Yöntem makalesi

Karaciğer Fibrozisi Fare Modellerinde Hepatik Yıldız Hücre Morfolojisinin Haritalanması

DOI:

10.3791/70396

⸱

13 Şubat 2026

 , 
1Division of Liver Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, sağlam karaciğer dokusunda karaciğer stellat hücrelerinin morfolojisini görselleştirmek ve modellemek için kapsamlı bir görüntüleme hattı sunar. Bu yaklaşım, fare genetiği kullanılarak fibroblastların floresan etiketlenmesini, yerinde karaciğer perfüzyon tabanlı doku hazırlığını ve modifiye edilmiş iDISCO doku temizleme yöntemini birleştirerek optik şeffaflığı sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokuda yerleşik fibroblastlar, dokular arasında fibrozin hücresel sürücüleridir. Karaciğer içinde, benzersiz "yıldız benzeri" morfolojiye sahip yerleşik perisitler olan karaciğer yıldız hücreleri (HSC), yaralanma sırasında fibrojenik miyofibroblastlara aktive olur ve karaciğer izi oluşturur. Onlarca yıl süren çalışmalar HSC aktivasyonunun altında yatan ana sinyal yollarını açıklasa da, görüntüleme ve analizdeki teknik sınırlamalar nedeniyle bu belirgin dendritik morfolojilerinin işlevsel önemi hâlâ anlaşılmamaktadır. Bu protokol, sağlam karaciğer dokusunda HSC morfolojisini görselleştirmek ve modellemek için kapsamlı bir görüntüleme hattı sunar. Bu yaklaşım, HSC'lerin fare genetiği kullanılarak floresan etiketlemesini, yerinde karaciğer perfüzyon tabanlı doku hazırlığını ve birkaç santimetre kalınlığında olabilecek doku örneklerinde optik şeffaflık sağlamak için modifiye edilmiş iDISCO doku temizleme yöntemini birleştirir. Temizlenmiş örnekler, optimize edilmiş konfokal mikroskopi platformları kullanılarak görüntülenir ve görüntü veri setleri, tek hücre çözünürlükte bireysel HSC'lerin üç boyutlu yeniden inşası için özelleştirilmiş bir analiz iş akışı ile işlenir. Bu boru hattı, karmaşık karaciğer mikro ortamında HSC morfolojisinin tekrarlanabilir haritalanmasını sağlar; dendritik süreçleri ve komşu hücrelerle mekansal ilişkileri de dahil. Karaciğerin ötesinde, iş akışı akciğer, böbrek, bağırsak ve kalp gibi diğer organlardaki fibroblastlara uyarlanabilir; burada yerleşik mezenkimal hücreler hastalıkta benzer fibrojenik roller sergiler. Bu nedenle önerilen çerçeve, fibroblast yapı-fonksiyon ilişkilerini ve fibrotik hastalıkta terapötik açıklıkları araştırmak için karşılaştırmalı çapraz organ çalışmaları için metodolojik bir temel oluşturur.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fibroz, yani doku patolojik skarları, neredeyse tüm kronik organ hastalıklarının son ortak yoludur ve sanayileşmiş ülkelerdeki ölümlerin yaklaşık %40'ına katkıdabulunur 1. Karaciğerde fibroz, viral hepatit, alkol kullanımı veya giderek artan metabolik işlevsizlikle ilişkili steatotik karaciğer hastalığı (MASLD) gibi kronik hakaretlerden kaynaklanır ve bu hastalık şu anda ABD'deki yetişkinlerin %30-40'ını etmektedir. Karaciğere kronik hakaretler ve bunun sonucunda oluşan prolesiiv fibroz, sirroz, karaciğer yetmezliği ve hepatosellüler karsinom gibi son evre karaciğer hastalıkları riskini ciddi şekildeartırır 2. 3,4,5.

Hepatik yıldız hücreleri (HSC), karaciğer homeostazı ve fibrogenezinde merkezi rol oynar. Sağlıklı karaciğerlerde HSC'ler sakin, A vitamini depolayan bir durumda bulunur ve hepatositlerin ve genel olarak tüm karaciğerin homeostazınakatkıda bulunur 6,7. Bu, sağlıklı karaciğerdeki neredeyse tüm HSC'lerin çıkarılmasının karaciğer kütlesini azalttığı ve karaciğer yenilenmesini ciddi şekilde sınırladığı HSC tükenme çalışmalarıyla açıkçagösterilmektedir 7,8. Yaralanmada, HSC'ler miyofibroblast benzeri hücrelere aktive olur; bu hücreler çoğalır, hasar görmüş bölgelere göç eder ve aşırı ekstrasellüler matriks (ECM) üreterek fibrotik izler oluşturur. Fibrotik karaciğerlerdeki aktive HSC'ler aynı zamanda kanserle ilişkili fibroblastların kaynağıdır ve hepatosellülerkarsinom 9,10,11,12'de tümör teşvik edici roller oynar. Hareketsiz HSC'ler, uzun menzilli projeksiyonların uzandığı küçük hücre gövdeleriyle benzersiz bir nöronvari morfolojiye sahiptir. HSC'ler, fibroz13'te aktive edildiğinde düz, tabaka benzeri bir miyofibroblast şekline dönüşür. Onlarca yıllık çalışma, HSC'lerin ECM üretimini kontrol eden sinyal yollarını aydınlatmış olsa da, onların kendine özgü nöronal morfolojisinin işlevsel önemi, nasıl düzenlendiği, HSC nişi içindeki etkileşimleri kolaylaştırıp kolaylaştıramayacağı ve HSC fibrojenliği ile hastalığına katkıda bulunup bulunamayacağı hâlâanlaşılmamaktadır 14,15.

HSC'lerin morfolojisini görselleştirmek için mevcut yöntemler, in vitro kültürlenmiş hücrelerin veya in vivo doku kesitlerinin iki boyutlu (2D) görüntüleriyle sınırlıdır ve nadiren HSC morfolojisinin tamamını, her yöne birkaç hücre vücut uzunluğunu uzatan projeksiyonlarla yakalar. Ayrıca, en yaygın kullanılan HSC belirteci olan desmin, HSC'lerin immünoflüoresans boyamasında benzersiz nöronvari morfolojisini tam olarak yakalayamaz; çünkü desmin, HSC16 içindeki ara filamentleri etiketleyen bir sitoskelet proteinidir. Bu metodolojik zorluklar, HSC morfolojisini ve hücresel etkileşimlerini doğal bağlamda, tek hücre çözünürlükte üç boyutlu (3D) bir şekilde tam olarak yakalamayı engelledi. Sonuç olarak, HSC morfolojisinin işlevsel durumları ve komşu hücre tipleriyle etkileşimleriyle nasıl ilişkili olduğuna dair temel sorular çözülmemiştir.

Bu makale, sağlam karaciğer dokusunda HSC morfolojisini görselleştirmek ve modellemek için yenilikçi ve kapsamlı bir görüntüleme ve analiz hattı sunmaktadır. Bu yöntem, birkaç önemli yeniliği entegre eder: (1) genetik raporlayıcı fare modelleri kullanılarak HSC'lerin floresan etiketlenmesi, (2) doku mimarisi ve hücresel ilişkileri korumak için optimize edilmiş in situ karaciğer perfüzyonu ve fiksasyonu, (3) optik şeffaflığı sağlamak için modifiye edilmiş iDISCO tabanlı doku temizlemeprotokolü 17, (4) derin doku görüntü yakalama için yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ve (5) 3D görüntü yeniden yapılandırma ve nicel için özelleştirilmiş hesaplamalı iş akışı bireysel HSC'lerin analizi. Protokol, doku boyutu ve zaman taahhüdü üzerinde dikkate alınması gereken bazı kısıtlamalar getirir. Bu protokol birlikte, HSC'lerin karmaşık 3D yapısını yakalamak ve komşu damar, bağışıklık ve parenkimal hücrelerle mekânsal ilişkilerini haritalamak için sağlam ve tekrarlanabilir bir çerçeve sağlar. Burada sunulan karaciğer stratejileri ve boru hatları diğer organlara da kolayca uyarlanabilir(17,18,19).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan tüm fare deneyleri, Mount Sinai Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'ndeki Icahn Tıp Fakültesi tarafından onaylandı. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. tdTomato (TdT) etiketli HSC'lere sahip fare üretimi

  1. Tg(lox-stop-lox-TdTomato) x Tg(Lrat:Cre) yetiştiricileri (sırasıyla Jackson Laboratories soru #00791420 ve Mutant Fare Kaynak & Araştırma Merkezleri (MMRRC) Süzü #06959521-JAX) kuruldu.
    NOT: 3 hafta sonra kum bekleyin. Üreme için LratCre dişileri kullanın, çünkü erkek germ hattında bazı Cre ekspresyonları tespit edilmiştir.
  2. Kuyrukları ve genotip F1 kum tabakasını toplayarak Tg(Lrat:Cre) tanımlanabilir; Tg(LSL-TdT) fareleri, TdTomato floroforunu hepatik yıldız hücrelerinde seçici olarak ifade ederler.

2. Yerinde karaciğer perfüzyonu ve fiksasyonu

  1. Ameliyat öncesi kurulum
    1. Fare anestezisi için 2 mL ketamin, 1 mL ksilazin ve 7 mL su karıştırarak ketamin/ksilazin karışımı hazırlayın.
      NOT: Ketamin kontrollü bir maddedir ve laboratuvar kullanımı için uygun lisans ve düzenleme gerektirir.
    2. %4 paraformaldehit (PFA) perfüzyon çözeltisini 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) içinde hazırlayın.
    3. Peristaltik pompayı 1x PBS'nin tüpten geçmesine izin vererek kur ve akış hızını 2 mL/dakika olarak ayarlayın.
      NOT: Tüpte hava baloncuğu olmadığından emin olun.
  2. Enjekte edilecek ketamin/ksilazin karışımının miktarını belirlemek için fareyi tartın.
  3. Ketamin/ksilazin karışımını peritoneal olarak fareye enjekte edin.
    NOT: Her 20 g fare ağırlığı için karışımdan 200 μL enjekte edin.
  4. Faresi kapağı olan bir kaba koyun ve farenin tam anestezi edilmesini yaklaşık 20 dakika bekleyin.
    NOT: Fare parmağını refleks yokluğunu kontrol etmek için sıkın. Perfüzyon başladığında farenin hâlâ hayatta olduğundan emin olun.
  5. Faresi cam kabtan ameliyat platformuna sırtüstü pozisyonda aktarın.
    DIKKAT: PFA toksik ve değişkendir; Bu nedenle, kimyasal bir kapüşonda perfüzyon işlemini gerçekleştirin. PFA akışını kurumsal biyogüvenlik yönergelerine uygun şekilde toplayın ve bertaraf edin.
  6. Fare ayağının avuç içini forsepsle sıkıştırarak farenin refleks/spazm hareketleri yapmamasını sağlar.
  7. Farenin karnını açmak için 4 avucunu iğnelerle sapla.
  8. Karın bölgesine %70 etanol sıkarak tüyleri ıslatın.
  9. Karın bölgesinin ortasındaki deriyi penseps ile alıp arka bacaklarla hizalayın ve deriyi (her iki katmanı) kesmeye başlayın, böylece karın bölgesi ortaya çıkarılır.
  10. PBS ile ıslak pamuklu çubuklarla bağırsakları ve diğer organları yana hareket ettirip sol lobu kaldırın.
  11. Sol lob ile kaudat lob arasına bağlı zarı dikkatlice kesin.
  12. Sol lobun üst tabanını bir dikiş ile bağlayın.
  13. Sol lobu dikiş düğümünün altına kesin ve sol lobu deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak (örneğin, sıvı azotta doğrudan snap-freeze, Optik Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşiğine gömülme veya formalin fiksasyonu) doku örnekleri toplama ve işleme için ayrılın.
  14. Karaciğeri hareket ettirmek ve portal ven ortaya çıkarmak için PBS ile ıslak pamuk çubukları kullanın.
  15. Kateter iğnesini portal venin uzunluğunun yaklaşık yarısına dikkatlice yerleştirin.
    NOT: Kateter takılmasına yardımcı olmak için, farenin vücudunu bir forseps yerleştirerek vücudun altına kaldırarak daha düz bir yüzey elde edin. Kateter iğnesini yerleştirmeden önce portal ven ile mümkün olduğunca paralel hizalayın.
  16. Kateter iğnesini çıkarın.
    NOT: Kateterden kanın geri akışını sağlayarak başarılı yerleştirmeyi gösterin.
  17. Perfüzyon pompasını 2 mL/dakika akış hızında başlatın, boruyu katetere bağlayın ve karaciğeri 20 mL 1x PBS ile perfüze edin.
    NOT: Kateterin tamamen kanla dolu olduğundan ve borunun perfüzyon tamponu ile tamamen dolu olduğundan emin olun; böylece sisteme hiçbir hava kabarcıkı girmemesini sağlayacak şekilde bağlantı yapın.
  18. Karaciğerin üzerindeki akciğer arterini hemostatla kelepçe ile 1x PBS'nin kalpten geçmesini durdurun.
  19. Basınç birikimini azaltmak için alt vena kava kesin.
  20. Pompa hızını 5 mL/da'ya ayarlayın.
    NOT: Perfüzyonun tamamlanması için yaklaşık 15 dakika bekleyin.
  21. Pompayı durdurup rezervuarı %4 PFA'ya değiştirin.
    NOT: Pompayı durdurarak hava kabarcıkları sokmadığınızdan ve rezervuarda hala sıvı varken durduğunuzdan emin olun.
  22. Karaciğeri 25 ml %4 PFA ile perfüze edin.
  23. Perfüzyon tamamlandıktan sonra, bağlayıcı dokuları keserek çevredeki organlardan karaciğeri alın.
  24. Karaciğeri, 25 mL %4 PFA ile doldurulmuş 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin.
  25. Çözeltinin hareketini sağlamak için tüpü yatay olarak oda sıcaklığında 1,5 rpm'de bir tezgah sallama platformuna yatay olarak koyun.
  26. Karaciğeri, 1x PBS ile 3 kez, oda sıcaklığında 1,5 rpm'de 30 dakika boyunca bir sallama platformunda yıka.
  27. Karaciğeri 20 mL 1x PBS ile %0,02 NaN3 ile 4 °C'de sakla.
    NOT: Bu aşamada karaciğeri uzun vadede, en az bir yıla kadar saklayabilirsiniz.

3. iDISCO+ tabanlı doku temizleme

NOT: iDISCO+ protokolünün orijinal tanımı 17 numaralı

1. Gün: Numune susuz kalması

  1. Karaciğer örneklerini yaklaşık 0,5-1 cm3 boyutlarında parçalara kesin.
    NOT: Görüntüleme aşamalarında daha kolay tespit etmek için farklı örnekleri farklı şekillere kesin.
  2. Ayrı cam şişelerde suda %20 (hacim), %40, %60 ve %80 metanol seyreltmesini hazırlayın.
  3. Karaciğer örnekleri, vidalı kaplı cam şişelere yerleştirin (örneğin, 4-7 mL).
    NOT: Bir 7 mL'lik cam şişeye 6 ciğer örneği parçasına kadar yerleştirin.
  4. Numuneyi, oda sıcaklığında 8 rpm'de tekerlek rotatorunda1 saat boyunca metanol seyreltmesiyle kurutun; %20 (hacim/hacim), %40, %60 ve %80.
  5. Numuneyi 8 rpm'de bir tekerlek rotatorunda %100 daha metanol ile yıkayın, oda sıcaklığında 1 saat boyunca santrifüj yapılmadan.
  6. Örneği 4 °C'de 30 dakikadan 1 saate kadar soğutun.
  7. Metanolde cam şişede %66 (hacim/hacim) DCM seyreltmeleri hazırlayın.
    NOT: Her seferinde yeni seyreltmeler hazırlayın. Çözeltiyi hazırlamak için cam silindirler kullanın, çünkü DCM polistiren gibi plastikleri çözebilir.
  8. Örnekleri %66 DCM/metanol çözeltisinde gece boyunca 8 rpm'de oda sıcaklığında tekerlek rotatöründe kuluçka için, santrifüj gerçekleşmeden inkübe yapın.
    NOT: Çözüm eklendikten sonra örneklerin üstüne çıkmasına dikkat edin.

2. Gün: Numune ağartma

  1. Numuneyi 8 rpm'de bir tekerlek döner üzerinde %100 metanol ile iki kez yıkayın, her seferinde oda sıcaklığında 1 saat boyunca santrifüj yapılmadan.
  2. Örneği 4 °C'de 30 dakikadan 1 saate kadar soğutun.
  3. Numuneyi, 8 rpm'de, santrifüjyapılmadan metanolde (1 hacim %30 H2O2 ila 5 hacim metanol) soğutulmuş metanolde çamaşır suyu ile çamaşır suyu ile 8 rpm'de, santrifüj yapılmadan 4 °C'de gece boyunca temizleyin.
    NOT: Her seferinde yeni bir çözüm hazırlayın.

3-5. Gün: Örnek permeabilizasyonu

  1. Metanol/H2O serisi ile yeniden hidratlama: 80%, 60%, 40%, 20%, 1x PBS, oda sıcaklığında, tekerlek döner cihazında 8 rpm'de 1 saat boyunca, santrifüj olmadan.
  2. Numuneyi PTx.2 (Tablo 1) ile oda sıcaklığında, tekerlek döner cihazında 8 rpm'de iki kez 1 saat boyunca yıkayın, santrifüj gerçekleşmeden.
  3. Örnekleri Permeabilizasyon Çözeltisi (Tablo 1) içinde 37 °C'de 2 gün boyunca kuluçka edin.

5-17. Gün: İmmünoetiketleme

  1. Örnekleri 37 °C'de 2 gün boyunca Bloklama Çözeltisinde (Tablo 1) bloklayın.
    NOT: Eşek serumunun kararsızlığı nedeniyle her seferinde yeni bir bloklama çözümü hazırlayın. Artan blokaj çözeltisi 4°C'de 1 aya kadar saklanın.
  2. Örnekler, PTwH (Tablo 1) ile seyreltilmiş birincil antikorlarda, %5 DMSO ve %3 Donkey Serumu ile 37 °C'de, tekerlek döner üzerinde 5 rpm'de inkubasyon yapılacak şekilde, 4 gün boyunca santrifüj yapılmadan inkübe edin.
    NOT: 1:500 primer antikor seyreltmesiyle başlayın.
  3. Örnekleri PTwH'de 4-5 kez, oda sıcaklığında, tekerlek döner cihazında 8 rpm'de 1 saat boyunca yıkayın, santrifüj gerçekleşmesin.
    NOT: İsteğe bağlı olarak, örnekleri gece boyunca yıkamaya bırakın.
  4. Örnekler, %3 Donkey Serumu ile %37 °C'de, 5 rpm'de bir tekerlek rotatorunda ikincil antikorlar ve propidium iyodid ile incelendirin; 4 gün boyunca santrifüj yapılmadan.
    NOT: 1:500 ikincil antikor seyreltmesiyle başlayın. 5 mg/mL propidyum iyodid stok çözeltisinden 1:250 propidyum iyodid seyreltmesi kullanın.
  5. Örnekleri PTwH'de 4-5 kez, oda sıcaklığında, tekerlek döner cihazında 8 rpm'de 1 saat boyunca yıkayın, santrifüj gerçekleşmesin.
  6. Numune yıkamayı gece boyunca PTwH'de, oda sıcaklığında, 8 rpm'de bir tekerlek döner üzerinde bırakın, santrifüj gerçekleşmesin.

18. Gün: Temizleme

  1. Numuneyi, oda sıcaklığında 8 rpm'de tekerlek döner cihazında 1 saat boyunca H2Oserisinde (%20 hacim), %40, %60, %80 boyunca metanol sulandırmasıyla kurutun; santrifüj yapılmadan.
  2. Numuneyi 100% metanol ile oda sıcaklığında, tekerlek döner cihazında 8 rpm'de iki kez iki kez yıkayın, santrifüj olmadan.
  3. Numuneyi, 8 rpm'de bir tekerlek döner cihazında oda sıcaklığında %66 (hacim/hacim) DCM seyreltmeleriyle inkübe edin, santrifüj gerçekleşmeden oda sıcaklığında.
  4. Numuneyi 15 dakika boyunca oda sıcaklığında 8 rpm'de tekerlek döner cihazında iki kez 100% DCM ile yıkayın, santrifüj gerçekleşmesin.
  5. Numuneyi DBE'de oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edin, görüntülemeden önce.
  6. Örnekleri DBE'de uzun süreli, boylama sinyalini etkilemeden 1 yıla kadar saklayabilir.

4. Konfokal mikroskopi görüntüleme

  1. Temizlenmiş örneği, #1.5 cam tabanlı 35 mm cam tabanlı bir kaba yerleştirin.
  2. Tabağı etil sinnamat ile doldurarak numuneyi tamamen batırın.
  3. Çanı konfokal üzerine yerleştirin ve en parlak sinyali veren en iyi düzlemi belirlemek için odaklığı ayarlayın.
  4. En parlak düzlemde bir kart görüntüsü alın ve örnekin geniş bir alanını yakalayın; 1024 x 1024 formatı ve hız 600 kullanarak.
    NOT: Görüntü süresini ve dosya boyutunu azaltmak için karo görüntüsü için daha düşük bir objektif (10x veya 20x) kullanın.
  5. Karo görüntüsüne dayanarak, ilgi çekici bölgeleri seçerek daha yüksek çözünürlüklü z-tarama elde edin.
  6. Temizlenmiş dokudan bir z-taraması alın, dokunun tüm derinliğini mikroskopun en iyi çözünürlüğüyle kaplayın; 1024 x 1024 formatı ve hız 600 kullanarak.
    NOT: HSC için en iyi çözünürlüğü sağlamak için yağ daldırmada 40x objektif kullanın.
  7. Resim dosyalarını LIF formatında kaydedin ve dosyaları Fiji veya ImarisViewer 11.0.0 kullanarak görüntüleyin.

5. 3D yeniden yapılandırma için görüntü analizi ve bireysel HSC'lerin nicel analizi

  1. ImarisFileConverter 10.2.0 kullanarak görüntü dosyalarını IMS formatına dönüştürün.
  2. Imaris 10.2.0'daki Surface modelini kullanarak görüntülerdeki nesneyi tespit edebilirsiniz.
  3. Seçilmiş bir 3D bölgede analiz yapmak için Create sihirbazını kullanın, ardından bunu tüm görüntüye uygulayın.
    NOT: Bunu analiz sürecini hızlandırmak için kullanın.
  4. Kaynak kanalı, mutlak yoğunluk seçeneğini seçin ve tüm görüntü için yoğunluk eşiğini belirlemek için smooth butonunu işaretinden çıkarın.
  5. Eşiği değiştirerek görüntüdeki tüm nesneleri yakalayın.
  6. Voxel sayısını kullanarak enkaz nesneleri filtreleyin.
  7. Sihirbazı tamamla, istatistiksel butona basın ve tüm istatistiksel ölçümleri elde edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare karaciğerinin başarılı perfüzyonu ve sabitlenmesi, kanın etkili şekilde alınmasını ve fiksatifin nüfuzunu yansıtan tekdüze soluk, bej-sarı bir karaciğer rengiyle temsil edilir (Şekil 1A,B). Yanlış perfüzyon ise koyu kırmızı veya kahverengi kan pıhtıları bölgelerine yol açar; bu da optik netliği azaltır ve bu örnek bölgelerinde yüksek arka plan sinyaline yol açar (Şekil 1C).

Doku ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, sağlam karaciğer dokusunda HSC morfolojisinin üç boyutlu görselleştirmesi ve nicel analizine yol açan tekrarlanabilir ve uyarlanabilir bir örnek hazırlama boru hattını tanımlar. Genetik floresan hücre etiketleme, yerinde karaciğer perfüzyonu ve modifiye edilmiş iDISCO+ temizleme yönteminin entegrasyonu, karaciğer mikroçevresinin mekansal mimarisini korurken tek hücre çözünürlükte büyük doku hacimlerinin görüntülenmesini sağlar.

Bu yöntemi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, 1R01 DK136016-01 ve 5P30CA196521 (NCI merkez hibesi) ile desteklenmektedir. Mikroskopi ve/veya görüntü analizi, Mount Sinai'deki Icahn Tıp Fakültesi'ndeki Mikroskopi ve İleri Biyogörüntüleme CoRE'de gerçekleştirildi. Bu araştırma, kısmen Mount Sinai'deki Tisch Kanser Enstitüsü, P30 CA196521 - Kanser Merkezi Destek Grantı tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-RFP Antikor, tavşan, önceden adsorbe edilmişRockland600-401-379
4 odalı 35mm cam alt çanak, 20 mm mikro kuyruk, #1.5 kapak camıCellvisD35C4201.5N
AnaSed Enjeksiyonu (ksilazin enjeksiyonu)Akorn, Inc.NDC 593990110-2020 mg/mL
Konik santrifüj tüpleri: 50ml Falcon352098
Pamuk çubuklarıMedlineMDS202000
Curved Locking  HemostatlarFisher Scientific16-100-117
Cy3 ile bağlanmış AffiniPure Donkey Anti-Fare IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch712-165-153
Hassas Çalışma Makasları 4.75" Kavisli Keskin/KütRoboz Cerrahi Cihaz
728501
Dibenzil Eter (DBE), %98Sigma Aldrich108014
Diklorometan (DCM),   ≥ 99.8%Sigma Aldrich270997
Dimetil sülfoksit (DMSO), ≥ 99.9%Sigma AldrichD8418
Eşek Anti Tavşan IgG (H+L) Yüksek Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 647ThermoFisher ScientificA31573
Eşek SerumuEMD MilliporeS30
Etil sinamat, %99Sigma Aldrich112372
ekstra ince mikro diseksiyon makasi; 24 mm BıçakFisher ScientificNC9232515
F4/80 Monoklonal Antikor sıçanThermoFisher Scientific14-4801-82
FijiNIH
ForsepsFisher ScientificNC9214139
GlisinBio-Rad1610718
Heparin Sodyum TuzuChem-Impex29984
Hybaid Hibritleşme FırınıTriad ScientificMaxi 14
Hidrojen peroksit, %30Sigma Aldrich31642
Imaris 10.2.0 yazılımıOxford Instruments
ImarisFileConverter 10.2.0 yazılımıOxford Instruments
ImarisViewer 11.0.0Oxford Instruments
IV KateterExel International Inc.EXE 26751
Ketamin, Hidroklorür enjeksiyonuDechraB8U4100 mg/mL
LAS X 4.4.0.24861 yazılımıLeica
Leica Stellaris 8 Konfokal MikroskobuLeica
Metanol, HPLC derecesiFisherA452-2
Çok amaçlı rotatörScientific Industries, Inc.Model 151
İğneler (27G x 1/2'')BD305109
Paraformadehilde, toz, %95Sigma Aldrich158127
Peristaltik pompaGilsonModel Minipuls 3
Peristaltik pompa tüpü, MasterFlexTermo Bilimsel96400-163.1mm ID x 7.6m L/S Peroksitle Kürlenmiş Silikon Hassas Pompa Borusu, Boyut L/S 16, 1/8in Hortum Çubuğu
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)CytivaSH30256.01Steril, pH 7.0 - 7.2, kalsiyum ve magnezyum içermiyor
Propidium iyodid, ≥ %94,0 (HPLC)Sigma AldrichP4170
Jilet BıçaklarıAmerikan Hattı66-0362
Sallanan platformVWRModel 200
Sodyum Azid, ≥ 99.5%Sigma AldrichS2002
DikişEtikonJ109T
Şırınga (1 mL)BD309628
TritonX-100SigmaT9284
Tween-20Termo BilimselJ20605-AP
Şişeler, vida üstü ve katı kapağı, alüminyum astar, önceden monte edilmişSigma Aldrich27470-Ucilt 7 mL, kehribar cam şişe, aşırı ve zamanlar; H 17 mm ve zamanlar; 60 mm, 15-425 için dişli

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Henderson, N. C., Rieder, F., Wynn, T. A. Fibrosis: from mechanisms to medicines. Nature. 587 (7835), 555-566 (2020).
  2. Wang, S., Friedman, S. L. Found in translation-Fibrosis in metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH). Sci Transl Med. 15 (716), eadi0759(2023).
  3. Amini-Salehi, E., et al. Global prevalence of nonalcoholic fatty liver disease: An updated review meta-analysis comprising a population of 78 million from 38 countries. Arch Med Res. 55 (6), 103043(2024).
  4. Ekstedt, M., et al. Fibrosis stage is the strongest predictor for disease-specific mortality in NAFLD after up to 33 years of follow-up. Hepatology. 61 (5), 1547-1554 (2015).
  5. Hagström, H., et al. Fibrosis stage but not NASH predicts mortality and time to development of severe liver disease in biopsy-proven NAFLD. J Hepatol. 67 (6), 1265-1273 (2017).
  6. Geng, Y., Schwabe, R. F. Hepatic stellate cell heterogeneity: Functional aspects and therapeutic implications. Hepatology. , (2025).
  7. Trinh, V. Q. -H., et al. Hepatic stellate cells maintain liver homeostasis through paracrine neurotrophin-3 signaling that induces hepatocyte proliferation. Sci Signal. 16 (787), eadf6696(2023).
  8. Sugimoto, A., et al. Hepatic stellate cells control liver zonation, size and functions via R-spondin 3. Nature. 640 (8059), 752-761 (2025).
  9. Bataller, R., Brenner, D. A. Liver fibrosis. J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).
  10. Gäbele, E., Brenner, D. A., Rippe, R. A. Liver fibrosis: Signals leading to the amplification of the fibrogenic hepatic stellate cell. Front Biosci. 8 (4), 69-77 (2003).
  11. Marra, F. Hepatic stellate cells and the regulation of liver inflammation. J Hepatol. 31 (6), 1106-1119 (1999).
  12. Milani, S., et al. Procollagen expression by nonparenchymal rat liver cells in experimental biliary fibrosis. Gastroenterology. 98 (1), 175-184 (1990).
  13. Sato, M., Suzuki, S., Senoo, H. Hepatic stellate cells: Unique characteristics in cell biology and phenotype. Cell Struct Funct. 28 (2), 105-112 (2003).
  14. Du, K., Jun, J. H., Dutta, R. K., Plasticity Diehl, A. M. heterogeneity, and multifunctionality of hepatic stellate cells in liver pathophysiology. Hepatol Commun. 8 (5), e0411(2024).
  15. Trivedi, P., Wang, S., Friedman, S. L. The power of plasticity-Metabolic regulation of hepatic stellate cells. Cell Metab. 33 (2), 242-257 (2021).
  16. Niki, T., et al. Comparison of glial fibrillary acidic protein and desmin staining in normal and CCl4-induced fibrotic rat livers. Hepatology. 23 (6), 1538-1545 (1996).
  17. Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  18. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Mol Syst Biol. 17 (3), e9807(2021).
  19. Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (1), 43-55 (2014).
  20. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
  21. Mederacke, I., et al. Fate tracing reveals hepatic stellate cells as dominant contributors to liver fibrosis independent of its aetiology. Nat Commun. 4, 2823(2013).
  22. Slater, T. F., Cheeseman, K. H., Ingold, K. U. Carbon tetrachloride toxicity as a model for studying free-radical mediated liver injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 311 (1152), 633-645 (1985).
  23. Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. iScience. 24 (4), 102387(2021).
  24. Shrirao, A. B., et al. Autofluorescence of blood and its application in biomedical and clinical research. Biotechnol Bioeng. 118 (12), 4550-4576 (2021).
  25. Croce, A. C., Bottiroli, G. Lipids: Evergreen autofluorescent biomarkers for the liver functional profiling. Eur J Histochem. 61 (2), 2808(2017).
  26. Jafree, D. J., Long, D. A., Scambler, P. J., Moulding, D. Tissue clearing and deep imaging of the kidney using confocal and two-photon microscopy. Methods Mol Biol. , 103-126 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Hepatik Stellat H crelerDoku effafla t rmaKonfokal MikroskopiBoyutlu Rekonstr ksiyonKaraci er Dokusu G r nt lemeFibrojenik MiyofibroblastlarFloresan EtiketlemeFare Karaci er Modelleri

İlgili makaleler