Araştırma makalesi

Akış Sitometrisinde Farklı Kapı Stratejileri Kullanılarak Sperm DNA Analiz Sonuçlarının Karşılaştırılması

DOI:

10.3791/70417

⸱

10 Temmuz 2026

 ,  ,  , 
1Department of Reproductive Center, The Affiliated Huai'an No. 1 People's Hospital of Nanjing Medical University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çokgen kapı (PGG) ve haç şekilli kapı (CFG), sperm DNA bütünlüğünü tespit etmek için akış sitometrisi yöntemleridir. PGG, DNA parçalanma indeksini (DFI) ve yüksek DNA boyama indeksini (HDS) ölçür. CFG şiddetli DFI, hafif DFI ve genel olarak DFI rapor ediyor. Bu çalışma, sonuçları ve aralarındaki korelasyonları karşılaştırmayı amaçlamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sperm DNA bütünlüğü, başarılı döllenme, embriyo gelişimi ve devam eden gebeliği sağlamak için kilit bir faktördür. DNA denatürasyonu sonrası akış sitometrisi ve akridin turuncu boyama kullanılarak sperm kromatin yapı değerlendirmesi (SCSA), sperm DNA'sının değerlendirilmesinde altın standart yöntem olarak kabul edilir. Literatürde sperm DNA parçalanma indeksinin (DFI) akış sitometrisine dayalı değerlendirmesi için iki kapı stratejisi bildirilmiştir: poligonal kapı (PGG) ve haç şekilli kapı (CFG). Bu çalışmanın amacı, PGG ve CFG arasındaki test sonuçlarının ilişkilerini karşılaştırmak ve bunların temel sperm analizinin parametreleriyle korelasyonlarını analiz etmekti. İki yöntemle bağımsız olarak elde edilen veriler, Bland-Altman grafikleri ve regresyon analizi dahil olmak üzere istatistiksel analiz kullanılarak karşılaştırıldı. Hastanemizin üreme merkezinde doğurganlık değerlendirmesi uygulanan toplam 121 erkek ayaktan hasta, tamamen rastgele örnekleme yöntemiyle seçildi. Sperm DFI ve ilgili göstergeler, sırasıyla PGG ve CFG kullanılarak akış sitometrisiyle tespit edildi. Sonuçlar, iki yöntemden elde edilen DFI değerlerinin iyi uyum gösterdiğini gösterdi. PGG yönteminden DFIp ile CFG yönteminden DFIm, DFIc ve DFIc arasındaki korelasyon katsayıları sırasıyla 0.6497, 0.9404 ve 0.9667 idi ( Hepsi p < 0.01). Yüksek DNA boyama indeksi (HDS), DFI'larla hafif negatif bir korelasyon gösterdi (r = -0.3042, p < 0.05). Hareketli spermlerin yüzdesi DFIp, DFIs ve DFIc ile negatif korelasyonlıydı (r = -0.3824, -0.3794, -0.3574, hepsi p < 0.05). HDS ile sperm hacmi, sperm konsantrasyonu, toplam sperm sayısı veya PR (%) arasında anlamlı bir korelasyon gözlemlenmedi. Bu bulgular, DFI'ların erkek doğurganlıkla daha yakından ilişkili olduğunu göstermekte, bu parametri sağlayan CFG yönteminin sperm DNA hasarının klinik değerlendirmesi için daha uygun olabileceğini göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sperm DNA bütünlüğü, sperm çekirdeğindeki DNA moleküler yapısının bütünlüğü ve fonksiyonel stabilitesini ifade eder. Özellikle, normal kromatin konformasyonu, kırılma veya oksidatif hasar olmadan sağlam baz dizileri ve genetik bilgiyi yavrulara doğru şekilde aktarma kapasitesiyle karakterize edilir. Spermatogenez sırasında, oksidatif stres1 arttığında, kromatin yeniden şekillendirilmesi anormalolduğunda 2 veya sperm çevreseltoksinlerden etkilendiğinde 3, sperm DNA'sının bütünlüğü zarar görür ve baz uyumsuzluğuna, kayıplara, modifikasyona, DNA ekleme ve çapraz bağlanmaya, tek ve çift iplikli kopuklara yol açar. Ayrıca, hasarlı sperm DNA'sı erkek doğurganlığını olumsuz etkileyebilir ve destekli üreme teknolojisi (ART)4 ile gebelik sonuçlarını olumsuz etkileyebilir, ayrıca tekrarlayan gebelik kaybı riskiniartırır 5. 2021 yılında, Avrupa Üroloji Derneği (EAU), erkek doğurganlık değerlendirme sistemine DFI testinin dahil edilmesiniönerdi 6.

Şu anda sperm DNA'sının bütünlüğü esas olarak sperm DNA parçalanma indeksi (DFI) tespit edilerek değerlendirilmektedir. Akış sitometrisiyle sperm kromatin yapısı testi (SCSA), DFI7'nin değerlendirilmesi için birincil yöntemdir. Literatürde sperm DFI tespiti için iki akış sitometri kapı yöntemi rapor edilmiştir. Bunlardan biri, iki ana göstergeyi (sperm DFI veHDS 8) aynı anda rapor edebilen çokgen kapı yöntemidir (PGG). PGG, daha küçük bir varyasyon katsayısı ve üstün tekrarlanabilirlik ile karakterize edilen klasik bir SCSAyaklaşımıdır 9. Ancak, DNA hasarının şiddetini ayırt edemez. Bir diğer tür ise haç şeklindeki kapı yöntemidir; bu yöntem sperm DNA'sının ciddi hasar belirteci (DFIs), hafif sperm DNA'sı hasar belirteci (DFIm) ve haç şeklindeki kapı yönteminin (DFIc) toplam DFI'sini bildirebilir. DFIc, DFIs ve DFIm'in toplamına eşittir. Sperm DNA bütünlüğünü değerlendirmek için kullanılan mevcut teknolojilerle karşılaştırıldığında, CFG yöntemi sperm DNA'sının hasarının ciddiyetiniyansıtabilir.

Sperm kalitesini değerlendirmek için hangi yöntemin daha uygun olduğunu belirlemek amacıyla, bu çalışma hem PGG yöntemini hem de CFG yöntemini kullanarak spermde DFI ve ilgili parametreleri ölçtü. Bu iki yöntemin sonuçları ile geleneksel sperm analiz parametreleri arasındaki korelasyon karşılaştırıldı. Bildiğimiz kadarıyla, bu çalışma iki metodoloji, PGG ve CFG arasındaki tespit sonuçlarının korelasyonunu analiz eden ilk çalışmadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Nanjing Tıp Üniversitesi Bağlı Huai'an İlk Halk Hastanesi Tıbbi Etik Komitesi tarafından onaylandı (Onay numarası: KY-2024-181-01). Bu çalışmada örnekleri kullanılan hastalardan bilgilendirilmiş onay alındı. Şekil 1'de sunulan iş akışının genel şematik diyagramı. Kullanılan reaktifler ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosu'nda özetlenmiştir.

Akış sitometresi için CFG ayarları
Asit tedavisinden sonra, hasarlı DNA'ya sahip spermin nükleer kromatini tek zincirli DNA gösterirken, zarar görmemiş DNA'ya sahip spermin nükleer kromatini sağlam çift zincirli yapısını korur. Floresan boya akridin turuncu (AO), tek zincirli DNA'ya bağlanır ve 488 nm lazer ile uyarıldığında kırmızı floresans yayar. Çift zincirli DNA'ya bağlandığında, 488 nm lazer tarafından uyarıldığında yeşil floresans yayar. Akış sitometresi tarafından yakalanan kırmızı ve yeşil floresan sinyal sayısına dayanarak, kırmızı floresansın kırmızı ve yeşil floresansın toplamına oranı hesaplanır; bu oran sperm DFI'sini temsil eder.

CFG ayarları, Yang ve ark.10 tarafından sağlanan genel bakış doğrultusunda uygulanmıştır. Akış sitometresi, sınır referansları olarak AO boyalı normal spermde ölçülen en düşük yeşil floresans ve en yüksek kırmızı floresans kullanılarak yapılandırılmalıdır (Şekil 2). Aşağıda, CFG'deki her bir dörtgenin hücresel özelliklerinin bir listesi bulunmaktadır:
Quadrant Q1 normal spermin göstergesidir. Sperm DNA'sının sağlam olduğu ve AO'nun bağlanma miktarının minimal olduğu gözlemlendi; bu da yeşil floresans oluşmasına yol açtı.
Q2 kvadrantındaki spermler, kısmen parçalanmış DNA'ya sahiptir ve floresan mikroskopisi altında turuncu görünür. Bu tür DNA onarılabilir olabilir, bu spermler hafif DNA parçalanmasına (DFIm)10 sahip olarak sınıflandırılır.
Quadrant Q3, çıkarılmış spesifik olmayan floresans olarak tanımlanır.
Q4 kuadrantındaki spermler, floresan mikroskopisinde parçalanmış DNA'ya sahiptir ve kırmızı görünür; bu da şiddetli DNA parçalanmasını (DFI) gösterir.

Q2 ve Q4 kuurtlardaki spermlerin her ikisinin de parçalanmış DNA içerdiği ve toplamlarının DFIc olarak tanımlandığı öne sürülmektedir.

PGG'nin akış sitometresi için ayarları
Akış sitometrik analizi için çokgen kapı, Evenson ve ark.8 tarafından tanımlanan yöntemle belirlenmiştir. Şekil 3'te gösterildiği gibi, her kapıya ait hücresel özellikler şunlardır:
P3, DNA'nın denatüre olduğu hücrelerin yüzdesini gösterir.
P4, yüksek DNA boyalanabilirliğine (HDS) sahip spermi temsil eder. Bu sperm grubu, normal histon-protamin değişiminden yoksundur.
P3 ve P4 kapılarının dışındaki baskın hücre popülasyonları, azalmış kırmızı floresans gösteren ve ağırlıklı olarak yeşil floresans yayan normal spermatozoidlerden oluşur.

Meni örneği toplama ve analiz
Tüm 121 sperm örneği, Nanjing Tıp Üniversitesi'ne bağlı Huai'an Birinci Hastanesi Üreme Merkezi'ni ziyaret eden erkeklerden alındı. Sperm örnekleri, 2-7 günlük abstinensi sonrası mastürbasyon yoluyla alındı. Rutin sperm analizi, WHO İnsan Sperminin İndenmesi ve İşleme Laboratuvar El Kitabı11,12'nin gereksinimlerine uygun olarak sıkı bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Sperm konsantrasyonu ve hareketlilik analizleri, bilgisayar destekli sperm analiz sistemi (CASA) kullanılarak gerçekleştirildi. Her örnek iki kez analiz edildi. Sonuçlar yalnızca iki sonuç arasındaki fark %95 güven aralığı içinde olduğunda ortalama olarak bildirildi; aksi takdirde, yeniden örnekleme ve analiz yapıldı.

DFI analizi
Akış sitometri kitinden reaktif A içindeki spermin nihai konsantrasyonunu 2–3 x 106/mL olarak hesaplamak için menin gerekli örnek hacmini hesaplayın. Hesaplama yöntemi: Orijinal sperm örneğindeki sperm konsantrasyonu M x 106/mL olarak varsayıldığında, gerekli sperm hacmi (μL) = 150/M. Hesaplanan sperm hacmini akış sitometre tüpüne ekleyin, ardından 50 μL reaktif A ekleyin ve nazikçe karıştırın. 100 μL reaktif B ekleyin, nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 30 saniye kuluçka yapın. Hemen 300 μL reaktif C ekleyin ve nazikçe karıştırın. Akış sitometresinde CFG ve PGG kullanarak örneği tespit edin ve en az 5000 spermatozoidi analiz edin.

İstatistiksel analiz
Veriler, GraphPad Prism 6.0 kullanılarak istatistiksel analizlere tabi tutuldu. Bland-Altman parsları, PGG ve CFG arasındaki uyum seviyesini ortalama ve farklar hesaplayarak değerlendirmek için inşa edilmiştir. İki yöntem arasındaki farklar ortalama değerleriyle karşılaştırıldı. Ayrıca, PGG ile CFG arasındaki korelasyonu analiz etmek için Pearson yöntemi kullanıldı. 0,05'in altında olan p-değerinin istatistiksel olarak anlamlı olduğu belirlendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

121 çalışma katılımcısı arasında (ortalama yaş: 32,5 ± 4,9 yıl; aralık: 26–44 yaş) 28'ine astenozoospermi ve 4'üne oligozoospermi teşhisi kondu. Temel demografik özellikler ve meni analizi parametreleri Tablo 1'de özetlenmiştir.

Şekil 4'te gösterildiği gibi, Bland-Altman grafiki, PGG ve CFG yöntemleriyle elde edilen sperm DFI sonuçlarının mükemmel tutarlılık gösterdiğini ortaya koydu (r = 0.9667, p = 0.0000). Sade...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

WHO İnsan Sperminin İncelenmesi ve İşleme Laboratuvar ElKitabı'nın 6. baskısı, sperm DNA bütünlüğünün değerlendirilmesi için dört yöntem önermektedir: terminal deoksinükleotidil transferaz (dUTP) nik uç etiketleme (TUNEL), tek hücreli jel elektroforezi (Comet) testleri, SCSA ve sperm kromatin dağılımı (SCD) testi. Bunlar arasında, SCSA, analiz için akış sitometrisi kullanımı nedeniyle androoloji laboratuvarlarında yaygın olarak benimsenmiştir; bu yöntem yüksek ver...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Computer destekli sperm analiz sistemiBeijing Suijia Software Co., LtdSA-II 
Akış sitometrisiShenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., LtdCyto E6
Akış sitometri kitiShenzhen BRED Biotechnology Co., LTD
Makler sayım odasıSefi Medical Instruments
Sperm çekirdeği DNA bütünlük KitiShenzhen BRED Biotechnology Co., LTD-

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vaughan, D. A., Tirado, E., Garcia, D., Datta, V., Sakkas, D. DNA fragmentation of sperm: a radical examination of the contribution of oxidative stress and age in 16 945 semen samples. Hum Reprod. 35 (10), 2188-2196 (2020).
  2. Štiavnická, M., et al. H3K4me2 accompanies chromatin immaturity in human spermatozoa: an epigenetic marker for sperm quality assessment. Syst Biol Reprod Med. 66 (1), 3-11 (2020).
  3. Jeng, H. A., et al. Mixture analysis on associations between semen quality and sperm DNA integrity and occupational exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. Arch Environ Occup H. 78 (1), 14-27 (2023).
  4. Li, F., Duan, X., Li, M., Ma, X. Sperm DNA fragmentation index affect pregnancy outcomes and offspring safety in assisted reproductive technology. Sci Rep. 14 (1), 356(2024).
  5. Zhu, X. B., et al. Sperm DNA fragmentation in Chinese couples with unexplained recurrent pregnancy loss. Asian J Androl. 22 (3), 296-301 (2020).
  6. Minhas, S., et al. European Association of Urology Guidelines on Male Sexual and Reproductive Health: 2021 Update on Male Infertility. Eur Urol. 80 (5), 603-620 (2021).
  7. Agarwal, A., et al. Technical Aspects and Clinical Limitations of Sperm DNA Fragmentation Testing in Male Infertility: A Global Survey, Current Guidelines, and Expert Recommendations. World J Mens Health. 42 (1), 202-215 (2023).
  8. Evenson, D., Jost, L. Sperm chromatin structure assay is useful for fertility assessment. Meth Cell Sci. 22 (2-3), 169-189 (2000).
  9. B, V. L., et al. Sperm chromatin structure assay versus sperm chromatin dispersion kits: Technical repeatability and choice of assisted reproductive technology procedure. Clin Exp Reprod Med. 47 (4), 277-283 (2020).
  10. Yang, F., et al. Establishment and evaluation of a flow cytometry technique reflecting the severity of human sperm DNA damage. Zhonghua Nan Ke Xue. 26 (11), 989-995 (2020).
  11. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. , 5th ed., World Health Organization. Geneva. (2010).
  12. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. , 6th ed., World Health Organization. Geneva. (2021).
  13. Evenson, D. P. The Sperm Chromatin Structure Assay(SCSA) and other sperm DNA fragmentation tests for evaluation of sperm nuclear DNA integrity as related to fertility. Anim Reprod Sci. 169 (6), 56-75 (2016).
  14. Lin, M. H., et al. Sperm chromatin structure assay parameters are not related to fertilization rates, embryo quality, and pregnancy rates in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection, but might be related to spontaneous abortion rates. Fertil Steril. 90 (2), 352-359 (2007).
  15. Virro, M. R., Larson-Cook, K. L., Evenson, D. P. Sperm chromatin structure assay (SCSA) parameters are related to fertilization, blastocyst development, and ongoing pregnancy in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertil Steril. 81 (5), 1289-1295 (2004).
  16. Mohammadi, Z., Tavalaee, M., Gharagozloo, P., Drevet, J. R., Nasr-Esfahani, M. H. Could high DNA stainability (HDS) be a valuable indicator of sperm nuclear integrity. Basic Clin Androl. 30, 12(2020).
  17. Shen, L., et al. High sperm DNA stainability might not be an accurate predictive indicator of male fertility and assisted reproductive technology outcomes. Front Endocrinol (Lausanne). 16, 1510114(2025).
  18. Lu, J. C. High DNA stainability (HDS) should not be recommended as a marker for the detection of sperm DNA damage. Andrologia. 54 (7), e14442(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

T pSay 233Say 233Bu Ay JoVE deSay

İlgili makaleler