Hipokampal Gefirin, Kollybistin ve Otofaji üzerindeki Tritolid Etkilerinin Aβ1-42 Fare Modelinde Değerlendirilmesi

Özet

Bu protokol, toplanmış Aβ1-42 kaynaklı Alzheimer hastalığına benzer fare modelinin kurulmasını ve hipokampal inhibitör sinapsla ilişkili proteinler, PI3K/Akt/GSK-3β sinyalizasyonu ve otofaji ile ilişkili belirteçler üzerindeki triptolid etkilerinin değerlendirilmesini tanımlar.

Özet

Alzheimer hastalığı sinaptik işlevsizlikle ilişkilidir, ancak Aβ kaynaklı patolojinin inhibitör sinapsla ilişkili proteinleri ve aday müdahaleden sonra otofaji ile ilişkili sinyalleri nasıl etkilediğini değerlendirmek için standart prosedürler sınırlıdır. Bu protokol, Aβ1-42 kaynaklı Alzheimer hastalığına benzer bir fare modeli oluşturmak ve triptolidin hipokampal Gephyrin, Collybistin, PI3K/Akt/GSK-3β sinyalizasyonu ve otofaji ile ilgili belirteçler üzerindeki etkilerini değerlendirmek için bir iş akışını tanımlar. Yetişkin C57BL/6J fareleri, agregasyon indükleyici koşullarda hazırlanan iki taraflı intracerebroventriküler Aβ1-42 enjeksiyonu alır ve ardından PI3K inhibitörü LY294002 ile veya olmadan günlük intraperitoneal triptolite uygulanır. Mekânsal öğrenme ve hafıza, Morris su labirenti testleri kullanılarak değerlendirilir. Hipokampal nöron hasarı ve Aβ birikimleri, hematoksilin ve eozin boyama ile Aβ immünohistokimyası ile değerlendirilirken, hipokampal lizatlar Western blotting ile analiz edilip Gephyrin, fosforile edilmiş Gephyrin, Collybistin, PI3K/Akt/GSK-3β sinyal proteinleri, LC3-II/I ve p62 ölçülür. Temel prosedürel hususlar arasında standartlaştırılmış Aβ1-42 hazırlığı, doğru stereotaksik enjeksiyon, tutarlı davranışsal test koşulları, kör ilgi alanı seçimi ve standartlaştırılmış görüntü ve densitometri analizi yer alır. Bu iş akışını kullanarak, Aβ1-42 uygulaması mekânsal öğrenme ve hafıza eksiklikleri, hipokampal nöron hasarı, Aβ birikim, azaltılmış Gephyrin ve Kollybistin ifadesi, PI3K/Akt/GSK-3β sinyal bildirimini değiştirmiş ve LC3-II/I ile p62 birikimini artırmıştır. Triptolid bu davranışsal, histolojik ve moleküler değişiklikleri kısmen tersine çevirirken, etkilerini LY294002 azaltmıştır. Bu protokol, Aβ kaynaklı hipokampal moleküler değişiklikleri ve aday müdahaleleri değerlendirmek için kullanılabilir; aynı zamanda bu modelin insan Alzheimer hastalığının kronik, çok faktörlü ilerlemesini tekrarlamadığını kabul eder.

Giriş

Alzheimer hastalığı (AD), bilişsel gerileme, hafıza bozuklukları ve davranışsal bozukluklarla karakterize edilen ilerleyici bir nörodejeneratif bozukluktur ve yaşlı yetişkinlerde demansın başlıca nedenlerinden biridir. Amiloid-β (Aβ) biriktirilmesi, tau patolojisi, sinaptik disfonksiyon, nöroinflamasyon ve bozulmuş protein homeostazı AD patogenezinde yaygın olarak rol oynamış olsa da, Aβ ile ilişkili toksisiteyi inhibitör sinaptik protein bozulmasına bağlayan moleküler mekanizmalar hâlâ tam olarak^{anlaşılmamıştır} 1,2,3,4 . Inhibitör sinaptik disfonksiyon, nöronal devrelerde uyarılma ve inhibisyon arasındaki dengeyi bozabilir, böylece ağ istikrarsızlığına ve bilişsel bozulmaya katkıda bulunabilir. Ancak, Aβ kaynaklı AD benzeri patolojik koşullarda inhibitör sinaps ilişkili iskelet proteinlerini düzenleyen hücre içi sinyal olayları daha fazla açıklama gerektirir⁵.

Gefirin, glisin reseptörleri ve γ-aminobutirik asit tip A reseptörleri dahil olmak üzere inhibitör nörotransmitter reseptörlerini postsinaptik bölgelerde sabitleyen ve stabilize eden ana postsinaptik iskelet^{proteinidir 6}. ARHGEF9 tarafından kodlanan kollybistin, Gephyrin ile etkileşime giren ve inhibitör sinaptik bileşenlerin kümelenmesini ve membran lokalizasyonunu teşvik eden bir guanin nükleotit değişim^{faktörüdür 7}. Bu nedenle, Gephyrin ile Collybistin arasındaki fonksiyonel etkileşim, inhibitör sinapsların organizasyonu, bakımı ve plastisitesi için gereklidir. Bu protein kompleksinin bozulması, inhibitör nörotransinasyonu bozabilir ve bilişsel eksikliklere katkıda bulunabilir. Özellikle, Gephyrin stabilitesi ve sinaptik kümelenme, fosforilasyona bağlı mekanizmalarla düzenlenebilir. Aβ oligomer ile ilişkili sinyal beslemesinin, serin 270'te Gephyrin fosforilasyonunu teşvik edebilen glikojen sentaz kinaz-3β (GSK-3β) gibi kinazları etkilediği bildirilmiştir. Bu bulgular, Gephyrin'in kinaz aracılı düzenlemesinin Aβ ile ilişkili patoloji ile inhibitör sinaptik disfonksiyon ^8,9 arasında önemli bir moleküler bağlantı oluşturabileceğini göstermektedir.

PI3K/Akt yolu, nöronal hayatta kalma, sinaptik plastisite, protein homeostazı ve otofaji düzenlemesinde rol alan önemli bir hücre içi sinyal yoludur. AKT aktivitesi, inhibitör fosforilasyon yoluyla GSK-3β'yi baskılayabilir, böylece nöronal fonksiyon ve sinaptik stabilitede yer alan alt akış substratlarını modüle edebilir. PI3K/Akt/GSK-3β sinyalinin düzensizliği, AD ile ilişkili nöronal hasara yol açmış ve hem sinaptik bozulmaya hem de anormal protein bozulmasına katkıda bulunabilir^10,11. Paralel olarak, otofaji hasar görmüş organelleri ve yanlış katlanmış proteinleri çıkaran temel bir hücre içi bozunma yoludur. Otofagi-lizozomal disfonksiyon, AD^12'de Aβ birikimi, tau patolojisi ve nöronal hasarla yakından ilişkilendirilmiştir. Ancak, LC3-II/I değişiklikleri tek başına artan otofagozom oluşumunu bozmuş otofajik bozulmadan ayırt edemez; Bu nedenle, otofaji ile ilişkili akı değişikliklerini daha iyi değerlendirmek için P62 gibi ek belirteçlere ihtiyaç vardır. Bu gözlemler birlikte, PI3K/Akt aktivitesi, GSK-3β aracılı Gephyrin'in düzenlenmesi ve otofaji ile ilgili belirteçlerin aynı deneysel çerçevede incelenmesi gerekliliğini desteklemektedir.

Tripterygium wilfordii'den izole edilen biyoaktif bir diterpen triepoksit olan triptolide'nin anti-inflamatuar, immünomodülatör ve nöroprotektif etkiler gösterdiği^{bildirilmiştir 13}. Önceki çalışmalar, triptolidin bilişsel performansı iyileştirebileceğini ve inhibitör sinapsla ilişkili proteinleri AD benzeri modellerde koruyabileceğini öne sürmüştür. Buna rağmen, triptolid tedavisi, PI3K/Akt yol aktivasyonu, GSK-3β aracılı Gephyrin fosforilasyonu, kollibistin ekspresyonu ve otofaji ile ilişkili proteinlerdeki değişiklikler arasındaki mekanik ilişki tam olarak tanımlanmamıştır. Aβ1-42 indüklenen AD benzeri bir fare modelinde triptolid'in hipokampal Gephyrin ve Kollibistin ekspresyonunu PI3K/Akt/GSK-3β ile ilişkili bir mekanizma aracılığıyla düzenleyip düzenlemediği belirsizdir^14,15.

APP/PS1 veya 5xFAD fareleri gibi kronik transjenik AD modelleri ve tauopati tabanlı modellerle karşılaştırıldığında, toplanmış Aβ1-42'nin intracerebroventriküler enjeksiyonu, Aβ ile ilişkili hipokampal yaralanma ve bilişsel bozulmayı indükte etmek için nispeten hızlı ve teknik olarak erişilebilir bir yaklaşım sunar. Bu protokol, deneysel amaç kısa vadeli Aβ kaynaklı nörotoksisite, hipokampal moleküler değişiklikler ve tanımlanmış sinyal yolları üzerindeki müdahaleyle ilgili etkileri değerlendirmek olduğunda uygundur. Ancak bu model, insan AD'nin kronik amiloid üretimini, tau patolojisini, damar değişikliklerini, nöroimmün karmaşıklığını veya yaşa bağlı ilerlemesini yeniden üretemez. Bu nedenle, bu protokol kullanılarak elde edilen bulgular, Aβ kaynaklı AD benzeri patoloji olarak yorumlanmalı ve ideal olarak kronik transgenik modellerde, tau ile ilgili modellerde veya insan kaynaklı nöronal sistemlerde doğrulanmalıdır. Aβ patolojisi, PI3K/Akt/GSK-3β sinyalizasyonu, inhibitör sinaps ilişkili proteinler ve otofaji ile ilişkili anormallikleri AD benzeri patolojiye bağlayan önceki kanıtlara rağmen, davranışsal testler, hipokampal histolojik değerlendirme, Aβ immünohistokimyası, inhibitör sinaps ilişkili proteinlerin analizi, kinaz sinyal değerlendirmesi ve otofaji ile ilişkili belirteçlerin tek bir Aβ1-42 indüklenmiş müdahale modeli içinde tespit edilmesini içeren protokoller azdır. Bu metodolojik boşluk, aday bileşiklerin inhibitör sinapsla ilişkili proteinlerdeki değişiklikleri tanımlanmış hücre içi sinyal yolları aracılığıyla modüle edip etmediğine dair tekrarlanabilir değerlendirmeyi sınırlar.

Bu protokolün amacı, triptolid ile işlenmiş, PI3K inhibitörü LY294002 olsun ya da olmasın, hipokampal Gephyrin ve Kollybistin ifadesini ve bunlara bağlı düzenleyici mekanizmaları değerlendirmek için tekrarlanabilir bir iş akışı sağlamaktır. Bu çalışmanın orijinal katkısı, stereotaksik Aβ1-42 uygulaması, sinyal yollarının farmakolojik modülasyonu, Morris su labirenti testi, histolojik ve immünohistokimyasal değerlendirme ve inhibitör sinapsla ilişkili proteinlerin Western blot analizi, PI3K/Akt/GSK-3β sinyal iletimi ve otofagi ile ilgili belirteçlerin entegrasyonudur. Çalışma hipotezi, Aβ1-42 kaynaklı AD benzeri patolojinin PI3K/Akt sinyalizasyonunun bozulması, GSK-3β ile ilişkili Gephyrin fosforilasyonunun değişmesi, hipokampal Gephyrin ve Collybistin ekspresyonunun azalması ve otofaji ile ilgili proteinlerin anormal birikimi ile ilişkilendirileceği, oysa triptolid tedavisinin bu davranışsal ve moleküler anormallikleri kısmen tersine çevireceğiydi.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri Hubei Tıp Üniversitesi Tıbbi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve hayvan bakımı ve kullanımı için kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir (No. SYXK2019-0031.). Hayvanlarla ilgili tüm işlemler, Aβ1-42, triptolid, LY294002, paraformaldehit, ksilen, etanol ve kemimilüminesans reaktifler, laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlük dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla yapılmalıdır. Hayvan karkasları, beyin dokuları, Aβ ile kirlenmiş tüketim maddeleri, paraformaldehit atığı, ksilen atığı ve ECL ile kirlenmiş maddeler ayrı ayrı toplanmalı ve kurumsal biyogüvenlik ile kimyasal atık bertaraf düzenlemelerine uygun olarak bertaraf edilmelidir. Görüntü analizi ImageJ kullanılarak gerçekleştirildi. İmmünohistokimyasal analiz için, görüntüler 8 bit gri tonlara dönüştürüldü veya DAB-pozitif boyama izole etmek için renk dekonvolüsyonuna tabi tutuldu. Aynı eşik aynı deneydeki tüm görüntülere uygulandı. Pozitif boyama alanı, toplam ilgi alanı alanı ve entegre yoğunluk ölçüldü. Western blotting için, bant yoğunlukları arka plan çıkarma sonrası jel analiz aracı kullanılarak ölçüldü. Hedef protein seviyeleri β-aktine normalleştirilirken, fosforile edilmiş proteinler karşılık gelen toplam protein seviyelerine normalleştirildi.

Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar, ürün isimleri, üreticiler, katalog veya model numaraları ile genel açıklamalar dahil olmak üzere Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

Hayvanlar ve deneysel gruplama
Hubei Tıp Üniversitesi Hayvan Deney Merkezi'nden 24 erkek ve 24 dişi dahil olmak üzere 10-12 haftalık ve 22-28 g ağırlığında kırk sekiz yetişkin C57BL/6J faresi satın alındı. Fareler, 22 ± 2 °C sıcaklıklarda, otoklavlı suya ve standart kemirgen yemeğine serbest erişimle belirli patojensiz koşullarda barındırıldı. 1 haftalık aklimatizasyondan sonra fareler rastgele dört gruba ayrıldı: kontrol grubu, Aβ1-42 indüklenmiş AD benzeri model grubu, triptolid ile tedavi edilen grup ve LY294002 artı triptolid ortak tedavi grubu, her grupta 12 fare. Erkek ve dişi fareler gruplar arasında mümkün olduğunca eşit şekilde dengelendi.

Aβ1-42 peptidi, steril normal tuzlu sunda son konsantrasyon 10 μg/μL olarak çözüldü. Aβ1-42'nin toplama indükleyici koşullarda hazırlanması için, çözelti 7 gün boyunca dolaşan su banyosunda 37 °C'de kuluçka halindeydi, kullanılmadan önce nazikçe karıştırıldı ve enjeksiyon sırasında buz üzerinde tutuldu. Bu hazırlık koşulu, daha önce yayımlanmış Aβ42 toplama prosedürlerinden uyarlanmıştır. Mevcut çalışmada, tam enjekte edilen Aβ1-42 partisinin toplama durumu Thioflavin T floresansı, SDS-PAGE/Western blotlama veya iletim elektron mikroskopisi ile bağımsız olarak karakterize edilmemiştir. Bu nedenle, bu protokolteki "toplu Aβ1-42" terimi, toplama indükleyici kuluçka koşullarında hazırlanan Aβ1-42'yi ifade eder.

Model oluşturmak için, fareler 0,04 mL/10 g vücut ağırlığı dozda %10 pentobarbital sodyum intraperitoneal enjeksiyonla anestezi edildi. Pedal çekilmesinin ve kornea reflekslerinin olmaması yeterli anestezi olarak doğrulandı. Her fare daha sonra stereotaksik bir cihaza sabitlendi ve saç derisi tıraş edilip iyodofor veya %75 etanol ile dezenfekte edildi. Kafatasını ortaya çıkarmak için orta hat kesisi yapıldı ve bregma stereomikroskop altında tespit edildi. Kafatası öyle ayarlandı ki, bregma ve lambda aynı yatay düzlemde konumlandırıldı.

İki taraflı lateral ventrikül enjeksiyonları, bregmaya göre aşağıdaki koordinatlarla gerçekleştirildi: anteroposterior, −0,50 mm; mediolateral, ±1.00 mm; ve dorsoventral, kafatası yüzeyinden −3,00 mm yükseklikte. Toplam 2 μL toplamlı Aβ1-42 çözeltisi, mikro şırınga kullanılarak her lateral ventriküle yavaşça (2 μL/dakika) enjekte edildi. Enjeksiyon, doku hasarını ve reflüsünü azaltmak için sürekli düşük hızda yapıldı. Enjeksiyondan sonra iğne yaklaşık 5 dakika yerinde bırakıldı, sonra yavaşça çekildi. Kontrol fareleri, aynı koordinatlarda ve aynı cerrahi işlemle eşit miktarda steril normal salin aldı. Enjeksiyondan sonra, saç derisi kesisi dikişler veya yara klipçeleriyle kapatıldı ve fareler bilinçlerine gelene kadar ısıtılmış bir iyileşme kafesine yerleştirildi. Ameliyat sonrası iyileşme, vücut ağırlığı, yara iyileşmesi, bakım davranışı, hareketli aktivite ve ağrı veya sıkıntı belirtileri günlük olarak izlendi.

Model stabil kabul edildikten sonra stereotaksik enjeksiyondan 2 hafta sonra ilaç müdahalesi başlatıldı. Triptolid, %4 propilen glikol içeren normal salinle çözündü ve 30 gün ardışık olarak günde bir kez intraperitoneal olarak verildi. Triptolid ile tedavi edilen grup günde 0,2 mg/kg oranında triptolid alırken, LY294002 artı triptolid ortak tedavi grubu PI3K inhibitörü LY294002 ile birlikte günde bir kez 30 gün ardışık 30 gün boyunca 0,3 mg/kg ile triptolid aldı. Kontrol grubu ve Aβ1-42 indüklenen AD benzeri model grubu, aynı enjeksiyon^{programı 16} kullanılarak eşit hacimde araç çözeltisi aldı.

Morris su labirenti testi
Mekansal öğrenme ve hafıza, son ilaç uygulamasından 24 saat sonra Morris su labirenti kullanılarak değerlendirildi. Su labirenti, 22 °C ± 1 °C arasında tutulan suyla dolu dairesel bir havuzdan oluşuyordu. Görsel ipuçları havuzun etrafına yerleştirildi ve deney boyunca değişmeden kaldı. Yer navigasyon aşamasında, gizli platform hedef kadranda sabitlenmişti. Her gün test yapılmadan önce, farelerin test odasına yaklaşık 30 dakika alışmalarına izin verildi.

Yer navigasyon testi 6 gün ardışık yapıldı. Her denemede fare nazikçe suya yerleştirildi, başlangıç kadranlarından birinden havuz duvarına bakacak şekilde ve 60 saniyeye kadar gizli platformu aramasına izin verildi. Fare platformu 60 saniye içinde bulursa, platformda 15 saniye kalmasına izin verilirdi. Fare platformu 60 saniye içinde bulamazsa, platforma yönlendirilir ve mekânsal bellek konsolidasyonu için 20 saniye orada kalmasına izin verilirdi. Her fare günde 4 deneme geçirdi ve kaçış gecikmesi, yüzme mesafesi ve yüzme hızı otomatik bir video takip sistemi kullanılarak kaydedildi.

7. gün, platform soruşturma denemesi için kaldırıldı. Fare, orijinal platformun karşısındaki kadrandan suya konmuş ve 60 saniye boyunca serbestçe yüzmesine izin verilmiştir. Platform geçiş sayısı ve hedef çeyrekte geçirilen sürenin yüzdesi kaydedildi. Her denemeden sonra fare kurutulup hipotermiyi önlemek için ısıtılmış kafese^{geri getirilirdi 17,18}.

Doku koleksiyonu
Davranışsal testlerden sonra, fareler %10 pentobarbital sodyum enjeksiyonu ile %10 mL/10 g vücut ağırlığı dozunda derin anestezi altına alındı. Her gruptan sekiz fare hipokampal protein ekstraksiyonu için rastgele seçildi. Beyinleri buz üzerinde hızla çıkarıldı ve iki taraflı hipokampus dokuları buz gibi soğuk bir yüzeyde disseksiye edildi. Hipokampus örnekleri önceden etiketlenmiş kriyoviallere yerleştirildi, sıvı azotta donduruldu ve protein çıkarılana kadar −80 °C'de saklandı.

Her gruptan kalan dört fare histolojik ve immünohistokimyasal analizler için kullanıldı. Derin anestezi altında, fareler karaciğer solgunlaşana kadar fosfatla tamponlanmış tuzlu su ile transkardiyal perfüzyon edildi, ardından %4 paraformaldehit verildi. Beyinler dikkatlice çıkarıldı ve 24 saat boyunca 4 °C'de %4 paraformaldehit ile sabitlendi. Fiksasyondan sonra beyin dokuları patoloji deney platformuna gönderildi; burada parafin gömülüp ardından kesitlenme gerçekleştirildi. Paraformaldehit kimyasal bir duman davlumanında işleniyordu ve paraformaldehit içeren atıklar kurumsal kimyasal atık bertaraf gereksinimlerine uygun olarak ayrı ayrı toplanıyordu.

Hematoksilin ve eozin boyama
Parafinle gömülü beyin dokuları, hipokampusu içeren 4 μm koronal kesitlere bölündü. Bölümler 60 °C'de 1 saat pişirildi, her biri 10 dakika boyunca iki kez ksilen içinde deparafin edildi ve sınıflandırılmış etanol çözeltileriyle (%100, 95%, %85 ve %75) yeniden nemlendirildi, ardından damıtılmış su (her adım için 5 dakika) verildi. Rehidrasyondan sonra, bölümler 10 dakika boyunca hematoksilinle boyandı, akan musluk suyunda durulandı, gerektiğinde kısa süreliğine asit alkolle (2 s) farklılaştırıldı ve akan musluk suyunda mavileştirildi. Bölümler daha sonra 5 dakika boyunca eosin ile karşı boyandı, derecelendirilmiş etanol ile kurutuldu, ksilende iki kez 5 dakika boyunca temizlendi ve nötr reçine ile monte edildi.

Hipokampal morfoloji ışık mikroskobu altında gözlemlendi. Tüm gruplarda aynı hipokampal alt bölgeden 20× büyütme ve görüntüleme parametreleri kullanılarak görüntüler alındı. Nöronal hasar, grup dağılımı^19'a kör bir araştırmacı tarafından görüntü analiz yazılımı kullanılarak nöron yoğunluğu, nükleer piknoz ve düzensiz düzene dayalı olarak değerlendirildi.

Aβ immünohistokimya
Aβ immünohistokimya için, parafin kesitleri hematoksilin ve eozin boyama için tanımlandığı gibi deparafinize edilip yeniden hidratlandırılmıştır. Antijen toplama, bölümlerin yüksek güçte mikrodalga fırında 3 dakika boyunca iki kez ısıtılması ile pH 8.0'da EDTA antijen toplama tamponunda gerçekleştirildi. Bölümler oda sıcaklığına kadar soğumaya bırakıldı ve ardından PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkandı. Endojen peroksidaz aktivitesi, oda sıcaklığında %3 hidrojen peroksit ile 15 dakika boyunca engellendi, ardından PBS üç kez her biri 5 dakika boyunca yıkandı. Oda sıcaklığında %5 normal keçi serumu ile spesifik olmayan bağlanma 30 dakika boyunca engellendi. Kesimler, gece boyunca 4 °C'de kuluçka edildi ve Aβ'ye karşı birincil antikor PBS'de 1:200 derecesinde seyreltildi. İnkubasyondan sonra, bölümler PBS ile üç kez 5 dakika boyunca yıkanmış, ardından HRP ile konjuge edilmiş ikincil antikor ile oda sıcaklığında 60 dakika kuluçka uygulanmıştır. PBS ile yıkamadan sonra DAB altlığı uygulandı ve renk gelişimi mikroskop altında izlendi. Reaksiyon, kahverengi-pozitif lekelenme ortaya çıkınca damıtılmış suyla durduruldu. Bölümler hematoksilinle karşı boyanmış, derecelendirilmiş etanolle kurutulmuş, ksilen ile temizlenmiş ve nötr reçine ile örtülenmişti. Tüm gruplarda aynı hipokampal alt bölgeden görüntüler, aynı mikroskop ayarlarıyla 20× büyütme ile alındı. Aβ immünboyama, görüntü analiz yazılımı kullanılarak nicelendirilmiştir. Pozitif boyama eşiği tüm görüntülerde tutarlı tutuldu ve Aβ birikintisi, pozitif boyama alanının her mikroskobik alandaki toplam hücre sayısına bölünmesi olarak hesaplandı.

Hipokampal protein ekstraksiyonu ve western blot analizi
Dondurulmuş hipokampal dokular buz üzerinde tutuldu ve proteaz ile fosfataz inhibitörleri içeren buz soğukluğu RIPA lizin tamponunda homojenleştirildi. Homojenatlar 30 dakika boyunca buzda kuluçka içinde tutuldu ve yeterli lizisi sağlamak için aralıklı olarak girdap bırakıldı. Lizatlar daha sonra 12.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjlendi ve süpernatantlar protein analizi için toplandı. Protein konsantrasyonları, üreticinin talimatlarına göre BCA protein test kiti kullanılarak belirlendi. Kısaca, BSA standartları ve protein örnekleri duble olarak hazırlanmış, BCA çalışma reaktifiyle karıştırılmış, 37 °C'de 30 dakika kuluçka edilmiş ve mikroplaka okuyucu kullanılarak 562 nm ölçülmüştür. Protein konsantrasyonları standart eğriye göre hesaplandı ve tüm örnekler^{elektroforez 20'den} önce aynı nihai konsantrasyona ayarlandı.

Her hipokampus örneğinden toplam 20 μg protein %12 SDS-PAGE ile ayrılarak PVDF zarlarına aktarıldı. Elektroforez üst üste yığma için 80 V, ayırma için ise 120 V olarak gerçekleştirildi. Proteinler, 100 V'da ıslak transfer kullanılarak metanolde aktive edilen PVDF membranlarına aktarıldı ve 90 dakika boyunca 4 °C'de kullanıldı. Transferden sonra, zarlar oda sıcaklığında 1 saat boyunca %5 BSA ile tıkandı. Zarlar daha sonra Gephyrin (1:1000 seyreltme), fosforil-Gephyrin (1:500 seyreltme), Collybistin (1:1000 seyreltme), PI3K (1:1000 seyreltme), Akt (1:1000 seyreltme), fosforile Akt (1:1000 seyreltme), GSK-3β (1:1000 seyreltme), fosforile GSK-3β (1:1000 seyreltme), LC3 (1:1000 seyreltme), p62 (1:1000 seyreltme) ve β-aktin (1:5000 seyreltme) ile birlikte gece boyunca kuluçka altına alındı. TBST ile yıkandıktan sonra, zarlar HRP ile konjuge ikincil antikorlarla oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuluçka edildi (1:5000 seyreltme). Protein bantları ECL kemimilüminesans alt yüzeyi kullanılarak görselleştirildi ve kemilyüminesans görüntüleme sistemiyle yakalandı. Bant yoğunlukları görüntü analiz yazılımı kullanılarak nicelendirildi. Toplam protein ekspresyon seviyeleri β-aktine normalleştirildi. Yüksek çözünürlüklü kırpılmamış Western blot görüntüleri ek materyallere dahil edilmiştir.

İstatistiksel Veriler
İstatistiksel analiz, istatistiksel analiz ve grafik oluşturma yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Veriler, şekil kısalarında belirtildiği gibi ortalama SD ± olarak ifade edilmiştir. Davranış testi ve görüntü miktarı ölçeme, grup dağılımı konusunda kör olan araştırmacılar tarafından gerçekleştirildi. Morris su labirenti eğitim aşamasındaki kaçış gecikmesi, grup ve eğitim günü faktörleri olarak gösterilen iki yönlü tekrarlanan ANOVA ile analiz edildi. Prob deneme verileri, histolojik nicelik, immünohistokimyasal nicelleştirme ve Western blot densitometrisi, tek yönlü bir ANOVA testi kullanılarak analiz edildi. İstatistiksel anlamlılık p < 0.05 olarak tanımlandı. Standart anlamlılık gösterimi şu şekilde kullanılmıştır: *p < 0.05, **p < 0.01 ve ***p < 0.001. Kesin örneklem boyutları ilgili figür yazılarında bildirilmiştir. Erkek ve dişi fareler deneysel gruplar arasında eşit şekilde dağıtıldı. Ancak, cinsiyete özgü etkileri tespit etmek için tasarlanmadığı veya güçlendirilmediği için cinsiyete göre katmanlanmış istatistiksel analiz yapılmadı. Bu sınırlama Tartışma bölümünde kabul edilmektedir.

Sonuçlar

Aβ1-42 kaynaklı AD benzeri farelerde öğrenme ve hafıza bozulması ve triptolid tedavisi sonrası kısmi iyileşme

Aβ1-42 ile indüklenen AD benzeri bir fare modeli oluşturmak için, topladığı Aβ1-42 stereotaksik olarak C57BL/6J farelerinin iki taraflı lateral ventriküllerine enjekte edildi. Model oluşturulduktan sonra, fareler PI3K inhibitörü LY294002 ile birlikte araçlar, triptolid veya triptolid ile tedavi edildi. Daha sonra mekansal öğrenme ve hafıza Morris su labirenti kullanılarak değerlendirildi.

6 günlük yer navigasyon aşamasında, kaçış gecikmesi tüm gruplarda kademeli olarak azalmış ve bu da farelerin mekansal öğrenme görevini tekrar eden eğitimle kazandığını göstermiştir (Şekil 1A). Ancak, Aβ1-42 kaynaklı AD benzeri fareler, özellikle sonraki eğitim günlerinde, kontrol farelerine göre sürekli daha uzun kaçış gecikmeleri gösterdi ve bu da mekânsal öğrenmenin bozulduğunu gösteriyordu. Triptolid tedavisi, Aβ1-42 kaynaklı AD benzeri model grubuna kıyasla kaçış gecikmesini kısalttı, LY294002 ile birlikte tedavi ise bu iyileşmeyi zayıflattı. Bu bulgular, triptolidin Aβ1-42 kaynaklı mekânsal öğrenme bozukluğunu kısmen iyileştirdiğini ve bu etkinin PI3K inhibisyonuyla azaltıldığını göstermektedir.

Temsil eden yüzme yolları bu davranışsal değişiklikleri daha da desteklemiştir (Şekil 1B). Kontrol fareleri platform konumu etrafında daha doğrudan, hedef odaklı bir arama deseni gösterirken, Aβ1-42 kaynaklı AD benzeri fareler dağınık ve verimsiz bir yüzme yörüngesi sergiledi. Triptolid ile tedavi edilen farelerde arama davranışı iyileşti, yörüngeler hedef alan çevresinde daha yoğunlaştı. Buna karşılık, LY294002 ve triptolid ile tedavi edilen fareler, yalnızca triptolid ile tedavi edilenlere göre daha az verimli arama göstermiştir. Platform kaldırıldıktan sonra yapılan prob denemesinde, Aβ1-42 indüklenmiş AD benzeri fareler, kontrol farelerine göre orijinal platform konumunu daha az kez geçti ve bu da mekansal hafıza tutumunun bozulduğunu gösteriyor (Şekil 1C). Triptolid tedavisi platform geçiş sayısını artırırken, LY294002 birlikte tedavi bu etkiyi azalttı. Benzer şekilde, hedef kadranda geçirilen zaman yüzdesi Aβ1-42 indüklenmiş AD benzeri farelerde kontrol farelerine kıyasla azalmış, triptolid tedavisinden sonra artmış ve LY294002 birlikte tedaviden sonra tekrar azalmıştır (Şekil 1D).

Bu davranışsal sonuçlar birlikte, toplanmış Aβ1-42'nin çift taraflı intracerebroventriküler enjeksiyonunun farelerde mekânsal öğrenme ve hafıza eksikliklerini tetiklediğini göstermektedir. Triptolid bu davranışsal bozuklukları kısmen tersine çevirirken, triptolid'in koruyucu etkisini azaltmış LY294002 bu da PI3K/Akt sinyalizasyonunun bu modelde gözlemlenen davranışsal etkilere katkıda bulunabileceğini göstermektedir.

Aβ1-42 enjeksiyonu, triptolid ile zayıflatılan hipokampal nöron hasarı ve Aβ birikimini indükte etti

Aβ1-42 kaynaklı AD benzeri patolojik değişikliklerin kurulmasını daha iyi doğrulamak ve triptolidin hipokampal hasar üzerindeki etkisini değerlendirmek için, her gruptaki beyin kesitlerinde hematoksilin ve eosin boyama ile Aβ immünohistokimyası yapıldı.

HE boyama, kontrol grubundaki nöronların yoğun ve düzenli olarak düzenlendiğini, hücre morfolojisi ve nükleer yapısı nispeten net olduğunu gösterdi (Şekil 2A). Buna karşılık, Aβ1-42 kaynaklı AD benzeri fareler, hücresel düzensizliği, azalmış nöron yoğunluğu ve artan nükleer yoğunlaşma ile karakterize edilen belirgin hipokampal nöron hasarı sergilemiştir. Triptolid tedavisi, Aβ1-42 indüklenmiş model grubuna kıyasla daha fazla korunmuş hücresel düzen ve daha az belirgin nükleer piknoz ile hipokampal nöronal morfolojiyi kısmen iyileştirdi. Ancak, LY294002 ile birlikte tedavi, triptolidin koruyucu etkisini azalttı; bu, triptolid ile tedavi edilen gruba kıyasla daha belirgin nöronal düzensizlik ve yaralanma ile yansıdı.

Daha sonra hipokampusta Aβ birikimini değerlendirmek için Aβ immünohistokimyası yapıldı (Şekil 2B). Kontrol grubunda minimal Aβ-pozitif boyama gözlemlenirken, Aβ1-42 indüklenen AD benzeri model grubunda belirgin şekilde artan kahverengi Aβ-pozitif sinyaller görüldü. Triptolid tedavisi, model grubuna kıyasla Aβ-pozitif boyamanı azaltmış ve bu modelde triptolidin Aβ birikintisini zayıflattığını göstermiştir. Buna karşılık, LY294002 artı triptolid ile tedavi edilen farelerde, yalnızca triptolid ile tedavi edilen farelere kıyasla Aβ-pozitif boyama artışı göstermiştir. Nicel analiz bu histolojik gözlemleri daha da doğrulamıştır. Aβ-pozitif sinyal alanı, her mikroskobik alandaki toplam hücre sayısına normalleştirilmiş, Aβ1-42 indüklenen AD benzeri model grubunda kontrol grubuna kıyasla artmış, triptolid tedavisinden sonra azalmış ve LY294002 birlikte tedaviden sonra kısmen artmıştır (Şekil 2B).

Bu sonuçlar, Aβ1-42 enjeksiyonunun hipokampal nöron hasarını ve Aβ birikimini tetiklediğini, triptolidin ise bu patolojik değişiklikleri kısmen hafiflettiğini göstermektedir. LY294002 birlikte tedaviden sonra gözlemlenen tersine dönüş, PI3K/Akt sinyalinin triptolidin koruyucu etkisine katkıda bulunabileceğini göstermektedir.

Triptolid, hipokampal Gephyrin ve Kollibistin ekspresyonunu geri getirdi ve PI3K/Akt/GSK-3β sinyalini modüle etti

Davranışsal ve histolojik değişikliklerin, inhibitör sinapsla ilişkili proteinlerde ve bunların yukarı akışındaki düzenleyici sinyallerde değişikliklerle birlikte olup olmadığını belirlemek için, her gruptan hipokampal lizatlar Western blotting ile analiz edildi. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, Aβ1-42 indüklenmiş AD benzeri farelerde hipokampal Gephyrin ifadesinde belirgin bir azalma varken, fosforile edilmiş Gephyrin seviyeleri arttı (Şekil 3A). Triptolid tedavisi, toplam Gephyrin ifadesini kısmen geri kazandı ve fosforile Gephyrin seviyelerini azalttı. Buna karşılık, LY294002 birlikte tedavi, triptolidle işlenmiş gruba kıyasla azalan Gephyrin ekspresyonu ve artan fosforile Gephyrin ile gösterildiği gibi, triptolidin etkisini zayıflatmıştır. Bu sonuçlar, Aβ1-42 kaynaklı patolojinin sadece hipokampal Gephyrin bolluğunun azalmasıyla değil, aynı zamanda artan Gephyrin fosforilasyonu ile ilişkili olduğunu, triptolidin ise bu değişiklikleri kısmen tersine çevirdiğini göstermektedir.

Kollibistin ise total Gephyrin'e benzer bir ifade desenini gösterdi. Aβ1-42 ile indüklenen AD benzeri fareler, kontrol farelerine kıyasla hipokampal kollibistin ekspresyonunda azalmış iken, triptolid tedavisi Kollibistin ekspresyonunu geri kazanmıştır. LY294002 birlikte tedavi bu etkiyi kısmen tersine çevirdi (Şekil 3B). Bu bulgular, triptolid'in hipokampustaki inhibitör sinapsla ilişkili iskelet proteinlerinin ifadesini koruduğunu ve bu etkinin PI3K inhibisyonuyla azaltıldığını göstermektedir. Daha sonra PI3K/Akt/GSK-3β sinyal yolu incelenerek Gephyrin fosforilasyonunun altında yatan moleküler değişiklikleri daha iyi açıkladı. Aβ1-42 indüklenen AD benzeri model grubunda, PI3K ekspresyonu ve p-Akt/Akt oranı kontrol grubuna göre azalmış, bu da PI3K/Akt sinyal aktivitesinin bozulduğunu göstermektedir (Şekil 3B). Model grubunda p-GSK-3β/GSK-3β oranı da azaltıldı. GSK-3β'nin inhibitör bölgedeki fosforilasyonu, GSK-3β aktivitesinin baskılanmasını yansıttığı için, bu azalma Aβ1-42 indüklenen AD benzeri hipokampusta GSK-3β aktivitesinin nispeten arttığını gösterir. Triptolid tedavisi PI3K ifadesini artırdı, p-Akt/Akt oranını geri getirdi ve p-GSK-3β/GSK-3β oranını yükseltti. Bu etkiler LY294002 birlikte tedavi ile zayıflatıldı.

Bu sonuçlar birlikte, Aβ1-42 kaynaklı AD benzeri patolojinin hipokampal Gephyrin ve Kollybistin ekspresyonunun azalması, artan Gephyrin fosforilasyonu ve GSK-3β'nun PI3K/AKT aracılı inhibitör fosforilasyonunun bozulmasıyla ilişkili olduğunu göstermektedir. Triptolid bu moleküler değişiklikleri kısmen tersine çevirirken, triptolidin etkilerini zayıflattı LY294002 ve bu modelde hipokampal Gephyrin ve Kollybistin regülasyonunda PI3K/Akt/GSK-3β sinyallerinin katılımını destekledi.

Triptolid, Aβ1-42 indüklenen AD benzeri farelerin hipokampusunda otofaji ile ilişkili protein anormalliklerini zayıflattı

Aβ1-42 kaynaklı AD benzeri patolojinin ve triptolid tedavisinin otofaji ile ilişkili proteinlerdeki değişikliklerle ilişkili olup olmadığını belirlemek için, Western blotting ile hipokampal lizatlarda LC3 ve p62 ekspresyonları incelendi. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, Aβ1-42 indüklenmiş AD benzeri farelerde LC3-II/I oranı arttı; bu da otofagozomlarla ilişkili LC3-II birikimi artışını gösteriyor. Paralel olarak, model grubunda p62 ekspresyonu da yükseldi; bu da hipokampusta otofaji ile ilişkili substratların birikimine işaret etmektedir. Triptolid tedavisi, hem LC3-II/I oranını hem de p62 ifadesini Aβ1-42 kaynaklı AD benzeri model grubuna kıyasla azaltmıştır. Bu sonuçlar, triptolid'in Aβ1-42 tarafından indüklenen otofaji ile ilişkili proteinlerin anormal birikimini azalttığını göstermektedir. Buna karşılık, LY294002 birlikte tedavi, yalnızca triptolid tedavisine kıyasla LC3-II/I oranını ve p62 ekspresyonunu artırdı; bu da PI3K inhibisyonunun triptolidin otofaji ile ilişkili protein değişiklikleri üzerindeki etkisini azalttığını gösterdi (Şekil 4).

Genel olarak, kontrol grubu temel davranışsal, histolojik ve moleküler profil sağladı; Aβ1-42 indüklenen AD benzeri model grubu ise intracerebroventriküler Aβ1-42 uygulamasının bilişsel bozukluk, hipokampal nöron hasarı, Aβ birikmesi, azaltılmış inhibitör sinaps ile ilişkili proteinler, PI3K/Akt/GSK-3β sinyalindeki değişiklikler ve otofaji ile ilişkili proteinlerin birikimi sağladığını doğruladı. Aβ1-42 indüklenen model grubu ile triptolid ile tedavi edilen grup arasındaki karşılaştırma, triptolidin bu anormallikleri kısmen tersine çevirdiğini gösterdi. Triptolid ile tedavi edilen grup ile LY294002 artı triptolid ortak tedavi grubu arasındaki karşılaştırma, PI3K inhibisyonunun triptolidin etkilerini azalttığını gösterdi. Bu sonuçlar, triptolid'in hipokampal Gephyrin, Collybistin ve otofaji ile ilişkili proteinlerdeki değişiklikleri, Aβ1-42 indüklenen AD benzeri modelde PI3K/Akt/GSK-3β ile ilişkili bir mekanizma aracılığıyla modüle ettiği çalışma hipotezini desteklemektedir.

VERİ ERIŞILEBILIRLIĞI:

Bu çalışmanın bulgularını yeniden üretebilmek için gerekli tüm ham veriler, Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2 olarak sunulmaktadır. Bunlar arasında orijinal western blot ve jel görüntüleri, kırpılmamış leke verileri, istatistiksel analizler için kullanılan ham sayısal değerler ve oluşturulan grafikler yer alır. (Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2) Bu dosyalar, Şekil 1–4'te bildirilen nicel sonuçları destekleyen ham verileri sağlar.

Şekil 1: Triptolid, Aβ1-42 kaynaklı AD benzeri farelerde mekânsal öğrenme ve hafıza eksikliklerini kısmen iyileştirmiştir. (A) Morris su labirentinin 6 günlük yer navigasyon aşamasında kaçış gecikmesi. (B) Soruşturma denemesi sırasında temsil eden yüzme yörüngeleri. (C) Platform kaldırıldıktan sonra orijinal platform konumundan geçen geçiş sayısı. (D) Sondalama denemesi sırasında hedef bölgede geçirilen zamanın yüzdesi. Veriler ortalama SD ± olarak sunulmaktadır. Kaçış gecikmesi iki yönlü tekrarlanan ANOVA ile analiz edilirken, prob denemesi verileri tek yönlü ANOVA testi ile analiz edilmiştir. Kontrol grubu için Ktr; AD, Aβ1-42 indüklenmiş AD benzeri model grubu; TP, triptolid ile işlenmiş grup; LY, LY294002 triptolid ortak tedavi grubu. n = grup başına 6. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Aβ1-42 ile indüklenen AD benzeri farelerde triptolid zayıflatılmış hipokampal nöron hasarı ve Aβ birikimini azaltmıştır. (A) Her gruptan hipokampal kesitlerin temsil hematoksilin ve eozin boyama görüntüleri. Ölçeg çubuğu = 50μm. (B) Hipokampusta Aβ pozitif birikiminin temsil Aβ immünohistokimyasal boyama görüntüleri ve nicel analizi. Ölçek çubuğu = 50μm. Veriler ortalama SD ± olarak sunulmaktadır. İstatistiksel analiz tek yönlü bir ANOVA testi kullanılarak yapılmıştır. Kontrol grubu için Ktr; AD, Aβ1-42 indüklenmiş AD benzeri model grubu; TP, triptolid ile işlenmiş grup; LY, LY294002 triptolid ortak tedavi grubu. n = her grup için 3. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Triptolid, hipokampal Gephyrin ve Kollibistin ekspresyonunu geri getirdi ve Aβ1-42 ile indüklenen AD benzeri farelerde PI3K/Akt/GSK-3β ile ilişkili sinyalizasyonu modüle etti. (A) Her gruptan hipokampal lizatlarda toplam Gephyrin ve fosforile Gephyrin ekspresyonunun temsil Western blot görüntüleri ve nicel analizi. (B) Hipokampal lizatlarda Collybistin, PI3K, Akt, fosforile Akt, GSK-3β ve fosforile GSK-3β'nin temsil Western blot görüntüleri ve nicel analizi. Kollibistin ve PI3K β-aktine normalize edildi. Fosforile Akt ve fosforile GSK-3β, sırasıyla p-Akt/Akt ve p-GSK-3β/GSK-3β oranları olarak nicele edilmiştir. Veriler ortalama SD ± olarak sunulmaktadır. İstatistiksel analiz tek yönlü bir ANOVA testi kullanılarak yapılmıştır. Kontrol grubu için Ktr; AD, Aβ1-42 indüklenmiş AD benzeri model grubu; TP, triptolid ile işlenmiş grup; LY, LY294002 triptolid ortak tedavi grubu. n = her grup için 3. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Triptolid, Aβ1-42 ile indüklenen AD benzeri farelerin hipokampusunda otofaji ile ilişkili protein anormalliklerini zayıflattı. Her gruptan hipokampal lizatlarda LC3-I/II ve p62 ekspresyonunun temsilli Western blot görüntüleri ve nicel analizi. LC3-II/I oranı, LC3-II bant yoğunluğunun LC3-I bant yoğunluğuna bölünmesiyle hesaplandı ve p62 ekspresyonu β-aktine normalize edildi. Veriler ortalama SD ± olarak sunulmaktadır. İstatistiksel analiz tek yönlü bir ANOVA testi kullanılarak yapılmıştır. Kontrol grubu için Ktr; AD, Aβ1-42 indüklenmiş AD benzeri model grubu; TP, triptolid ile işlenmiş grup; LY, LY294002 triptolid ortak tedavi grubu. n = her grup için 3. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Kırpılmamış Western Blot görüntüleri. Nicel belirleme için kullanılan bantlar gösterilir ve moleküler ağırlık belirteçleri mevcut olduğunda gösterilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Bu makalede istatistiksel analizler için kullanılan ham sayısal değerler. Bu dosya, Şekil 1–4'te nicel grafiklerin oluşturulmasında kullanılan ham sayısal veri setlerini içerir; bunlar arasında Morris su labirenti davranış ölçümleri, Aβ immünohistokimya nicelikleri ve Western blot densitometri değerleri bulunur. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışmanın temel mekanik önerisi, Aβ1-42 kaynaklı patolojinin PI3K/Akt sinyalini baskıladığı, GSK-3β'nun inhibitör fosforilasyonunu azalttığı, Gephyrin fosforilasyonunu teşvik ettiğini, hipokampal Gephyrin ve Collybistin ekspresyonunu azalttığını ve otofaji ile ilgili proteinlerin birikimini katkıda bulunduğu, oysa triptolid'in PI3K/Akt/GSK-3β ile ilişkili bir yol aracılığıyla bu değişiklikleri kısmen dengelediğidir. Bu çalışma, Aβ1-42 kaynaklı AD benzeri patolojinin mekânsal öğrenme ve hafıza bozulması, hipokampal nöron hasarı, artan Aβ birikimi, azalmış Gephyrin ve kollibistin ekspresyonu, artmış Gephyrin fosforilasyonu, değişen PI3K/Akt/GSK-3β sinyalizasyonu ve otofajiyle ilgili protein birikimi ile birlikte gerçekleştiğini göstermektedir. Triptolid, bu davranışsal, histolojik ve moleküler anormallikleri kısmen tersine çevirirken, etkilerini LY294002 azaltmıştır. Bu bulgular, triptolid'in hipokampal inhibitör sinapsla ilişkili proteinleri, en azından kısmen, PI3K/Akt/GSK-3β aracılı Gephyrin fosforilasyonu ve otofaji ile ilgili proteinlerdeki değişiklikler düzenlemesi yoluyla koruduğu bir modeli desteklemektedir. Aβ1-42 intracerebroventriküler enjeksiyon modelinin, insan AD^21'in tam kronik, çok faktörlü ilerlemesini değil, öncelikle Aβ kaynaklı nörotoksisite ve AD benzeri patolojiyi yansıttığı belirtilmelidir.

Gefirin ve kollibistin, inhibitör sinaptik organizasyonun merkezi bileşenleridir. Gephyrin, inhibitör nörotransmitter reseptörlerini postsinaptik bölgelerde sabitlerken, Collybistin Gephyrin kümelenmesini ve membran lokalizasyonunu destekler. Bu proteinlerin azalmış ekspresyonu bu nedenle inhibitör sinaptik stabiliteyi bozabilir ve hipokampal ağ^{fonksiyonunun 8}. bozulmasına katkıda bulunabilir. Bu çalışmada Aβ1-42, hipokampal Gephyrin ve Collybistin ekspresyonunu azaltırken, triptolid her iki proteini de geri getirdi. Fosforile edilmiş Gephyrin artışı, Ser270'deki fosforilasyonun Gephyrin dağılışı, azalan kümelenme ve protein kararsızlığı ile ilişkilendirildiği için Gephyrin kaybı için makul bir mekanizma sağlar. GSK-3β'nin PI3K ekspresyonundaki paralel azalma, Akt fosforilasyonu ve inhibitör fosforilasyonu, Aβ1-42'nin PI3K/Akt sinyalizasyonunu zayıflattığını ve GSK-3β aktivitesini artırabileceğini göstermektedir; bu da gelişmiş Gephyrin fosforilasyonuyla tutarlıdır. Buna karşılık, triptolid Akt fosforilasyonunu geri kazandı, GSK-3β'nun inhibitör fosforilasyonunu artırdı ve Gephyrin fosforilasyonunu azalttı, ancak LY294002 bu etkileri zayıflattı. Bu sonuçlar, triptolid'in Gephyrin fosforilasyonunun PI3K/Akt/GSK-3β ile ilişkili düzenlenmesi yoluyla Gephyrin ve Collybistin ekspresyonunu koruyabileceğini göstermektedir. Ancak, tüm hipokampal lizatlar kullanıldığı için, bu bulgular doğrudan sinaptik lokalizasyonun kanıtı değil, hipokampal protein bolluğu ve fosforilasyondaki^{değişiklikleri yansıtmaktadır 22,23}.

Otofaji ile ilgili anormallikler de bu modelde gözlemlenen moleküler değişikliklere katkıda bulunabilir. Otofaji nöronal proteostazis için önemlidir, ancak AD'de bozukluğun bozukluğu otofagozmların ve patolojik protein substratlarının birikmesine yol^{açabilir 24,25}. Mevcut çalışmada, Aβ1-42 hem LC3-II/I oranını hem de p62 ifadesini artırdı; bu da otofagozomla ilişkili LC3-II ve otofagi ile ilgili substratların birikimini önermektedir. Triptolid her iki belirteçiyi de azalttı, LY294002 ise bu etkiyi kısmen tersine çevirdi; bu da triptolid'in otofaji ile ilgili protein birikimini PI3K/Akt bağımlı bir mekanizma yoluyla hafifletebileceğini düşündürdü. Gephyrin, Collybistin ve PI3K/Akt/GSK-3β sinyalizasyonlarındaki değişikliklerle birlikte, bu bulgular triptolid'in nöroprotektif etkilerinin anti-inflamatuar veya genel nöroprotektif etkilerinin ötesine geçmesini sağlar ve triptolid'in Aβ ile ilişkili AD benzeri patolojide inhibitör sinapsla ilişkili iskelet proteinlerini, kinaz sinyalini ve proteostazla ilgili yolları da etkileyebileceğini^{öne sürmektedir 26}.

Bu protokolün başarısını ve tekrarlanabilirliğini belirleyen birkaç kritik adım. İlk olarak, Aβ1-42'nin toplama durumu enjeksiyondan önce dikkatlice kontrol edilmeli ve doğrulanmalıdır, çünkü peptit hazırlama patolojik sonuçları güçlü şekilde etkileyebilir. İkinci olarak, lateral ventriküllere doğru stereotaksik enjeksiyon gereklidir; reflü, yanlış iğne yerleştirmesi veya aşırı enjeksiyon hızı, değişken Aβ maruziyetine ve tutarsız davranışsal veya histolojik sonuçlara yol açabilir. Üçüncü olarak, Morris su labirenti testi, motor bozulmayı karıştırıcı faktör olarak dışlamak için sabit görsel ipuçları, tutarlı su sıcaklığı ve yüzme hızının izlenmesini gerektirir. Dördüncü olarak, histolojik ve immünohistokimyasal nicel belirleme, önceden belirlenmiş ilgi çekici hipokampus bölgeleri ve kör analiz kullanılarak yapılmalıdır. Son olarak, Western blot sonuçları eşit protein yüklemesi, uygun jel konsantrasyonu, verimli transfer ve bant özgüllüğünü doğrulamak için kırpılmamış leke görüntülerinin kullanılmasına bağlıdır.

Birkaç sınırlama göz önünde bulundurulmalıdır. Birincisi, Aβ1-42 enjeksiyon modeli, insan AD'nin kronik ilerlemesini, tau patolojisini, damar değişikliklerini veya nöroimmün karmaşıklığını yeniden üretmez. İkincisi, erkek ve dişi fareler gruplar arasında eşit şekilde dağıtılmış olsa da, çalışma cinsiyete göre sınıflandırılmış analiz için^{desteklenmedi 27}. Üçüncü olarak, tüm hipokampal lizatlar, Gephyrin ve Collybistin değişikliklerinin özellikle inhibitör sinapslarda olup olmadığını belirleyemez. Dördüncü olarak, önerilen PI3K/Akt/GSK-3β–Gephyrin mekanizması ilişkilendirilmiş kalır, çünkü GSK-3β aktivitesi ve Gephyrin Ser270 fosforilasyonu doğrudan manipüle edilmemiştir. Son olarak, LC3-II/I ve p62 statik Western blot okumalarıdır ve dinamik otofajik akı tam olarak tanımlayamazlar. Gelecekteki çalışmalarda sinaptozomal fraksiyonasyon, inhibitör postsinaptik belirteçlerle immünofluoresans ko-lokalizasyon, GSK-3β kazanç veya fonksiyon kaybı yaklaşımları, Gephyrin Ser270 mutant yapıları ve lizozomal inhibitör tabanlı akı testleri kullanılmalıdır. Kronik transjenik AD modellerinde, tau ile ilgili modellerde ve insan kaynaklı nöronal sistemlerde doğrulama, bu yolun AD patolojisi¹⁴ ile geniş çapta ilgili olup olmadığını belirlemek için gereklidir. Bir diğer sınırlama ise, stereotaksik enjeksiyon için kullanılan tam Aβ1-42 preparatının toplama durumunun Thioflavin T floresansı, SDS-PAGE/Western blotlama veya geçirim elektron mikroskopisi ile bağımsız olarak doğrulanmamasıdır. Peptit, Aβ1-42 agregasyonunu teşvik etmek için yaygın olarak kullanılan uzun süreli 37 °C kuluçka prosedürü kullanılarak hazırlanmış olsa da, agregasyon durumundaki partiden partiye varyasyon patolojik sonuçları etkileyebilir. Gelecekteki çalışmalar, bu iş akışını kronik transgenik AD modellerinde, tau ile ilgili modellerde ve insan kaynaklı nöronal sistemlerde doğrulamalıdır. Ek deneyler arasında Aβ1-42 agregasyon durumunun doğrudan doğrulanması, boya veya anatomik doğrulama kullanılarak stereotaksik enjeksiyon doğruluk değerlendirmesi, sinaptozomal fraksiyonlaşma, inhibitör postsinaptik belirteçlerle immünofluoresan ko-lokalizasyon, GSK-3β fonksiyon kazanımı veya kaybı yaklaşımları, Gephyrin Ser270 mutant deneyleri ve lizozomal inhibitör tabanlı otofajik akı testleri yer almalıdır. Translasyonel uygulamalar düşünülmeden önce triptolidin doz-yanıt ve güvenlik çalışmaları da gereklidir

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anti-Gephyrin antikoru	12681	Peoteintech	Toplam Gephyrin'in Western blot tespiti için primer antikor.
Anti-fosforile-Gephyrin  antikoru	147011	Synaptic Systems	Fosforile Gephyrin'in Western blot tespiti için primer antikor.
Anti-Collybistin antikoru	ab316963	abcam	Collybistin'in Western blot tespiti için primer antikor.
Anti-PI3K antikoru	27921	Peoteintech	PI3K'nin Western blot tespiti için primer antikor.
Anti-Akt antikoru	9272	Cell Signaling Technology	Toplam Akt'in Western blot tespiti için primer antikor.
Anti-fosforile Akt antikoru	4060	Cell Signaling Technology	Fosforile Akt'in Western blot tespiti için primer antikor.
Anti-GSK-3β antikoru	12456	Cell Signaling Technology	Toplam GSK-3β'nin Western blot tespiti için primer antikor.
Anti-fosforile GSK-3β antikoru	5558	Cell Signaling Technology	Fosforile GSK-3β'nin Western blot tespiti için primer antikor.
Anti-β aktin antikoru	66009	Peoteintech	Western blot normalizasyonu için yükleme kontrol antikoru.
Anti-LC3 antikoru	11972	Cell Signaling Technology	LC3-I ve LC3-II'nin Western blot tespiti için primer antikor.
Anti-p62 antikoru	5114	Cell Signaling Technology	p62/SQSTM1'in Western blot tespiti için primer antikor.
Anti-Aβ1-42 antikoru	ab150155	abcam	Aβ1-42'nin tespiti için primer antikor.
HRP-konjuge sekonder antikor (anti-fare IgG)	7076S	Cell Signaling Technology	Western blotting'de fare primer antikorları için sekonder antikor.
HRP-konjuge sekonder antikor (anti-tavşan IgG)	7074S	Cell Signaling Technology	Western blotting'de tavşan primer antikorları için sekonder antikor.
Anti-Aβ antikoru	GT622,	Invitrogen,	Aβ immünohistokimya için primer antikor.
Aβ1-42	9001	Shanghai Duma Technology Co., Ltd.	Toplama indükleyici enjeksiyon çözeltisi hazırlanmasında kullanılan amiloid-β peptidi.
triptolide	BD9097	Shanghai Bide Pharmaceutical.	İntraperitoneal olarak uygulanan test bileşiği.
LY294002	ab120243	abcam	Eş zamanlı tedavi grubu için kullanılan PI3K inhibitörü.
paraformaldehit	P0099	Beyotime	Transkardiyak perfüzyonda ve doku sonrası fiksasyonunda sabitleyici.
ksilen	108298	Merck	Deparaffinasyon ve doku temizleme reaktifi.
etanol	100983	Merck	Parafin kesitlerinde rehidrasyon ve dehidrasyon reaktifi.
propilen glikol	294004	Merck	İlaç çözeltisi hazırlanmasında ara madde bileşeni.
proteaz ve fosfataz inhibitörleri	P1045	Beyotime	Proteinleri ve fosforilasyon durumlarını korumak için kullanılan lizis tamponu katkı maddesi.
RIPA lizis tamponu	P0013	Beyotime	Hipokampal dokudan toplam protein ekstraksiyonu için lizis tamponu.
EDTA antijen geri kazandırma tamponu	ab93680	abcam	Immünohistokimya için ısı-aracılı antijen geri kazandırma tamponu.
pentobarbital sodyum	P3761	Sigma	Cerrahi ve doku toplama için kullanılan anestetik.
Keçi serumu	ZLI-9056	ZSGB-BIO	Immünohistokimya için blokaj reaktifi.
PVDF membranlar	ISEQ00010	Merck Millipore	Western blot transferi için kullanılan membran.
Morris su labirenti	VX80	Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.	Uzamsal öğrenme ve bellek değerlendirmesi için davranışsal cihaz ve video izleme sistemi.
kimilüminesans görüntüleme sistemi	Doc™ XR+ 1708195	Bio-rad	Kimilüminesan Western blot sinyal alımı için görüntüleme sistemi.
stereotaktik aparat	/	Stoelting Technology Co., Ltd	Stereotaktik intracerebraloventriküler enjeksiyon için kullanılan aparat.
BCA protein ölçüm kiti	P0006	Beyotime	Toplam protein konsantrasyon ölçümü için kolorimetrik ölçüm kiti.
mikroplate okuyucu	Synergy2	Biotek	BCA ölçümü için absorbans okuyucu.
ImageJ	versiyon 9.0.1	National Institutes of Health	Histoloji, immünohistokimya ve Western blot denzitometrisi için görüntü analiz yazılımı.
GraphPad Prism	versiyon 8.5	GraphPad Software	İstatistiksel analiz ve grafik oluşturma yazılımı.