Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Rekombinant İnsan SLFN14 ribonükleazının hızlı üretimi ve kütle fotometrisi ile stoikiyometrik analiz

961 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70393

⸱

20 Şubat 2026

 ,  , 
1Department of Structural Biology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, SUNY, 2Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Baylor College of Medicine, 3Therapeutic Innovation Center (THINC), Baylor College of Medicine

Bu makalede

Özet

Bu protokol, rekombinant insan SLFN14 ribonükleazının üretimini ve kütle fotometrisiyle stoikiyometrik analizini tanımlar.

Özet

Ribonükleazlar, RNA bölünmesini katalize eden ve gen düzenlemesi dahil çeşitli biyolojik süreçlere katkıda bulunan özel bir RNA bağlayıcı protein sınıfıdır. Buna rağmen, birçok insan ribonükleazının yapısı, işlevi ve düzenlemesi, rekombinant protein üretimindeki zorluklar nedeniyle hâlâ kötü tanımlanmıştır. Bu yöntem, insan Schlafen 14 (SLFN14) ribonükleazının geçici ifadesi, saflaştırması ve stoikiyometrik analizi için verimli bir yaklaşımı tanımlar. Rekombinant Bayrak etiketli SLFN14, HEK293 süspansiyon hücrelerinde eksprese edildi ve anti-Flag affinite kromatografisi ile düşük çözünürlüklü boyut dışlama kromatografisinden oluşan hızlı iki aşamalı bir arıtma iş akışı kullanılarak izole edildi. Kütle fotometrisi, hassas tek moleküllü bir teknik, fizyolojik tuz koşullarında SLFN14'ün hücresel RNA'ya bağlı kararlı bir homodimer oluşturduğunu, yüksek tuzun ise homodimer düzenini koruyarak RNA ayrışmasını teşvik ettiğini ortaya koymuştur. Ortaya çıkan rekombinant insan SLFN14 proteini, sonraki yapısal çalışmalar ve niteliksel biyokimyasal testler için uygundur. Rekombinant insan protein izolasyonu ve örnek karakterizasyonu için bu hızlı yaklaşım, biyofiziksel ve biyokimyasal karakterizasyon için amaçlanan diğer memeli ribonükleazları ve RNA bağlayıcı proteinlerin üretiminde geniş çapta uygulanabilir.

Giriş

Schlafen 14 (SLFN14), az incelenmiş bir ribonükleaz ve memelilerde konak kısıtlamafaktörü 1,2,3'tür. İnsan SLFN14 proteini, bağışıklık sistemi, antiviral aktivite, kemosensitivlik ve hücre farklılaşmasında rol oynayan altı üyeli SLFN gen düzenleyici ailesinedahildir. SLFN gen düzenleyicilerinin rolüne dair mekanik içgörü henüz eksik değildir; ancak birçok üye translasyonel kontrol için gerekli ribonükleazaktivitesini barındırır 7,9. SLFN ribonükleazları, protein homodimerizasyonu sırasında aktive olur ve substrat bölünmesinde yetkin olan bileşik RNA bağlayıcıyarık oluşturur 10,11. Hücreleri sahte RNA bölünmesinden korumak için, çoğu SLFN ribonükleazı ağırlıklı olarak monomer olarak bulunur ve her aile üyesine özgü molekülersinyallerle aktivasyonunu bekler 5,7,11,12.

İnsan SLFN14'ün rekombinant üretimi, bu ribonükleazın daha önce yeterince incelenmemiş kapsamlı moleküler çalışmalarını mümkün kılmış ve fonksiyonu vedüzenlemesi 2,13,14 hakkında yeni bilgiler sağlamıştır. Arıtılmış rekombinant SLFN14 proteini, in vitro RNA bölünmetestleri 2,14 kullanılarak yapıya bağlı transfer RNA bölünme aktivitesinin karakterizasyonunu hızlandırmıştır. Temizlenmiş SLFN14 proteininin kriyoelektron mikroskopisi (kriyoEM) çalışmaları ayrıca, çift yönlü RNA'nın merkezi 2,13,14 yarığına yüklendiği bir SLFN14 homodimer düzenini ortaya koyar. SLFN14'ün üst düzey montajı, moleküler kütle ölçümü için tek moleküllü bir teknik olan kütle fotometrisiyle de karakterize edilmiştir. Beklenmedik şekilde, bu hassas teknik SLFN14'ün ağırlıklı olarak tuza dirençli bir homodimer oluşturduğunu, ancak aynı zamanda bilinmeyen fonksiyon 2,13,14 olan tuza duyarlı bir homotetramer de oluşturabildiğini gösterir. Toplamda, saflaştırılmış insan SLFN14 proteini elde etme yeteneği kritik bir dönüm noktasıydı ve SLFN14 aracılı translasyon kontrolü üzerine heyecan verici yeni bir araştırma aşamasını başlatacak erken moleküler içgörülerin ortaya çıkmasını sağladı.

Rekombinant SLFN14 ribonükleaz, standart protein üretim stratejileri kullanılarak tarihsel olarak elde edilmesi zor olmuştur. SLFN14'ün enzimatik aktivitesini tanımlayan orijinal raporda düşük verim, azalmış stabilite ve düşük çözünürlüğübelirtilmiştir 1. İnsan SLFN14 proteini, uzun polipeptid zinciri, belirgin hidrofobik ve ribonükleaza bağımlı sitotoksisite ile karakterize edilir; bunlar birlikte geleneksel bakteriyel ifadesistemlerinin 1,13,14 kullanımını büyük ölçüde engeller. Ancak, gelişmiş ökaryot çeviri ve şaperon makineleri, tam boy insan SLFN14proteini 15'i verimli bir şekilde üreten güçlü bir alternatif sunar. Hem baculovirus-böcek hem de memeli ifade sistemleri, kriyoEM çalışmaları ve biyokimyasaltestler 2,13,14 için tam boy insan SLFN14 proteini elde etmek amacıyla kullanılmıştır. Ancak bazı durumlarda böcekten köken alan SLFN14 proteini, örnek toplamanı önlemek için stabilize edicimutasyonlar gerektiriyordu 2. Baculovirus aracılı gen teslimatı da önemli bir çaba taahhüdü ve uzun bir teslim süresiyle ilişkilidir; bu da araştırma ilerlemesinigeciktirmekte 15,16. Öte yandan, memeli ekspresyon konakçısından izole edilen rekombinant SLFN14 proteini, hız avantajı sunar ve örnek optimizasyonunda protein mühendisliğine ihtiyaç duyulmaz.

Bu yöntem, aşağı yönlü moleküler çalışmalar için uygun rekombinant yabani tip SLFN14 proteini üretmek için nispeten hızlı ve düşük çabalı bir yaklaşım sunmak üzere tasarlanmıştır. Memeli hücrelerinin kullanımı, SLFN14 protein mühendisliğine gerek kalmadan doğru protein katlanmasını korumak için neredeyse doğal bir ortam sağlar13. Kimyasal tabanlı bir gen dağıtım yöntemi, viral vektör stratejisinin aksine, üretim zaman çizelgesini aylardan15. günlere hızlandırıyor. Memeli hücre kültürünün nispeten yüksek maliyetini dengelemek için, bu yöntem maliyet etkin polietilen (PEI) transfeksiyon reaktifi ve transfeksiyon etkin insan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücrelerini17,18 süspansiyonda yetiştirmektedir. Numune işleme sırasında protein kaybını en aza indirmek için, bu prosedür SLFN14 protein arıtımı ve örnek kalitesi kontrolü için stoikiyometrik analiz için düşük örnek tüketme stratejilerini de kullanır. Bu dört günlük protokol, 1) HEK293 hücrelerinde geçici gen ekspresyonunun, 2) spin sütunları kullanılarak iki aşamalı kromatografi iş akışının nasıl yapılacağına ve 3) protein stoichiometry'nin kütle fotometrisiyle belirlenmesine dair özel detaylar sunar. Bu prosedürün nihai ürünü, çift C-terminal Myc-Flag etiketi (SLFN14Myc-Flag) taşıyan vahşi tip insan SLFN14 proteinidir ve bu etiket sonraki kriyoEM çalışmaları ve niteliksel biyokimyasal karakterizasyoniçin kullanılabilir. Bu çok yönlü yaklaşım, özellikle heterolog ekspresyon sistemlerinde aşırı ekspresye edilmesi zor olan büyük ve sitotoksik ribonükleaz genlerini, az incelenmiş diğer insan RNA bağlayıcı proteinlerini izole etmek ve karakterize etmek için uygulanabilir. Bu nedenle, bu protokol insan proteomunun kapsamlı moleküler karakterizasyonu için engeli azaltmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

HEK293 hücre kültürünü içeren deneyler, onaylanmış kurumsal biyogüvenlik protokollerine uygun olarak Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL-2) koşullarında yapılmalıdır.

1. Memeli hücrelerinde SLFN14Myc-Flag'in geçici ekspresyonu

  1. Tohum memelileri HEK293 hücrelerini 0,5 x 106 hücre/mL boyutunda önceden ısıtılmış serumsuz büyüme ortamına yerleştirerek havalandırılmış, 1 L şişede 320 mL nihai hacim elde eder.
  2. Hücreleri 37 °C, 125 rpm, %8CO2, %75-80 nemde 24-32 saat boyunca kuluçka yapın.
  3. Hücre sayısının 1.2-1.8 x 106 hücre/mL olduğunu ve canlılığın %90'dan fazla olduğunu tripan mavisi boyama ve hücresayacı 19 kullanarak doğrulayın.
  4. 40 mL kültürü sekiz konik tüplere ayrılır.
  5. Hücreleri 400 x g hassasiyetinde 20-25 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjle hasat edin.
  6. Büyüme ortamını at.
  7. Her hücre pelletini 38 mL önceden ısıtılmış serumsuz transfeksiyon ortamında nazikçe tekrar askıya alın ve nihai hacmi 304 mL elde edin.
    NOT: 1.1. adımda tanımlanan orijinal kültür hacminin kalan 16 mL'si, 1.12'de tanımlanan transfeksiyon karışımıyla sağlanacaktır.
  8. Hücreleri yeni havalandırmalı, baffed 1 L şişeye aktarın.
  9. Konik bir tüpte, rekombinant SLFN14Myc-Flag genini kodlayan 320 μg saflaştırılmış plazmid DNA'sını 8 mL serumsuz transfeksiyon ortamına ekleyin ve 20-25 °C'de 5 dakika kuluçka yapın.
    NOT: Plazmid konsantrasyonu genellikle 500 ng/μL olup, nihai hacmi 640 μL'dir.
  10. 1.9. adımla eş zamanlı olarak, 8 mL serumsuz transfeksiyon ortamına 960 μg 0,22 μm filtre sterilize edilmiş PEI ekleyin ve 20-25 °C'de 5 dakika kuluçka yapın.
    NOT: Çalışma stoku genellikle 1 mg/mL ve nihai hacmi 960 μL'dir.
  11. PEI karışımını (bkz. adım 1.10) rekombinant plazmid DNA çözeltisine yavaş yavaş damla ekleyin (bkz. adım 1.9) ve 20-25 °C'de 15 dakika kuluçka yapın.
  12. 1.8. adımda hazırlanan hücrelere yavaş yavaş 16 mL DNA/PEI karışımını damla olarak ekleyin.
  13. Hücreleri 37 °C, 125 rpm, %8CO2, %75-80 nem sıcaklıkta 48 saat boyunca kuluçka edin.
  14. Transfekte edilmiş hücrelerden 40 mL dekant sekiz konik tüpe ayrılır.
  15. Transfeksiyon edilen hücreleri 400 x g sıcaklığında 5 dakika boyunca 20-25 °C'de santrifüjle hasat edin.
  16. Süpernatantı degente edin ve sekiz hücre pelletini -80 °C'de saklayın.

2. İki aşamalı rekombinant SLFN14Myc-Flag arıtması

  1. Anti-Bayrak Affinity Kromatografisi.
    Her hazırlık için 1.16. adımdan dört hücre peleti kullanarak anti-Flag affinity kromatografi protokolünü iki adet olarak gerçekleştirin.
    1. Reçine Hazırlığı.
      1. Anti-Flag agarose reçinesini 20-25 °C'ye 15 dakika boyunca dengeleyin.
      2. Reçineyi nazikçe tekrar askıya alın, şişede %50 reçine bulamaç 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarmadan hemen önce ters çevirin.
        NOT: Pipet ucunun ucunu kesin, böylece viskoz bulamaç kolayca toplanır.
      3. Reçineyi 1 mL Yüksek Tuzlu Yıkama Tamponu (50 mM Tris pH 7.4, 600 mM NaCl, 5 mMMgCl 2, 0.5 mM β-ME, %0.1 Tween-20) içinde yeniden süspansiyona alın.
      4. 45 dakika boyunca 4 °C'de kuluçka yapın.
      5. Reçine çamurunu 8.000 x g ile 2 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj edin.
      6. Yüksek Tuzlu Yıkama Tamponunu aspirasyon ve atarak reçineyi bozmamaya dikkat edin.
    2. Hücre lizat açıklaması.
      1. Her transfeksiyon edilen hücre pelletini 225 μL soğutma Yeniden Süspansiyon Tamponu (50 mM Tris pH 7.4, 600 mM NaCl, 5 mMMgCl 2, 0.5 mM β-ME, %0.5 Triton-X-100, 1 mM PMSF, 5 μg/mL Leupeptin, 1 mM Benzamidin, 0.7 μg/mL Pepstatin A, 0.25 U/mL Genius nukleaz) ile yeniden askıya alın ve dört hücre pelleti boyunca toplam hacim 900 μL elde edilir.
      2. Hücreleri, buz üzerinde önceden soğutulmuş 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      3. Mikrosantrifüj tüpünü 4 °C'de 30 dakika boyunca nutator üzerinde yatay olarak kuluçka edin.
        NOT: Zayıf protein ekspresyon seviyeleri durumunda sorun gidermek için 20 μL toplam lizat aliquotunu -20 °C'de sakla.
      4. Hücre lizatını 21.300 x g ile 20 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjle geçirin.
    3. Protein Affinity Yakalama ve Yıkama.
      1. Selenmiş lizat (bkz. adım 2.1.2.4) dengelenmiş anti-Flag reçine ile birleştirin (bkz. adım 2.1.1.6).
      2. Lizat-reçine karışımını, bir nutator üzerinde yatay olarak konumlandırılmış bir mikrosantrifüj tüpünde 4 °C'de 60 dakika boyunca kuluçka edin.
      3. Lizat-reçine karışımını 8.000 x g sıcaklıkta, 4 °C'de 2 dakika boyunca santrifüjlenerek reçine pelleti oluşturulur.
      4. Reçine pelletini bozmamaya dikkat ederek yaklaşık 700 μL süpernatantı atmak.
        NOT: Düşük yakalama verimliliği durumunda reçine bağlandıktan sonra -20 °C sıcaklıkta 20 μL süpernatan aliquotu saklayıp sorun giderme yapmayı unutmayın.
      5. Kalan reçine-süpernatan karışımını yeniden askıya alın ve çözeltiyi boş 800 μL kapasiteli spin kolonuna aktarın; bu sütun boş 2 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilir.
      6. Spin kolonunu 1.000 x g ile 2 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj edin ve akışı atın.
      7. 2.1.3.5 numaralı adımdan itibaren boş mikrosantrifüj tüpünü 500 μL Yüksek Tuzlu Yıkama Tamponu ile durulayın ve çözeltiyi spin kolonuna aktarın.
        NOT: Bu adım, mikrosantrifüj tüpünde kalan reçineyi geri kazanmaya yardımcı olur.
      8. Spin kolonunu 1.000 x g ile 2 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj edin ve akışı atın.
      9. Spin kolonuna 500 μL Yüksek Tuzlu Yıkama Tamponu ekleyin. Spin kolonunu 1.000 x g ile 2 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj edin ve akışı atın. Bu adımı tekrarlayın ve toplamda dört yüksek tuzlu yıkama elde edin.
      10. Spin kolonuna 500 μL Düşük Tuzlu Yıkama Tamponu (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mMMgCl 2, 0.5 mM β-ME, %0.1 Tween-20) ekleyin. Spin kolonunu 1.000 x g ile 2 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj edin ve akışı atın. Bu adımı tekrarlayın, toplamda iki düşük tuzlu yıkama yapın.
      11. Spin kolonuna 500 μL ATP Yıkama Tamponu (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mMMgCl 2, 0.5 mM β-ME, %0.1 Tween-20, 10 mM ATP) ekleyin. Spin kolonunun altını tıkayıp 4 °C'de 5 dakika kuluçka yapın. Spin kolonunu ve santrifüjü 1.000 x g sıcaklığında 4 °C'de 2 dakika boyunca fişten çıkarın ve akışı atın. Bu adımı tekrarlayın ve toplamda dört ATP yıkaması yapılır.
      12. Son yıkamayı spin kolonuna 500 μL Düşük Tuzlu Yıkama Tamponu ekleyerek gerçekleştirin. Spin kolonunu 1.000 x g ile 2 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj edin ve akışı atın.
    4. 3xFlag Peptid ile Protein Elusyonu.
      1. Spin kolonunun altını düşük tüy içeren bir sil ile lekeleyerek fazla sıvıyı çıkarın ve spin kolonunun altını tıkamayın.
      2. Reçineye doğrudan 55 μL 3xFlag Elution Buffer (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mMMgCl 2, 0.5 mM β-ME, %0.1 Tween-20, 300 μg/mL 3xFlag peptid) doğrudan reçine üzerine ekleyin.
      3. Spin kolonunun açıklığını parafilm ile kapatın ve kolonu 1.7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
      4. Spin kolonunu 4 °C'de 60 dakika boyunca bir nutator üzerinde dikey olarak kuluçka yapın.
        NOT: Dönme kolonunu dikey tutmak için, mikrosantrifüj tüplü rafı nutatora lastik bantlarla monte edin.
      5. Parafilm ve spin kolon tıpını çıkarın. Elutlanmış rekombinant SLFN14Myc-Flag proteinini, 1.000 x g hassasiyetinde 2 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yaparak temiz bir 1,7 mL mikrosantrifüj tüpünde toplayın.
      6. Sonraki boyut dışlama kromatografisi için 50 μL anti-Flag reçine eluat ve SDS-PAGE analizi için 5 μL tutar.
  2. Boyut Dışlama Kromatografisi.
    Standart SLFN14Myc-Flag protein analizi için Düşük Tuz Tuz Giderme Tamponu (150 mM NaCl) veya apo SLFN14Myc-Flag karakterizasyonu için Yüksek Tuz Tuz Giderme Tamponu (500 mM NaCl) kullanarak boyut dışlama kromatografi protokolünü gerçekleştirin.
    1. 2.1.4.6 adımından iki 50 μL anti-Bayrak reçine eluatını birleştirerek toplamda 100 μL örnek elde edilir.
    2. Kapağı gevşeterek, alt kapağı çıkararak ve kolonu 2 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirerek 40 kDa moleküler ağırlık kesimiyle 0,5 mL spin tuz çözme kolonu hazırlayın.
    3. Spin tuz arındırma kolonunu 700 x g sıcaklığında 4 °C'de 1 dakika boyunca santrifüj ederek kolon depolama çözeltisini çıkarın. Akışı at.
    4. Spin tuz giderme kolonuna 300 μL düşük veya yüksek tuz tuz aratıştırma tamponu (20 mM Tris pH 7.4, 150/500 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM TCEP) ekleyin. Dönme kolonunu 700 x g ile 4 °C'de 1-2 dakika boyunca santrifüjle yapın ve akışı atın. Bu adımı üç kez yerine getirerek sütunu tamamen dengeleyin.
    5. Spin tuz giderme kolonunun altını düşük tüy siliyle lekeleyin.
    6. Spin tuz çözme kolonunu temiz bir 1.7 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    7. Reçineye zarar vermeden kolon yatağının ortasına 100 μL kombine anti-Bayrak reçine eluat (bkz. adım 2.2.1) ekleyin.
    8. Rekombinant SLFN14Myc-Flag proteinini, spin tuzsuzlaştırma kolonunu 700 x g ile 2 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj ederek elütasyon yapın.
    9. Moleküler karakterizasyon için 95 μL rekombinant protein ve SDS-PAGE analizi için 5 μL tutulur.
  3. Arıtılmış Rekombinant SLFN14Myc-Flag Protein Numunesini karakterize edin.
    1. Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) gerçekleştirin.
      1. 5 μL 2x Laemmli örnek tamponu, arıtma protokolü boyunca farklı aşamalarda toplanan 5 μL aliquot örnekle birleştirin.
      2. 95 °C'de 5 dakika boyunca ısı örnekleri alın.
      3. Geniş aralıklı bir protein merdiveni ve 10 μL örnek-Laemmli tampon karışımı ile %4-15 SDS-PAGE ile 200V'da 30 dakika boyunca çöz.
      4. Protein bantlarını, jeli Coomassie G-250 boyama çözeltisiyle 30 dakika boyunca orbital bir shaker'da boyanarak görselleştirin ve jeli orbital bir shaker'da deionize su ile dejenlenerek arka plan temizlenene kadar görselleştirin.
      5. Ortaya çıkan protein bantlarını inceleyin; böylece 2.2.9. adımdan elde edilen örnek, SLFN14Myc-Flag teorik moleküler ağırlığı olan 107,5 kilodalton (kDa) ile uyumlu tek bir protein bandı olduğundan emin olun.
    2. UV/vis spektrotometri ile protein ve nüklein asidi niceliklerini ölçmek.
      1. Mikrohacimli spektrofotometreyi 2 μL ya Düşük veya Yüksek Tuz Tuz Giderme Tamponu ile boşaltın; protein depolama tamponuna uyun.
      2. Mikrohacim spektrofotometre ile 2 μL geri kazanılan rekombinant SLFN14Myc-Flag proteininden (bkz. adım 2.2.9) 260 nm ve 280 nm soğurgunlukları ölçün.
      3. Rekombinant SLFN14Myc-Flag protein konsantrasyonunu, 280 nm'de kaydedilen emilimi ve sönme katsayısını (93330 M-1 cm-1) kullanarak Beer-LambertLaw 20 ile hesaplayın.
      4. Örnek absorbans oranı A260/280'i, 260 nm'de kaydedilen absorbans değerini, 280 nm'de ölçülen absorbans değerine bölerek nükleik asidin rekombinant SLFN14Myc-Flag proteiniyle birlikte saflaştırıp arındırmadığını belirleyin.
        NOT: A260/280 oranı 0.7'nin üzerinde, muhtemelen nükleikasit 21'in varlığını gösterir.
    3. Hücresel RNA'yı florometri ile nicelikle ölçemek.
      1. RNA içeriğini, yüksek hassasiyetli RNA-spesifik floresanboya 22 ile 2.2.9. adımdan elde edilen 1-3 μL rekombinant protein kullanılarak nicelikle ölçün.

3. SLFN14Myc-Flag moleküler kütlesinin kütle fotometrisiyle analizi

  1. Kütle Fotometre Alet Kurulumu.
    1. Lazer cihazını, kütle fotometresinin elektronik kutusunun arkasındaki anahtarla açın.
    2. İzolasyon güvertesini açın ve enstrüman titreşimlerini en aza indirmek için "izolasyon" düğmesine tıklayın.
    3. AcquireMP yazılımını açın.
    4. Aletin termal dengeye ulaşmasını 1 saat bekleyin.
  2. Kapak Slaytı Hazırlığı.
    1. Cam kapağı yumuşak uclu cımbızlarla dikey pozisyonda tutun.
    2. Cam kapak sürgüsünün her iki tarafını Tip I ultrasaf su ile durulayın, ardından izopropil alkol ile durulayın. Bu adımı toplamda üç kez tekrarlayın.
    3. Cam kapak slaytının her iki tarafını son bir kez Tip I ultrasaf suyla 45 saniye boyunca durulayın.
    4. Cam kapak kaydırağından fazla su damlalarını, vakum hattına bağlı temiz bir pipet ucu ile nazikçe aspirasyon yoluyla çıkarın.
    5. Temiz cam kapak slaytı, lens kağıdıyla kaplı plastik bir kutuda saklanarak kütle fotometresine taşınabilir.
  3. Kapak sürgüsünü enstrümana takın.
    1. Metal hizalama aracına yumuşak uçlu cımbız kullanarak 6 delikli silikon conta yerleştirin.
    2. 3.2.5 numaralı adımdan temiz cam kapak sürgüsünü silikon contanın üzerine yerleştirin ve yumuşak uçlu cımbızla silikon contanın etrafına hafifçe bastırın.
      NOT: Numune kuyularına baskı uygulamayın.
    3. Kütle fotometresinin okülüsüne bir damla daldırma yağı koyun.
    4. Cam kapak sürgüsünü silikon contanın yukarı bakması için çevirin ve cam kapak sürgüsünü yumuşak uçlu cımbızlarla okulusun üzerine nazikçe yerleştirin.
    5. Cam kapak kaydırağının sol üst ve sağ alt köşelerini mıknatıslarla sabitleyin.
    6. Yan kontrol altında, AcquireMP yazılımında sol üst kuyu ile lazeri hizalamak için seçin.
  4. Geniş Aralıklı Protein Standartlarını Analiz Edin.
    1. 50x geniş aralıklı kalibrasyon çözeltisi (90 kDa'dan 1 MDa'ya) 1 μL 500x kalibrenli stok 9 μL 1x fosfat-tamponlu salin haline seyreltirerek hazırlanın.
    2. 3.4.1 adımından 50x geniş aralıklı kalibre çözeltisinden 2 μL 18 μL fosfat-tamponlu-tuzlu bir parçaya birleştirerek 5x kalibrenli bir çalışma stoku hazırlayın.
    3. Boş kuyuya 10 μL 0,22 μm filtrelenmiş Düşük veya Yüksek Tuz Tuz Giderme Tamponu ekleyin.
      NOT: Bu adımda filtrelenen tamponun, SLFN14Myc-Flag örneğini hazırlamak için kullanılan tamponla 2.2.9'da eşleştirilmesi önemlidir.
    4. Kapağı kapat.
    5. Find Focus altında, örnek kuyusunun doğru odakını belirlemek için AcquireMP yazılımında "damla seyreltme"ye tıklayın.
    6. 5x kalibrenli çalışma stokundan 10 μL tampon damlasına ekleyin (bkz. adım 3.4.3) ve çözeltiyi karıştırmak için hafifçe yukarı aşağı pipet yapın.
    7. Kapağı kapat.
    8. Hareket, sinyal, doygunluk ve keskinlik değerlerinin sabit ve optimal olduğundan emin olmak için alet ayarlarını inceleyin.
      NOT: Optimal değerler mavi görünür ve dışnalar turuncu renkte olur.
    9. 60 saniyelik bir video kaydetmek için AcquireMP yazılımında "kaydet" tuşuna tıklayın.
    10. Sonuç dosyasını (.mpr) tanımlayıcı bir başlık ve zaman damgası ile kaydedin.
  5. Bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.
    1. DiscoverMP yazılımını açın.
    2. Ölçümler bölümünde "+ aç" düğmesine tıklayın ve 3.4.10. adımdan kalibrasyon sonuç dosyasına gidin.
    3. Sonuçları görmek için listelenen protein standartları dosyasına çift tıklayın.
    4. Grafik yapılandırması altında, kontrast sınırlarını sırasıyla 0.00000 ve -0.03000 olarak ayarlayın.
    5. İlk dört protein standart zirvesi için elle bir Gauss eğrisi tanımlayın; her bir zirve boyunca imleci sürükleyin.
    6. "Create"e tıklayın ve "kütle kalibrasyonu"nu seçin.
    7. Kalibrant başlığı altında, 3.5.5 adımdan itibaren takılan her kalibrant zirvesini sırasıyla bilinen moleküler kütlesi olan 86, 172, 258 ve 344 kDa'ya atayın.
    8. Kalibrasyon eğrisinin 1.0'a yakın R2 ve maksimum kütle hatasının (MME) %2'den az olduğunu doğrulayın.
    9. "Kalibrasyonu onayla" tuşuna tıklayın ve kalibrasyon eğrisi dosyasını (.mc) kaydet.
      NOT: Kütle fotometresi her saat başı yeniden kalibre edilmelidir.
  6. Rekombinant SLFN14Myc-flag proteinini düşük ve yüksek tuzlu koşullarda analiz edin.
    1. Fizyolojik tuz koşullarında standart numune analizi için Düşük Tuz Tuz Giderme Tamponu veya apo protein örnek karakterizasyonu için Yüksek Tuz Tuz Giderme Tamponu kullanarak 50 μM rekombinant SLFN14Myc-Flag proteininin 50 μL çözeltisini (bkz. adım 2.2.9) hazırlayın.
    2. 50 nM rekombinant SLFN14Myc-Flag protein karışımını 21.300 x g sıcaklıkta 10 dakika boyunca 20-25 °C'de santrifüj ederek potansiyel protein agregası ve toz giderilecektir.
    3. Yan kontrol altında, AcquireMP yazılımında "next well"e tıklayın.
    4. 10 μL 0,22 μm filtrelenmiş Düşük veya Yüksek Tuz Tuz Giderme Tamponunu kuyuya yükleyin ve kapağı kapatın.
      NOT: Bu adımda filtrelenmiş tamponun, SLFN14Myc-Flag örnek seyreltmesini hazırlamak için kullanılan tamponla 3.6.1 adımında eşleştirilmesi önemlidir.
    5. Find Focus bölümünde, yeni örnek kuyusunun doğru odakını belirlemek için "damla seyreltme"ye tıklayın.
    6. 3.6.2. adımdan 50 nM rekombinant SLFN14Myc-Flag protein çözeltisinden 10 μL tampon damlasına yükleyin ve örnek karıştırmak için nazikçe pipet yapın.
    7. Kapağı kapatın ve 3.4.8 adımında tarif edildiği gibi en uygun enstrüman ayarlarını sağlayın.
    8. 60 saniyelik bir video kaydetmek için AcquireMP yazılımında "kaydet" tuşuna tıklayın.
      NOT: Optimum kütle çözünürlüğü, yaklaşık 1.000-4.000 toplam sayımla 60 saniyelik bir videodan elde edilir.
    9. Sonuç dosyasını (.mpr) tanımlayıcı bir başlık ve zaman damgası ile kaydedin.
  7. Rekombinant SLFN14Myc-Flag proteininin moleküler kütlesi ve stoichiometry'sini hesaplayın.
    1. DiscoverMP yazılımındaki ölçümler bölümünde, 3.6.9 adımından sonuç dosyasını seçmek için "+ aç" butonuna tıklayın.
    2. Kalibrasyonlar altında, kalibrasyonu uygulamak için 3.5.9 adımında oluşturulan kalibrasyon eğrisi dosyasına çift tıklama yapın.
    3. Her gözlemlenen SLFN14Myc-Flag türü için manuel olarak bir Gauss eğrisi tanımlayın; her zirve boyunca imleci sürükleyerek hesaplanan moleküler kütle değeri elde edin.
    4. Her oligomerik türün ortalama moleküler kütlesini, üç bağımsız ölçümden ve ilgili standart sapma ile hesaplayın.
    5. SLFN14Myc-Flag protomerinin teorik kütle değerinin tam sayılarla hesaplanan ortalama moleküler kütlesini değerlendirerek rekombinant SLFN14Myc-Flag proteininin stoiyometrisini belirleyin.
      NOT: SLFN14Myc-Flag monomerinin teorik kütlesi 107,5 kDa, dimer 215 kDa, trimer 322,5 kDa ve tetramer 430 kDa'dır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tam boy rekombinant insan SLFN14Myc-Flag proteininin geçici gen ekspresyonu için tasarlanmış bir memeli vektörü Şekil 1'de gösterilmiştir. İki aşamalı bir arıtma iş akışı, SLFN14Myc-Flag proteininin HEK293 hücrelerinden izole edilmesini gösterir (Şekil 2A). Arıtılmış SLFN14Myc-Flag proteininin başarılı bir temsilci denatüre edici jeli Şekil 2B'de gösterilmiştir. Afin...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protein üretim protokolünün performansını ve çok yönlülüğünü vurgulayan birkaç kritik adım. Rekombinant protein verimini en üst düzeye çıkarmak için, yabancı plazmid DNA'sını yüksek alıma sahip HEK293 hücreleri kullanıyoruz ve bu hücreler süspansiyonda kültürlenerek orta hacim23 boyunca hücre yoğunluğunu maksimize etmektedir. PEI transfeksiyon reaktifi, bu büyük ölçekli transgen teslimat protokolünde kullanılır çünkü diğer popüler reaktiflere kıyasla nispeten d...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Pillon laboratuvarı üyelerine bu el yazmasını eleştirel okumaları için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü Dış Araştırma Programı, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS; R35GM147123 M.C.P.'ye Baylor Tıp Fakültesi'ne verildi ve Buffalo'daki New York Eyalet Üniversitesi'ne transfer edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2-merkaptoetanol (b-Me)SigmaM3148-500ML14.3 M çözüm tock
AcquireMP 2024 R2Refeyn/Veri Edinme Yazılımı
Adenosin-5'-trifosfat disodyum tuzu trihidrat (ATP)Chem-Impex International00015-100GÇözeltiyi pH 7.0'a ayarlayın
Anti-Flag M2 affinity jeliMilliporeA2220Bayrak karşıtı affinity reçinesi
Benzamidin hidroklorür hidratSigmaB6506-25GProteaz inhibitörü
Geniş aralıklı protein standartları (10-250 kDa)Bio-RadP7719SPrestained protein standartları
Kontes 3InvitrogenA49862Otomatik hücre sayacı
DiscoverMP v2024 R2Refeyn/Veri analiz yazılımı
Dulbecco'nun fosfatla tamponlanmış tuzlu suyuCorning21-031-CV1x çözelti stok
DYKDDDDK peptidiThermo Fisher ScientificA368053xFlag peptidi
FreeStyle 293-F HücreleriThermo Fisher ScientificR79007memeli süspansiyon hücreleri
Geniust M nükleaz DMF dosyasıSanta Cruzsc-391121BEvrensel nükleaz
HyClone CDM4HEK293 medyasıCytivaSH3085802Serumsuz büyüme ortamı
HyClone SFM4Transfx-293 medyaCytivaSH3086002Geçici transfeksiyon ortamı
Immersol 518FZeiss4Y00-R0DY-1007-3BF3Daldırma yağı
İzopropil alkolMacron İnce Kimyasalları3032-02
Laemmli örnek tamponuBio-Rad16107372x çözelti stoku
LeupeptinVWRJ580-25MGProteaz inhibitörü
Magnezyum klorür heksahidrat (MgCl2)Fisher ScientificM33-500
MassFerence P1 RefeynMP-CON-41033500x kalibre dipçik
MassGlass UC numune hazırlık kitiRefeynMP-CON-21022Sürgü ve conta
Mikro biyo-spin kolonuBio-Rad7326204Boş polipropilen spin sütunu
Milli-Q IQ 7000 sistemiMilliporeZIQ7000T0CTip I ultrasaf su
Mini-Protean TGX lekesiz jellerBio-Rad4568086%4-15 SDS-SAYFA
Nem ile soğutma ve CO2 özellikli MinitronInfors72175kuluçka makinesi sarsıntısı
MP hizalama kitiRefeynMP-CON-21019hizalama aracı, yumuşak uçlu cımbız, mıknatıs
NanofotometreImplenNP80UV-vis spektrofotometresi
NutatorClay Adams Markası421105
Pepstatin ASanta Cruzsc-45036BProteaz inhibitörü
Fenilmetilsülfonil florür (PMSF)Research Products InternationalP20270-25.0Proteaz inhibitörü
Polikarbonat shake matrosu ve nbsp;Duran Wheaton KimbleWPFBC1000Shavalandırmalı, bıçaq taban şişesi
Polietilen (PEI) MW 40.000Çok bilimler24765Transfeksiyon Reaktifi
Qubit 4 FluorometreThermo Fisher ScientificQ33226
Kubit RNA yüksek hassasiyetli test kitiThermo Fisher ScientificQ32852RNA'ya özgü boya kullanılarak nicelik
SimplyBlue SafeStainThermo Fisher ScientificLC6065Coomassie G-250
SLFN14 ekspresyon plazmid DNA'sıOrigeneRC226257insan etiketli ORF klonu
Sodyum klorür (NaCl)Millipore1.37017
Tris, pH 7.4Thermo Fisher ScientificJ60202. K21 M tamponlu çözelti stok
Tris (2-karboksietil) fosfin hidroklorür (TCEP)Altın BiyoteknolojisiTCEP10TCEP
Triton X-100VWRM143-1Ldeterjan
Trypan mavi lekesiThermo Fisher ScientificT10282%0,4 çözelti stoku
Tween 20VWR0777-1Ldeterjan
TwoMPRefeynMP-PRO-00001Kütle fotometresi
Zeba 40K Desaltin KolonuThermo Fisher ScientificA57759Boyut Dışlama Kromatografisi

Kaynaklar

  1. Pisareva, V. P., Muslimov, I. A., Tcherepanov, A., Pisarev, A. V. Characterization of novel ribosome-associated endoribonuclease slfn14 from rabbit reticulocytes. Biochemistry. 54 (21), 3286-3301 (2015).
  2. Li, M., et al. Human schlafen 14 cleavage of short double-stranded rnas underpins its antiviral activity. Adv Sci (Weinh). 12 (37), e01727(2025).
  3. Seong, R. K., et al. Schlafen 14 (slfn14) is a novel antiviral factor involved in the control of viral replication. Immunobiology. 222 (11), 979-988 (2017).
  4. Jo, U., Pommier, Y. Structural, molecular, and functional insights into schlafen proteins. Exp Mol Med. 54 (6), 730-738 (2022).
  5. Lee, S., et al. Velcrin-induced selective cleavage of trna(leu)(taa) by slfn12 causes cancer cell death. Nat Chem Biol. 19 (3), 301-310 (2023).
  6. Murai, J., Thomas, A., Miettinen, M., Pommier, Y. Schlafen 11 (slfn11), a restriction factor for replicative stress induced by DNA-targeting anti-cancer therapies. Pharmacol Ther. 201, 94-102 (2019).
  7. Zhang, P., et al. Schlafen 11 triggers innate immune responses through its ribonuclease activity upon detection of single-stranded DNA. Sci Immunol. 9 (96), eadj5465(2024).
  8. Li, M., et al. Codon-usage-based inhibition of hiv protein synthesis by human schlafen 11. Nature. 491 (7422), 125-128 (2012).
  9. Valenzuela, C., Saucedo, S., Llano, M. Schlafen14 impairs hiv-1 expression in a codon usage-dependent manner. Viruses. 16 (4), (2024).
  10. Metzner, F. J., et al. Mechanistic understanding of human slfn11. Nat Commun. 13 (1), 5464(2022).
  11. Garvie, C. W., et al. Structure of pde3a-slfn12 complex reveals requirements for activation of slfn12 rnase. Nat Commun. 12 (1), 4375(2021).
  12. Kugler, M., Metzner, F. J., Witte, G., Hopfner, K. P., Lammens, K. Phosphorylation-mediated conformational change regulates human slfn11. Nat Commun. 15 (1), 10500(2024).
  13. Van Riper, J., et al. Cryoem structure of the slfn14 endoribonuclease reveals insight into rna binding and cleavage. Nat Commun. 16 (1), 5848(2025).
  14. Luo, M., et al. Structural and functional characterization of human slfn14. Nucleic Acids Res. 53 (10), (2025).
  15. Schellenberg, M. J., Maheshwari, S., Pillon, M. C. Encyclopedia of cell biology. Vol. 1, Elsevier. 57-73 (2022).
  16. Hutchinson, A., Seitova, A. Production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system. J Vis Exp. (173), e62510(2021).
  17. Ojha, R., Timin, E., Szirovicza, L., Xu, W., Hepojoki, J. A systematic comparison of in-house prepared transfection reagents in the delivery of mrna or DNA to a wide range of cultured cells. J Biol Chem. 301 (12), 110742(2025).
  18. Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension. J Vis Exp. (106), e53568(2015).
  19. Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cell counting and viability assessment of 2d and 3d cell cultures: Expected reliability of the trypan blue assay. Biol Proced Online. 19, 8(2017).
  20. Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci. 4 (11), 2411-2423 (1995).
  21. Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. Biotechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
  22. Li, X., Ben-Dov, I. Z., Mauro, M., Williams, Z. Lowering the quantification limit of the qubittm rna hs assay using rna spike-in. BMC Mol Biol. 16, 9(2015).
  23. Swiech, K., et al. Transient transfection of serum-free suspension hek 293 cell culture for efficient production of human rfviii. BMC Biotechnol. 11, 114(2011).
  24. Gu, J., et al. Correction: Advances in the structures, mechanisms and targeting of molecular chaperones. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 117(2025).
  25. Bernhard, H., et al. Structural basis of spliced leader rna recognition by the trypanosoma brucei cap-binding complex. Nat Commun. 16 (1), 685(2025).
  26. Lai, S. H., Tamara, S., Heck, A. J. R. Single-particle mass analysis of intact ribosomes by mass photometry and orbitrap-based charge detection mass spectrometry. iScience. 24 (11), 103211(2021).
  27. Liu, H., May, K. Disulfide bond structures of igg molecules: Structural variations, chemical modifications and possible impacts to stability and biological function. MAbs. 4 (1), 17-23 (2012).
  28. Marenchino, M., Armbruster, D. W., Hennig, M. Rapid and efficient purification of rna-binding proteins: Application to hiv-1 rev. Protein Expr Purif. 63 (2), 112-119 (2009).
  29. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Sci Adv. 7 (46), eabk0734(2021).
  30. Carrasco-Zanini, J., et al. Mapping biological influences on the human plasma proteome beyond the genome. Nat Metab. 6 (10), 2010-2023 (2024).
  31. Adhikari, S., et al. A high-stringency blueprint of the human proteome. Nat Commun. 11 (1), 5301(2020).
  32. Liao, J. Y., et al. Rbpworld for exploring functions and disease associations of rna-binding proteins across species. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D220-D232 (2025).
  33. Gebauer, F., Schwarzl, T., Valcarcel, J., Hentze, M. W. Rna-binding proteins in human genetic disease. Nat Rev Genet. 22 (3), 185-198 (2021).
  34. Poodts, J., et al. Improved expression of sars-cov-2 spike rbd using the insect cell-baculovirus system. Viruses. 14 (12), (2022).
  35. Mckenzie, E. A., Abbott, W. M. Expression of recombinant proteins in insect and mammalian cells. Methods. 147, 40-49 (2018).
  36. Shi, X., Jarvis, D. L. Protein n-glycosylation in the baculovirus-insect cell system. Curr Drug Targets. 8 (10), 1116-1125 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Rekombinant Protein ÜretimiRNA Bağlayıcı ProteinlerHEK293 Süspansiyon HücreleriAfinite KromatografisiBoyut dışlama KromatografisiProtein StokiyometrisiSDS-PAGE JeliBiyokimyasal Karakterizasyon
Rekombinant İnsan SLFN14 ribonükleazının hızlı üretimi ve kütle fotometrisi ile stoikiyometrik analiz
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.