Ex Vivo Fare Gözlerinde Dışkı Tesisi ve Göz Uyumluluğunun Ölçülmesi Bir Şırınga-Pompa Sistemi Kullanılarak

Özet

Fare gözlerinde çıkış tesisi ve göz uyumluluğunu değerlendirmek için yerleşik basınç kontrollü perfüzyon yöntemlerinden analitik yaklaşımların entegre edilmesi, basit, düşük maliyetli bir şırınga-pompa sistemini optimize etmiştir.

Özet

Göz içi basıncın (IOP) uygun ve stabil düzeyde tutulması göz sağlığı için gereklidir. Trabeküler ağ (TM), Schlemm kanalı (SC) ve tüm korneoskleral kabuğun biyomekanik özellikleri, IOP homeostazında kritik rol oynar. Çıkış tesisi (C), TM ve SC'nin sulu humoru boşaltma etkinliğini değerlendirmek için önemli bir parametredir; göz uyumu (φ) ise korneoskleral kabuğun elastikiyetini ve TM ile SC üzerinden geçici dış akışı yansıtır. Daha önce, C'yi değerlendirmek için basit ve maliyet etkin bir şırınga pompası sistemi geliştirilmiştir. Ancak, in vivo veri analizi için basit doğrusal regresyon kullanmak, TM ve SC fonksiyonunu karakterize etmede sınırlamalara sahiptir. Bu çalışmada, yerleşik basınç kontrollü göz perfüzyon sistemleri için geliştirilen analitik yaklaşımlar uygulanarak şırınga-pompa sistemi, optimize edilmiştir. Ex vivo gözlerde ölçülen C ve φ değerleri, daha önce yayımlanmış perfüzyon sistemi değerleriyle karşılaştırıldı ve bildirilen aralıklarla tutarlıydı. Özetle, bu basit ve düşük maliyetli şırınga pompası sistemi, TM ve SC'nin biyomekanik özelliklerinin değerlendirilmesini kolaylaştırır.

Giriş

Göz sağlığı için uygun ve stabil bir göz içi basınç (IOP) seviyesinin korunması^{gereklidir 1}. Glokom ^2,3 için birincil risk faktörü IOP'ta sürekli yükselmedir. Aylar veya yıllar süren uzun vadeli IOP dalgalanmaları da görme^{kaybına katkıda bulunur 4,5}. Son çalışmalar, günlük aktivitelerden kaynaklanan geçici dalgalanmalar olan başka bir INOP dalgalanması biçimini tespit etmiştir; bu dalgalanmalar da glokom ilerlemesini^{hızlandırabilir 6,7}. Örneğin, 20 yıllık göz kapağı ovuşturma geçmişine sahip 46 yaşında bir erkek ve 10 yıl boyunca gözlerini ovuşturan 52 yaşındaki bir erkek her ikisinde de hızlanmış optik disk hasarı ^8,9 gösterdi. Bu bulgular, ÖÖ değişikliklerine zamanında ve uygun yanıtların görsel kayıp riskini en aza indirmek için önemini vurgulamaktadır.

IOP, sulu humor (AH) üretimi ile drenaj arasındaki^{dengeyle düzenlenir 10}. AH gözden öncelikle geleneksel ve uveoskleral^{yollar 11} üzerinden çıkar. Hem normal hem de glokomatoz gözlerde, trabeküler ağ (TM) ve Schlemm kanalını (SC) içeren geleneksel yol, IOP homeostazını etkileyen çıkış direncinin^{başlıca kaynağıdır 12,13,14}. Bu nedenle, TM ve SC'nin biyomekanik özellikleri, gözün IOP^{15,16,17'deki} değişikliklere uyum sağlaması için gereklidir.

Son teknolojik gelişmeler, AH çıkışının daha doğru değerlendirilmesini kolaylaştırmıştır. Yerçekimi tabanlı perfüzyon ve şırınga-pompa sistemi gibi istilacı yaklaşımlar, TM ve SC'nin sabit durum çıkış^{akışını nasıl düzenlediğini gösteren çıkış tesisini (C) hesaplamak için geliştirilmiştir;} bu durum 18,19,20,21,22,23,24. Tonografi²⁵ ve florofotometri²⁶ gibi invaziv olmayan yöntemler, glokomlu hastalarda C değerini belirlemek için klinik olarak kullanılmıştır. Ancak, çoğu yaklaşım TM ve SC fonksiyonunu özel olarak değerlendiremez. Örneğin, şırınga-pompa sisteminde, sabit durum akış hızı ve basınç verileri basit doğrusal regresyon kullanılarak uyarlanır ve eğim basınca bağlı C olarak yorumlanır. Ancak, canlı farelerde hesaplanan bu C değeri, Goldmann denkleminde tanımlandığı gibi AH salgılanması, uveoskleral çıkış ve episkleral venöz basınçtan etkilendiği için geleneksel yol üzerinden AH çıkış kapasitesini doğru şekilde yansıtamaz.

Bu sınırlamayı gidermek için, Millar ve ark. aynı fare gözünde AH girişi, geleneksel çıkış ve uveoskleral çıkışı çoklu sabit akış ölçümleriyle hesapladı; bu ölçümler AH girişinin olmaması, episkleral venöz basıncın olmaması ve ötenaziden sonra uveoskleral çıkışın değişmediği^{varsayımına dayanarak hesapladı 22}. 2016 yılında Sherwood ve ark. uveoskleral çıkışın in ex vivo gözlerin 0 mmHg'de 0 olduğunu bildirmiş ve aynı soruya iPerfusion (bundan sonra perfüzyon sistemi olarak adlandırılacak basınç kontrollü perfüzyon ^{sistemi) kullanılarak} bir güç yasası modeli tanıtmıştır. Metodolojik gelişmeler, TM ve SC'nin belirgin rollerini netleştirerek, sabit durumlu AH çıkışını sürdürmedeki fizyolojik işlevlerinin anlaşılmasını artırmıştır.

Ayrıca, TM ve SC'nin ÇBK dalgalanmalarına geçici yanıtı, IOP homeostazını sürdürmek için gereklidir. Bu hareketi takip etmek için Xin ve arkadaşları,²⁸ saniyelik bir zaman ölçeğinde gözlem yapılmasını sağlayan faz duyarlı optik koherens tomografisi (OCT) geliştirmiştir. Üç boyutlu seri blok yüzü taramalı elektron mikroskobi, bu hareketi ultrastruktural²⁹ seviyede inceleyebilir. Ancak, görüntü tabanlı yöntemler yalnızca TM ve SC'nin biyomekanik özelliklerini tahmin eder ve geçici AH drenajının gerçek değerlerini vermez. 2019 yılında, iPerfüzyon geliştirildikten sonra, Sherwood ve ark. hem korneoskleral elastikiyetin hem de TM ile SC^30'un geçici yanıtının anahtar göstergesi olarak göz uyumluluğunu (φ) hesapladı. Bu ilerleme, TM ve SC'nin IOP dalgalanmalarına yanıt olarak geçici davranışlarını değerlendirmek için nicel bir parametre sağlar.

TM ve SC fonksiyonunun değerlendirilmesindeki bu ilerlemelere dayanarak, bu çalışma C hesaplaması için güç yasası modelini entegre ederek ve φ hesaplamak için yeni metodolojiler entegre ederek şırınga-pompa sistemini geliştirdi. Bu ölçümler, optimize edilmiş şırınga-pompa sisteminin ex vivo fare gözlerinde dış akış tesisi ve göz uyumluluğunu değerlendirmek için uygun olup olmadığını değerlendirmek için perfüzyon sistemi kullanılarak elde edilen yayımlanmış verilerle karşılaştırıldı.

Protokol

Tüm deneyler, Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için ARVO Bildirisi ve Qingdao Üniversitesi Tıp Merkezi'nin laboratuvar hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine (QDU-AEC-2022069) uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Hayvan seçimi ve yönetimi

1. %50 C57BL/6 ve %50 BALB/c genetik geçmişine sahip 5 aylık fareler kullanın. Deneysel tasarımda cinselliği dikkate almayın.
2. Fareleri 23 ± 2 °C sıcaklıkta 12 saat/12 saat ışık-karanlık döngüsünde ve nemin %50 ± 5 arasında tutun.

2. IOP ölçümü

1. Fareleri, %2,5 izofluran ve %80 (vol/hacim) oksijen ile kapalı bir odada 3,5 dakika boyunca anestezi yapın.
   DIKKAT: İzofluran uçucu bir anesteziktir. Anestezi iyi havalandırılan bir alanda veya uygun bir muhafaza sisteminde uygulanır.
2. Fareleri bir çalışma platformuna aktarın. Maske kullanarak anesteziyi 30 saniye daha sürdür.
3. Tüm ölçümleri 9:00 ile 12:00 arasında yapın. Her göz için üç ölçüm kaydedin. Her veri noktası için ortalama değeri hesaplayın.

3. Sistem kurulumu (Şekil 1)

1. 100 μL bir şırıngayı bir şırınga pompasına bağlayın.
2. Şırıngayı akış basınç sensörüne bağlayın.
3. Sensörü bir veri toplama sistemine bağlayın.
   NOT: Basınç sensörünün ve göz tutucusunun aynı yükseklikte hizalandığından emin olun, böylece basınç artefaktları önlenebilir.
4. Sistemi 1× fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) doldurun. Tüm hava kabarcıklarını çıkarın.
5. Gözü, dairesel girintiye sahip bir tutucuya yerleştirin (çapı 4–6 mm). Kanülasyon sırasında gözün stabil olduğundan emin olun. Basınç sensörünü ve göz tutucusunu aynı yüksekliğe konumlandırın.
   NOT: Hizalanma yanlış yapı basınç ölçüm hatalarına yol açabilir. Özelleştirilmiş göz tutucu için STL tasarım dosyası Ek Dosya 1 olarak sağlanır.

4. Yazılım çalışması

1. Basınç sensörünün kalibrasyonu
   1. Veri toplama yazılımını açın. Kalibrasyon kurulum dosyasını yükleyin. Kalibrasyon fonksiyonunu seçin.
   2. Sistemi iki tanımlanmış yükseklikte bir su rezervuarına bağlayın.
   3. Dönüşüm kullanılarak ölçülen giriş ve gerçek basınçlar:
      1 cm H₂O = 0.735 mmHg
2. Pompa kurulumu
   1. Modül ayarlarını açın. Regülatör yapılandırma dosyasını yükleyin.
   2. Pompa cihazını seçin. Maksimum akış hızını ve şırınga çapını girin.
3. Veri kaydı
   1. Kayda başlayın.
   2. Her baskı adımından sonra kaydı durdurun.
   3. Bir sonraki basınç değerini girin.
   4. Kaydı yeniden başlat.

5. İğne hazırlığı

1. Bir cam mikropipeti yerleşik protokole göre^{çek 8}.
2. Ucu iç çapı 80–100 μm olacak şekilde öğütülür. İğne ucunu parlat.
   DIKKAT: Cam iğneleri yaralanmamak için dikkatle kullanın.
3. İğneyi bir mikromanipülatöre takın. İğneyi basınç dönüştürücüsüne bağlayın.
4. İyneyi PBS ile doldur.
5. İğne ucunu basınç sensörüyle aynı yüksekliğe yerleştirin.
6. Direnç ölçümü
   1. 1 mmHg basınç uygulayın. Akış hızını kaydet.
   2. İğne direncini hesaplayın:
      
   3. 0.01 ile 0.5 mmHg/(μL/min) arasında dirençli iğneler kullanın.

6. Sistem tesisi ve uyum

1. Tesis ölçümü
   1. Sistemi PBS ile perfüze edin. Sistemi üç yönlü bir valf ile mühürleyin.
   2. 6, 8, 10, 12, 14 ve 16 mmHg basınç adımları uygulayın.
   3. Her adımda 10 dakika boyunca P ve Q kaydı yapın. Son 5 dakikanın ortalama değerlerini hesaplayın.
   4. Doğrusal regresyon yapın. Eğimi bir sistem tesisi olarak yorumlayın.
2. Doğrulama
   1. Ölçümleri 3 kez tekrarlayın.
   2. Sistem özelliğinin 0.2 nL/min/mmHg'den az olduğunu doğrulayın.
3. Uyum ölçümü
   1. Sisteme 35 cm silikon bir tüp ekleyin.
   2. Teflon boru ile ve olmadan uyumluluğu ölç.
   3. Hacim değişimini ayrık hacimli^{yöntemle hesaplayın 14}.
   4. Sistem uyumluluğunu 4 nL/mmHg olarak belirleyin.
4. Hassasiyet kontrolü
   1. Tespit edilebilir sistem uyumunun 9.9 nL/mmHg'den yüksek olduğunu doğrulayın.

7. Enukleasyon

1. Fareleri_CO2 kullanarak 0.7 L/min akış hızında 3 dakika boyunca ötenazi yapın.
   DIKKAT:_CO2 ötenazisi, insancıl son noktaları sağlamak için kurumsal yönergelere uymalıdır.
2. Göz dışı kasları ve optik sinirleri steril aletlerle disseksiye. Gözleri enülle.
3. Hemen bir gözünü tutucuya 35,5 °C'de takın.
4. Kontralateral gözü 4 °C'de tutun.
5. Her iki gözü aynı sistemle ölç.

8. Kanülasyon

1. İğne yerleştirme
   1. İğneyi merkezi korneadan 45° açı ile geçirin.
   2. İğneyi ön odaya 0,3–0,5 mm derinliğe kadar ilerlet.
2. Doğrulama
   1. Sistemi stabilize edin. Son 5 dakikada basınç dalgalanmasının 0.4 mmHg ≤ doğrulan.

9. Göz _Krizi

1. Gözü 30 dakika boyunca 8 mmHg'de stabilize edin.
2. 6, 8, 10, 12, 14 ve 16 mmHg basınç adımları uygulayın.
3. 8 mmHg'de son adımı uygula.
4. Veri toplama
   1. Maksimum akış hızını 4 μL/dakika olarak ayarlayın.
   2. Her adımda 10 dakika boyunca P ve Q kaydı yapın.
5. Analiz
   1. P–T ve Q–T eğrilerini çizin. Son 5 dakikanın ortalama değerlerini hesaplayın.
   2. Veriyi güç yasası^{modeli 27'ye} uydurun:
      
6. C_r'yi (sistem tesili çıkarıldıktan sonra) okul çıkış tesisi olarak tanımlayın.
7. P_r = 8 mmHg seti var.
8. β doğrusal olmayan katsayı olarak tanımlayın.

10. Okulyar Φ_r

1. Basınç artışları sırasında P–T ve Q–T eğrilerini analiz edin. Q_max'a kadar akış artışını ve ardından yavaşlamayı tespit edin.
2. T_p ile t_max arasındaki hacim değişimini ayrık hacim^{yöntemi 30} ile hesaplayın.
3. Verileri değiştirilmiş Friedenwald^{denklemi 30'a} uydurun:
   
4. P_r = 13 mmHg ayarı. Φ_r (sistem uyumu çıkarıldığında) göz uyumu Φ_r, _göz ve γ madde parametresi olarak tanımlayın.

Sonuçlar

Optimize edilmiş şırınga-pompa sisteminin performansı, 5 aylık farelerde C ve φ ile daha önce basınçlı kontrollü göz perfüzyon çalışmalarından yayımlanmış değerlerle karşılaştırılarak değerlendirildi. Şekil 2F'deki veri setlerinin normalliği Shapiro–Wilk testi kullanılarak değerlendirildi ve istatistiksel karşılaştırmalar iki kuyruklu çiftli Öğrenci t-testi kullanılarak yapıldı.

Şekil 2A–C'de<...

Tartışma

Bu çalışma, fare gözlerinde çıkış tesisini ve göz uyumluluğunu tahmin etmek için optimize edilmiş bir şırınga-pompa sistemi sunmakta olup, basınç kontrollü göz perfüzyon sistemleri kullanılarak bildirilen değerlerle tutarlı değerler elde etmektedir. Mevcut yaklaşım, şırınga tabanlı ölçümlerin doğruluğunu artırırken basit ve erişilebilir bir deneysel düzen sürdürmektedir. Metodolojik iyileştirme ve erişilebilirliğin bu birleşimi, daha gelişmiş sistemlerin kolayca bulunmadığı laboratuvarla...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif	1&Times; PBS Buffer	Thermo Fisher Scientific	10010023
İzofluran	Shenzhen Rewoode Yaşam Bilimleri Şirketi, Ltd., Çin	R640
Materyal	100 μ L Yüksek Hassasiyetli Şırınga	Hamilton	1710
Borosilikat cam	Sutter, Novato, CA	BF100-50-10
Tek kullanımlık steril şırınga	Fenglin Medical Devices Co., Ltd. Jiangxi, Çin	10 ml
Basınç Sensörü	IcuMedical	PX26-015G
Silikon tüp	Runze Fluid Co., Ltd, Nanjing, Çin	Yok
Şeffaf PTFE tüpü	Runze Fluid Co., Ltd, Nanjing, Çin	Yok
Ekipman	Alevli/Kahverengi pipet çekici	Sutter, Novato, CA	P-97
Manuel Mikromanipülatör	Dünya Hassas Aletleri (WPI)	M3301
Metal banyo	Beaver Biyolojisi, Suzhou, Çin	2016C
MicroForge	Narishige Bilimsel Enstrümanlar Laboratuvarı, Tokyo, Japonya	MF830
Mikropipet Öğütücüsü	MPInstrument Co., Ltd., Wuhan, Çin	KDG-02
PZMIII Stereo Zoom Dürbün Mikroskobu	Dünya Hassas Aletleri (WPI)	PZMIII
Şırınga-Pompası	Dünya Hassas Aletleri (WPI)	AL-1000