Bu protokol, sosyal durum manipülasyonu (sosyal izolasyon ve sosyal birleşme) sırasında serbest davranan farelerde minyatürize mikroskop (miniskop) kullanılarak hipotalamik nöronların in vivo kalsiyum görüntülemesini detaylandırır. Bu yöntem, sosyal ihtiyaç ve sosyal doygunluğu temsil eden hipotalamik aktivitenin tek nöron çözünürlükte görüntülenmesini sağlar ve sosyal homeostazın mekanik çalışmalarını mümkün kılar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
In Vivo'da Farelerde Sosyal Davranışları Anlamak İçin Hipotalamus'ta Minyatürize Mikroskopla Kalsiyum Görüntüleme
Bu makalede
Özet
Özet
Omurgalılarda sosyal davranış, hipotalamik devreler aracılığıyla sıkı bir şekilde düzenlenir. Moleküler olarak tanımlanmış hipotalamik nöron tiplerinin sosyal ihtiyacı homeostatik şekilde kodladığı yakın zamanda tespit edilmiştir. Burada, serbest davranan farelerde hipotalamik medial preoptik çekirdeği (MPN) başında monte edilen minyatürize mikroskop (miniskop) kullanılarak in vivo kalsiyum görüntüleme için adım adım bir protokolü açıklıyoruz. Bu yöntem, sosyal izolasyon ve birleşme sırasında nöronal popülasyon dinamiklerinin uzunlamasına kaydedilmesine olanak tanır ve böylece tek nöron çözümlemesinde sosyal ihtiyaç ve sosyal doyumluğun mekanik çalışmalarını mümkün kılar. Özellikle, yetişkin farelere genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi ile adeno-ilişkili bir virüs (AAV) stereotaksik enjeksiyonu uygulanır ve ardından gradyan indeksli (GRIN) lens ve miniskop taban plakası implante edilir. İyileşmeden sonra, fareler miniskop görüntüleme sistemine alıştırılır ve planlı sosyal izolasyon ve yeniden birleşme sürecine tabi tutulur; bu süreçte nöronal aktiviteler görüntülenir. Kalsiyum sinyalleri, daha ileri analiz için hayvan davranışlarıyla senkronize edilir. Bu protokol, sosyal davranışlar sırasında fare hipotalamusunda miniskop ile in vivo kalsiyum görüntüleme için kapsamlı rehberlik sağlar. Diğer derin beyin bölgelerinde ve farklı davranışsal bağlamlarda görüntüleme için kolayca uyarlanabilir. Bu yaklaşım, hücresel düzeyde sinirsel aktivite ile sosyal davranışı birleştirerek, serbest hareket eden hayvanlarda karmaşık davranışların sinirsel temelini anlamamızı ilerletir.
Giriş
Sosyal bağları sürdürebilme yeteneği, hayvanların hayatta kalması için temelbir unsurdur 1,2,3. Uzun süreli sosyal izolasyon anksiyete, bilişsel eksiklikler ve metabolik değişikliklere yol açarken, yeniden buluşma sosyal katılımı ve sosyal ihtiyaçları geri kazandırır 4,5,6. Kısa süreli sosyal izolasyondan sonra gözlemlenen sosyal davranış geri sıçraması, açlık 8,9 veyasusuzluğun 10,11,12 düzenlenmesine benzer bir homeostatikmekanizmanın varlığını gösterir. Ancak, sosyal homeostazı aracı eden sinir alt tabakaları hâlâ yeterince anlaşılmamaktadır.
Son çalışmalar, belirgin hipotalamik nöronal popülasyonların sırasıyla sosyal ihtiyaç ve sosyal doygunluğukodladığını ortaya koymuştur 7. In vivo kalsiyum görüntüleme, medial preoptik çekirdekte (MPN) genetik olarak tanımlanmış bir glutamaterjik nöron popülasyonunun izolasyon sırasında aktif hale geldiğini (MPNİzolüasyon nöronları) göstermiştir; başka bir GABAerjik nöronluk popülasyonu ise birleştiğinde aktif hale gelir (MPNBirleşme nöronları). MPNİzolasyon nöronların optogenetik aktivasyonu sosyal izolasyon durumunu taklit eder ve MPNBirleşme nöronların optogenetik aktivasyonu sosyal geri dönüşü zayıflatır ve bu da sosyal ihtiyacı düzenlemedeki zıt rollerini gösterir. Bu popülasyonlar karşılıklı olarak etkileşime girer ve beyin çapında sinir devreleriyle bağlantı kurarak sosyal ihtiyacı dinamik olarak modüle eden bir geri besleme döngüsü oluşturur.
Burada, etolojik olarak ilgili sosyal davranışlar (örneğin sosyal izolasyon ve yenidenbirleşme 13) sırasında serbestçe hareket eden farelerde derin beyin kalsiyum dinamiklerini tek nöron çözünürlükte kaydetmelerini sağlayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu görüntüleme tekniğinin etolojik olarak ilgili sosyal paradigmalarla birleşimi, farklı sosyal durumların sinirsel temsilini incelemek için eşi benzeri görülmemiş bir fırsat sunar. Bu uyarlanmış yöntemin geliştirilmesinin gerekçesi, sosyal ihtiyaç ve doygunluğun MPN gibi derin beyin yapılarında nasıl dinamik olarak temsil edildiğini görselleştirme ihtiyacından kaynaklanır. Miniskopun kullanımı daha önce 14,15,16 tanımlanmış olsa da, özellikle izolasyon ile yeniden birleşme arasındaki geçişleri içeren kısıtsız sosyal etkileşimlerde kullanımı, optik istikrarı korumak, hareket artefaktlarını en aza indirmek ve doğal davranışsal ifadeyi sağlamak için özel teknik ve davranışsal uyarlamalar gerektirir.
Lif fotometrisine kıyaslandığında, miniskop tabanlı yaklaşım hücresel çözünürlük sunar ve aynı bölgedeki farklı fonksiyonel nöron tiplerinin ayırt edilmesine olanak tanır. Serbest etkileşimde bulunan hayvanların uzun vadeli kayıtlarını mümkün kılar ki, bu da sosyal yönelimli sinir dinamiklerini incelemek için gereklidir. Bir foton mikroendoskopi yapılan önceki çalışmalar, büyük ölçüde mekânsal veya duyusal görevler sırasında korteks veya dorsal hipokampus üzerineodaklanmıştır 14,15,16. Protokolümüz, karmaşık sosyal davranışlar sırasında bu ilerlemeleri daha derin subkortikal bölgelere genişleterek, doğal koşullar altında duygusal durum devrelerini incelemek için bir şablon sağlar.
Protokol, GRIN lens implantasyonu ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri kullanılarak ~5 mm derinliğe kadar beyin bölgeleri için optimize edilmiştir. Önemli hususlar cerrahi hassasiyet, lens yerleştirme, davranışsal paradigma tasarımı ve ilgili veri analizidir. Bu yöntem, diğer derin beyin alanlarına ve davranışsal bağlamlara uyarlanabilir. Bu protokol, kullanıcıları tüm kritik aşamalarda yönlendirir: cerrahi hazırlık, viral teslimat, lens implantasyonu, davranışsal tasarım, miniskop takma, görüntüleme ve veri analizi (Şekil 1A-E). Bu erişilebilir ve detaylı iş akışının, derin beyin sinir popülasyonlarının çok çeşitli doğal davranışlar yelpazesinde incelenmesini güçlendireceğini öngörüyoruz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm prosedürler Westlake Üniversitesi hayvan etik komitesi tarafından hayvan protokolü #25-076-LD-9 ile onaylanmıştır. Tüm deneyler, Westlake Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Kaynakları yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Bu protokolte kullanılan tüm ekipman ve malzemeler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.
1. Virüs enjeksiyon ameliyatı
- Fareyi %2-3 izofluran içeren anestezi indüksiyon odasına yerleştirin.
NOT: Anesteziyi başarılı bir şekilde başlatmak, parmak sıkıştırma refleksinin olmaması ve düzenli, derin nefes alma ile doğrulanır. - 2-3 dakika sonra ya da düzeltme refleksi kaybedildikten sonra, hayvanı hızla stereotaksik alete aktarın. Burnu anestezi burun konisine sabitleyin ve ameliyat süresince %1-1,5 isofluran ile anestezi sürdürün (Şekil 1B). Oksijen akışı genellikle 0.8-1.2 L/d arasında ayarlanır.
NOT: Hayvanın solunum hızını ve diğer fizyolojik belirtileri takip edin. Hayvanın solunum hızı artarsa ve bıyık çıkarma ile diğer uyanış belirtileri gösterirse, izofluran konsantrasyonunu %2-3'e çıkarın. - Farenin kesici dişlerini stereotaksik enstrümanın kesici çubuğundan sabitleyin. Burun kelepçesini sıkın, başı sabitleyin.
- İki kulak çubuğunu dikkatlice dış işitme kanallarına yerleştirin, böylece sağlam ve sert bir baş sabitlenmesi sağlanır (Şekil 1B).
NOT: (1) Boyun dokularını sıkıştıran yanlış yerleştirme, solunum sıkıntısına veya dengesiz fiksasyona yol açabilir. (2) Hayvan fiksasyon sırasında zorlanma veya mücadele belirtileri gösterirse, kulak çubuklarını hemen bırakın ve yeniden konumlandırın; çünkü bu olası hava yolu sıkışmasını gösterir. (3) Her iki kulak çubuğunun aynı yükseklikte olduğundan emin olun. Bu, kafatasının sonraki hassas düzleştirilmesi için gereklidir. - Farenin her iki gözüne göz merhemi uygulayarak gözlerin kurumasını önleyin.
- Saç temizlik kremi ile baş tüylerini çıkarın. Bölgeyi %75 etanol mendiliyle iyice silerek kalan krem ve saçları temizleyin.
- Açıkta kalan cildi %75 etanol mendil ve betadin ile dezenfekte edin. İnce cerrahi makasla saç derisinden orta hat sagittal kesi yapıldı. Deriyi geri çekerek kafatasını hedef beyin bölgesinin üzerinde tamamen açığa çıkarın. Periosteumu çıkarmak için kafatası yüzeyini pamuk çubuğuyla nazikçe temizleyin.
NOT: Diş çimentosu için sağlam bir çapa sağlamak için kafatasının yeterince geniş bir alanını açığa çıkarmak, implantın uzun vadeli stabilitesini sağlamak için gereklidir. - Kafatası yüzeyi ölçümü için stereotaksik tutucuya cam pipet takın. Stereomikroskop altında, pipet ucunu bregmaya (sagital ve koronal dikişlerin kesişimi) konumlandırın ve orijin olarak ayarlayın (X = 0, Y = 0, Z = 0, Şekil 1C).
- Pipet ucunu bregma'ya ±2 mm yan pozisyona getirin ve kafatası seviyesini bu iki nokta arasındaki yükseklik farkı ±0,03 mm içinde olana kadar ayarlayın.
- Sonra pipeti lambda'ya (sagital ve lambdoid dikişlerinin kesişim noktasına) taşıyın ve anteroposterior eğimi bregma ile lambda arasındaki yükseklik farkı ±0,03 mm içinde olacak şekilde ayarlayın (Şekil 1C).
NOT: (1) Önceden yapılan görsel değerlendirme ve kafatasının ayarlanması, ince seviyeleme sürecini önemli ölçüde kolaylaştırabilir. (2) Kafatası yüzeyinin düzleştirmeden önce sıkıştırılmış havayla kurutulması, kafatası dikişlerinin görünürlüğünü artırır. - Hedef beyin bölgesi üzerinde kraniotomi yapmak için 0,8 mm matkap başlığına sahip elde taşınan bir matkap kullanın (örneğin C57BL6/J fareleri için). Koordinatlar MPN bölgesini hedeflemek için ön-arka (AP) 0 mm, medial-lateral (ML) 0,3 mm ve dorsal-ventral (DV) -4,8 mm'dir; FVB/NJ farelerinde kraniotomi AP +0.4 mm-+0.5 mm, ML 0.3 mm ve DV -4.8 mm aralığında yapılır (Şekil 1C).
NOT: Kanama durumunda, izofluran konsantrasyonunu geçici olarak %2-2,5'e çıkarın. Kanı emek için steril pamuk ucu veya hemostatik bir sünger kullanın, ardından hemen steril salin uygulayın. Hemostazdan sonra izofluranı bakım seviyesine (%1-1,5) geri getirin ve fazla sıvıyı çıkarın. - Kraniotomiden sonra, hedef beyin bölgesinde kalsiyum göstergesini ifade eden virüsün stereotaksik enjeksiyonu yapılacaktır.
- Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesini nöronlara ifade etmek ve kalsiyum sinyalleriyle nöron aktivitesinin görüntülenmesine izin veren adeno-ilişkili bir virüs olan AAV-hSyn-jGCaMP7f'yi, enjeksiyondan önce mililitrede yaklaşık 5 × 10¹² viral genom nihai titreme kadar seyreltir.
- Cam pipet'i önce mineral yağla, ardından viral çözeltiyle doldurun, böylece hava kabarcıkları yok olur. Pipeti kafatasının yüzeyindeki hedef koordinatlarına konumlandırın ve yavaşça hedef derinliğine indirin.
- Virüsü yavaş ve sabit bir hızda (örneğin, 30 nL/dakika) tek taraflı olarak, toplam hacim 400nL 7 ile enjekte edin; böylece MPN bölgesinde yeterli nöron enfekte edilir. Bu miktar, beyin bölgelerinin belirli boyutlarına ve Cre-loxP sistemi gibi ek kısıtlamaların olup olmadığına göre ayarlanabilir.
- İşlem tamamlandığında, pipeti 10-15 dakika boyunca yerinde bırakın, böylece yeterli viral difüzyon sağlanır ve enjeksiyon izi boyunca reflü en aza indirilir, ardından yavaşça çekilir.
NOT: (1) Uygun ve tutarlı titrelere sahip viral aliquotlar, hayvanlar arasında başarılı ve tutarlı ifade için kritiktir. Aşırı yüksek titre nörotoksisiteye yol açabilirken, yetersiz titre görüntülemede zayıf ekspresyona ve kötü sinyal-gürültü oranına yol açar. (2) Yavaş enjeksiyon hızı ve pipeti çekmeden önce yeterli bekleme süresi, doku hasarını en aza indirmek ve viral reflü önlemek, hedef bölgede hassas ve sağlam viral ifadeyi sağlamak için kritik öneme sahiptir. - Virüs enjeksiyonundan sonra, kafatasının üzerindeki deriyi emilebilir dikişlerle dikin.
- Analjezi ameliyatından hemen sonra deri altına karprofen (5 mg/kg) enjekte edin, sonraki 3 gün boyunca takip etmeye devam eder ve gerekirse ekstra uygulama uygulanır.
- Virüs enjeksiyonu ameliyatından sonra fareyi en az 2-3 hafta boyunca tek tek muhafaza ederek yeterli hayvan iyileşmesi ve viral ifadeye izin verilmesi sağlanır.
NOT: GRIN lens implantasyonu (Bölüm 2) viral enjeksiyonla aynı günde veya viral enjeksiyondan 2-3 hafta sonra yapılabilir. Bu protokolde, deney yapıcının GRIN lens implantasyonu sırasında viral ekspresyonu değerlendirmesini sağlayan iki aşamalı yöntemi tanımlıyoruz.
2. GRIN lens implantasyonu
- Kraniotomiyi yeniden açmak için 1.1-1.10 adımlarını tekrarlayın. Diş çimentosunu daha iyi kavramak için kafatası yüzeyini bir bistürle kazıyarak 2.8. adımda kullanın. Yeni kraniotomi için, yumuşak implantasyon için çapın GRIN lensinden biraz daha büyük (genellikle ~1 mm) olması gerekir. Delme yaptıktan sonra tüm kemik kalıntılarını titizlikle temizleyin.
- GRIN lens implantasyonu sırasında doku sıkışmasını azaltmak için, hedef beyin bölgesine cam pipet yerleştirin ve pipeti yavaşça medialateral olarak hareket ettirerek bir kesi oluşturun. Bu mikro-kesim ~1 mm uzunluğundadır ve GRIN lensinin implantasyonu için alan açılır (Şekil 2A).
NOT: Bu adım, tüm protokolün başarısı için kritik öneme sahiptir. - GRIN lensi takmadan önce, lensi %75 etanol ile dezenfekte edin, ardından steril salinle yıkayın ve lens mendiliyle nazikçe temizleyin.
- GRIN lensini bir lens tutucuyla tutun ve miniscope'u lensin üstüne takın.
- Tüm montajı bregma konumuna getirin ve tüm koordinatları sıfıra ayarlayın (yani, X = 0, Y = 0, Z = 0). Sonra, kraniotominin üzerindeki hedef X-Y koordinatlarına konumlandırın.
- Katası yüzeyini steril tuzlu suyla nemlendirin. GRIN lensini yaklaşık 100 μm/dakika hızla beyin dokusuna çok yavaş indirerek hedefe ulaşın (Şekil 2B).
NOT: (1) GRIN lens implantasyonu viral enjeksiyondan 2-3 hafta sonra, lens takma sırasında yapılıyorsa, miniskopu açıp gerçek zamanlı floresan değişikliklerini gözlemleyin. Lens hedef bölgeye yaklaştıkça, görüş alanındaki genel floresan sinyal daha parlak hale gelir ve bu değişim, görüntüleme yazılımı kullanılarak gerçek zamanlı olarak sinyal histogramından doğrudan okunabilir (Şekil 2C, D). (2) İmplantasyon sırasında kanamadan kaçının, çünkü kan pıhtıları sinyal kalitesini önemli ölçüde düşürür. (3) Kanama kaçınılmaz ve şiddetliyse, GRIN lensini çekin, lensi temizleyin ve kanama durduktan sonra tekrar takın. - Lens implantasyonundan sonra, kalan sıvıyı emerek ve sıkıştırılmış hava ile üfleyerek kafatası yüzeyini iyice kurutun.
- GRIN lens tabanını kafatasına sabitlemek için dikkatlice diş çimentosu uygulayın ve açıkta kalan kafatasını kapatacak tam bir başlık yapın (Şekil 2B). Çimentonun çevredeki kas dokularına temas etmemesine dikkat edin. Sonra lens tutucusunu dikkatlice gevşetir ve tutucuyu miniskopla birlikte çıkar.
NOT: (1) Diş çimentosunu, soğutulmuş bir levhada buz üzerinde karıştırarak katılaşma sürecini yavaşlatır ve daha fazla çalışma süresi sağlar. (2) Miniskop bağlantısı sırasında fareyi tutmak için lensin arkasına bir başlık çubuğu eklenmesi önerilir. (3) Lens tutucuya veya miniskopa çimentonu uygulamamaya çok dikkat edin. - İki parçalı silikon yapıştırıcıyı iki sıvıyı karıştırarak hazırlayın. İyileşme sürecinde toz ve çiziklere karşı koruyucu bir mühür oluşturmak için GRIN lensinin üstüne uygulayın.
- GRIN lens implantasyonundan sonra, iyileşme sırasında kafes eşlerinin lense zarar vermesini önlemek için fareyi tek tek barındırın.
3. Taban plaka kurulumu
- GRIN lens implantasyonundan iki ila üç hafta sonra taban plakası kurulumu yapılır. Yukarıda açıklandığı gibi fareyi stereotaksik cihazda anestezi yapın ve sabitleyin.
- GRIN lensinin üstündeki silikon contasını çıkarın ve lens yüzeyini bir parça lens dokusuyla nazikçe temizleyin.
- Taban plakasını miniskopa takın. Tüm mikroskop-taban panelini stereotaksik manipülatör koluna bir tutucu aracılığıyla monte edin.
- Miniskopu veri toplama kutusuna bağlayın ve canlı görüntülemeyi açın.
- Miniskop objesi ile implante edilen GRIN lensini, manipülatörü ince bir şekilde ayarlayarak miniskop ile GRIN lens arasında hassas optik koeksenel hizalama elde ederek hizalayın.
- Miniscope objektîfini GRIN lensinin üst yüzeyine paralel konumlandırın ve tüm GRIN lensinin sınırının görüntü penceresine mükemmel dairesel bir görünümle dahil edilmesinden ve lensin merkezinin görüntü penceresinin ortasında olduğundan emin olun.
- Miniskopu hedef odak düzlemindeki nöronların net görüntülerini elde etmek için optimal çalışma mesafesine indirin.
- Temel plakayı mevcut çimento kapağına bağlamak ve bağlamak için diş çimentosu kullanın (Şekil 2B).
NOT: (1) Kritik bir adım, nihai fiksasyondan önce miniskopu küçük, ampirik olarak belirlenmiş bir mesafe (yaklaşık 50-100 μm) kaldırmaktır; böylece katılış sırasında çimento büzemesinin neden olduğu olası odak düzlemi kaymasını telafi etmek için bu mesafe yaklaşık 50-100 μm. (2) Taban plakası takıldığından sonra ayrılacak miniskop parçalarına diş çimentosunun temas etmesini önlemek için son derece dikkatli olun. - Diş çimento tamamen katılaştıktan sonra, tutucuyu gevşedin, mikroskobu taban plakasından dikkatlice çıkarın ve optik arayüzü korumak için hemen taban plakasına bir kapak vidalın.
- Taban plakası kurulumundan sonra fareyi 3-5 gün boyunca tek tek tutun ve ardından sosyal durum manipülasyonu (örneğin sosyal izolasyon) olmadan önce en az 1 hafta kafes arkadaşlarıyla birleştirin.
4. Alışkanlık ve görüntüleme parametre ayarları
- Implante edilen fareleri miniskop için geçici baş desteğine ve resmi görüntüleme seanslarından önce görüntüleme kurulumuna 2-3 kez alıştırın.
- Miniskopu taban plakasına monte etmek için, implante edilen farelerin başını sabitleyin, taban plakası kapağını çıkarın ve miniskopu mıknatıs arayüzü aracılığıyla taban plakasına kenetleyin. Sonra, miniskopu sabitlemek için yan vidayı sıkın. 10 dakika boyunca kalsiyum görüntüleme yapın; bu süre boyunca hayvan kayıt alanında veya kafeste serbestçe hareket ediyor.
- Bu pilot görüntüleme oturumu sırasında nazik bir dokunuş ve yeni bir fare gibi uyaranlar ekleyin. Verileri analiz edin (ayrıntılar Bölüm 6'daki bilgilere bakınız) ve tek nöron sinyallerinin çıkarılıp çıkarılamayacağını kontrol edin. Alışkanlık sırasında, mini skobun odak düzlemini çalışma mesafesi boyunca ayarlayarak gözlemlenen nöron sayısını ve görüntü keskinliğini en üst düzeye çıkararak optimal görüntüleme ayarlarını belirleyin.
- Aydınlatma gücünü maksimum değerin ~%10'una ve sensör kazancını maksimum değerin ~%10-20'sine ayarlayarak net sinyaller elde edin ve doygunluk olmadan. 1280 x 800 mekansal çözünürlükte ve 20 Hz örnekleme hızında görüntü. Bu ayarları her hayvan için kaydedin ve aşağıdaki görüntüleme seanslarında tekrar kullanın.
5. Miniskop kalsiyum görüntüleme için sosyal davranışsal testler
- Sosyal buluşma testi (Şekil 3A)
- Miniskop implantlı fareyi görüntülemeden önce 1, 3 veya 5 gün boyunca izole edin. Başlangıç, birleşme ve yeniden izolasyon sırasında kalsiyum görüntüleme yapın.
- Temel: Fareyi miniskopa bağlayın ve fare izole tutulduğu 10 dakika boyunca kaydedin.
- Yeniden buluşma: Kayıt odasına eski bir kafes arkadaşını ekleyin ve 10 dakikalık bir kayıt yapın.
- Yeniden izolasyon: 10 dakikalık buluşmadan sonra kafes arkadaşını çıkarın ve izolasyon sırasında 10 dakika daha görüntü koyun.
- Sosyal izolasyon testi (Şekil 3B)
- Miniskop implantı fareyi 6 saat boyunca izole edin ve her saatin başında 15 dakika boyunca kalsiyum sinyallerini kaydedin.
- Kayıt odasına eski bir kafes arkadaşını ekleyin ve tüm görüntüleme oturumunun sonunda 10 dakika boyunca kayıt yapın; böylece sosyal birleşme ile önemli ölçüde modüle edilen nöronlar tespit edilir (Detaylara Bölüm 6 ve 7'de bakınız).
NOT: (1) Bu özel görüntüleme programı, sinyal fotobeyazlamasını en az azaltmak ve sosyal izolasyonun ilk 6 saatinde nöronal aktivitenin izlenmesini sağlamak için kullanılır. (2) Miniskop tüm işlem boyunca bağlıdır. (3) Bu yaklaşım, aynı nöronal topluluğun tüm görüntüleme oturumu boyunca takip edilmesini sağlar. (4) Görüntüleme sırasında gıda ve hidrojel sağlanır.
6. Veri ön işleme
- Ham görüntüleme videolarını veri işleme yazılımına aktarın.
- Gerekirse, veri analizi için hesaplama yükünü azaltmak amacıyla orijinal videoyu mekânsal ve zamansal olarak aşağı örnekleyin.
NOT: Bu analiz için, ham görüntüleme verileri 20 Hz'de 1280 x 800 uzamsal çözünürlükte yakalanmıştır; Videoyu mekânsal olarak 4 kat aşağı, zamansal olarak ise 2 kat aşağı örnekleme. - Yüksek frekanslı gürültüyü ve düşük frekanslı arka plan kaymasını azaltmak için küresel ortalama çıkarma ile bir uzamsal bant geçişli filtre uygulayın.
- Veri işleme yazılımındaki hareket düzeltme algoritması kullanılarak hareket artefaktlarını düzeltin. Hareket düzeltmeli filmi görsel olarak inceleyerek stabil nöronal somata ve minimum kalıntı hareket artefaktlarını kontrol edin.
- "Hücreleri Tanımlama" butonuna tıklayın ve CNMF-E17 (MikroEndoskopik Veriler için Kısıtlı Negatif Olmayan Matris Faktörizasyonu) algoritmasıyla bireysel nöronların kalsiyum aktivite izlerini çıkarmak için listeden "CNMFe" seçeneğini seçin.
- Veri işleme yazılımında cetvel düğmesine tıklayın ve temsilci nöronlardan soma çaplarını (piksel cinsinden) ölçün. Ortalama boyutu "Ortalama hücre çapı (pikseller)" kutusuna girin. Sonra CNMF-E'yi çalıştırmak için Apply butonuna tıklayın.
- Hücre algısı yetersiz olduğunda, aşırı hücre dışı bileşenler ortaya çıktığında veya aşırı segmentasyon oluştuğunda CNMF-E başlatma ayarlarını ayarlayın.
- Tüm çıkarılmış bileşenleri inceleyin ve hücre morfolojisi ile biyolojik olarak makul kalsiyum dinamiğine dayanarak kabul eder/reddedersiniz. Düzensiz ve sivri şekilli bileşenleri hariç tutun. Gürültü veya hareket artefaktı baskın izleri dışlayın.
NOT: (1) Şekil 2E ve 2F , nöronların net morfolojisine sahip iki kabul edilmiş nöronu ve tipik kalsiyum geçişlerini göstermektedir. (2) Şekil 2G ve 2H, belirgin başlangıç dalgalanmaları olan ve tipik kalsiyum geçişleri olmayan iki reddedilmiş nöronu göstermektedir. - Sosyal durum modülasyonlu nöronların aşağıya doğru tanımlanması için kabul edilen nöronların floresan izlerini veri işleme yazılımından ihraç edin (Bölüm 7).
7. Sosyal durum modülasyonlu nöronları tanımlayın
- Önceden işlenmiş verileri daha fazla analiz etmek için MATLAB veya Python kullanın.
- Kabul edilen nöronların kalsiyum aktivite izlerini davranışsal zaman damgalarına hizalayın.
- Davranış videosundan sosyal buluşma zamanını bul. Her nöron için, aktiviteyi 300 saniyelik buluşma öncesi sosyal izolasyon dönemi ve 300 saniyelik sosyal buluşma dönemine ayırın.
- Her nöron için, izolasyon ve birleşme dönemlerindeki kalsiyum aktivite dağılımlarını niceleştirin.
- Alıcı Çalışma Karakteristikleri (ROC)analizi 18 uygulayarak nöronal aktivitenin izolasyon ve birleşme durumlarını ayırt etme yeteneğini değerlendirin ve ROC eğrisinin altındaki alanı hesaplayan bir AUC değeri elde edin.
- İstatistiksel anlamlılığı bir permütasyon testi kullanarak değerlendirin. Her nöron için, kalsiyum aktivite değerleri, davranışsal durumlar arasında 1 sn zaman kutusunda 1.000 kez dairesel olarak karıştırılır ve böylece AUC değerlerinin null dağılımı oluşturulur. Karıştırılmış null dağılımının 95. perdeliğini aşan gözlemlenen AUC değerleri olan nöronlar sosyal durum tarafından anlamlı şekilde modüle edilmiş kabul edilir.
- Modülasyon yönüne göre anlamlı modüle edilmiş nöronları sınıflandırın. Yeniden birleşme ile inhibrelenen nöronları İzolasyon Nöronları olarak sınıflandırın ve birleşme ile aktive edilen nöronları Yeniden Birleşme Nöronları olarak sınıflandırın (Şekil 4).
8. Deney sonrası doğrulama
- Fareleri perfüze edin ve GRIN lens izini ve viral ifadesini doğrulamak için standart bir histoloji yapın ( Şekil 2I'deki örnek histoloji görüntülemesine bakınız).
- %4 PFA kullanarak tüm fare başını implantla birlikte sabitleyin, ardından GRIN lensini çıkararak net bir lens izi görselleştirin.
NOT: Sadece doğru hedefleme ile hayvanların verilerini ekleyin.
9. Sorun Giderme ve Pratik Ipuçları
- Miniskopun arkasında diş çimentosu ile bir baş-bar sabitleyerek miniskopun montajını ve çıkarmasını kolaylaştırın.
NOT: Baş-bar çok uzun olmamalı ve sosyal davranışa müdahale etmemek için hafifçe eğik bir açıyla yerleştirilebilir. - Ameliyattan sonraki iyileşme sürecinde implant edilen fareleri en az bir hafta boyunca bireysel olarak barındırın. Bu, farelerin iyileşmesi için yeterli zaman sağlar ve diğer farelerin implant hasarını önler.
- Tamamen iyileştikten sonra implante edilen fareleri önceki kagematlarına yeniden birleştirin. Kapak kapaklarını düzenli olarak kontrol edin ve sıkın. Ekstra kapaklar hazırlayın ve hayvan bakımı sırasında kaybolduklarında değiştirin.
- GCaMP virüsü enjekte edildikten 3-4 hafta sonra kalsiyum sinyallerini kontrol edin. Sinyaller çok zayıf veya belirsizse, daha uzun bir iyileşme süresi bazen sinyallerin kalitesini artırır.
- GRIN lens tarafında ya da miniscope tarafında lens yüzeylerine dikkat edin. Lensleri temiz ve çizilmemiş tutun. Kullanmadığınız zamanlarda lensi kapatın.
- Görüntülemeden önce, sinyal kablosunun uzunluğunu, hayvanın görüntüleme alanının köşelerine ulaşabileceği kadar uzun ve sosyal etkileşimlerin sorunsuz olmasını sağlayacak kadar kısa hale ayarlayın.
- Sosyal etkileşimler sırasında diğer farelerin ısırmasını önlemek için gerekli olduğunda kabloyu sert bir malzeme tabakasıyla koruyun. Sinyal kablosunu düzenli olarak kontrol edin ve yoğun sosyal etkileşim nedeniyle bükülüp bükülmediğini kontrol edin.
- Aynı nöronal topluluğu ardışık görüntüleme seanslarından (örneğin, Şekil 3B'de) tanımlamak için, ham görüntüleme videoları kalsiyum izleri çıkarmak için birleştirilebilir.
- Örneğin, davranışsal videolar ve kalsiyum sinyalleri gibi birden fazla sinyalin senkronize edilmesi için, yaygın TTL girişleri ve senkronize el fenerleri genellikle farklı kayıt dosyalarını hizalamak için kullanılır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Nöronal popülasyonların tanımlanması
GCaMP virüsünü eksprese ettik ve bir C57BL/6J faresinin MPN'sine bir GRIN lens yerleştirdik. Ameliyattan sonra fare bireysel olarak iyileşti ve kafes arkadaşlarıyla en az bir hafta boyunca yeniden bir araya geldi. Fare daha sonra kalsiyum görüntüleme seansından önce 3 gün boyunca tek başına tutuldu. Görüntüleme sırasında önce 10 dakikalık izolasyon tabanı kaydedildi, ardından eski bir kafes arkadaşıyla 10 dakikalık sosyal buluşma y...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, in vivo miniskop kalsiyum görüntülemeyi sosyal davranışsal paradigmalarla birleştirerek hipotalamik nöronların aktivite profilini değerlendiren entegre bir yaklaşımı detaylandırır. Doğal sosyal etkileşimler sırasında derin beyin yapılarından uzun vadeli, hücresel çözünürlüklü kalsiyum görüntüleme yapılmasını sağlar. Aşağıdaki bölümler, bu yaklaşımın kritik adımlarını, metodolojik önemini, sınırlamalarını ve gelecekteki potansiyelini ele almaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarlar veya çıkar çatışmaları belirtmemektedir. ChatGPT, el yazması düzenleme sürecinde kullanıldı ve tüm yazarlar özenli ve detaylı düzeltme yaptı.
Teşekkürler
Miniskop deneylerinin ilk eğitimine verdiği destek için Profesör Catherine Dulac'a ve ameliyatın gerçekleştirilmesine yardımcı olduğu için Yang Sun'a teşekkür etmek isteriz. Bu çalışma, Westlake Üniversitesi'nden alınan başlangıç finansmanı ve NOMIS Vakfı, Harvard Üniversitesi Tan-Yang Otizm Araştırma Merkezi, D.L.'ye verilen Jane Coffin Childs Tıbbi Araştırma Ödülü ve Charles A. King Trust Doktora sonrası Bursu ile desteklendi. Liu Laboratuvarı'ndaki tüm üyelere el yazması hakkındaki yorumları için teşekkür ederiz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| AAV2/9-hSyn-jGCaMP7f-WPRE-pA | Taitool | S0587-9 | Viral vektörler, Cerrahi |
| Mevcut hemostatik jelatin sünger | FUKANGSEN | FKS-A | Cerrahi |
| Betadin çözeltisi (%10 iyodlu Povidon) 500mL | HYNAUT | Q13702855HNW002 | Cerrahi |
| Davranışsal video için kamera | DAHENG | MER2-160-227-U3C | Davranış |
| Karprofen | MCE | HY-B1227 | Cerrahi |
| Dijital Stereotaksik Aletler | RWD | 68803 | Cerrahi |
| Etanol (%75) | Sinopharm kimyasal reaktif şirketi, Ld | 801769610 | Cerrahi |
| Göz Merhemi | FODU | H37022025 | Cerrahi |
| Inscopix Veri İşleme Yazılımı (IDPS) | Inscopix | 1000-006551 | Veri Analizi |
| İzofluran | RWD | R510-22-10 | Cerrahi |
| Kwik-Sil 2 kişilik yapıştırıcı paketi | Dünya Hassas Aletleri | KWIK-SIL | Cerrahi |
| Mikromatkap | RWD | 78001 | Cerrahi |
| MP-1000 Mikropipet Çekici | RWD | MP-1000 | Cerrahi |
| Çok Fonksiyonlu Hayvan Anestezi Çözümleri | RWD | TAIJI-IE | Cerrahi |
| Nanolitre Mikroenjeksiyon Pompası | RWD | R-480 | Cerrahi |
| nVista 3.0 miniscope | Inscopix | 1000-004323 | Görüntüleme |
| Oftalmik forsep | RWD | F12006-10 | Cerrahi |
| Makas Çalışması | RWD | S14001-15 | Cerrahi |
| ProView İmplant Kiti | Inscopix | 1000-004238 | Cerrahi ve görüntüleme |
| Reçine çimento (Süper bağ) | Sun Medical | Süper bağ C& B | Cerrahi |
| 5 taban plaka kapak seti | Inscopix | 1050-004639 | Görüntüleme |
| 5 taban plakasından oluşan set | Inscopix | 1050-004638 | Görüntüleme |
| 5 GRIN lens seti, 0.6mm çap, 7.3mm uzunluk | Inscopix | 1050-004626 | Cerrahi ve görüntüleme |
| Stereotaksis Mikroskobu | Murzider | MSD205A | Cerrahi |
| Steril salin | QIDUKELIN | R1B25071902 | Cerrahi |
Kaynaklar
- Beery, A. K. Frank Beach award winner: Neuroendocrinology of group living. Horm Behav. 107, 67-75 (2019).
- Krause, J., Ruxton, G. D. Living in groups. , Oxford University Press. (2002).
- Riters, L. V., Kelm Nelson, C. A., Spool, J. A. Why do birds flock? A role for opioids in the reinforcement of gregarious social interactions. Front Physiol. 10, 421(2019).
- Panksepp, J. B., Lahvis, G. P. Social reward among juvenile mice. Genes Brain Behav. 6 (7), 661-671 (2007).
- Matthews, G. A., Tye, K. M. Neural mechanisms of social homeostasis. Ann N Y Acad Sci. 1457 (1), 5-25 (2019).
- Lee, C. R., Chen, A., Tye, K. M. The neural circuitry of social homeostasis: Consequences of acute versus chronic social isolation. Cell. 184 (6), 1500-1516 (2021).
- Liu, D., et al. A hypothalamic circuit underlying the dynamic control of social homeostasis. Nature. 640 (8060), 1000-1010 (2025).
- Luquet, S., Perez, F. A., Hnasko, T. S., Palmiter, R. D. NPY/AgRP neurons are essential for feeding in adult mice but can be ablated in neonates. Science. 310 (5748), 683-685 (2005).
- Balthasar, N., et al. Leptin receptor signaling in POMC neurons is required for normal body weight homeostasis. Neuron. 42 (6), 983-991 (2004).
- Zimmerman, C. A., et al. Thirst neurons anticipate the homeostatic consequences of eating and drinking. Nature. 537 (7622), 680-684 (2016).
- Augustine, V., et al. Hierarchical neural architecture underlying thirst regulation. Nature. 555 (7695), 204-209 (2018).
- Allen, W. E., et al. Thirst-associated preoptic neurons encode an aversive motivational drive. Science. 357 (6356), 1149-1155 (2017).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nat Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. J Vis Exp. (124), (2017).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. J Vis Exp. (162), (2020).
- Burrows, R., Ma, C. H., Sun, Y. J. Long-term imaging of identified neural populations using microprisms in freely moving and head-fixed animals. J Vis Exp. (203), (2024).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. eLife. 7, e28728(2018).
- Britten, K. H., Shadlen, M. N., Newsome, W. T., Movshon, J. A. The analysis of visual motion: a comparison of neuronal and psychophysical performance. J Neurosci. 12 (12), 4745-4765 (1992).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
