Yöntem makalesi

Astyanax mexicanus'un yüzey balıkları ve mağara balıkları popülasyonlarında beyin ve bağırsak diseksiyonu

DOI:

10.3791/70412

⸱

24 Şubat 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neurobiology, UPR- Medical Sciences Campus, 2Molecular Sciences Research Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, Astyanax mexicanus'un yüzey ve mağara adapte olmuş morfotiplerinin tüm beyin ve bağırsak bileşenlerinin disseksiye ve çıkarılması için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, transkriptomik, metabolomik ve bağırsak mikrobiyota analizi gibi sonraki uygulamalarda kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Teleost balıkları, gelişimden genetik ve sinirbilime kadar uzanan geniş bir araştırma sorusuna yanıtlamak için kullanılır; daha yakın zamanda bağırsak-beyin ekseninin karmaşıklıklarını anlamak ve hatta daha geniş bir bağlamda bağırsak-beyin-karaciğer eksenini anlamak için kullanılır. Meksika tetrası Astyanax mexicanus, nehirde yaşayan yüzey balıkları ve mağara adaptasyonuna sahip kör mağara balıkları dahil olmak üzere morfolojik ve fizyolojik olarak farklı morfotiplerin bulunması nedeniyle karşılaştırmalı ve gelişimsel evrim çerçevelerinde giderek daha fazla kullanılmıştır. Mağara habitatlarına uyum, laboratuvar koşullarında da bulunan morfolojik özellikler, davranışsal özellikler ve bağırsak mikrobiyota çeşitliliğindeki değişikliklerle ilişkilidir. Bu durum, mikrobiyom, metabolik aktivite, sinirsel adaptasyon ve karmaşık davranışsal çıktılar arasındaki etkileşimler hakkında sorular sorma fırsatı açtı. Bu etkileşimler, yüzey ve mağara adapte fenotipleriyle ilişkili bakteri çeşitliliğini tespit etmek için temizlenmiş beyin ve bağırsak mikrobiyota dizileme çalışmalarıyla tüm beyin haritalama çalışmalarıyla ele alınabilir. Ancak, bu çalışmaların çoğu, bütün, dikkatlice parçalanmış ve korunmuş bütün organ ve dokulardan fayda sağlayacaktır; bu da sonraki uygulamalarda sonradan işlem yapılmasına olanak tanır. Bu protokol, beyin ve bağırsak diseksiyonunda adım adım bir yöntem tanımlar; burada tüm beyin ve karın organları çıkarılıp hem yüzey balıkları hem de mağara balığı morfotipleri için izole edilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Omurgalı balıklar da dahil olmak üzere hayvan modelleri, biyolojik fenomenleri ve karmaşık patolojileri nispeten basit ve erişilebilir sistemlerde modellemek için kritik araçlardır. Örneğin, zebra balığı Danio rerio, gelişimlerini, genetiğini, fizyolojisini ve davranışlarını incelemek için uygulanan çok sayıda yöntemle en yaygın teleost balık modellerinden biridir ve biyomedikal ve nörodavranış bilimlerinde önemli etkiye sahiptir 1,2,3,4,5,6,7,8 . Günümüzde zebrafish kullanımının büyük avantajı, fonksiyon kaybı mutant hatlarda organ ve doku histolojisi ile patolojisini incelemek için çeşitli yöntemlerin mevcut olmasıdır; bunlar için adım adım diseksiyonprotokolleri mevcuttur 3,9,10.

Ancak, son on yıllarda, evrimsel biyoloji alanları dahil olmak üzere başka türde soruları sormak için uygun birçok başka teleost balık modeli de artmıştır; bunlar arasında evrimsel biyolojialanları da vardır (11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21, yaşlanmanın altında yatan biyolojik mekanizmalar2,22, toksikoloji23,24 ve diğerleri25,26. Buna bir örnek, Kuzeydoğu Meksika'dan gelen teleost balığı olan Meksika tetrası Astyanax mexicanus'un örneğidir; nehirde yaşayan yüzey balıklarının ataları ve 30'dan fazla kör, mağarada yaşayan mağara balığı popülasyonu bulunuyor (Şekil 1)12.

Mağara balıkları, gözkaybı 12,27, pigmentasyonkaybı 28, duyu sistemleriningenişlemesi 17,29,30 ve artan yağ deposu(12,31) gibi bir dizi morfolojik özelliği adapte etmişler; bu özellikler düşmanca mağara habitatlarında hayatta kalabilmesini sağlamıştır. Bu balıklar ayrıca uykuazalması 19,20, kaygı32, sürü33 ve saldırganlık13,18,19,20,29,34,35,36,37 gibi bir dizi davranışsal özelliği benimsemiştir, atalarının yüzey balıklarına kıyasla. Bu özelliklerin çoğunun adaptasyonu muhtemelen genetik varyasyon ve çevresel baskılarınbirleşiminden kaynaklanmıştır (35,36,28), bunlar nehirler ile mağaralar arasındaki habitat farklılıklarını da içerir. Genetik varyasyonun morfolojik ve davranışsal özellik adaptasyonu üzerindeki etkisi üzerine sorular sormak için giderek daha faydalı bir model 16,18,19,20,35,38,39 ve daha yakın zamanda bağırsak mikrobiyota çeşitliliği üzerindeki etkisi 14,15, beyin, bağırsak, karaciğer ve diğer organların toplanmasını gerektirebilecek sorular için, toplum genelinde kullanılabilecek standart bir brüt anatomi diseksiyon protokolüne ihtiyaç vardır. A. mexicanus'ta tüm beyin diseksiyleri ve organ diseksiyonları daha önce yapılmış olsa da, bu tür diseksiyonların zaman verimli bir şekilde nasıl yapılacağını anlamayı sağlayan tek noktalı, kapsamlı bir yöntem eksikliği vardır; bu, metabolomik40, metagenomik41 için örnek toplamayı gerektiren birçok proje türü için kritik öneme sahiptir. veya tüm organgörüntülemesi 16,38. Amacımız, bu modeldeki organlara erişim engelini ortadan kaldırmak, böylece topluluk kullanıcılarının araştırmalarına sorunsuz odaklanmasını sağlamaktır.

Bu protokolde, yetişkin yüzey balıkları ve Astyanax mexicanus türüne ait Pachón mağara balıklarında beyin ve gastrointestinal diseksiyon için adım adım bir yöntem özetliyoruz. Bu yöntem, bağırsak mikrobiyomu, doku metabolomları ve ışık levhası mikroskobu ile tüm beyin görüntülemesi için beyin temizleme gibi çeşitli sonraki protokollere uyarlanabilir. Bu teknik, aynı örnekle eşzamanlı olarak uygulanabilir de olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, IACUC onaylı 2024-0004 ve A790125 protokollerine uygun olarak Porto Riko Üniversitesi Moleküler Bilimler Merkezi ve Tıp Bilimleri Kampüsü'nde yürütülmektedir.

1. Ön diseksiyon kurulumu

  1. Sylgard Petri (SP) kabı kullanılarak disseksiyon yapılırsa, işlem öncesinde hazırlandığından emin olun; böylece birkaç gün sürebileceğini göz önünde bulundurun.
  2. SP yemeği hazırlamak için Sylgard 184 ve Elastomer 184'ü 10:1 oranında kullanın. 200 g Sylgard 184 bazını 20 g elastomer ile tek kullanımlık bir bardakta karıştırın. Petri kaplarına yaklaşık üçte biri ila yarı derinliğe dök. Kabarcıqları ve kapağı çıkarmak için tabağa dokunun. Tabakların doldurulduğundan ve düz bir zeminde bırakıldığından emin olun. En az 1 hafta42 boyunca kürlenmesine izin verin.
    NOT: 16s rRNA dizileme veya metagenomik için örnekler toplarken, SP tabak kullanmaktan kaçının. Bunun yerine, sterilize edilmiş, tek kullanımlık Petri plakaları kullanın ve laminar akış başlığı altında aseptik tekniği takip edin. Aseptik teknik uygulanıyorsa, laminar akış başlığını %70 etanol, yani mikrobisit deterjanla temizlemek ve ideal olarak 15 dakika boyunca mikrobiseid ultraviyole C-lambasına maruz bırakmak önerilir. Bu, dezenfekte edilmiş ve otoklavlanmış malzemeler/aletler laminar akış başlığına yerleştirilmeden önce yapılmalıdır.
  3. Her iki tarafta kağıt havlularla bir diseksiyon mikroskobu kurun. Bir tarafı atık depolama (örneğin, fazla organ dokusu) için, diğer tarafı sterilize edilmiş diseksiyon aletleri için ayırın. Diseksiyonlar arasında aletleri temizlemek için küçük kağıt havlu parçaları kesin.
  4. 1 PBS hazırlayın ve soğuk bir buz çamurunda elinizde tutun, daha iyi görünürlük için alanlar veya örnekleri temizlemek için gerekirse. Protokole bağlı olarak, 1PBS kullanmayı tercih edin.
    NOT: Örneğin, metagenomik dizileme için örnek toplarken kullanılmamasıönerilir 43. Bu tür bir yaklaşımda 1 PBS kullanılırsa, olası kontaminasyon için 1PBS örneği toplanarak dizeleme önerilir.
  5. SP'yi (veya tek kullanımlık, sterilize edilmiş Petri kabını) mikroskop altına koyun ve tüm aletlerin (diseksiyon seti, buzda doku toplama için mikrosantrifüj tüpleri vb.) elinizde olduğundan emin olun.
  6. 1 PBS ve etiketli mikrosantrifüj tüplerini yakındaki bir buz kovasına yerleştirin. Elimde 1 PBS için plastik bir damlacı var.
  7. Yakında bir balık ötenazi istasyonu kurun. Buz bulutu içinde plastik ızgara bulunan bir tanka yerleştirerek buz banyosu hazırlayın, ardından balık sisteminin suyu (kendi ev sistemlerinden veya ev tankından) doldurun.
    NOT: MS-222 de kullanılabilir, ancak sonraki protokollere (örnek sonrası işleme ihtiyaçları) bağlı olarak da kullanılabilir.

2. Yetişkin yüzey balıklarında ve mağara balıklarında beyin diseksiyonu

  1. Balıkları buz bulamaçta ötenazi edin. Hareket olmadığından ve balığın operasyonel hareket olmadan dipte battığından emin olun. Zaman büyüklüğe bağlı. Daha büyük balıkların operküler hareketi durması daha uzun sürer.
    NOT: Genç balıkların operküler hareketin (ötenazi) durması yaklaşık 2-5 dakika sürerken, yetişkin ve büyük balıklar yaklaşık 10-15 dakika sürebilir. Morfotip tabanlı farklılıklar da mevcuttur. Bazı mağara balıkları popülasyonları anestezi/ötenazi için yüzey balıklarından daha uzun sürede sürebilir. Bakım ve deneysel protokoller, anestezi ve ötenazi prosedürlerinin popülasyonlar arasında doğrulanmasını önerir; çünkü yanıtlar morflar ve popülasyonlar arasında değişebilir. 11.
  2. Balıkları bir SP'ye (veya kapüşon içindeki tek kullanımlık, sterilize edilmiş Petri kabına) aktarın ve bir damlacı ile buz gibi 1x PBS ile yıkayın (Şekil 1).
  3. Başı, solungaçların yaklaşık 2 mm gerisinde bir skarpelle keserek vücuttan ayırın (Şekil 2). Bu, orta beynin bir kısmını korur ve disseksiye edildikten sonra beynin hasar vermeden manipüle edilmesine olanak tanır. Cesedi bir kağıt havlu kullanarak atık alanına doğru götürün, ardından bertaraf için biyolojik tehlike konteynerine bir biyolojik tehlike torbasına koyun.
  4. İnce forseps veya hemostatla, balık başının arka kısmını iyi kavra. Mikro-makasla ağzın kenarlarını başın ve solungaçların arkasına doğru kesin (Şekil 3).
  5. Diğer tarafta tekrarlayın. Çeneyi çıkarın ve alt tarafı ikinci bir çift ince veya ultra-ince forseps ile iyice temizleyin.
    NOT: Solungaçların iç konturunu takip edin.
  6. Bu noktada, balığın başına hemostatla sıkıca tutun veya kullanıyorsanız SP'ye dikkatlice T piniyle ağzın ucundan sabitleyin.
  7. Her iki gözü ultra ince forseps veya makasla ayırın. Ucu gözün kenarına sokulan ve sonra gözü nazikçe çekin veya çıkarın (Şekil 4).
    NOT: Mağara balığı için geçerli değildir (göz çevresinden deriyi kazımak).
  8. Başın üst kısmında, gözler arasında önden arkaya uzanan ve başı sol ve sağa ayıran bir sagittal çizgi çiz. Sonrasında, mikro makasla çizgiyi sığ bir şekilde kesin (Şekil 5).
  9. İnce forsepsle, başın iki tarafını dikkatlice çekmeye başlayın, beynin altındaki bağ dokusunun altında kırılmaması için ekstra dikkat edin. Beyin göründüğünde, süper ince forseps ucu ile beyni kafatasından ayırın (Şekil 6).
    1. Beyni ezmekten kaçının, forseps ile çekin. Bunun yerine, eğer kalıntısı hâlâ varsa, onu arka beyin veya omurilikten tutarak bütünlüğünü koruyun.
    2. Beyin hala başın bir tarafındaysa, ultra ince forsepsle burunları nazikçe beynin arkasına yerleştirip nazikçe kaldırarak yatak kafatasından dikkatlice ayırın. Her zaman çekmekten kaçının, çünkü bu onu kırabilir.
  10. Beyin çıkarıldıktan sonra, ultra ince forsepsle nazikçe temizleyin, yağ veya çevresindeki dokuları yok edin. Bir mikrosantrifüj tüpüne veya aşağı akış protokolü için uygun depoya yerleştirin. Bu noktada, tüm beyni koruyun veya beynin alt bölgelerini (örneğin, telencephalon, optik tektum, koku soğanları) toplayın (Şekil 7).
  11. Telensefalon izolasyonu: Telensefalonu çıkarmak için, telensefalon ile optik tektum arasındaki tabanı ultra ince forsepsle sıkıştırın ve telensefalonu beynin geri kalanından ayırın. Uygun depolama tüpüne aktarın.
  12. Metagenomik için kullanılırsa, toplanan örnekleri sıvı azotta fırlatıp -80 °C'de saklayın. Bunu mikrosantrifüj tüpünü sıvı azotla 5 saniye daldırarak yapın.

Şekil 1
Şekil 1: Astyanax mexicanus morfotipleri. (a) Yüzey balıkları. (B) Pachón mağara balığı. Ölçek çubuğu: 10 mm Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2
Şekil 2: Başın ayrılması. (A) Yüzey Balıkları. (B) Pachón mağara balığı Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayın.

Şekil 3
Şekil 3: Kopuk bir balık başından çene çıkarılması. (A) Yüzey balığı. (B) Pachón mağara balığı Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayın.

Şekil 4
Şekil 4: Kopmuş bir balık başından gözün alınması. Mağara balıklarında, dokunun inceltilmesi için bölgenin kazıması yapılabilir. (a) Yüzey balıkları. (B) Pachón mağara balığı Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayın.

Şekil 5
Şekil 5: Sagittal kesim balık başının üst kısmını kesiyor. (A) Yüzey balığı. (B) Pachón mağara balığı. Ölçek çubuğu: 5 mm Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6
Şekil 6: Başın yan kısımlarının ayrılması ve beynin kranial boşluğu içindeki açığa. (A) Yüzey balıkları. (B) Pachón mağara balığı. (C,D) Kafatası yatağından beynin alınması. Ölçek çubuğu: 5 mm Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7
Şekil 7: A. mexicanus bölgesel beyin anatomisi. (a) Yüzey balıkları. (B) Pachón mağara balığı. Ölçek çubuğu: 5 mm Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Yetişkin yüzey balıklarında ve mağara balıklarında bağırsak diseksiyonu

  1. Yukarıda açıklandığı ötenazi yöntemini takip edin.
  2. Balığı tüy içermeyen bir mendil ile kurutarak temiz bir SP üzerine koyup damlacı ile buz gibi soğuk 1 PBS (veya aşağı akış uygulamasına bağlı olarak sistem suyu) ile örtün ki doku nemli kalsın.
  3. Balıkları SP (kullanıyorlarsa) T pinleriyle sabitleyin.
    1. SP kullanmıyorsanız, kesikler yaparken ağızdan ön tarafa güçlü bir şekilde tutunacak bir hemostat yeterli olur. İğneyi ön tarafta göz çukurunun içine yerleştirin (mağara balığı için de geçerlidir), böylece SP'ye ulaştığından emin olun.
    2. Kuyruğun arkasından plakaya doğru iğne. İşlem sırasında balığın hareketsiz kaldığından emin olun.
      NOT: Beyin diseksiyonuyla aynı örnekte gastrointestinal diseksiyon yapıyorsanız, diseksiyona başlamadan önce hemen bir skarpelle kafayı kesin ve balığı plakanın yüzeyine sabitleyin. Operkulumun arkasında ön çapraz bir kesik yapın; bu kesik başın üst kısmını koruyor ve bağırsaktan kaçınır. İdeal olarak, kafa ve gövdeyi ayırın ve her birinde iki deneyimli dissektor uzmanı zaman verimliliği için çalışsın. Ön pim, kafa kesildikten sonra vücudun en üst ön kısmına yerleştirilirken, arka pim aynı yerde kalır (Şekil 8).
  4. Diseksiyon mikro-makası kullanarak, ventral orta hat boyunca deri ve alt kası, anal yüzgeç/anüs üzerinden operkuluma (solungaçların üzerindeki sert örtü) doğru yarım dairesel bir çizgi şeklinde balığın alt kıvrımını takip ederek kesin (Şekil 9).
  5. Mikromakas ve ince penslerle operkulumu ve pektoral yüzgeci çıkarın.
    NOT: Bu adım, cildin çıkarılmasını daha verimli hale getirmeye yardımcı olur, ancak diseksiyonu yavaşlatabilir ve ihtiyaçlara göre atlanabilir.
  6. Deriyi ve alt kası anal yüzgeciden yukarıdan kesin, ardından solungaçlara doğru öne doğru kesin, ventral kesiyi gerektiğinde uzatın (Şekil 10). Bu nihayetinde bir pencere yaratır.
  7. İnce forseps yardımıyla kesiyi açın ve vücut boşluğunu açığa çıkarın. İnce forsepsle cildi tutun ve nazikçe kaldırarak çıkarın (Şekil 11).
  8. Bağırsağın hem ön hem de arka bağlantılarını kesin ve tüm iç organları dikkatlice çıkarın - gastrointestinal sistemi vücuttan çıkarıp SP'nin (veya tek kullanımlık, sterilize edilmiş Petri kabın) temiz bir bölgesine yerleştirin (Şekil 12 ve Şekil 13).
  9. İlk olarak, ultra ince forsepsle karaciğeri diğer karın organlarından ayırın. Karaciğeri izole ediyorsanız, mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin veya aşağı akış protokolüne veya ihtiyaca göre uygun bir depolama yöntemi kullanın. Bağırsağı dikkatlice esnetin ve mid, orta bağırsak/arka bağırsak kısımlarını belirleyin (Şekil 14).
  10. Mideni mid/arka bağırsaktan ayırın.
  11. Midgut/arka gutuğun ön ve arka uçlarını ince forsepsle tutun ve nazikçe uzatarak tam uzunluğuna kadar uzatın.
  12. Dokuyu mikrosantrifüj tüpünde toplayın ve uygun şekilde depolayın.
  13. Metagenomik için kullanılırsa, toplanan örnekleri sıvı azotta fırlatıp -80 °C'de saklayın. Bu, mikrosantrifüj borusunun sıvı azotla 5 saniye daldırılması ile yapılır.

Şekil 8
Şekil 8: Gastrointestinal diseksiyon için pim yerleştirme. (a) Yüzey balıkları. (B) Pachón mağara balığı Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayın.

Şekil 9
Şekil 9: Alt kesimden ön diseksiyona kadar. (a) Yüzey balıkları. (B) Pachón mağara balığı Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayın.

Şekil 10
Şekil 10: Operkulumun kaldırılması ve pencerenin oluşturulması. (a) Yüzey balıkları. (B) Pachón mağara balığı Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayın.

Şekil 11
Şekil 11: Yüzeysel yan deri ve kasın çıkarılması. (A) Yüzey balıkları. (B) Pachón mağara balığı Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayın.

Şekil 12
Şekil 12: Kas ve deri çıkarıldıktan sonra yetişkin balık vücut boşluğundaki organlar yerinde konumda. (A) Karın boşluğu açıkta kalmış ve organları açığa çıkarmak için yumurtaları alınmış dişi yüzey balıkları. (B) Karın boşluğu ve organları açıkta olan erkek yüzey balıkları. (C) Karın boşluğu açıkta kalmış ve organları açığa çıkmak için yumurtaları alınmış dişi Pachón Mağara balığı. (D) Karın boşluğu ve organları olan erkek Pachón Mağara balığı. Siyah oklar, gastrointestinal demetin bulunduğu bölgeyi işaret eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 13
Şekil 13: Balığın vücut boşluğundan çıkarılan gastrointestinal demet. (A) Yüzey Balıkları. (B) Pachón mağara balığı. Ölçek çubuğu: 10 mm Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 14
Şekil 14: Yüzey balıkları ve mağara balıklarının izole gastrointestinal organları. (a) Yüzey balıkları. (B) Pachón mağara balığı. Ölçek çubuğu: 10 mm Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokole uygun olarak, beyin ve bağırsak içeriği çıkarıldı, tam bağırsak, telensefalon ve optik tektumun uzunluğu ölçüldü ve yüzey balıkları ile Pachón mağara balığı morfotipleri arasında karşılaştırıldı (Şekil 15). İstitiksel karşılaştırmalar için bağımsız örneklemli Welch t-testlerini kullandık; örneklem büyüklüğü n = 6 yüzey balığı ve n = 6 Pachón mağara balığı idi. Yüzey balıkları, daha önce yayımlanmış beyin kayıtprotokollerine uygun olarak

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A. mexicanus'un evrimden biyomedikal sinirbilime ve mikrobiyolojiye kadar birçok alanda araştırma modeli olarak artan önemi, standartlaştırılmış bir organ diseksiyon ve toplama yöntemi gerektirmektedir. Optik tectum16,38, yetişkinkalp 11 ve diğerleri11,44 dahil olmak üzere izole yapılar daha önce incelenmiş ve belgelenmiş olsa da, bu türün...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması yoktur. Tüm prosedürler IACUC onaylı protokol 2024-0004'ü takip eder.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, NIH hibesi 5R16EY037336-02, RCMI hibi U54 MD007600 ve NIH hibesi 1P20GM156713-01 (COBRE Porto Riko Mikrobiyom Bilimleri Merkezi) tarafından finanse edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.0 Litrelik Zebrafish Yetiştirme TankıTecniplasthttps://shop.tecniplastusa.com/products/1-0-liter-zebrafish-breeding-tankÖtenazi buz bulamacını hazırlamak için. Tank yarı buzla doldurulur ve ardından delikli iç tank üstüne konur. Sonra üstüne kadar su ile doldurulur.
4L Poliyuretan Buz TavasıUSA ScientificMadde #2328-7242
Biyotehlike Atık TorbalarıFisherbrand14-828-244
Calbiochem OmniPur PBS 10x Sıvı Konsantre, Moleküler Biyoloji Sınıfı, SterilMilliporeSigma65074L
Diseksiyon Mikroskobu Olympus SZ51Olympus OLSZ51NPS-LED/R
Diseksiya Doku PensepleriFisherbrand08-953G
Diseksiyon Pinleri, 100 paketEv Bilimleri araçlarıhttps://www.homesciencetools.com/product/dissection-pins-100-pack/?srsltid=AfmBOoofk8r6_hd4nx_7bjjP2
GzkNBlnOJ3vUKor5
rFCJvVxPN9xRlpc
Pensetler, Narin, Ekstra İnce Keskin Uçlar MOPECAB132
Penset, doku, hassas süper ince uçMOPECAB047
Hemostat, 12,5 cm, düzDünya Hassas Aletlerihttps://wpiinc.com/products/var-15920-halsted-mosquito-hemostatic-forceps
Kucevherler forsetleri, Dumont No. 5MilliporeSigmahttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/f6521
Kimwipes EX-LKimberly-Clark34155
Sıvı AzotKurum tarafından sağlanan
Noyes Mikro Makas, 12 cmDünya Hassas Aletleri500228
Kağıt HavlularKurum tarafından sağlanan
Şeffaf kapaklı Petri Kasaları, 95 mm, 15 mm, yuvarlakFisherbrandFB0875714G
Skalpel Bıçakları, #22, 10 paketEv Bilimi Araçlarıhttps://www.homesciencetools.com/product/scalpel-blades-22-10-pack/
Neştil sapı #4Surtexhttps://surtex-instruments.com/product/scalpel-handle-no-4/
Makas, iris diseksiyonMOPECAA146
Makas, Superfine MicroMOPECAA152
Standart Tek Kullanımlık Transfer PipetleriTermo Bilimsel13-711-9D
Steril Eppendorf Mikrosantrifüj 1.5 & mikro; L tüpleriEppendorf05-402-25
Sylgard 184Elektron Mikroskopi Bilimleri24236-10
Termo-MatlaLab-Line Instruments Inc.2119
Ultra İnce MakasNEWMED EnstrümanlarıNM-DI-206023
Elektroforez, PCR için uygun suSigma-AldrichW4502-1L

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ji, J., Thwaite, R., Roher, N. Oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds. J Vis Exp. (139), e58366(2018).
  2. Örling, J., Kosonen, K., Villman, J., Reichard, M., Paatero, I. Impaired fin regeneration and angiogenesis in aged zebrafish and turquoise killifish. Biol Open. 12 (4), bio059622(2023).
  3. Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A. Anatomical dissection of zebrafish brain development. Brain Dev Methods Protoc. 1082, 197-214 (2014).
  4. Barbosa, A., et al. Western Blotting Assay for egr-1 Immediate Early Gene in Brain Tissue of Zebrafish Applied to Neuroethological Study. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. , Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
  5. Corradi, L., Zaupa, M., Sawamiphak, S., Filosa, A. Using perk immunostaining to quantify neuronal activity induced by stress in zebrafish larvae. STAR Protoc. 3 (4), 101731(2022).
  6. Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
  7. Leigh, S. C., Nguyen-Phuc, B. -Q., German, D. P. The effects of protein and fiber content on gut structure and function in zebrafish (danio rerio). J Comp Physiol B. 188 (2), 237-253 (2018).
  8. Sassen, W. A., et al. Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging. Dev Biol. 430 (1), 18-31 (2017).
  9. Jie, J., et al. Adult zebrafish intestine dissection: a technique to analyze compound absorption. J Vis Exp. (10), e20199(2023).
  10. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), e1717(2010).
  11. Baumann, D. P., Ingalls, A. Mexican Tetra (astyanax mexicanus): Biology, Husbandry, and Experimental Protocols. Laboratory Fish in Biomedical Research. , Academic Press. (2022).
  12. Gross, J. B., Meyer, B., Perkins, M. The rise of Astyanax cavefish. Dev Dyn. 244 (9), 1031-1038 (2015).
  13. Carlson, B. M., Gross, J. B. Characterization and comparison of activity profiles exhibited by the cave and surface morphotypes of the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 208, 114-129 (2018).
  14. Riddle, M., et al. Evolution of the Mexican cavefish gut microbiome. Curr Biol. 23, 01307(2023).
  15. Riddle, M. R., et al. Host evolution shapes gut microbiome composition in Astyanax mexicanus. Ecol Evol. 14 (4), e11192(2024).
  16. Jaggard, J. B., et al. Cavefish brain atlases reveal functional and anatomical convergence across independently evolved populations. Sci Adv. 6 (38), eaba3126(2020).
  17. Rodríguez-Morales, R. Sensing in the dark: constructive evolution of the lateral line system in blind populations of Astyanax mexicanus. Ecol Evol. 14 (4), e11286(2024).
  18. Rodriguez-Morales, R., et al. Convergence on reduced aggression through shared behavioral traits in multiple populations of Astyanax mexicanus. BMC Ecol Evol. 22 (1), 116(2022).
  19. Duboué, E. R., Borowsky, R. L., Keene, A. C. β-adrenergic signaling regulates evolutionarily derived sleep loss in the Mexican cavefish. Brain Behav Evol. 80 (4), 233-243 (2012).
  20. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biol. 13, 15(2015).
  21. Forberg, J. Temperature effects on the development of the axial skeleton and body shape in Astyanax mexicanus (teleostei: characidae) [Master's Thesis]. , College of Science and Health Theses and Dissertations. https://via.library.depaul.edu/csh_etd/514 (2022).
  22. Platzer, M., Englert, C. Nothobranchius furzeri: a model for aging research and more. Trends Genet. 32 (9), 543-552 (2016).
  23. Blackwell, B. R., et al. Effects of metformin and its metabolite guanylurea on fathead minnow (Pimephales promelas) reproduction. Environ Toxicol Chem. 41 (11), 2708-2720 (2022).
  24. Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquat Toxicol. 78 (1), 91-102 (2006).
  25. Butler, J. M., Whitlow, S. M., Roberts, D. A., Maruska, K. P. Neural and behavioural correlates of repeated social defeat. Sci Rep. 8 (1), 6818(2018).
  26. Norton, W. H. J., Gutiérrez, H. C. The three-spined stickleback as a model for behavioural neuroscience. PLoS ONE. 14 (3), e0213320(2019).
  27. Espinasa, L., Jeffery, W. R. Conservation of retinal circadian rhythms during cavefish eye degeneration. Evol Dev. 8 (1), (2006).
  28. Jeffery, W., Ma, L., Parkhurst, A., Bilandzija, H. Pigment Regression and Albinism in Astyanax Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , Academic Press, Elsevier. (2015).
  29. Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., van Netten, S. M., McHenry, M. J. The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus). J Exp Biol. 217 (Pt 6), 886-895 (2014).
  30. Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line-dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Dev Biol. 441 (2), 328-337 (2018).
  31. Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Dev Biol. 441 (2), 297-304 (2018).
  32. Chin, J. S. R., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Dev Biol. 441 (2), 319-327 (2018).
  33. Kowalko, J. E., et al. Loss of schooling behavior in cavefish through sight-dependent and sight-independent mechanisms. Curr Biol. 23 (19), 1874-1883 (2013).
  34. Espinasa, L., et al. Divergent evolutionary pathways for aggression and territoriality in Astyanax cavefish. Subterr Biol. 43, 169-183 (2022).
  35. Kowalko, J. Utilizing the blind cavefish Astyanax mexicanus to understand the genetic basis of behavioral evolution. J Exp Biol. 223 (Suppl_1), jeb208835(2020).
  36. Sekulovski, B., Miller, N. Mechanisms of social behaviour in the anti-social blind cavefish (Astyanax mexicanus). Proc Biol Sci. 292 (2043), 20250052(2025).
  37. Chin, J. S. R., et al. Analysis of stress responses in Astyanax larvae reveals heterogeneity among different populations. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 334 (7-8), 486-496 (2020).
  38. Kozol, R. A., et al. A brain-wide analysis maps structural evolution to distinct anatomical module. eLife. 12, e80777(2023).
  39. Ra, K., et al. Evolution of a central dopamine circuit underlies adaptation of light-evoked sensorimotor response in the blind cavefish, Astyanax mexicanus. bioRxiv. , (2024).
  40. Medley, J. K., et al. The metabolome of Mexican cavefish shows a convergent signature highlighting sugar, antioxidant, and ageing-related metabolites. eLife. 11, e74539(2022).
  41. Yen, S., Johnson, J. S. Metagenomics: a path to understanding the gut microbiome. Mamm Genome. 32 (4), 282-296 (2021).
  42. Marder, E. Marder lab website - Sylgard dishes. , https://sites.google.com/brandeis.edu/marder-lab/experimental-resources/sylgard-dishes (2026).
  43. Hallmaier-Wacker, L. K., Lueert, S., Roos, C., Knauf, S. The impact of storage buffer, DNA extraction method, and polymerase on microbial analysis. Sci Rep. 8, 6292(2018).
  44. Riddle, M. R., et al. Evolution of gastrointestinal tract morphology and plasticity in cave-adapted Mexican tetra, Astyanax mexicanus. bioRxiv. , (2020).
  45. Garduño-Sánchez, M., et al. Phylogeographic relationships and morphological evolution between cave and surface Astyanax mexicanus populations (de Filippi 1853) (actinopterygii, characidae). Mol Ecol. 32 (20), 5626-5644 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Beyin DiseksiyonuBa rsak Beyin EkseniBa rsak MikrobiyotasN ral AdaptasyonT m Beyin HaritalamaKar la t rmal Evrim
Video yakında

İlgili makaleler