleus and chromatin. Genes Dev. 22 (7), 832-853 (2008).
  27. Oh, J. -M., et al. Comparison of cell type distribution between single-cell and single-nucleus RNA sequencing: enrichment of adherent cell types in single-nucleus RNA sequencing. Exp. Mol. Med. 54 (12), 2128-2134 (2022).
  28. Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nat. Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).
  29. Gulko, A., et al. Protocol for flow cytometry-assisted single-nucleus RNA sequencing of human and mouse adipose tissue with sample multiplexing. STAR Protoc. 5 (1), 102893(2024).
  30. Fernandez, D. M., et al. Single-cell immune landscape of human atherosclerotic plaques. Nat. Med. 25 (10), 1576-1588 (2019).
  31. Galvis, A. E., Fisher, H., Camerini, D. NP-40 fractionation and nucleic acid extraction in mammalian cells. BIO-PROTOCOL. 7 (20), (2017).
  32. Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nat. Med. 25 (8), 1280-1289 (2019).
  33. Pan, H., et al. Single-cell genomics reveals a novel cell state during smooth muscle cell phenotypic switching and potential therapeutic targets for atherosclerosis in mouse and human. Circulation. 142 (21), 2060-2075 (2020).
  34. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).
  35. Litviňuková, M., et al. Cells of the adult human heart. Nature. 588 (7838), 466-472 (2020).
  36. Hu, P., et al. Single-nucleus transcriptomic survey of cell diversity and functional maturation in postnatal mammalian hearts. Genes Dev. 32 (19-20), 1344-1357 (2018).
  37. Rani, U., et al. Evaluation of use of RPMI Medium to preserve cell morphology for pleural/peritoneal fluid cytology. J. Cytol. 39 (1), 26-29 (2022).
  38. Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends Cell Biol. 31 (11), 888-897 (2021).
  39. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat. Med. 26 (5), 792-802 (2020).
  40. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nat. Protoc. 11 (3), 499-524 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Aterosklerotik Plakekirdek zolasyon ProtokolAk SitometrisiKonfokal MikroskopiTrypan Blue BoyamaDAPI BoyamaTek ekirdek RNA DizilemeH cresel Heterojenite
Koroner Endarter Baypas Grefti Hastalarının Koroner Endarterektomi Dokusundan Tek Çekirdek İzolasyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.