Kronik Obstrüktif Akciğer Hastalığında Buti Huatan Tang'ın Bütüncül Multi-Omik Analizi

Özet

Kronik obstruktif akciğer hastalığında Buti Huatan Tang'ın (BTHTT) çoklu omik profillemesi, IL-1R2/IL-1β-tiroid hormonu metabolik eksenini modüle etme potansiyelini ortaya koymaktadır. Bu çalışma, BTHTT'nin biyoaktif bileşenlerinin daha mekanik doğrulaması için bir çerçeve sağlar ve bu ekseni doğrulamak için gelecekteki nedensel müdahale çalışmaları için temel oluşturur.

Özet

Bu çalışma, kronik obstruktif akciğer hastalığına (KOAH) karşı Geleneksel Çin Tıbbı (TCM) formülü Buti Huatan Tang'ın (BTHTT) terapötik potansiyelini incelemek için çoklu omik ve hesaplamalı biyoloji çerçevesi kullandı. BTHTT müdahalesi sonrası bir fare modelinde önemli fizyolojik iyileşmeler gözlemlenmiştir. Histolojik analizler akciğer patolojik hasarının tersine döndüğünü gösterirken, biyokimyasal testler ve transkriptomikler IL-1β ve IL-1R2 seviyelerinin normalleştiğini doğruladı. Ayrıca, metabolik profilleme BTHTT'nin T3 ve T4 tiroid hormon seviyelerindeki bozulmaları düzelttiğini ortaya koydu. IL-1β/IL-1R2 ekseni ile bu tiroid hormonları arasında negatif bir korelasyon gözlemlendi; bu da bu hormonların düzenlenmesinin formülün terapötik etkisiyle ilişkili olduğunu gösteriyor. Doğrudan ölçümlerin ötesinde, makine öğrenimi algoritmaları klinik veritabanlarından on KOAH imza genini tespit etti. Yol zenginleştirme analizi, BTHTT'nin sitokin-sitokin-reseptör etkileşimleri ve tiroid hormonu sentezi yolları aracılığıyla etki gösterebileceğini göstermektedir. Ayrıca, in vivo 283 bileşen tespit edilmiş olsa da, tanshinone IIA ve kriptotanshinon gibi bileşikler şu anda aktif madde aday olarak kabul edilmektedir. Birincil sürücü olarak rolleri, IL-1R2'ye istikrarlı şekilde bağlandıkları bir model tarafından desteklenmektedir; bu çıkarım, doğrudan deneysel izolasyon yerine moleküler kenetlenme ve moleküler dinamik (MD) simülasyonlarına dayanır. Genel olarak, veriler BTHTT'nin iltihap ve metabolik homeostazı modüle ederek KOAH üzerinde çoklu hedefli etki yarattığı bir modeli desteklemektedir. Bu entegre yaklaşım, BTHTT'nin klinik uygulaması için gelişmiş bir bilimsel temel sağlar ve gelecekteki deneysel doğrulama için özel yolları vurgular.

Giriş

Kronik obstruktif akciğer hastalığı (KOAH), klinik uygulamada en yaygın solunum yolu hastalıklarından biri olup, son derece yüksek engellilik oranı ve tekrarlayan akut alevlenmeleri nedeniyle dünya genelinde üçüncü en yaygın ölüm nedeni^{haline gelmiştir 1}. KOAH, nüfusun iş gücü kaybına ve aile bakım maliyetlerinde keskin bir artışa yol açan önemli bir faktördü; sosyal ve ekonomik kayıplar çoğu kronik hastalığın çok daha^{fazlasıdır 2}. "Sağlıklı Çin Girişimi 2030"da, KOAH önleme ve tedavi için önemli bir hastalık olarak listelenmiştir. KOAH'nın altında yatan mekanizmaların tam olarak anlaşılmaması nedeniyle, bronkodilatörler ve kortikosteroidlerin birleşik kullanımı birincil tedavi olarak kaldı. Bu yaklaşım nispeten belirgin bir semptom rahatlaması sağlasa da, akciğer fonksiyonundaki ilerleyici düşüşü önleyemez. Ayrıca, kortikosteroidlerin uzun vadeli kullanımı kaçınılmaz olarak yan reaksiyon sıklığını artırır ve ilaçların uzun vadeli etkinliğini ve hastaların toleransını daha da etkiler³. Çalışmalar, üçlü terapiye rağmen, hastaların %28–%31'inin hala akut alevlenmeler veya semptomların kötüleşmesini yaşadığını göstermiştir. Bu nedenle, KOAH için etkili ilaçların geliştirilmesi, güncel KOAH araştırmalarında kilit ve birincil bir konu^{olmaya devam eder 4}.

Bu ihtiyaçları karşılamak için Buti Huatan Tang (BTHTT), Shengmai Yin ve Bu Fei Tang gibi klasik TCM formülleri geliştirilmiştir. Bunlar arasında, BTHTT özellikle akciğerin tonlaşmasını, enerjiyi artırmasını, balgamı çözmede öksürüğü hafifletmek için^{önemli etkileriyle dikkat çekmiştir} 5,6,7,8. BTHTT, yalnızca olağanüstü etkinliği ve minimal yan etkileri nedeniyle değil, aynı zamanda akciğer fonksiyonundaki ilerleyici düşüşü tersine çevirme potansiyeli nedeniyle KOAH klinik tedavisinde yaygın olarak kullanılmıştır. Klinik ve sosyal bağlamlarda büyük umut vaat ediyordu ve önemli bilimsel ve ekonomik değere sahip "ikincil gelişim" potansiyeline sahipti; 9,10,11,12. Ancak, sistematik, uzun vadeli bilimsel araştırmaların eksikliği nedeniyle, BTHTT üzerine yapılan çalışmalar genellikle bileşen temelinin anlaşılamaması ve belirlenmemiş temel eylem hedefleri nedeniyle olumsuz etkilenmiştir. Temelde, bu BTHTT'nin ana mekanizması ve potansiyel terapötik madde temeli üzerine yapılan araştırmalarda önemli eksikliklerden kaynaklanıyordu.

Bu özelliğine yanıt olarak, metabolomik ve transkriptomik gibi çoklu omik teknolojileri ile çoklu algoritma madenciliği yöntemlerinin entegre edilmesi, vücudun mikro ortamındaki karakteristik anahtar genler ile anahtar metabolik yollar arasındaki ana korelasyonlara^odaklanmak 13,14,15 sadece tedavinin özünü keşfetmekle kalmaz, aynı zamanda aktif bileşenlerin sinerjik etkinliğini de değerlendirir. Özellikle tiroid hormon eksenine odaklanılır; çünkü yeni araştırmalar, tiroid disfonksiyonunun KOAH'ta sıkça bir eş hastalık olduğunu ve genellikle artan sistemik iltihap ve solunum kası fonksiyonunun bozulmasıyla ilişkili olduğunu göstermektedir. Bu eksenin modüle edilmesi, akciğer hastalığında metabolik homeostazın yeniden sağlanması için yeni bir yol^{olabilir 16,17}.

Özetle, bu çalışma çoklu omik entegrasyonu ile hesaplamalı biyolojiyi birleştiren üç yönlü bir yaklaşım benimsedi; bu yaklaşım sendrom ve formül uyumu varsayımına dayandı. Bir yandan, BTHTT'nin kan yoluyla bulaşan bileşenlerini etkili koşullarda tanımlamak için TCM serum farmakokimya tekniklerini kullandı. Öte yandan, KOAH'nin temel karakteristik genlerine odaklanarak, kapsamlı doku metabolomiği kullanarak endojen küçük moleküllerden hastalık biyobelirteçlerini keşfetti ve formülün genel etkilerinin hassas bir değerlendirmesini oluşturdu. Bu arada, çoklu algoritma madenciliği ve transkriptomik tanımlama analiziyle birleşince, BTHTT tarafından etkili koşullarda düzenlenen ana karakteristik genleri tespit etti ve ana karakteristik genler ile ana metabolik yollar arasında korelasyon analizi yaptı. Potansiyel terapötik madde temeli, moleküler kenetlenme ve moleküler dinamik analiziyle taranmıştır.

Multi-omik çerçevemiz ve BTHTT'nin farmakolojik profiline dayanarak, bu çalışma aşağıdaki test edilebilir tahminleri önermektedir. Antiinflamatuar modülasyon: BTHTT müdahalesi, özellikle IL-1β/IL-1R2 ekspresyon eksenini normalize ederek doku hasarını hafifletmek için sistemik ve akciğer iltihabı belirteçlerini önemli ölçüde azaltacaktır. Metabolik restorasyon: BTHTT, tiroid hormonu sentezi yolunda sinyalleri değiştirerek T3/T4 seviyelerinin ölçülebilir bir düzeltmesine ve ardından akciğer mikro ortamının metabolik durumunda iyileşmeye yol açar. Metabolik Restorasyon: BTHTT, tiroid hormonu sentezi yolunda sinyalleri değiştirerek T3/T4 seviyelerinin ölçülebilir bir düzeltmesine ve ardından akciğer mikroçevresinin metabolik durumunda iyileşmeye yol açar.

Protokol

NOT: Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

Klinik veri edinimi ve ön işleme

KOAH'nin moleküler imzalarını araştırmak için, transkriptomik veri setleri Gen İfadesi Omnibüsü (GEO) veritabanından alındı. Toplamda beş veri seti seçildi: GSE11784, GSE12472, GSE16972, GSE38974 ve GSE222965. Ham veri ve platform açıklama dosyaları, prob-gen haritalama için indirildi. Birden fazla prob tek bir geni hedeflediğinde, maksimum ifade değeri korunurdu. Ortaya çıkan gen ifade matrisleri (satırlar genler, sütunlar örnek olarak) tek bir keşif veri setinde birleştirildi. Farklı mikroarray platformları ve çalışma kohortları arasındaki teknik farklılıkları hesaba katmak için, sva R paketinden ComBat algoritması kullanılarak toplu etki düzeltmesi yapıldı. Düzeltmenin etkinliği Ana Bileşen Analizi (PCA) grafikleriyle doğrulandı. Toplu düzeltmenin ardından, birleştirilmiş keşif veri seti diferansiyel analiz için kullanıldı. KOAH hastaları ile sağlıklı kontroller arasında farklı ekspresyoner genler (DEG) limma paketi kullanılarak tanımlandı. Anlamlılık eşikleri |logFC| olarak belirlendi. ≥ 1 ve p ≤ 0.05.

En sağlam karakteristik genleri belirlemek için üç bağımsız makine öğrenimi algoritması entegre edildi. Modellerin güvenilirliğini sağlamak ve veri sızıntısını önlemek için, özellik seçim süreci uygun olduğunda çapraz doğrulama döngüleri içinde iç içe yerleştirildi ve keşif veri seti bağımsız doğrulama setlerinden sıkı bir şekilde ayrıldı. LASSO modeli, glmnet paketi kullanılarak DEG'lere uygulandı. Optimal ceza parametresini belirlemek için 10 kat çapraz doğrulama kullandık. Minimum çapraz doğrulama hatasına karşılık gelen optimal ceza parametre değeri, temel özellik genlerini belirlemek için eşik olarak seçildi. SVM, genleri ayırt etme gücüne göre sıralamak için kullanıldı. Minimum genelleme hatası noktasını belirlemek ve böylece karakteristik genlerin optimal sayısını belirlemek için 10 katlı çapraz doğrulama stratejisi uygulandı. RandomForest paketi, DEG'leri Ortalama Azalma Doğruluğu ve Gini endeksine göre sıralamak için kullanıldı. En yüksek önem puanına sahip genler hastalıkla ilgili özellikler olarak seçildi.

LASSO, SVM ve randomForest tarafından tanımlanan özelliklerin kesişimi, nihai çekirdek karakteristik genleri tanımlamak için alındı. Bu genlerin tanısal performansı, Alıcı Çalışma Karakteristikası (ROC) eğrisi analiziyle değerlendirildi. Eğri Altındaki Alan (AUC) ve ilgili %95 Güven Aralıkları (CI) pROC paketi kullanılarak hesaplandı. AUC 0.70 > bir genin yüksek tanısal değere sahip olduğu düşünülmüştür. Son olarak, bu genlerin ifade seviyeleri ve tanısal doğruluğu, bulguların genellenebilirliğini sağlamak için bağımsız bir doğrulama setinde daha da doğrulandı.

PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) ve drugbank (https://go.drugbank.com/) kullanılarak toplam 12 spesifik ilaç profili elde edildi; bunlar arasında LABA'lar, LAMA'lar, SABA'lar, SAMA'lar, Fluticasone propionat, Budesonid, Beklometazon (Fluticasone), Salmeterol, Umeclidinium, Vilanterol, Theophylline bulunmuştur. Derlenen hedefler, Uniprot veritabanı (https://www.uniprot.org/) kullanılarak kalibre edildi; bu süreçte insan dışı genler çıkarıldı ve geçersiz kopyalanmış hedefler silinerek standartlaştırılmış gen isimleri elde edildi. GeneCards (https://www.genecards.org/), OMIM (https://www.omim.org/) ve DisGENET (https://www.disgenet.org/) veritabanlarına "kronik obstrüktif akciğer hastalığı", "KOAH" anahtar kelimesi girilerek, hastalıkla ilgili hedefler alındı. Üç veritabanındaki tüm hedefler bir Excel dosyasında birleştirildi, tekrarlanan genler çıkarıldı ve veriler Uniprot veritabanı kullanılarak nihai hastalık hedef gen bilgisi elde edilerek kalibre edildi.

Makine öğrenimi modeli geliştirme

Çok algoritmalı bir makine öğrenimi çerçevesi, glmnet, e1071 ve randomForest gibi R paketlerinin ardışık şekilde kullanılmasıyla oluşturuldu. Özellikle, ceza bazlı boyutluluk azaltma için LASSO regresyonu yapıldı, örneklem gruplamasına dayalı doğrulama hatalarını değerlendirmek için Destek Vektör Makinesi (SVM) analizi kullanıldı ve özellikleri önem puanlarına göre filtrelemek için Random Forest kullanıldı. Bu süreç, çapraz doğrulama eğrileri ve gen önemi balon grafikleri dahil olmak üzere karşılık gelen tanısal görselleştirmeler ortaya çıkardı. Model oluşturulmasının ardından, bu çoklu algoritmalarla tanımlanan gen setleri üzerinde bir Venn diyagramı analizi yapılarak örtüşen "kesişim" özellik genlerini çıkararak potansiyel biyobelirteçlerin güvenilirliği artırıldı. Bu kesişim genlerinin ifade matrisi çıkarılarak gruplar arası ifade farklarını keman grafikleri aracılığıyla görselleştirildi. Son olarak, her gen için yinelemeli döngüler aracılığıyla ROC eğrileri oluşturularak Eğri Altındaki Alan (AUC) hesaplandı ve bu da onların tanısal değerini aday biyobelirteç olarak doğruladı.

Hayvan modeli indüksiyonu

Deneysel protokol, Guizhou Tıp Üniversitesi (2303411) Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve ARRIVE yönergeleri ile hayvan refahı düzenlemelerine uymuştur. Toplam 72 SPF dereceli erkek Sprague-Dawley (SD) sıçan (230 ± 20 g). Standart koşullarda (25 ± 1 °C, %50 ± %5 nem, 12 saat ışık-karanlık döngü) 1 hafta adaptif barınma süresinden sonra, fareler rastgele olarak Kontrol grubu (C grubu) (n = 24) ve Model grubu (M grubu) (n = 48) olarak ayrıldı.

M grubu çift faktörlü modellemeye tabi tutuldu: Aralıklı sigara dumanı maruziyeti (9 hafta, haftada 6 gün, günde 3 araştırma derecesinde sigara, 2 seansa bölünmüş, seans başına 30 dakika) ve intratrakeal LPS instasasyonu (her indamsiyonda 200 μg, her iki haftada bir)^18,19. C grubu ise normal salin hacmi eşdeğer miktarda aldı. Başarılı modellemeden sonra, gruplar rastgele olarak M grubu (n = 12), yüksek dozlu BTHTT grubu (H grubu) (Yüksek, 1× klinik doz, n = 12) ve düşük dozlu BTHTT grubu (L grubu) (Düşük, 1/2× klinik doz, n = 12) olarak rastgele olarak bölündü ve 2 hafta boyunca sürekli gavaj müdahalesi uygulandı. C ve M gruplarına damıtılmış su eşzamanlı olarak verildi.

Vücut ağırlığı ve spontan aktivite parametreleri haftalık olarak kaydedildi. Modelleme ve tedavi sonunda, akciğer dokusu, serum ve bronkoalveolar lavaj sıvısı (BALF) toplandı. İnflamatuar belirteçler (örneğin, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, OPN ve MCP-1) seviyeleri ELISA kullanılarak kit talimatlarına göre ölçüldü. Ayrıca doku patolojisi ve çoklu omik analizleri de yapıldı.

Tedavi uygulaması

Buti Huatan Tang (BTHTT), dokuz geleneksel Çin şifalı bitkisinden oluşur: Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. (Astragali Radix, 15 g), Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax (Pseudostellariae Radix, 15 g), Cinnamomum cassia (L.) J. Presl (Cinnamomi Cortex, 15 g), Angelica sinensis (Oliv.) Diels (Angelicae Sinensis Radix, 10 g), Salvia miltiorrhiza Bge. (Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma, 15 g), Perilla frutescens (L.) Britt. (Perillae Folium, 10 g), Raphanus sativus L. (Raphani Semen, 10 g), Lepidium apetalum Willd. (Descurainiae Semen, 10 g) ve Mahonia fortunei (Lindl.) Fedde (Mahoniae Folium, 10 g). Bitkisel malzemeler toplam ağırlığının 10 katı suda 30 dakika bekletildi ve ardından 1 saat boyunca dekokop edildi. Karışım filtrelendi, filtre toplanıp üç eşit porsiyona bölünerek ağızdan uygulandı.

Klinik güvenlik ve etkinlik temelinde, yetişkinler için standart BTHTT dozu klinik ilaç kılavuzlarına göre 1.57 g∙^kg-1∙^day-1 idi. Fareler için doz dönüşüm faktörü göz önüne alındığında, standart fare ilaç dozunun insan standart dozunun 6,3× olduğu belirtildiğinde, fareler için karşılık gelen H grubu 9,9 g∙kg-1∙day-1 olarak, L grubu ise bu dozun yarısı olarak belirlendi (4,95 g∙^kg-1∙^day-1). BTHTT'nin nihai yoğunlaştırılmış hacmi 50 mL olduğundan, sıçanlarda H grubu için verilen hacim yaklaşık 1,6 mL, L grubu için ise yaklaşık 0,8 mL idi. İlaç günde bir kez oral garajla uygulanıyordu.

Doku ve BALF koleksiyonu

Deneysel son noktalarda (9. ve 11. haftalar), fareler intraperitoneal %5 sodyum pentobarbital (1 mL/100 g) enjeksiyonuyla anestezi edildi. Kan portal damardan toplandı, oda sıcaklığında 30 dakika bekletildi ve ardından 13.000 × g ile 15 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj edildi. Üst malzeme -80 °C sıcaklıkta depolanıyordu. Akciğer dokuları sıvı azotta hızla donduruldu ve -80 °C'de depolandı. BALF, soğuk PBS ile ardışık üç yıkama ile toplandı.

Transkriptomik analiz

Toplam RNA akciğer dokusundan çıkarıldı ve (A₂₆₀/A₂₈₀ > 1.8) (RIN ≥ 7.0) kullanılarak kalite kontrollü hale getirildi. RNA dizileme kütüphaneleri oluşturuldu: mRNA oligo(dT) ile zenginleştirildi, parçalandı ve çift zincirli cDNA sentezinde kullanıldı; bu kDNA adaptör oligonukleotidlere bağlandı ve PCR ile amplifikasyona getirildi. Kütüphaneler dizilemeden önce nicelendirildi ve kalite kontrolü yapıldı. İçerik dağılımı denetimi, her örnek için FPKM yoğunluk dağılım analizi ve^{RNA-seq 20'nin} genel kalite değerlendirme analizi dahil.

Dizileme platformu tarafından üretilen ham transkriptomik veriler, Perl scriptleri kullanılarak işlenmiş ve adaptör dizilerini ve düşük kaliteli okumaları (Q ≤ 25 tabanlı okumalar %60 veya N oranı > %5 > oluşturuyor). Bu filtreleme sürecinden sonra temiz okumalar elde edildi. Temiz okumalar HISAT2 kullanılarak referans genomla hizalandı ve gen ifade seviyeleri FPKM değerleri hesaplanmak için nicelendirildi. Diferansiyel ifade analizi yapıldı (tarama kriterleri |log2FC| > 1 ve p-adj < 0.05 olarak). Transkripsiyon faktörü açıklaması, Animal TFDB veya Pfam/DBD veritabanlarına dayanarak, gen kimlikleri ve protein alan bilgisi²¹ eşleştirilmiştir.

Türler arası doğrulama için metodolojik titizliği sağlamak amacıyla ortologik bir gen haritalama stratejisi uygulandı. Bu strateji, NCBI HomoloGene ve Ensembl BioMart veritabanları kullanılarak temel insan genleri ( örneğin, SRPX2, IL-1R2, TFF3) için sıçanlarda ortologların alınmasını içeriyordu. Seçim, net bir "bire bir" eşleme ilişkisi ve yüksek protein dizisi kimliği sergileyen gen çiftleriyle sınırlıydı. Birden fazla aday bulunduğunda, HGNC tarafından onaylanmış ortolog çiftlere tercih edilirdi. Yüksek tespit hassasiyeti sağlamak için, tanımlanan fare ortologlarının mRNA dizilerine dayanarak özel RT-qPCR primerleri tasarlandı. Doğrulama kriterleri, ifade yönü ve fonksiyonel doğrulama tutarlılığı ile tanımlandı. İfade Yönünde Tutarlılık: Dumanla indüklenen bir fare KOAH modelinde, RT-qPCR, hedef genlerin fare akciğer dokusundaki ifade eğilimlerinin insan GEO klinik veri setlerinde gözlemlenenlerle tamamen uyumlu olduğunu gösterdi. Türler arasında aynı polaritede değişim gösteren genler, hastalık biyobelirteçleri olarak koruma özelliğine sahip olarak kabul edilmiştir. Patolojik Doğrulama: İfade tutarlılığı üzerine, bu genlerin KOAH'nin patolojik evrimindeki rolüne sahip olup olmadığını doğrulamak için korelasyon analizi yapıldı.

Metabolomik iş akışı

Akciğer dokusu (20–50 mg) önceden soğutulmuş metanol-asetonitril suda (2:2:1, v/v) homojenize edilip buz banyosunda soniklendi. Homojenat, 4 °C'de 20 dakika boyunca 13.000 × g santrifüjlendi. Süpernatant vakumda yoğunlaştırıldı, asetonitril suda (1:1, v/v) yeniden çözüldü ve LC-MS^{analizi için} 0,22 μm bir membrandan filtrelendi.

Kromatografik ayrım, amid bazlı bir UPLC kolonu (1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm) kullanılarak gerçekleştirildi. Kolon sıcaklığı 25 °C'de tutuldu. Mobil faz, (A) 25 mM amonyum asetat ve 25 mM amonyak içeren sudan ve (B) asetonitrildən oluşuyordu. Akış hızı 0,5 mL/dakika olarak ayarlandı ve enjeksiyon hacmi 2 μL idi. Gradient elülasyon programı şöyleydi: 0–0,5 dakika, %95 B; 0,5–7 dakika, B'nin doğrusal olarak %95'ten %65'e düşmesi; 7–8 dakika, B'nin doğrusal olarak %65'ten %40'a düşmesi; 8–9 dk, B %40 ile tutuldu; 9–9,1 dakika, B'nin doğrusal olarak %40'tan %95'e yükselmesi; 9,1–12 dk, B %95'te kaldı. Tüm analiz boyunca, örnekler otosamplerda 4 °C sıcaklıkta tutuldu. Sistem kararlılığını ve deneysel verilerin güvenilirliğini sağlamak için, örnekler rastgele bir sırayla analiz edildi ve kuyruğun arasına kalite kontrol (QC) örnekleri serpiştirildi. Kütle spektrometrisi analizi, ultra yüksek performanslı sıvı kromatografi (UHPLC) sistemi ve kütle spektrometresi kullanılarak gerçekleştirildi. Örnekler, hem pozitif hem de negatif iyon modlarında elektrosprey iyonizasyon (ESI) kullanılarak iyonize edildi. ESI kaynak ve MS ayarları şöyleydi: nebulizör gazı (Gaz 1) 50, yardımcı gaz (Gaz 2) 2, iyon kaynağı sıcaklığı 350 °C, püskürtme voltajı (ISVF) pozitif iyon modunda 3.500 V, negatif iyon modunda ise 2.800 V'a ayarlandı. MS1 için kütle aralığı 70 ila 1.200 Da arasında ayarlanmış, çözünürlüğü 60.000 ve tarama birikim süresi 100 ms. MS2 için, basamaklı çarpışma enerjisiyle veri bağımlı toplama (DDA) kullanıldı. MS2 için kütle aralığı da 70 ila 1.200 Da arasında ayarlanmış, çözünürlüğü 60.000 ve tarama birikim süresi 100 ms. Dinamik hariç tutma süresi 4 saniye olarak belirlendi.

Ham metabolomik veriler mzXML formatına dönüştürülür ve ardından zirve hizalama, tutma süresi düzeltmesi ve zirve alanı çıkarımı için işlenilirdi. Veri ön işleme iş akışı aşağıdaki adımları içeriyordu: İlk olarak, %50 > eksik oranı olan iyon zirveleri kaldırıldı. İkinci olarak, kalan eksik değerler KNN algoritması kullanılarak hesaplanmıştır. Üçüncüsü, göreceli standart sapma (RSD) >%50 olan metabolik özellikler elendi. Deneysel verilerin kalitesi, ana bileşen analizi (PCA) ve kalite kontrol örneklerinin kümelenmesi kullanılarak değerlendirildi. Sonraki analizler arasında tek değişkenli istatistikler (örneğin, t-testleri), çok değişkenli istatistikler (PLS-DA), diferansiyel metabolit taraması (VIP > 1 ve p < 0.05) ve KEGG yol zenginleştirme analizi (hipergeometrik test) ^{yer aldı23,24}.

In vivo ve in vitro bileşenler için analitik yöntemlerin kurulması

BTHTT örneklerinin in vitro test için hazırlanması: BTHTT suda (2 x 30 dakika) dekoksiyonla ekstraksiyon yapılmış, 1.1–1.2 g/mL olarak konsantre edilmiş ve ardından dondurularak kurutulmuştur. Analiz öncesi, 600 μL dondurulmuş toz çözeltisi 400 μL metanol ile karıştırıldı, %40 metanole yeniden çözündü ve süpernatant toplanmak için santrifüj edildi.

BTHTT örneklerinin in vivo test için hazırlanması: Serum, metanol ile karıştırarak (1:1) deproteinize edildi ve 30 dakika boyunca −20 °C'de çökeltildi, ardından 20 dakika boyunca santrifüjlendi. Süpernatant vakumda kurutulmuş ve %40 metanolde yeniden çözünerek nihai örnek elde edilmiştir. Boş serum + BTHTT örneklerinin hazırlanması için, uygun miktarda boş serum in vitro BTHTT süpernatantı ile takviye edildi ve kalan adımlar tarif edildiği gibi gerçekleştirildi.

Örnekler, ters faz UPLC kolonuyla donatılmış bir UHPLC sistemi kullanılarak ayrıldı (2,1 mm × 100 mm, 1,8 μm). Kolon sıcaklığı 35 °C olarak tutuldu ve akış hızı 0,3 mL/dakika olarak ayarlandı. Hareketli faz, (A) suda %0,1 formik asit ve asetonitrildə %0,1 formik asitten oluşuyordu. Gradient elütasyonu, Tablo 1'de gösterildiği gibi gerçekleştirilmiştir.

Hem MS1 hem de MS2 spektrumlarının elde edilmesi için bir kütle spektrometresi kullanıldı. Kütle spektrometresi UHPLC sistemiyle eşleştirilmiş ve hem pozitif hem de negatif ESI modlarında çalışıyordu. ESI parametreleri şu şekildeydi: püskürtme voltajı 3.800 V (ESI+) / 3500 V (ESI-), kılıf gaz basıncı 45 arb, yardımcı gaz basıncı 20 arb, iyon transfer boru sıcaklığı 320 °C ve buharlaştırıcı sıcaklığı 350 °C. Algılama modu tam tarama/veri bağımlı MS2 (Full-MS/dd-MS2) olarak ayarlanmış, MS1 için 60.000 ve MS2 için 15.000 çözünürlük olmuştu. En üst 10 MS1 iyonu MS/MS parçalanması için seçildi ve 20, 40 ve 60 basamaklı normalize çarpışma enerjileri elde edildi. MS1 için kütle aralığı 90 ila 1.300 Da arasında ayarlandı.

Boş grup örnekleri, dozlanmış grup örnekleri ve boş grup + BTHTT örnekleri dahil olmak üzere in vivo analizler için, her örnekten 6 μL tam olarak enjekte edildi. BTHTT'nin in vitro analizi için 2 μL numune enjekte edildi. Her boş ve dozlanmış grup örneği bir kez enjekte edilirken, boş grup + BTHTT örnekleri üçlü olarak enjekte edilirken, BTHTT örnekleri beşli enjekte edilirdi.

MzXML formatındaki veriler işlendi ve bileşikler, yerel yüksek çözünürlüklü ticari TCM kütle spektrometrisi veritabanı temelinde tanımlandı. Tanımlama kriterleri şu şekilde belirlendi: MS1 için <25 ppm kitle hatası ve MS2 için > 0.7 eşleşme puanı (burada skor parça iyonların benzerliğini yansıtıyor ve ≥0.7 güvenilir bir eşik olarak gösteriliyor)^25,26. İstatistiksel analiz, bileşik sayımı ve sınıflandırmasını (örneğin, flavonoidler, alkaloidler) içeriyordu ve bu da kütle spektrometrisi^{veritabanı 27'den} yapılan açıklamalarla birlikte gerçekleştirildi.

Moleküler kenetlenme ve MD simülasyonu

Tanımlanan karakteristik proteinler ile ilgili ligandlar arasındaki potansiyel bağlanma modlarını araştırmak için, in silico moleküler kenetleme gerçekleştirildi. Küçük moleküllerin üç boyutlu yapıları PubChem veritabanından alındı ve geometrik konfigürasyonları optimize edildi. Hedef proteinlerin kristal yapıları RCSB Protein Veri Bankası'ndan (PDB) alındı. PyMOL kullanılarak su molekülleri ve heteroatomlar çıkarıldı ve aktif site koordinatlarını tanımlamak için birlikte kristalize ligandlar çıkarıldı. Hidrojen atomları eklendi ve Gasteiger yükleri yazılım kullanılarak atandı. Kenetlenme simülasyonları gerçekleştirildi ve her çalışma başına 15 bağımsız konformasyon oluşturuldu. En düşük bağlanma enerjisine sahip konformasyon daha ileri analiz için seçildi. Kovalent olmayan etkileşimleri titiz bir şekilde karakterize etmek için, reseptör-ligand kompleksleri Protein-Ligand Etkileşim Profileri (PLIP) kullanılarak analiz edildi. NOT: Bu kenetlenme sonuçlarının potansiyel moleküler etkileşimler için yapısal destek sağladığını ve daha fazla dinamik iyileştirme için temel oluşturduğunu vurgulamak önemlidir; ancak biyolojik etkinliğin bağımsız kanıtı değildirler.

Fizyolojik olarak ilgili koşullarda öngörülen protein-ligand komplekslerinin kararlılığı ve konformasyonel evrimini değerlendirmek için, moleküler dinamik simülasyonları GROMACS yazılım paketi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Hem proteinler hem de ligandlar için topoloji dosyaları GROMOS96 43a1 kuvvet alanına göre oluşturuldu. Her kompleks, kutu kenarlarından en az 1,0 nm mesafede korunan bir dodekaedr kutunun merkezine yerleştirildi ve SPC su modeliyle çözüldü. Elektriksel nötrlüğü sağlamak için, gerektiğinde sisteme sodyum veya klorür iyonları eklendi. Enerji minimizasyonu, maksimum kuvvet 1.000,0 kJ∙^mol-1∙^nm-1'den aşağı olana kadar en dik iniş algoritması kullanılarak gerçekleştirildi. Sistem daha sonra iki aşamada dengelendi: ilki bir NVT topluluğu kullanılarak sistemi V-yeniden ölçeklendirme termostatı kullanarak 100 ps üzerinde 300 K'ya kadar ısıtmak için kullanıldı; ikincisi, Parrinello-Rahman barostatı kullanılarak 1 barda 100 ps üzerinde basıncı stabilize etmek için bir NPT topluluğu kullanıldı. Üretim simülasyonları toplam 10 ns süreyle ve 2 fs zaman adımı ile gerçekleştirildi. Uzun menzilli elektrostatik etkileşimler Particle Mesh Ewald (PME) yöntemiyle hesaplanırken, kısa menzilli van der Waals ve elektrostatik etkileşimler 1,2 nm kesim yarıçapıyla yönetildi. Simülasyonların güvenilirliğini sağlamak için, mümkün olduğunda üç bağımsız çalışma gerçekleştirildi. Komplekslerin kararlılığı, protein omurgasının atomlarının başlangıç yapısına göre Kök Ortalama Kare Sapması (RMSD) ve Kök Ortalama Kare Dalgalanması (RMSF) hesaplanarak nicel olarak değerlendirildi. RMSD profilinde bir platoya ulaşılması, sistem dengesi ve yapısal kararlılık için birincil kriter olarak kullanıldı.

Genel istatistiksel analiz

Bu deneyde, grup hesaplamaları t-testleri veya tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak gerçekleştirildi.

Sonuçlar

KOAH'ta temel karakteristik genlerin tahmini

Birden fazla mikroarray platformundan alınan klinik verilerin toplu etki düzeltmesinin ardından (Ek Dosya 1–Ek Şekil S1), diferansiyel bir ifade analizi gerçekleştirildi. SRPX2, CLDN10 ve TFF3 dahil olmak üzere 34 aday gen (32 yukarı regülasyon ve 2 aşağı) tanımlandı (Şekil 1A).

Bu adayları ...

Tartışma

Tiroid hormon seviyelerinin sentezi ve korunması, KOAH hastaları için önemlidir ve sadece endokrin fonksiyonun çok ötesine geçer; hastalık ilerlemesini, beslenme durumunu, akciğer fonksiyonunu ve genel prognozu 31,32,33 derinden etkiler. Özellikle akut alevlemeler sırasında, KOAH hastaları genellikle "düşük T3 sendromu" olarak adlandırılan hipotiroidiye benzer bir durum sergilerdi. Tiroid hormon...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Asetonitril (kromatografik derecede)	Merck, Almanya	1499230-935
Agilent 4150 biyoanalizörü	Agilent Technologies, ABD
Amonyum asetat	SIGMA, Almanya	SRE0035-20230321
Angelica sinensis (Oliv.) Diels (Angelicae Sinensis Radix),	Guizhou Shanhaitongjia İlaç A.Ş., Ltd., Çin	20240807
Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. (Astragali Radix),	Guizhou Shanhaitongjia İlaç A.Ş., Ltd., Çin	20240601
Kimya Ofisi		Kimyasal yapı çizimi ve moleküler modelleme yazılımı
Cinnamomum cassia (L.) J. Presl (Cinnamomi korteksi),	Guizhou Shanhaitongjia İlaç A.Ş., Ltd., Çin	20240901
Eppendorf Santrifüj 5430 R	Eppendorf, Almanya
Deneysel sigaralar	Harbin Taihua, Çin	20230208
GraphPad Prizması 8		İstatistiksel analiz ve grafik yazılımı
Huangshan sigaraları		Dumana maruz kalma deneyleri için araştırma sınıfı sigaralar
IL-1β ELISA kiti	Şanghay Enzim Bağlantılı Biyoteknoloji, Çin	E-EL-R0012c-20230522
Illumina Novaseq 6000 dizileme platformu	Illumina, ABD
Lepidium apetalum Willd. (Descurainiae Semen)	Guizhou Shanhaitongjia İlaç A.Ş., Ltd., Çin	20240201
Lepidium sativum L. (Raphani spermi)	Guizhou Shanhaitongjia İlaç A.Ş., Ltd., Çin	20240301
Lipopolisakkarit (LPS)	Shandong Huino İlaçaçısı, Çin	20230315
Mahonia fortunei (Lindl.) Fedde (Folium Mahoniae)	Guizhou Shanhaitongjia İlaç A.Ş., Ltd., Çin	20240301
Metanol (kromatografik derecede)	Fisher, ABD	DK745764
Nanodrop ND-2000 spektrofotometresi	Thermo Scientific, ABD
Perilla frutescens (L.) Britt. (Perillae Folium)	Guizhou Shanhaitongjia İlaç A.Ş., Ltd., Çin	20240510
Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax (Pseudostellariae Radix),	Guizhou Shanhaitongjia İlaç A.Ş., Ltd., Çin	20250201
Qubit 4.0 florometre	Thermo Fisher Scientific, ABD
RNA kütüphane yapım kiti	ABclonal, ABD	RK20301-20230415
SMINA		Moleküler kenetlenme yazılımı
Salvia miltiorrhiza Bge. (Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma)	Guizhou Shanhaitongjia İlaç A.Ş., Ltd., Çin	20240902
Küçük hayvan spontan aktivite kaydedicisi (KW-ZF)	Nanjing Karlvin Biyoteknoloji, Çin
Sodyum pentobarbital	Şanghay Deneysel Reaktif Tedarik Şirketi, Çin	20230412
TNF-α ELISA kiti	Şanghay Enzim Bağlantılı Biyoteknoloji, Çin	E-EL-R2856c-20230522
Geleneksel Çin Tıbbı MS veritabanı (Shanghai Applied Protein Technology Co., Ltd.)		ticari geleneksel Çin tıbbı kütle spektrometrisi spektrometrisi veritabanı
Trizol reaktifi	Magen, Çin	20230508
UPLC BEH Amide column		amide tabanlı UHPLC analitik sütunu
UPLC HSS T3 kolonu		ters faz UHPLC analitik kolonu (T3 tipi)
Vanquish Neo UHPLC-Orbitrap Exploris 480 MS sistemi	Thermo Scientific, ABD
Vanquish UHPLC-Q-Exactive HF-X MS sistemi	Thermo Scientific, ABD