Lewis Farelerinden Pankreas Adacığı İzolyasyonu ve Arındırma, Enzimatik Sindirim ve Yoğunluk-Gradient Ayrımı Kullanılarak

Özet

Bu protokol, Lewis sıçan pankreas adacıqlarının cerrahi hasamı, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanlı arındırması için standartlaştırılmış bir yöntemi tanımlar; böylece doğrudan nakil veya in vitro çalışmalarda kullanılmak üzere yüksek verimli, yüksek saflıkta preparatlar sağlanır.

Özet

Pankreas adacığı hem klinik adacığı nakli hem de diyabetin mekanizmalarını ve ilerlemesini anlamaya yönelik preklinik çalışmalar için gereklidir. Ancak, bu alanlardaki ilerleme genellikle yüksek kaliteli adacıqların bulunabilirliğiyle sınırlıdır; çünkü ortaya çıkan terapötik stratejiler daha büyük, daha temiz ve daha standart hazırlıklar gerektirir. Bu makale, Lewis sıçanlarından pankreas adacıklarının cerrahi hasadı, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanlı arındırılması için yüksek verimli, standartlaştırılmış bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem, intraduktal pankreas perfüzyonu ile tanımlanmış bir enzim karışımı, birden fazla pankreasın ortak sindirimi ve yoğunluk tabanlı ayrımı birleştirerek verimi en üst düzeye çıkarırken, parçalanmayı en aza indirir ve rutin elle toplama ihtiyacını ortadan kaldırır. Adacığı verimi iki tamamlayıcı yaklaşımla nicelendirilir: klinik ortamlarda yaygın olarak kullanılan geleneksel aliquot tabanlı sayma yöntemi ve yarı otomatik tam hazırlık görüntüleme tabanlı yöntem. 12 pankreastan temsil bir izolasyonda, manuel sayımda pankreas başına yaklaşık 3.300 adacık eşdeğeri (IEQ) ve 2.700 mutlak adacık (~39.600 toplam IEQ) elde edildi; boyut dağılımı %62 (50-100 μm), %17 (100-150 μm), %10 (150-200 μm), %5 (200-250 μm) ve %6 (>250 μm) idi. Buna karşılık, tüm hazırlık otomatik analizi toplam 16.350 IEQ (1.362 IEQ/pankreas) rapor etmiş ve aliquot tabanlı niceliklendirmedeki doğal değişkenliği ortaya koymuştur. Hazırlıklar ditizin boyama ile %98 saflıkta bulunuyordu ve izolasyon sonrası 3. ve 7. günlerde in vitro adacığının canlılığı %98 olarak korundu. Statik glukozla uyarlanan insülin salgılanmasıyla yapılan fonksiyonel değerlendirme, 1 saatlik uyarı sonrası 16,7 mM glukozla insülin salınımında 10 kat artış olduğunu gösterdi. Genel olarak, bu protokol yüksek saflıkta, işlevsel olarak sağlam adacığı hazırlamak için tekrarlanabilir ve verimli bir yaklaşım sunar; bu hazırlıklar ek temizlik olmadan hemen kullanılabilir. Adabaşlar, kültürde yedi güne kadar sağlam işlev görür; bu da büyük ölçekli in vitro testler ve in vivo nakil çalışmaları için esneklik sağlar.

Giriş

Pankreas adacığı nakli, tip 1 diyabetli (T1D) bireylerde endojen insülin üretimini yeniden sağlamak için uygulanabilir bir strateji temsil eder^. T1D'nin ötesinde, adacığak biyolojisi ilerleyici β hücre işlev bozuklukları ve kaybıyla karakterize edilen tip 2 diyabet (T2D) ile birlikte kronik pankreatit, pankreas tümörleri veya travmatik yaralanma nedeniyle kısmi veya tam pankreatektomi geçiren hastalar için giderek daha önemli hale gelmektedir. Bu bağlamlarda, yüksek kaliteli adacığa erişim hücresel tedavilerin ilerlemesi, β-hücre arızasının modellemesi, adacık-bağışıklık ve adacık-stromal etkileşimlerinin incelenmesi ve yeni yenileyici yaklaşımların geliştirilmesi için gereklidir². Sonuç olarak, sağlam ve tekrarlanabilir adacığı izolasyon prosedürleri, hem mekanistik araştırmaları hem de çok çeşitli pankreas endokrin bozukluklarında translasyonel gelişimi desteklemek için kritiktir.

Adabaşlar pankreas kütlesinin %2'sinden azını oluştursa da, glikoz homeostazında orantısız derecede önemli bir rol oynarlar. Hipoksiye, enzimatik aşırı sindirime, oksidatif strese ve mekanik kaymaya karşı içsel savunmasızlıkları onları izolasyona bağlı yaralanmalara karşı özellikle hassas^{kılar 3,4,5}. Sıcaklık, oksijenasyon veya doku yönetimindeki ince sapmalar bile, sınırlı antioksidan savunmaları ve yüksek metabolik talep nedeniyle β hücre uyarıcı-salgı bağlanmasını bozabilir veya apoptozu tetikleyebilir ^6,7. Sonuç olarak, çoğu geleneksel protokol, genellikle hem klinik hem de deneysel ortamlarda hasattan 24-48 saat içinde hızlı ilerleyen kullanıma vurgu^yapar 8,9,10,11,12. Bu "hemen kullanım" çerçevesi bozulmayı en aza indirse de, deneysel esnekliği sınırlar, boylamasına çalışmaları engeller ve büyük in vitro testler veya in vivo nakil deneyleri için yeterli adacık sayısı toplama çabalarını zorlaştırır.

Kemirgen modelleri arasında, Lewis fareleri, akraba evliliği genetik geçmişi, stabil bağışıklık profili ve tekrarlanabilir fizyolojik özellikleri nedeniyle adacığı araştırmalarında yaygın olarak kullanılır¹⁴. Adacığın verimliliği, tepkisi ve dayanıklılığındaki gerilime bağlı farklılıklar iyi belgelenmiştir. De Groot ve ark. Lewis sıçan adacıqlarının diğer suşlara kıyasla daha iyi glukoz uyarılı insülin salgısı sergilediğini göstererek, fonksiyonel, metabolik ve nakil çalışmaları için uygunluklarını vurgulamıştır¹⁵. Ek çalışmalar, immünolojik ve allo-/xenotransplantasyon araştırmaları için güvenilirliğini^{doğrulamıştır 14,15,16}. Ancak, laboratuvarlar arasında adacığı verim, saflık ve işlevdeki değişkenlik önemli bir engel olarak kalmaktadır. Bu değişkenliğin büyük bir kısmı, enzim karışımı, intraduktal perfüzyon teknikleri, pankreas yönetimi, sindirim zamanlaması ve arındırma stratejisindeki tutarsızlıklardan^{kaynaklanmaktadır 17}.

Bu sınırlamaları gidermek için, Lewis sıçanlarından pankreas adacığının cerrahi hasamı, enzimatik sindirimi ve yoğunluk gradyanı arındırılması için tekrarlanabilir, adım adım bir protokol geliştirdik. Bu iş akışı, verimi en üst düzeye çıkarmak, parçalanmayı en aza indirmek ve işlevsel kullanılabilirliği korumak için optimize edilmiştir. Önemli olarak, adacığı eşdeğerleri (IEQ), zamanla canlılık, saflık ve glukozla uyarlanan insülin salgılanması gibi net ölçütler belirler; bu da araştırmacıların başarılı ve suboptimal izolasyonları güvenilir şekilde ayırt etmesini^sağlar 18,19,20. Hem verimi hem de ömrü artırarak, protokol deneysel esnekliği artırır ve donör hayvan sayısını azaltarak daha etik ve ölçeklenebilir deney tasarımını destekler.

Birçok geleneksel yaklaşımdan farklı olarak, mevcut yöntem Lewis sıçan adacıqlarının kültürde 7 güne kadar sürdürülebilir ve işlevsel korunarak sürdürülebilirliğini artırabileceğini ve bu da uzun süreli in vitro çalışmalar için faydalarını artırdığını göstermektedir. Protokol, tek bir partide 30'a kadar pankreas işleyebilen sadeleştirilmiş ve havuzlu işleme stratejisini de içeriyor; bu da eşit sindirimi sağlar ve örnekler arası değişkenliği azaltır. Endokrin saflığı %98'e ulaştığında, bu işlem emek yoğun el toplama ihtiyacını ortadan kaldırır ve mikrobiyal kontaminasyon riskini azaltır. Sıklıkla kirsiz veya mekanik olarak zayıf preparatlar üreten tek adımlı veya toplu sindirim^{yöntemleriyle karşılaştırıldığında,} bu yüksek verimli iş akışı, in vitro testler, metabolik profilleme ve in vivo nakil çalışmaları için uygun çok sayıda temiz, nakil kalitesinde adacık üretir.

Protokol

Tüm prosedürler, Houston Metodist Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC, protokol #IS00007362) tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Rehberi ile Hayvan Refahı Yasası uyarınca yürütülmüştür.
NOT: Protokol boyunca kullanılan malzemeler ve aletler Materyaller Tablosu'nda bulunabilir.

1. Hasat öncesi hazırlık ve izolasyon günü

1. Aşağıdaki çözeltileri bir biyogüvenlik dolabında aseptik koşullarda hazırlayın ( bkz. Tablo 1) ve tüm çözeltileri 4 °C'de kullanana kadar saklayın.
   Penisillin-streptomisin durulama çözeltisi (Pen-Streptokok).
   Çamaşır medyası.
   Söndürme tamponu.
   Adacığak kültürü medyası.
   Krebs buffer.
2. Aletleri ve ekipmanları otoklavlama yoluyla sterilize edin.
   1. Otoklav pankreas hasatı, cerrahi paket: cerrahi perdeler, gazlı bez, sıçan dişi dokusu forsepsi, düz forset, ince kavisli forset, bir deri makasi, mikro-diseksiyon makasi, iki küçük hemostat ve bir kavisli hemostat.
      NOT: İki cerrahi operatör olacaksa, iki pankreas cerrahi paket toplayan otoklav yapın.
   2. Otoklav pankreas temizleme cerrahi paketi: ince kavisli penseps ve mikro-disseksiya makasları.
   3. 30 cm x 30 cm boyutlarında bir alüminyum folyo levhayı otoklavla geçirin.
   4. İşlenecek pankreas sayısına göre 1-6 600 mL ve 1 L beakerleri otoklav olarak kullanın ( bkz. Tablo 2).
   5. Otoklav bir 500 μm elek.
   6. İki adet 14 G omurilik iğne, sindirilmemiş pankreas dokusuyla tıkanırsa diye otoklav yapın.
   7. Gerekli her 50 mL şırınga için bir şırınga tüpü otoklav edin ( bkz. Tablo 3).
3. Sindirim için su banyosunu hazırlayın.
   1. Yörünge sallayıcısıyla donatılmış su banyosu, platformun seviyesinden 3/4 inç yukarıya kadar otoklavlanmış ultra saf su ile doldurun.
   2. 3 mL antimikrobiyal çözelti ekleyin ve kapağı kapalı tutarak en aza indirin.

2. Hasat ve izolasyon gününde hazırlıklar

1. Gradyan şırıngaları hazırlayın.
   1. Bir sonraki adımlarda ve "Adacığı Arıtma" 5.2 aşamasında hazırlanıp kullanılan 1.108 g/cm³, 1.096 g/cm³ ve 1.069 g/cm³ adacık gradyan çözeltilerini 4 °C depolamadan çıkarın ve yaklaşık 1 saat boyunca oda sıcaklığında dengelenmesine izin verin.
      NOT: Gerekli gradyan hacmi, işlenecek pankreas sayısına göre değişir; Seçilmiş gradyanların yeterli çözülmüş hacimlerini sağlamak için Tablo 3'e bakınız.
   2. 50 mL şırıngaları 1.096 g/cm³ ve 1.069 g/cm³ gradyanlarıyla önceden yükleyin ve etiketleyin.
      1. 1.069 ve 1.096 g/cm³ yoğunluk gradyan çözeltilerini şiddetle karıştırın.
      2. Tablo 3'e bağlı olarak, cerrahi tüp ve 16 G iğne ile donatılmış 50 mL şırıngalara uygun hacimleri yükleyin.
      3. Dolgu yaptıktan sonra, iğneleri sterilliği korumak için kapalı kapatın ve şırıngaları "Adacığı Arıtma" 5.5. adımında kullanmak üzere bir kenara koyun.
   3. 1.108 g/cm³ gradyanı oda sıcaklığında daha sonra kullanana kadar tutun.
2. Çalışan dissosiyasyon ortamı (WDM) enzim çözeltisi yapın, perfüzyon için şırıngalara ve otoklavlanmış bedeklere yükleyin.
   1. Steril koşullarda bir biyogüvenlik dolabında çalışın ve tüm çözeltileri buz üzerinde tutun.
   2. Kollajenaz, termolisin ve DNase I aliquotlarını buz üzerinde eritin.
   3. WDM kullanılarak steril bir 1 L beakerde enzim reaktiflerini seyreltirerek aşağıdaki nihai konsantrasyonları elde edinin: kollagenaz 0,15 mg/mL, termolizin 5 μg/mL ve DNase I 0,1 mg/mL (Tablo 2).
   4. WDM'yi nazikçe 10 kez dönen bir hareketle karıştırın. Pipetle karıştırmayın; nazikçe dönerek enzim aktivitesini koruyun.
   5. Her 10 mL enzim çözeltisi 10 mL ile 16 G'lik iğne ile hızlı doldurma için tek tek WDM enzim çözeltisi yükleyin, ardından daha sonra pankreas perfüzyonu için kapalı 25 G X 1/2" inç iğne ile değiştirin.
   6. Dolu şırıngaları otoklavlanmış alüminyum folyoya sarın ve kullanıma kadar buzun üzerine koyun.
   7. Fazla WDM'yi Tablo 2'ye göre hasat edilen pankreasları tutmak için steril 600 mL'lik bedeklere eşit şekilde dağıtın. Her bir beakeri steril alüminyum folyo ile kaplayıp buz üzerinde tutun (Tablo 2).
3. Hücre kültürü çalışma alanını hazırlayın.
   1. Yörüngesel su banyosu sallayıcısını aç, 130 rpm'ye ve 37 °C'ye ayarlandı. Pankreas hasadı sırasında bu şekilde bırakın.
   2. Aşağıdaki ürünleri daha fazla sterilizasyon için biyogüvenlik kabininde 1 saat boyunca UV ışığı altında koyun.
      Steril 500 μm elek.
      Steril 1 L beaker.
      Şırınga pompası.
   3. Hücre kültürü kuluçka makinesinin %25 °C 5_{CO2 olarak ayarlandığından emin olun.}
   4. Santrifüjü 4 °C'ye ayarlayın, ivme ve yavaşlama 9'a ayarlanır.
4. Hasat için malzemeleri toplayın ve ameliyat odasına gidin.
   1. Pankreas temizleyicisi olarak belirlenmiş:
      1. Gerekli sayıda 600 mL WDM beakerini ve pankreas durulama çözeltisini tutacak büyük bir buz kovası topla ( bkz. Tablo 1 ve Tablo 2).
      2. İşlenecek her 6 pankreas için 1 steril Petri kabı toplayın.
      3. 1 steril mikro diseksiya makası ve 2 küçük, kıvrık, hassas forseps toplayın.
   2. Atanmış pankreas hasat makinesi:
      1. Steril bir hasat cerrahi paketi topla.
      2. Steril cerrahi eldivenleri topla.
      3. Otoklavlı alüminyum folyoya kapatılmış, önceden yüklenmiş 10 mL WDM şırıngalarla bir buz tepsisi toplayın.
5. Ameliyat odasında, pankreas hasat istasyonunu hazırlayın.
   1. Cerrahi aletleri sterilizasyona 1 dakika batırarak her hayvan arasında sterilize etmek için cam boncuk sterilizatörünü açın. Aletler, steril 1x PBS içine daldırarak hızla soğutulabilir.
   2. Mikroskopun görüş alanının altına herhangi bir kan veya sızdırılmış WDM enzim çözeltisi için emici bir ped yerleştirin.
   3. Mikroskobu göz ve objektif lensler arasında toplam 6,3x büyütme ile ayarlayın.
   4. Cerrahi paketi açın ve aseptik teknikle steril cerrahi eldivenler giyin.
   5. Cerrahi hasat sürecine devam edin.
6. Ameliyat odasında pankreas temizleme istasyonunu hazırlayın.
   1. Yaklaşık 6 mL'lik 100 mm Petri kabının yarısını dolduracak kadar Pen-Strep çözeltisi döküp izole pankreasları batırıp buz üzerine koyun.
   2. Cerrahi paketi açın ve aseptik teknikle steril cerrahi eldivenler giyin.
7. Cerrahi odasında ötenazi odasını hazırlayın.
   1. Rezervuar tepsilerini boş, temiz ve yeniden kapatılabilir bir fare kafesine yerleştirin.
   2. Tepsileri yarı yarıya isofluran doldurun.
   3. Delikli tepsiyi rezervuarların üstüne koyun, böylece fareler içeriye yerleştirilirken dökülmesini önleyin.
   4. Kamır üstünü kafes kapağıyla mühürleyin.
8. Pankreas hasadına geçin.

3. Pankreas hasadı

1. Hızlı izofluran aşırı dozu için fareleri teker teker tepsinin üstündeki ötenazi odasına yerleştirin.
   NOT: Farenin ötenazi süresi, özellikle izofluran buharlaştıkça değişkenlik gösterir.
2. Her sıçan için nabız ve solunum eksikliğini doğrulayın.
3. Karın boşluğunu rahatsız etmeyen ikincil bir yöntemle ötenazi doğrulayın (örneğin, kalp ponksiyonu).
   NOT: Diğer birincil ötenazi yöntemleri kabul edilebilir; Ancak, hızlı ötenazi adacığığı hipoksisini en aza indirdiği için izofluran aşırı doz tercih edilir.
4. Her farenin karın tüylerine %70 etanol ile sprey uygulayın; böylece cerrahi alanda gevşek tüylerin çıkmasını önleyin.
5. Ötenazi yapılan sıçanı mikroskop altında, başı operatöre distal şekilde yerleştirin. Üst karın boşluğunun mikroskop görüş alanı altında olduğundan emin olun.

Şekil 1: Fare pankreasının cerrahi maruziyeti ve intraduktal perfüzyon. Pankreas maruziyeti ve füzyonundaki temel adımların Oddi Sfinkteri aracılığıyla gösterileri. (A) Karın boşluğu açık şekilde ötenazi yapılan Lewis sıçanı. (Aa) Ortak safra kanalı ve karaciğer veninin kelepçe yerleştirilmesi. (B) Oddi Sfinkteri bölgesini işaretleyen hemostatları gösteren onikili kosenin büyütülmüş görünümü. (Bb) Perfüzyon iğnesi ana pankreas kanalında konumlandırılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

6. Pankreası hasat edin (pankreas hasatçı rolü):
   1. Deri makası ile "V-şeklinde" bir kesi yapın; pubik simfizden başlayıp her yan kaburga kafesine doğru karın boşluğuna ulaşın ( bkz. Şekil 1A).
   2. Hayvanın ince ve kalın bağırsaklarını, düz forseps kullanarak hayvanın sol tarafına çekerek karın boşluğu "çalışma alanını" temizleyin.
   3. Düz forseps ve kavisli hemostatlarla onikiparı açın. Ortak safra kanalı ve hepatik portal venin mikroskop görüş alanında olduğundan emin olun.
   4. Karaciğer sefadasını geri çekin ve ortak safra kanalı ile hepatik ven kıskaçlarını kavisli hemostatlarla sıkıştırın. Karaciğerden 1-2 mm mesafede kelepçe yapın (bkz. Şekil 1Aa).
      NOT: 3.6.1-3.6.4 ve 3.6.8 adımları doğrudan görselleştirme yoluyla yapılabilir. Hassas doku manipülasyonunu sağlamak için diğer tüm adımlarda mikroskopu kullanın.
   5. Mikroskop altında, düz forseps ve düz hemostatlar kullanılarak, onikili kodenumdaki içeriği nazikçe harekete geçirerek Sfinkter'i Oddi'den temizleyin.
      NOT: Onikili koşu içeriğinin iğne yerleştirilme noktasından yerinden ayrıldığından emin olun.
   6. Oddi Sfinkteri'nin çevresindeki bölgeyi, sfinkterin her iki tarafından yaklaşık 5 mm mesafede düz hemostatlarla nazikçe sıkıştırarak izole edin. Doku bütünlüğünü korumak için minimum sıkıştırmayı sağlamak ( bkz. Şekil 1B).
   7. Steril bir WDM şırıngası kullanarak, iğneyi dikkatlice onikili ikipari duvardan geçirin, Oddi Sfinkter'inden geçirin ve perfüzyon için ana pankreas kanalına ilerledin (bkz. Şekil 1Bb).
      1. İğne Oddi Sfinkterinden geçer geçmez, sabit basıncı koruyarak, pankreas tamamen şişene kadar yaklaşık 500 μL/s hızla 7-10 mL WDM pankreasa perfüze edilir.
         NOT: Travmayı en aza indirmek için eğimin yukarıda olduğundan ve iğneyin pankreas kanalına paralel olduğundan emin olun. Yerleştirme işlemi hemen başlar başlamaya başlayın. Bu, sfinkter ve kanalın genişletilmesine yardımcı olur ve iğneyin ilerlemesini kolaylaştırır. Pankreas kuyruğu, dalak yakınında bulunan ve gözle görülür şekilde defüzyona başladığında, pankreas tamamen şişmiş sayılır.
   8. Pankreası çevresindeki yapılardan nazikçe disseksiye ederek aşağıdaki sırayla kesin: dalak, mide, kalın bağırsak, onikizili ve mezenteri.
      NOT: Doku hasarını en aza indirmek için küt diseksiyon kullanın. Anatomik yönelimi korumak ve damar ile kanal bağlantılarındaki gerilimi azaltmak için sıralı olarak ilerleyin.
      1. Her iki düz hemostatı da onikili kosten çıkarın.
      2. Düz forsepsle dalak pankreas bağını (pankreas ve dalağı birleştirir) sıkıştırın ve nazik bir çekiş uygulayın.
      3. İnce kavisli diseksiyon penslerini kullanarak pankreası bitişik dalak bağlantılarından dikkatlice hareket ettirip ayırın.
      4. Pankreas dokusunu ince kavisli forsepsle kaldırarak ve düz forsepsle nazik karşı çekiş uygulayarak pankreası mideden ayırın.
      5. Sonra, düz forsepsle pankreastan kalın bağırsağı avületmek için sert bir çekiş uygulayın.
      6. Düz forsepsle ince bağırsağı kaldırın ve ince kavisli forsepsle pankreastan mezenteriyi disekiye edin.
      7. Perfüzyon edilmiş pankreası düz forsepsle nazikçe kaldırın ve ince diseksiyon makası ile bağ dokusuna kalan bağlantıları kesin.
   9. Çıkarılan pankreası hemen buz gibi durulama çözeltisi içeren bir Petri kabına aktarın ve hemen bir sonraki pankreas hasadına geçin; pankreas temizleyicisi pankreas temizlemeye başlar.
7. Pankreası temizleyin (pankreas temizleyici rolü):

Şekil 2: Perfüze edilmiş fare pankreasının temizlenmesi. Pankreasın sıralı görselleştirmesi, gerekli olmayan dokunun çıkarılmasından önce ve sonra. (A) Diseksiyon sonrası hemen perfuzlanmış pankreas, bitişik yağ dokusu, lenf düğümleri ve bağ yapıları görünür. (B) Büyük anatomik işaretlerle işaretlenmiş perfüzon pankreas. (C) Fazla dokunun alınmasının ardından pankreas temizlenmiş, sindirimden önceki son görünümü göstermiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

1. İnce kavisli forseps ve ince disseksiyon makası kullanarak perfüzyonlu pankreastan lenf düğümlerini, yağ dokusuynu, mezenteri ve büyük damarları dikkatlice kesin (bkz. Şekil 2).
2. Temizlenmiş pankreası 25 mL soğuk WDM içeren steril 600 mL'lik bir beakere aktarın. Cerrahi çalışma alanından hücre kültürü çalışma alanına transferin temizliğini korumak için şişeliği steril alüminyum folyo ile kaplayın.
   1. Kirlenme önlemek için Petri kabındaki durulama çözeltisini her 6 pankreasda bir değiştirin.
   2. İlk pankreasın buz üzerine konduğu zamanı kaydedin. Bu, soğuk iskemi dönemini belgelemek için kullanılacaktır.

8. Tüm pankreaslar sağlanıp temizlendikten sonra, hücre kültürü çalışma alanında hızla sindirim aşamasına geçin.

4. Pankreas sindirimi

1. Yörünge sallayıcı dönüşlerini durdurun ve pankreasları içeren kapalı beaker(ler)i su banyosunun belirlenmiş tutucularına sabitleyin.
2. Hızlıca, 130 rpm'de ayarlanmış yörünge sallayıcısını yeniden başlatın ve sindirim süresi için 10 dakikalık bir zamanlayıcı başlatın ( bkz. Şekil 3A).
   NOT: Bu noktayı soğuk iskemi döneminin sonu olarak kaydedin. Her adacık hasadını, karşılık gelen toplam soğuk iskemi süresiyle birlikte laboratuvar kaydına kaydedin.
3. 5 dakikada, doku ayrışmasını kolaylaştırmak için beaker'i manuel olarak saat yönümünde, sonra saat yönünün tersine çevirin.
4. 8 dakikada, soğutma çözümünü soğuk depodan alın ve daha sonra hemen kullanılmak üzere biyogüvenlik dolabına aktarın (bkz. Tablo 1).
5. 10. dakikada, enzim aktivitesini yavaşlatmak için beakerleri hızla buza aktarın ve batırın ( bkz. Şekil 3B).
   NOT: Bu noktadan itibaren, oda sıcaklığında yoğunluk gradyanları kullanıldığında, tüm dokuları, hücreleri ve çözeltileri 4.20. adıma kadar buz üzerinde işleyin ve onları koruyun.
6. Beaker'ın dış kısmını ve tepsisini biyogüvenlik dolabına aktarın.
7. Sindirimi durdurmak için sindirimi durdurmak için bedekteki çözeltiyle 1:1 oranında söndürme tamponu ekleyin (yaklaşık 75-100 mL başı başı).
8. Büyük doku parçalarını ayırmak için 14 G'lik omurga iğnesi takılmış 50 mL şırınga ile nazikçe ve tekrar tekrar doku süspansiyonunu aspire edin ve dışarı çıkarın (bkz. Şekil 3C).
9. Süspansiyonu 200 mL'lik konik tüplere aktarın.
10. Kabı 5 mL yıkama ortamı ile durulayın ve dekantı, adacığı içeren 200 mL konik tüpte kalan sindirimi toplayın.
11. Santrifüj, 4 °C'de 5 dakika boyunca 200 × g'de sindirir. Güvenlik için uygun santrifüj şişesi adaptörleri ve minderlerinin kullanılmasına dikkat edin.
12. Süpernatantı dikkatlice dezent edin ve pelleti 100 mL yıkama malzemesinde önceki 14 G spinal iğneyle tekrar askıya alın.
13. Süspansiyonu, steril bir 600 mL beakerin üzerine yerleştirilmiş steril 500 μm elek üzerinden filtreleyin ve büyük, sindirilmemiş dokuları çıkarın.
    NOT: Pankreas perfüzyonu ve temizliği en iyi şekilde yapıldıysa, minimal yağ dokusu ve perfüzyon olmayan pankreas elek üzerinde kalmaz.
14. Hapsolmuş dokuyu geri kazanmak için eleği 10 mL yıkama ortamıyla durulayın.
15. Filtratı yeni 200 mL'lik konik tüplere aktarın.
16. 200 × g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
17. Üst maddeyi degente edin ve pelleti 100 mL serolojik pipet kullanarak 100 mL yıkama ortamında yeniden askıya alın.
    NOT: Adacıklara maruz kalmadan önce pipet uçlarını FBS içeren tampon ile önceden ıslatarak minimum hücre kaybını sağlayın.
18. Santrifüj 600 × g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca koyun.
19. Süpernatantı dikkatlice aspire ederek kuru bir pelet elde edin.
20. Gradyan ayrımı için santrifüj sıcaklığını 22 °C'ye ayarlayın.
    NOT: Bu, santrifüjü 2000 x g g'de 15 dakika boyunca 22 °C'de, örnek olmadan çalıştırarak hızlandırılabilir.

5. Adacığı arındırma

1. Gerekli 50 mL konik tüp sayısını belirlemek için Tablo 3'e bakabilirsiniz.
   NOT: Toplam pellet hacmini eşit şekilde dağıtmak için Tablo 3'e bakın; böylece her gradyan tüpte yaklaşık 2-3 mL pellet sindirimi bölünür. Daha sonra zayıf bir ada bant ayrımı tespit edilirse, ayrım çözünürlüğünü artırmak için ek gradyan tüpleri kullanın.
2. 10 mL'lik serolojik pipet ucu, 1.108 g/cm³ yoğunluk gradyan çözeltisiyle önceden ıslatılır, böylece adacik istiklerin ucu iç yüzeye yapışmasını engeller.
3. Her doku peletini, önceden ıslanmış 10 mL serolojik pipet kullanılarak 2 mL pellet hacmi için 15 mL 1.108 g/cm³ gradyan çözeltisine yeniden askıya alın. Toplam hacmin 10 mL'yi aşmasına rağmen, daha küçük pipet genişliği daha kontrollü karıştırma ve verimli pelet ayrışmasını sağlar. Dengesiz olana kadar hafifçe karıştırın.
4. Her 50 mL'lik konik tüpün altına 15 mL hücre süspansiyonu dikkatlice dağıtın, tüp duvarlarıyla temas etmeden temiz gradyan seviyeleri sağlanın.
5. Önceden yüklenmiş gradyan şırıngaları kullanılarak, ardışık olarak 10 mL 1.096 g/cm³ gradyanı ve ardından 10 mL 1.069 g/cm³ gradyanı üzerine bindirin.
6. Her gradyanı 5 mL/dakika hızda bir şırınga pompası ile dağıtın, 16 G'lik iğne ucunu tüpün iç duvarına yaslayarak gradyanların karışmasını önleyin.
7. Tüpleri 700 × g sıcaklığında 15 dakika boyunca 22 °C'de santrifüjlenin; gaden karışımını önlemek için santrifüj ivmesi 3'e ve yavaşlama 0'a ayarlandı.
   NOT: Uzatılmış yavaşlama süresi göz önüne alındığında, tüm santrifüj döngüsü yaklaşık 45 dakika sürer. Zamanı yakından takip edin; çünkü adacıqlar gradyan karışımı ve olası hücre hasarını önlemek için derhal toplanmalıdır. Gerekirse, denge tüp(leri) ağırlıkla değil, ağırlıkla hazırlanarak yoğunluk farklarını hesaba katabilirsin. Tüpler çıkarıldıktan sonra santrifüjü 4 °C'ye sıfırlayın, sonraki adımlar için hızlanma ve yavaşlamayı 9'a indirin.
8. Santrifüjlemeden sonra, 1.069-1.096 g/cm³ ve 1.096-1.108 g/cm³ gradyan katmanları arasındaki arayüzlerde bulunan adacığı tabakası tanımlanır ( bkz. Şekil 3D).
9. Üst katmanda toplanan dokuları dikkatlice Pasteur pipetiyle yıkama ortamıyla asulup atın.
10. Başka bir Pasteur pipetini ıslatın, adacık tabakasını toplayın ve 5 mL yıkama ortamı içeren önceden soğutulmuş 200 mL konik bir tüpe aktarın.
11. Önceden soğutulmuş 200 mL konik tüp hacmini yıkama ortamıyla 200 mL'ye çıkarın.
12. 600 × gr'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı dekant edin.
13. Pellet'i 30 mL yıkama ortamında önceden ıslatılmış 10 mL serolojik uç kullanarak yeniden askıya alın.
14. Daha iyi adacık pelletlenmesi için önceden ıslanmış 10 mL serolojik uç kullanarak resüspansiyonu yeni 50 mL konik bir tüpe aktarın.
15. Aynı 200 mL'lik konik tüpü 20 mL yıkama ortamıyla durulayın ve kalan adacıqları içeren 50 mL konik tüpe aktarın.
16. 50 mL'lik konik kağızı adacıqlar ve yıkama ortamıyla 300 × g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
17. Süpernatantı boşaltın ve adacığı pelletini 50 mL adacığı kültür ortamında yeniden süspansiyona yerleştirin ( bkz. Tablo 1).
    NOT: Manuel niceleme yöntemiyle sayılan adacıqları bu adımda 100 μL aliquot çıkarın.
18. Doku kültürü ile işlenmemiş 100 mm Petri kablarına adacıkları eşit şekilde yerleştirin; işlenen her beş Lewis fare pankreası için bir tabak kullanılır.
    1. Toplam adacığı ortam hacmini şu formülle hesaplayın (pankreas sayısı 5 × 10 mL÷ kadar).
    2. Adacığı pelletini hesaplanan ortam hacminin yarısına yeniden süspansiyon ekleyin, ardından süspansiyonu belirlenen plaka sayısına eşit şekilde dağıtın.
    3. Kalan adacıkları içeren 50 mL konik tüpü kalan hesaplanan ortamın yarısıyla durulayın ve bu yıkamayı aynı plakalar üzerinde pipetleyin; böylece her tabak başına 10 mL nihai hacme ulaşılır ( bkz. Şekil 3E).
19. Gece boyunca 25 °C'de %5 CO₂ içinde kuluçka yapın. Her Petri kabının yanına her 24 saatte 3 ml adacık kültürü ortamı ekleyin ve ardından ortamı yenilemek için nazikçe karıştırın.
20. Adacık sayımı (6. adım) geçin.

Şekil 3: İzole adacıqların pankreas sindirimi ve arındırılması. Pankreas sindiriminden adacığı arındırmasına kadar olan ardışık adımların temsilci görüntüleri. (A) Enzimatik sindirimden önce birikmiş perfüze pankreaslar. (B) Enzimatik sindirim sonrası parçalanmış pankreas. (C) Mekanik post-mekanik uniform doku süspansiyonu. (D) Santrifüjlemeden önce (solda) ve santrifüjlemeden sonra (sağda) yoğunluk-gradyan tüpleri, gradyan arayüzünde görünür adacığı bandı daire çizilmiş. (E) Koleksiyondan hemen sonra Day 0 adacığının parlak alan görüntüsü. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

6. Adacığı sayımı

1. Manuel adacığı ölçümü toplayın.
   1. 5.16. adımda, adacığı süspansiyonundan üç adet 100 μL aliquot ile 200 μL pipet ve normal 200 μL uçlar kullanılarak çekilin.
      NOT: Ölçüm için alikotlar alındığında, adacıkların pipet karıştırmasıyla ortamda eşit şekilde asılı olduğundan emin olun.
   2. Her aliquot'u kendi 2 mm × 2 mm ızgaralı Petri kabına aktarın; bu kap 1 mL 1× PBS içerir.
   3. Ters bir mikroskop altında adacıkları sayın, gözlük nişangahı lens insertiyle çaplarına göre kataloglayın.
      NOT: Tüm adacıklar dairesel olmayacaktır; sayma sırasında yatay veya dikey ölçümlere uyun.
   4. Standart dönüşüm tablosunu kullanarak toplam 150 μm adacık eşdeğeri hesaplayın (bkz. Tablo 4).
      NOT: Her örneğin IEQ'sünü karşılaştırın. Aliquotların IEQ'su %30'dan fazla farklıysa, en benzer aliquotların ortalamasına devam edin.

7. Güvenlik önlemleri

1. Uygun olduğunda tüm cerrahi ve doku işleme işlemlerini aseptik koşullarda bir biyogüvenlik dolabında gerçekleştirin. Reaktif ve dokuların kullanımı sırasında güvenlik gözlüğü, laboratuvar önlüğü, eldiven ve cerrahi maske dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman (PPE) kullanın.
2. Pankreas hasadı steril koşullarda yeterli cerrahi aletler ve PPE ile gerçekleştirilir. İzofluran ve diğer anestezikleri kurum yönergelerine uygun olarak kullanarak solun maruz kalmasını önleyin.
3. Hayvan dokularını, keskin ve biyolojik tehlike atıklarını kurumsal biyogüvenlik protokollerine uygun olarak bertaraf etmektir. Aktivite ve canlılığı korumak için başka belirtilmedikçe buz üzerinde enzimatik reaktifler ve biyolojik malzemeler tutulmalıdır.

Sonuçlar

Aşağıdaki sonuçlar, tarif edilen yöntemle yapılan tipik bir adacik izolasyonunu temsil etmektedir; on iki Lewis sıçan pankreası paralel olarak işlenmiştir.

Verim ve boyut dağılımı

Manuel aliquot sayımı ve IEQ dönüşümü

"Adacık Sayımı", Adım 6.1'de tanımlandığı gibi, karışık adacığı süspansiyonundan iki bağımsız 100 μL aliquot elde edildi ve çaplı kutulara göre sayıldı (50-100 μm, 100-150 μm, 150-200 μm, 200-250 μm, 250-300 μm, 250-300 μm, 250-300 μm). Sayımlar, standart eşdeğerlik tabloları kullanılarak adacığı eşdeğerlerine (IEQ; 150 μm referans) dönüştürüldü ve toplam süspansiyon hacmine ekstrapolasyon yapıldı (bkz. Şekil 4A). Test izolasyonu boyunca (n = 12), verim pankreas için 3330 IEQ, 50-100 μm kutuda ise ortaca bir adacık çapı bulunuyordu. Çoğaltılan aliquotlar, bin başına %18,8 (varyasyon katsayısı) ile uyum sağladı; bu da orta derecede varyasyon olduğunu ancak manuel sayım yöntemleriyle beklendiğini gösteriyor. Önceki 14 adacığı izolasyonunda, bu yöntem pankreas için ortalama 1353 (SD 607) IEQ üretti.

Otomatik tam plaka nicel ölçme

Manuel IEQ'yu karşılaştırmak için, D1'de mikroskop kullanılarak parlak alan görüntüleri alındı ve tüm tabak kompozitleri oluşturmak üzere dikildi (4× objektif; 1/100 s pozlama). Otomatik boyutlandırma ve nesne niceleme Fiji ve önceden tanımlanmış 50-600 μm boyut eşiği ile kodlama kullanılarak gerçekleştirildi. Görüntüler önce arka plan varyasyonunu azaltmak ve kontrast düzenliliğini artırmak için önceden işlendi. Adacık yapıları, çevredeki dokuya göre yoğunluk farklılıklarına göre tanımlandı ve böylece ikili nesne maskeleri oluşturuldu. Bitişik veya kısmen birbirine değinen adabaşlar, nesne sayısının küçümsenmesini önlemek için ayrılmıştır. Belirlenen boyut aralığı dışındaki nesneler, enkaz ve adacığı olmayan dokuları temizlemek için hariç tutuldu. Her tutulan nesne için, alan ve x ile y eksenli çapları dahil morfometrik parametreler çıkarıldı. Adacıklar daha sonra çapına göre binlendi ve IEQ, her boyut kutusundaki adacık sayısının karşılık gelen dönüşüm faktörü ile çarpılmasıyla hesaplandı. Otomatik boyutlandırma, ortalama x ve y eksenli çapları sırasıyla 117 μm ve 116 μm olmak üzere toplam 98.832 nesne elde etti; tahmini toplam 16.350 IEQ oldu; bu da manuel IEQ ile D0 olarak ölçülmesiyle güçlü şekilde korelasyonluydu (Spearman r = 0.937, p = 0.0048; bkz. Şekil 4A-C).

Adacığı hücresi dökülmesi

Tam plaka görüntüleri, arıtmadan 2 saat sonra ve tekrar 1. Günde (D1) alındı; aynı yöntem "Otomatik tam plaka niceliklendirme"de erken adacık stabilizasyonunu ("dökülme") değerlendirmek için kullanıldı. Nesne sayısı %0,9 oranında, IEQ ise %6,11 değişti (bkz. Şekil 4D). D0 ve D1 arasındaki adacığığı çaplarının eşleştirilmiş karşılaştırılması, istatistiksel olarak anlamlı bir medyan azalma olarak 2 μm olduğunu göstermiştir (Wilcoxon işaretli sıralama testi, p = 0.0136, n = 2820). Ancak, bu değişikliğin küçük büyüklüğü biyolojik veya klinik açıdan anlamlı olmayabilir.

Şekil 4: Adacık büyüklüğü dağılımı, korelasyonu ve erken dökülmesinin nicel değerlendirmesi. Manuel ve otomatik analizlerle elde edilen adacık ölçümlerinin grafik özeti. (A) Gün 0 (D0) Standartlaştırılmış adacığığı eşdeğer IEQ boyutlu kutular arasında manuel nicelik verilerine dayalı adacık boyutu dağılımı (B) Aynı standartlaştırılmış IEQ boyut kutularında otomatik görüntü tabanlı ölçümlerle belirlenen 1. Gün (D1) adacık boyutu dağılımı. (C) IEQ boyutlu kutular arasında manuel D0 ile otomatik D1 nicelik ölçme arasındaki sayıların korelasyonu. (D) Aynı plakanın otomatik ölçümleri için D0 ile D1 arasındaki adacığığının dağılımının kutu grafiki. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Saflık (endokrin vs. ekzokrin içerik)

Dithizone (DTZ) boyama

D1'de, adacıkların bir aliquotu (n = 451) oda sıcaklığında 30 saniye DTZ ile boyanmış ve hemen parlak alan mikroskopisiyle görüntülenmiştir (4× objektif; 1/20 s. pozlama). Fiji'de, arka plan pikselleri kaldırıldı ve kalan piksel alanı toplam adacığı alanına karşılık gelecekti. DTZ-negatif ekzokrin doku bölgeleri, daha koyu renk kontrastıyla tanımlanarak, lasso aracı kullanılarak manuel olarak seçildi ve ilgi duyulan her bölgenin alanı otomatik olarak piksel cinsinden kaydedildi. Endokrin saflık, DTZ-pozitif piksellerin toplam adacığı piksellerine göre yüzdesi olarak hesaplanmış ve %0,38 ± 98,56 saflık elde edilmiştir (Şekil 5A).

Uygulanabilirlik ve işlevsel performans

Glikozla uyarlanan insülin salgısı (GSIS)

Her zaman noktasında (D1, D3, D7), 15 boyut uyumlu adacığı elle seçilip 24 kuyu tabağının bireysel kuyularına yerleştirildi; bu kuyular dört kez hazırlandı. Adabaşlar, Krebs tamponu içinde 37 °C 5%_CO2 oranında düşük-yüksek-düşük glikoz uyarısı protokolü altında inkübe edildi: önce düşük glikozda (2,8 mM, 60 dakika), ardından yüksek glikozda (16,7 mM, 60 dakika, bkz. Tablo 1). Her kuluçka döneminin sonunda atık su fraksiyonları toplandı ve insülin konsantrasyonları fare insülin ELISA testi kullanılarak nicelendirildi. Uyarım indeksleri, yüksek ve düşük glikoz koşullarında insülin salgılanmasının oranı olarak hesaplandı. Uyarılma indeksleri sırasıyla 1., 3. ve 7. günlerde 9.37, 8.34 ve 6.7 idi ve anlamlı fark yoktu (Şekil 5B).

Canlı/Ölü boyama

D1, D3 ve D7 seviyelerinde, üreticinin talimatlarına göre 15 adacık el ile seçilip Live/Dead canlılık kiti ile boyandı. Kısa bir süreliğine, adacıqlar 25 °C'de 30 dakika boyunca Live/Dead boyama çözeltisinde kuluçka edildi, ardından zaman noktaları arasında karşılaştırılabilirliği sağlamak için tutarlı mikroskop ayarlarında görüntülendi (4X nesnel; 1/30 saniye pozlama, Texas Red ve GFP filtreleri). Yaşamlılık, adacığı segmentasyonu ve floresan ölçümü için scikit-image kullanılarak Python betiği kullanılarak nicel olarak belirlendi. Adabaşlar, yeşil ve kırmızı floresans kanallarının birleştirilmesi, Li eşik yöntemi uygulanarak ikili bir maske oluşturulması ve dokunan adacıqları ayırmak için havza segmentasyonu kullanılarak tanımlandı. Nesneler, enkaz ve eserleri dışlamak için alana göre filtrelendi. Her adacığı için, canlı entegre yoğunluğun (yeşil pikseller) toplam entegre yoğunluğuna (yeşil artı kırmızı pikseller) göre yüzdesi olarak canlılık hesaplandı. Sonuçlar, D1'de %68 ± %9, D3'te %98,2 ± %0,6 ve D7'de %100 olarak gösterilmiştir. %70 etanol ile 10 dakika işlenmiş pozitif kontrol örneği 2,7 ± %7,2 canlılık göstermiştir (bkz. Şekil 5C-F).

Şekil 5: Adacık saflığı, yaşamlılığı ve fonksiyonel yanıt verme değeri. İzole adacığığının zaman içinde temsil görüntüleri ve nicel özetleri. (A) Dithizon (DTZ) ile boyanmış adacıqların 10× parlak alan görüntüsü, kırmızı boyalı endokrin adacıklar ve lekensiz ekzokrin dokuyu gösteriyor. (B) 1., 3. ve 7. Günler için yüksek glikoz/düşük glikoz (HG/LG) uyarım indeksi için glikozla uyarılan insülin salgılanması (GSIS) değerleri. (C-E) 1. Gün (C), 3. Gün (D) ve 7. Gün (E) adacıklarının canlı/ölü floresans görüntüleri. (F) Etanol ile işlenmiş pozitif kontrol adacıqlarının canlı/ölü floresans görüntüsü. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

(A) Medya Yıkama
Bileşen	Son yoğunlaşma	Miktar (mL)
RPMI 1640	-	500 mL
Fetal Sığır Serumu	10%	50 mL
Pen-Strep (10.000 U/mL)	1%	5.5 mL
HEPES	25 mM	1M stokundan 12,5 mL
L-glutamin	2 mM	200 mM stoktan 5 mL
(b) Adacık Kültürü Medyası
Bileşen	Son yoğunlaşma	Miktar (mL veya g)
RPMI 1640, Glikoz yok	-	500 mL
Fetal Sığır Serumu	10%	50 mL
Pen-Strep (10.000 U/mL)	1%	5.5 mL
HEPES	20 mM	1M stoktan 11 mL
Sodyum Piruvat	1 mM	100 mM stoktan 5,5 mL
Glikoz	5.5 mM	200 g/L stoktan 2.75 mL
(C) Penisillin-Streptomisin Durulama Çözeltisi
Bileşen	Son yoğunlaşma	Miktar (mL veya g)
Tuzlu Çözelti %0,9	-	500 mL
Penisilin Streptomisin (10.000 U/mL)	2%	10 mL
(D) Söndürme Tamponu
Bileşen	Son yoğunlaşma	Miktar (mL veya g)
HBSS	-	500 mL
Fetal Sığır Serumu	20%	100 mL
HEPES (1 M)	2.50%	2.5 mL
(E) Krebs Buffer
Bileşen	Son yoğunlaşma	Miktar (mL veya g)
dH2O	-	975 mL
NaCl	115 mM	6.72 g
NaHCO3	24 mM	2.02 g
KCl	5 mM	0.3728 g
HEPES (1 M)	25 mM	25 mL
MgCl2	1 mM	0.0952 g
BSA	0.10%	1 g
CaCl2	2.5 mM	0.2775 g

Tablo 1: Çözüm listesi. Adacığı izolasyon ve arıtma protokolü boyunca kullanılan tüm çözeltiler için bileşim ve hazırlık detayları. Her alt bölüm bileşenleri, nihai konsantrasyonları, hazırlık hacimlerini ve katalog numaralarını listeler. (A) Yıkama Medyası, sindirim ve arınma sırasında doku durulama ve yıkama için kullanılır. (B) İzolasyon sonrası adacığığının bakımı ve yaşamlılığı için kullanılan Adacık Kültürü Medyası. (C) Penisillin-Streptomisin Durulama Çözeltisi, hasat edilen pankreasları sterilize etmek ve durulamak için kullanılır. (D) Enzimatik sindirimi sonlandırmak ve hücre canlılığını korumak için kullanılan Söndürme Tamponu. (E) Krebs Buffer, glikozla uyarlanan insülin salgılanması (GSIS) testlerinde kullanılır.

Pankreas sayısı	Kollagenaz (15,38 mg/mL)	Termolizin (1 mg/mL)	DNAse (100 mg/mL)	Çalışma tamponu	600 mL Beaker'ler kullanılacak	Hacim/Beaker
30	4.5 mL	2.25 mL	450 μL	450 mL	5	25 mL
24	3.6 mL	1.8 mL	360 μL	360 mL	4	25 mL
20	3 mL	1.5 mL	300 μL	300 mL	3	25 mL
16	2.4 mL	1.2 mL	240 μL	240 mL	2	25 mL
12	1.8 mL	0.9 mL	180 μL	180 mL	2	25 mL
10	1.5 mL	0.75 mL	150 μL	150 mL	2	25 mL
Son sonuç.	0.15 mg/mL	5 mg/mL	0.1 mg/mL

Tablo 2: Pankreas miktarına göre sindirim enzimi çözeltisi. Farklı sayıda fare pankreası için Çalışan Dissosiyasyon Ortamı (WDM) hazırlamak için kollagenaz, termolizin ve DNaz I hacimleri gerekti. Her enzimin nihai konsantrasyonları tablonun en altında listelenmiştir.

Pankreas sayısı	50 mL numaralı tüpler	Hacim/şırınga	1.096 şırınga sayısı	1.068 şırınga sayısı
30	10 tüp	50 mL	2	2
24	8 tüp	40 mL	2	2
20	6 tüp	30 mL	2	2
16	4 tüp	40 mL	1	1
12	4 tüp	40 mL	1	1
10	2 tüp	20 mL	1	1

Tablo 3: Pankreas miktarına göre gradyen yükleme. İşlenen pankreas sayısına göre adacığı arıtması için gereken 50 mL konik tüp sayısı ve buna karşılık gelen gradyan hacmleri.

Adacık Çapı Aralığı (μm)	Adacık Parçacık Sayısı (AI)	IEQ Dönüşüm Faktörü	IEQ Aralık Başına
50-100	a	* 0.167	a * 0.167
101-150	b	* 0.648	b * 0.648
151-200	c	* 1.685	c * 1.685
201-250	d	* 3.500	d * 3.500
251-300	e	* 6.315	e * 6.315
301-350	f	* 10.352	f * 10.352
> 350	g	* 15.833	g * 15.833

Tablo 4: Adacığı eşdeğerlik dönüşümü. Adacık çapı aralıklarının standartlaştırılmış adacığı eşdeğerlerine (IEQ) dönüştürülmesi. Tablo, gözlemlenen adacığı çaplı kutuları, aralık başına adacık parçacık sayısını, her boyut aralığı için karşılık gelen IEQ dönüşüm faktörünü ve her aralık başına elde edilen IEQ katkısını listeler.

Tartışma

Bu protokol, Lewis sıçanlarından pankreas adacıqlarını izole etmek ve arındırmak için yüksek verimli bir yaklaşım sunmaktadır. Yöntemin başarısı, adacığının bütünlüğünü ve işlevini birlikte koruyan birkaç kritik adıma bağlıdır. Bunlar arasında pankreasın hassas ve tam intraduktal perfüzyonu, perfüzyonlu pankreasın dikkatli temizlenmesi ve tam enzimatik sindirim süresi yer alır. Pankreasın eşit bir şekilde yayılmasını sağlamak ve kollajenaz-termolizin-DNaz karışımının eşit dağılımı sağlamak için tutarlı tüm organ perfüzyonu çok önemlidir; bu karışım sırasıyla ekstrasellüler matrisi sindirir, enzim penetrasyonunu artırır ve DNA aracılı^{viskoziteyi düşürür 21,22}. Düşük perfüzyon, eksik doku sindirimine ve adacıkların önemli bir kısmının kaybına yol açabilir; çünkü az sindirilmiş doku elek ile süzülür. Benzer şekilde, sindirimden önce yağ veya damar dokusunun yetersiz şekilde alınması, saflığı düşüren endokrin olmayan saflıklara yol açabilir. Son olarak, uzun süren sindirim, aşırı hücre dışı matriks kırılması nedeniyle adacığının ayrımcılığını aradan kaldırırken, optimal olmayan sindirim ise omurilik iğnesi yoluyla mekanik sindirime dirençli sindirilmedik doku oluşturur. Bu adımlar en sık kullanılan teknik tuzakları temsil eder ve eğitim ile optimizasyon sırasında dikkatlice izlenmelidir.

Bu yöntem özellikle Lewis fareleri için tasarlanmış olsa da, muhtemelen sindirim süresi ve enzim^oranı 23,24,25,26 olarak küçük ölçüde yeniden optimize edilerek diğer suşlara veya türlere uyarlanabilir. Bazı laboratuvarlar, Çalışma Dissosiyasyon Ortamında (WDM) kollajenaz, termolisin ve DNaz I oranını, özgün enzim partisi veya doku özelliklerine göre verimi optimize etmek amacıyla ayarlamayı tercih edebilir. Bunu yapmak için laboratuvarlar, üreticinin enzim ve doku optimizasyonu için adım adım rehberini dikkatle takip edebilir ve her durumda 0.1 M EDTA, sistein, merkaptoetanol, proteaz inhibitörleri, serum veya albümin gibi bileşenler eklemekten kaçınabilir; çünkü bunlar kollajenaz, termolisin ve DNaz 1 enzim^{aktivitesini engelleyebilir. 27}. Dissosiyasyondan önce enzim karışımı için kesin çalışma süresi yayımlanmamış olsa da, önceki veriler pankreasların uzun süreli soğuk korunmasının adacığı verimi ve^{fonksiyonu 28'i} olumsuz etkilediğini göstermektedir. Ampirik olarak, protokolümüzde, toplam soğuk iskemi süresi, ilk pankreasın buzun üzerine konması ile 37 °C su banyosuna aktarılması arasındaki aralık olarak tanımlanan toplam soğuk iskemi süresi 1,5 saatin altında tutulduğunda tutarlı şekilde sağlandığını tespit ettik. Bu parametrin daha fazla optimize edilmesi, son kullanıcı uygulamasına bağlı olarak gerekebilir.

Dayanıklılığına rağmen, bu protokolün birkaç pratik ve teknik sınırlaması vardır. İlk olarak, enzim karışımı (kollajenaz, termolizin ve DNaz I) ve yoğunluk gradyanları etkili doku ayrışması ve adacığı izolasyonu için gereklidir, ancak önemli maliyetler gerektirir. Enzim kombinasyonu seçimimiz, pankreas ekstrasellüler matriksinin yapısal özellikleri ve etkili doku ayrışmasını adacığığın bütünlüğünün korunması ile dengeleme ihtiyacından şekillendi. Her enzimatik bileşen kendine özgü bir rol sağlar: kollajenaz, adacıkları serbest bırakmak için fibriller ve bazaz zar kollajenlerini hedef alır; nötr bir proteaz olan termolizin, kollajen olmayan matriks proteinlerini ve hücre-hücre yapışma moleküllerini parçalar ve gerekli kollajenaza maruziyetini azaltır; ve DNase I, lizlenmiş hücrelerden salınan DNA'nın neden olduğu^{viskoziteyi en aza indirir (29,30,31}). Sindirim enzimlerinin daha düşük maliyetli formülasyonları ticari olarak mevcut olsa da, saflıkları değişkendir ve enzimatik performansı^{zayıflatabilir 13,23}. Kolajenazın bakteriyel kültürlerden izole edilmesi nedeniyle, ek saflaştırma adımları endotoksin kontaminasyonunu azaltır ancak maliyeti önemli ölçüde^{artırır 13,23}.

Kolajenaz için, şişe başına yaklaşık 2.000 ila 4.000 Wünsch birimi aktiviteye sahip preparatlar öneriyoruz; bu da orta dozda etkili dissosiyasyonu desteklerken uzun süren sindirimi önler. Özellikle, karışımın yaklaşık 0.3-0.5 arasında kollagenaz II/toplam kollagenaz fraksiyonuna karşılık gelen kollagenaz sınıf I ile sınıf II arasında dengeli bir oranı içermelidir. Bu oran, kollajen dışı ekstraselüler matriksin aşırı bozulmasını sınırlarken güçlü kollajenolitik aktivite sağlar. Ayrıca, kollagenaz karışımı, daha önce belirtilen nedenlerle orta düzeyde nötr proteaz aktivitesi (yaklaşık 150.000-250.000 birim) ve DNaz ile tamamlanmalıdır.

Kalite kontrol açısından, her partide düşük endotoksin yükü (≤50 EU/mg protein), yüksek enzim saflığı (HPLC ile ≥%85) ve doğrulanmış lot-lot aktivite belgeleri içermelidir; çünkü enzim saflığı ve bileşimi üreticiye göre önemli ölçüde değişebilir. Son olarak, lot bileşimindeki değişiklikler sindirim tutarlılığını ve adacığı verimini etkileyebilir ve bu da lota özgü iç doğrulamanın yapılmasını gerektirir. Bu doğrulama, bu protokolde tanımlanan standartlaştırılmış sindirim koşullarını takip ederek ve ardından sindirim verimliliği ile adacık morfolojisi değerlendirilerek sağlanabilir. Enzim performansının eksik olduğu belirtiler arasında eksik doku ayrışması, düzensiz veya pürüzlü kenarlı adacik veya ayrımı sağlamak için aşırı mekanik kayma ihtiyacı bulunur; bu durumda sindirim süresinin titrasyonu gerekebilir.

Benzer hususlar yoğunluk gradyanları için de geçerlidir. Polisukroz bazlı bir gradyan seçtik; iyon olmayan, yüksek hidrofilik bir sukroz-epiklorohidrin kopolimeri, 1.2 g/mL'ye kadar kararlı gradyanlar oluşturuyor ve adacığı izolasyonunda uzun bir^{geçmişe sahip 32,33}. İyodiksanol iyi doğrulanmış bir alternatiftir ve insan adacığında yapılan çalışmalar, iyodiksanol bazlı gradyanların adacığın iyileşmesini iyileştirirken canlılık ve işlevi^{koruyabileceğini göstermektedir} 34,35,36,37. Ancak, kemirgen verileri kesin değildir; bazı çalışmalar iyodiksanol kullanımında daha iyi sonuçlar verirken, diğerleri polisükroz bazlı gradyanlarda daha iyi canlılık ve işlev^{göstermektedir 32,35}. Kritik olarak, laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirliği artırmak için ticari olarak üretilen, kalite kontrollü gradyan çözümlerinin kullanılması önerilir. Polisukroz bazlı gradyanlar, adacığı izolasyonu için optimal yoğunluklarda yaygın olarak bulunurken, iyodiksanol gradyanları genellikle kendi içinde seyreltme ile hazırlanır ve bu da ek değişkenlik sağlar. İkinci bir sınırlama ise, cerrahi hasat için özellikle Oddi Sfinkteri üzerinden intraduktal perfüzyon ve hızlı pankreas eksizyonu için yüksek düzeyde teknik yeterlilik gerektirmesidir. Küçük gecikmeler veya hizalanma bozuklukları bile doku hasarı, sızıntı, düzensiz perfüzyon veya uzun süren sıcak iskemiye yol açabilir; bu da adacık vermesini ve yaşamlılığını zayıflatabilir. Bu sınırlamayı azaltmak için, protokol ayrıntılı prosedürel açıklamalar ve renk kodlu anatomik simgelerle birlikte orijinal grafik yardımcılar içerir; böylece anlaşılmayı kolaylaştırmak gerekir. Yeni operatörlerin tam izolasyon yapmadan önce perfüzyon tekniğine alışmaları teşvik edilir ve canlı hasat denemeden önce leşler üzerinde pratik yapılması tavsiye edilir.

Üçüncüsü, maksimum verimlilik için bu protokol koordineli ekip çalışması gerektirir. Pankreas hasadı ve enzimatik sindirim sırasında genellikle üç eğitimli operatör gereklidir: biri steril cerrahi yapar, biri pankreası steril koşullarda temizler ve biri steril olmayan koşullarda hayvanları dolaştırır ve ötenazi yapar. Sindirimden sonra, yeterlilik sağlandıktan sonra genellikle daha az operatör tarafından aşağı akış arıtma adımları gerçekleştirilebilir. Bu koordinasyon önceden lojistik bir talep oluştursa da, birçok adacığın nispeten kısa bir sürede birden fazla hayvandan izole edilmesini sağlar ve daha az koordine edilmiş iş akışlarına kıyasla genel verimliliği artırır. Bu protokol teknik olarak zorlayıcı ve kaynak yoğun olsa da, bu sınırlamalar tüm adacık izolasyon yöntemlerinde ortaktır. Standartlaştırılmış sindirim koşullarını, yapılandırılmış eğitimi ve koordineli uygulamayı vurgulayarak, bu yüksek verimli yaklaşım, izolasyon başına zaman ve emek miktarını azaltabilir ve eğitimli bir ekip tarafından gerçekleştirildiğinde tutarlı, tekrarlanabilir sonuçlar elde edebilir.

Geleneksel kemirgen adacığı izolasyon protokolleriyle karşılaştırıldığında, bu yöntem verimlilik, tekrarlanabilirlik ve tutarlılık açısından önemli avantajlar sunar. Geleneksel tek organ sindirimleri büyük ölçüde elle toplamaya dayanır ve genellikle değişken^{saflık 13} sağlar. Buna karşılık, protokolümüz birleştirilmiş sindirim ve yoğunluk gradyanı arındırmasını kullanır; bu da hazırlık süresini ve örnek arası değişkenliği önemli ölçüde azaltırken, yüksek adacık canlılığı ve fonksiyonel duyarlılığı korur. İzole edilen adabaşlar morfoloji (ditizone boyama), canlılık (canlı/ölü testi) ve fonksiyon (glikozla uyarlanan insülin salgılanması) açısından kapsamlı şekilde karakterize edildi ve yöntemin sağlamlığını doğruladı. Bu standartlaştırılmış iş akışı, kapsülleme, nakil ve mikrofizyolojik modelleme gibi sonraki uygulamalar için uygun bol, temiz ve işlevsel adacık hazırlıklarının oluşturulmasını sağlar 38,39,40. Önemli olarak, bu teknikle izole edilen Lewis sıçan adacıqları, preklinik modellerde diyabeti tersine çevirmiş olup, bu tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir yaklaşımın translasyonel önemini^{vurgulamaktadır 41}.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
21 G x 2 in. BD PrecisionGlide İğnesi	BD	305129
500 µ m Pirinç Çerçeve ve 304 Paslanmaz Çelik Perde, 3" Çapta x 1" Derinlikte (Elekter numarası 35)	McMaster-Carr	34735K525
Air-Tite Steril Şırıngalar, Luer Kilidi	Fisher Scientific	14-817-178
Biogel PI UltraTouch M	Mö Lnlycke	42665
Bonn Makasları; Straight; Keskin Uçlar; 15 mm bıçak uzunluğu; 3 1/2" Toplam Uzunluk	Roboz	RS-5840
Braintree Scientific GERMINATOR 500 KURU STERIL	Fisher Scientific	NC9956482
Cell-IQ Serisi 5.8 cu.ft. CO2 Laboratuvar Kuluçka Makinesi	PHCBI	MCO-170AICUVHL-PA
Corning 100 mm TC ile işlenmemiş kültür tabağı	Corning	430591
Corning fetal sığır serumu, 500 mL, normal, USDA güvenlik testinden geçti (ısı inaktive edildi)	Corning	35011CV
Corning Adacığı Gradienti 1.069 (yoğunluk 1.069 g/cm3)	Corning	99-815-CIS	Şirketten özel bir talep gerektirir
Corning Adacığı Gradienti 1.096 (yoğunluk 1.096 g/cm3)	Corning	99-691-CIS	Şirketten özel bir talep gerektirir
Corning Adacığı Gradienti 1.108 (yoğunluk 1.108 g/cm3)	Corning	99-692-CIS	Şirketten özel bir talep gerektirir
Covidien Tendersorb Alt Pedleri	Fisher Scientific	22-225-102
DNase I Grade II	Roche	10104159001
Falcon  50 mL Yüksek Berraklıkta Konik Santrifüj Tüpleri	Fisher Scientific	14-432-22
Fisherbrand Alüminyum Folyo, Standart Açıklıklı Rulo	Fisher Scientific	01-213-100
Fisherbrand  Dokumasız Gazlı Süngerler	Fisher Scientific	22-028-559
Fisherbrand Yeniden Kullanılabilir Cam Ağır Hizmet Düşük Form Beakerler	Fisher Scientific	FB101600
Floresans Mirkoskop  BZ-X810	Keyence	BZ-X810
Glikoz Çözeltisi	Gibco	A2494001
Halsey Mikro İğne Tutacağı	Güzel Bilim Araçları	12500-12
HBSS, kalsiyum, magnezyum, fenol kırmızı yok	Gibco	14025092
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Hemostatik Pensler Klasik Crile 5-1/2 inç Uzunluğu	McKesson	1231217
Hudson (Ewald) Pensetleri	Roboz	RS-5238
Hipodermik İğne Monoject 1-1/2 inç Uzunluğu 16 gauge Emniyetsiz Normal Duvar	McKesson	43481
L-Glutamin (200 mM)	Gibco	25030081
Liberase T-Flex, Araştırma Derecesi	Roche	5989132001
CANLI/ÖLÜ Yaşamı/Sitotoksiklik Kiti, memeli hücreleri için	Invitrogen	L3224
MATLAB yazılım paketi	MathWorks	https://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML
NE-4000 İki Kanallı Programlanabilir Şırınga Pompası	ŞırıngaPompa	NE-4000-US
İĞNE, HIPO STR DISP 27GX1/2"(100/BX) EXLINT	McKesson	408877
Nunc Hücre Kültürü/Petri Kasaları	Termo-Bilimsel	174926
Olympus CKX41 Ters Faz Kontrast Mikroskobu	Olympus	CKX41-B
PBS, pH 7.4	Gibco	10010023
Penisilin Streptomisin (10.000 U/mL)	Gibco	15140122
RPMI 1640	Gibco	11875093
RPMI 1640, glikoz yok	Gibco	11879020
Sodyum Piruvat (100 mM)	Gibco	11360070
Sodyum Piruvat (100 mM stok)	Gibco	11360070
Sorval ST 16R	Termo-Bilimsel	75004381
Paslanmaz çelik 304 şırınga iğnesi	Milipore Sigma	Z117013-1EA
CERRAHI PERDE, TEK KULLANILABILIR, 36 IN X 100 YD	Covetrus	10408
Cerrahi Makas - ToughCut	Güzel Bilim Araçları	14054-13
Başparmak Sarma Pensetleri 4.5" Dişli Hassas 1.3 mm Uç Genişliği	Roboz	RS-8120
Thermo Scientific Nunc 200mL Santrifüj Tüpü	Termo-Bilimsel	14-962-17
Thermo Scientific Nunc Santrifüj Şişe Adaptörleri ve Yastıkları	Termo-Bilimsel	12-565-283B
TSDUB15 15L Dubnoff Sallama Su Banyosu	Fisher Scientific	300610298
TX-400 4 x 400 mL Sallanan Kova Rotoru	Termo-Bilimsel	75003181
Tygon S-50-HL	Tygon	AAXoooo3
Ultra Hassas Fare İnsülin ELISA Kiti	Kristal Kimya	90060