Yöntem makalesi

Drosophila melanogaster'den Göz-Antenli ve Kanat Hayali Disklerinin Küçük Ölçekli Diseksiyonu ve Antikor Boyama

143 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70434

⸱

15 Mayıs 2026

 , 
1Department of Developmental and Cell Biology, Charlie Dunlop School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Irvine

Bu makalede

Özet

Bu makale, reaktiflerle ekonomik olan ve az sayıda hayali disklerin işlenmesini kolaylaştıran verimli bir imaginal disk diseksiyon ve antikor boyama protokolünü tanımlar.

Özet

Drosophila hayali diskleri uzun süredir epitel gelişimi, desenlenme ve yenilenme modelleri olarak incelenmiştir. Diseksiye edilen imaginal disklerin antikor etiketlenmesi ve görüntülemesi, protein ekspresyon desenlerinin gelişimsel ve fizyolojik süreçlerin belirteçleri olarak görselleştirilmesi için önemlidir. Bu hayali disk diseksiyon ve etiketleme yöntemi, Tomlinson ve Ready tarafından göz-antenal imaginal disklerin immün-elektron mikroskopisi için geliştirilmiştir. 60 mikrokuyu plakalar kullanılarak ve çözümler yerine çözümler arasında doku aktararak, doku örneklerine bireysel dikkat çok az israf ile mümkündür. Tek hayali diskler bile işlenebiliyor. Bu yöntem yalnızca küçük miktarda antikor ve diğer reaktifler gerektirir. Yöntemin diğer küçük dokulara uygulanmasına bir örnek olarak, makale aynı yöntemle kanat imaginal disklerinin nasıl parçalanıp etiketlenebileceğini de göstermektedir. Benzer bir yaklaşım, benzer boyutlara sahip herhangi bir küçük dokuya ve antikor boyama dışında diğer histokimyasal ve etiketleme işlemlerine uygulanabilir.

Giriş

Drosophila imaginal diskleri, embriyogenez sırasında ayrılan ve larva içinde farklılaşmadan büyüyen ve pupalevre 1 sırasında yetişkin epidermal yapılara katkıda bulunan öncül dokulardır. Çalışmaları, gelişimsel desenleme mekanizmaları hakkında birçok içgörü sağlamıştır; göz ve kanat hayali diskleri özellikle iyiincelenmiştir 2,3,4,5,6. İmmünohistokimya, imaginal disklerdeki gen ekspresyonunun mekânsal ve zamansal kalıplarını incelemek ve hücre bölünmesi ve hücre ölümü gibi hücre davranışlarını karakterize etmek için özellikle faydalıdır.

Antikor etiketli göz imaginal disklerinin elektron mikroskobik analizinin ek gereksinimlerini kolaylaştırmak için, Tomlinson ve Ready, özellikle reaktiflerle ekonomik olan ve çok yüksek güvenilirlik ve özelleştirme derecesi sağlayan küçük ölçekli bir protokolgeliştirmiştir 7. Yöntemleri basılı olarak açıklanmıştır, ancak video mevcutdeğildir 3,8,9. Bu yöntem, diğer imaginal disklerin (veya diğer dokuların) etiketlenmesi için kolayca değiştirilebilir ve göz-antenli imaginal disklerin yanı sıra kanat imaginal disklerine de uygulanabilir.

Drosophila imaginal disklerinin antikor etiketlemesi, herhangi bir doku10 için uygulanabilir genel taslağı takip eder (Şekil 1). Doku, ilgi gören proteinlere özgü antikorlarla kuluçka olmadan önce diseksiyon edilip sabitlenmelidir. Bağlanmamış antikor yıkandıktan sonra, etiketlenmiş (genellikle floresan) ikincil bir antikor eklenir; bu antikor birincil antikora bağlanır ve birincil antikor ise sabit dokudaki ilgilenilen proteine bağlanır. Bağlanmamış ikincil antikoru çıkarmak için yıkamadan sonra, doku mikroskobik inceleme için monte edilebilir ve ilgilenilen proteinler görselleştirilebilir. Bu sürecin birçok genel tanımı mevcuttur ve hayal diskler ile diğer Drosophila dokularınauygulanabilir. Burada, doku örneklerinin mikro kuyu plakasındaki küçük kuluçka kuyuları arasında bireysel olarak aktarıldığı ve her adımda stereo mikroskopla gözlemlendiği Tomlinson & Ready yöntemi için bir protokol sağlanmıştır (Şekil 2). Bu yaklaşım, aynı anda daha az sayıda dokuyu (onlarca örnek) boyamak için en iyi şekilde çalışır ve büyük partiler (yani yüzlerce) için ideal değildir. Bu yaklaşım, her kuyrukta sadece 13 μL'lik küçük çözelti hacimleri gerektirir ve bu nedenle çok az antikorla gerçekleştirilebilir. Minimum doku kaybı olduğu için minimum örnek boyutu yoktur ve tek hayal diskler bile güvenilir şekilde işlenebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Transfer aracının yapılması

  1. Kısma kullanarak ~2.5cm çapında 0.005" çapında tungsten tel kesin. Forseps kullanarak telin bir ucunu bir kanca veya halka şeklinde şekillendirin (Şekil 3). Diğer ucu bir iğne tutucuya yerleştirin. Bu, disklerin çok az veya hiç sıvı transferi olmadan transferi için kullanılacaktır. Halka kullanımı ikisinden daha kolay olabilir, ancak kanca çözelti aralarında daha az sıvı aktarır.

2. Göz antenli hayali disklerin disseksiyonu ve sabitlenmesi

  1. Larvaları ~7.5 mL 0.1 M sodyum fosfat tamponu (pH7.2) ile bir Petri kabında (60 mm çapı) durulayarak sinek ortamı veya diğer kalıntıları temizleyin. Kanat imaginal disklerinin diseksiyonu için göz antenli diskleri yerine 6. adıma bakınız. Bu iki hayali disk vücudun ön kısmında yer alır (Şekil 4).
    NOT: PBS, 2.1–2.3. adımlarda fosfat tamponu yerine de kullanılabilir.
  2. Larvaları taze tampon içeren bir Petri Kabına aktarın.
    NOT: Bazı işçiler bireysel larvaları 60 mm Petri kabında tek tampon damlalarında disseksiye etmeyi tercih eder; Bazıları depresyon iyi slaytları kullanır.
  3. Diseksiya mikroskobu altında gözlemlerken, larvaları forseps ile vücudun ~%50'si boyunca tutun. Ağız kancalarını tutmak için ikinci bir ince forseps çifti kullanın ve çekin. Göz antenleri ağız parçalarına bağlı olarak dışarı çıkar. Beyin ayrıca göz disklerine bağlı kalabilir.
  4. Tel aleti kullanarak diseksiyon edilen dokuyu ~3 mL fiksator içeren küçük bir Petri kabına (35 mm çapında) aktarın; örneğin, %3,7 formaldehit 0,1 M sodyum fosfat tamponunda (pH7,2) %37 formaldehit stok çözeltisinde tamponda seyreltilerek üretilmiştir.
    NOT: Formaldehit işleme için yerel onaylı güvenlik prosedürlerine uyun. %3,7 formaldehit basit bir fiksasyondur ve birçok durumda tatmin edici olur, ancak bazı antijenler için diğer fiksatörler optimal olabilir. PBS veya PEM (0.1 M PIPES pH 7.0, 2 mM MgSO4, 1 mM EGTA) 0.1 M sodyum fosfatın yerine fiksasyon tamponu olarak kullanılabilir veya formaldehit çözeltisi konsantre stok çözeltisi yerine katı paraformaldehit çözülerek elde edilebilir. Fiksatif paraformaldehit-lizin-periyodlu (PLP), daha hafif protein fiksasyonunu karbonhidrat çapraz bağlama ile birleştirir ve membran yapılarını daha iyikorur 12. Örneğin, Drosophila glikoprotein Scabrous, PLP fiksasyonundan sonra antijenik kalır ancak formaldehit fiksasyonundan sonra kalmaz. PLP'yi taze olarak şu şekilde hazırlayın: (1) 2 g paraformaldehit tozunu konik bir şişede 25 ml deyonize suya ekleyin ve düşük ısıda karıştırın; (2) Bir pipeti %50 sodyum hidroksit stok çözeltisine batırın ve karışıma sıvıdan (bir damladan çok daha az) bir parça aktarın. Paraformaldehit birkaç dakika içinde çözülmeden çözülmelidir. %8 formaldehit çözeltisi soğuturken, 0,36 g lizin 10 mL deyonize suda, 7,5 mL 0,1 M sodyum fosfat pH 7,2, 2,5 mL 0,1 M Na2HPO 4'te çözün ve buzda kalın. Bu soğuk tamponlu lizin çözeltisini 5 mL taze %8 formaldehit ve 50 mg sodyum periodyatla 50 mL'lik vida kapaklı bir tüpte karıştırın, vortexing ile karıştırın ve taze kullanın.
  5. Oda sıcaklığında 15–20 dakika sonra, diseksiyon edilen dokuyu 0,1 M sodyum fosfat tamponu (pH 7,2) içeren başka bir Petri kabına aktarın.
    NOT: PBS ayrıca fosfat tamponu yerine kullanılabilir. Bazı antijenler için buz üzerinde fiksasyon tercih edilebilir olabilir veya dokuda ekspreslenen GFP veya RFP'nin endogen floresansının görüntülenmesi istendiğinde. PLP fiksasyonu her zaman buzda 45 dakika sürer.

3. Birincil antikor ile bloke ve kuluçka

  1. Dokuyu bloklamak için ~3 mL NSG antikor yıkama tamponu içeren 35 mm Petri kabına aktarın. Petri kabını en az 15 dakika buz üzerinde kuluçka yapın. NSG, 0,1 M sodyum fosfat tamponu (pH 7,2), %0,1 saponin, %5 normal keçi serumudur. Yıkama tampon stokları 4 °C'de filtre sterilizasyonunda saklanır.
    NOT: Farklı yıkama tamponları belirli antikorlar için optimal olabilir. Örneğin, saponin hafif ve iyon olmayan bir deterjan olup özellikle plazma zarını çözünürken, çekirdek içindeki antijenleri tespit etmek için diğer deterjanlar tercih edilebilir. Bir başka örnek olarak, Jarman ve ark.13 tarafından nükleer Atonal proteine karşı geliştirilen antikor, deterjan olarak NP40 içeren tamponlarda en çok immünoreaktiftir. Alternatif yıkama tamponları için tarifler için Malzeme Tablosu'na bakınız: PDT, PBT veya NSG. Normal serum bloklayıcı protein olarak kullanılırken, ideal olarak, ikincil antikorun üretildiği türden olmalıdır; örneğin, keçi ikincil antikorları kullanılacaksa normal keçi serumu veya eşek ikincil antikorları kullanılacaksa normal eşek serumu. Pratikte bunun pek bir farkı yok.
  2. Bloklama sırasında göz antenli imaginal disklerdeki istenmeyen dokuları ince forseps ile temizleyin, ağız kancaları hariç. Şimdilik ağız kısımlarını bağlı bırakın, transferleri kolaylaştırmak için.
    NOT: Gereksiz dokular, örneğin beyin, sürgü montajına (adım 5.4) kadar da bırakılabilir, yeter ki boyama veya görünürlüğü engellemesin.
  3. Bloklama sırasında, NSG'de 1:100 derecesinde mAb40-1a antikor çözeltisi hazırlanır; örneğin, 100 μL NSG'de 1 μL antikor hazırlanır. Pipetle karıştırın, vortex ile değil.
    NOT: mAb40-1a, beta-galaktosidaza karşı yetiştirilen bir monoklonal antikordur. Optimal antikor seyreltme ve yıkama tamponu kullanılan antikorlara bağlı olarak değişir.
  4. 60 kuyruklu mikrokuyu mini tepsisinin ilk sütunundaki altı kuyunun her birine 13 μL antikor çözeltisi ekleyin. Düz kenarlı konik mikro kuyular optik berraklık için önemlidir. Altı kuyudan fazla gerekirse, ikinci bir mini tepsi başlatın.
  5. Göz antenli hayal disklerini, tercihen ağız parçalarına bağlı olarak, tel halka veya kanca kullanarak birincil antikor çözeltisine teker teker aktarın.
    NOT: Her kuyuya eklenebilecek imaginal disk sayısı antikora bağlıdır. Çok fazla doku bazı antikorları o kadar tüketebilir ki etiketleme azalabilir. Her kuyu başına 5 çift genellikle tatmin edicidir. Böylece, ~60 disk, 60 kuyruklu mikrotiter plakalarının 6 satırıyla kolayca etiketlenebilir. Her satır için farklı antikorlar kullanılabilir. Antikor çözeltilerinin yeniden kullanılamayacağı, her vaka için ampirik test gerektirir; Laboratuvarımızda rutin bir şey değil.
  6. Plakayı kapağıyla kapatın ve buharlaşmayı sınırlamak için parafilm ile mühürleyin. Buzda veya 4 °C'de 4 saatten gece boyunca kuluçka yapın. Sallanmak gerekli değil.
    NOT: Antikor kuluçkasının optimal zamanı ve sıcaklığı antikora bağlıdır. Birçok durumda, oda sıcaklığında 1–2 saat yeterli olur, ancak bazı antikorlar 4 °C'de kuluçkadan sonra daha iyi sonuçlar verir ve genellikle gece boyunca 4 °C'de kuluçka yapmak pratik olabilir. Çok az durumda, 2–3 günlük primer antikor kuluçkaları optimal olabilir. Mikro kuyu kapağının sızdırmazlığı sadece ~4 saatten uzun kuluçkalar için gereklidir.

4. İkincil antikorla yıkama ve kuluçka

  1. Her antikor kuyusundan sonraki üç kuyuya 13 μL NSG tamponu ekleyin, örnekler üç kez yıkanacaktır. Numuneleri her kuyunun içinde ardışık olarak 5 dakika boyunca yıkamaya aktarın.
  2. Yıkama sırasında, NSG tamponu içinde floresan konjuge ikincil antikorların 1:200–400 derecesinde seyreltilmesi hazırlanır; örneğin, 100 μL NSG'de 0,5 μL antikor hazırlanır. Pipetle karıştırın, vortex ile değil. İkincil antikor stok çözeltisini sulandırmadan önce maksimum hızda 60 saniye santrifüj yapın, çünkü antikor agregaları doku yüzeyine spesifik olmayan şekilde bağlanabilir.
    NOT: Optimal ikincil antikor seyreltmesi üreticiye göre değişebilir. Alexa veya Siyanin ile konjuge edilmiş antikorlar, çoklu etiketleme kolaylaştırmak için diğer türler için çıkarılmış olarak mevcuttur.
  3. Bir sonraki (5.) kuyuya ikincil antikor çözeltisinden 13 μL ekleyin.
  4. Örnekleri halka veya kanca kullanarak ikincil antikora aktarın.
  5. Plakayı kapağıyla kapatın ve buharlaşmayı sınırlamak için parafilm ile mühürleyin. Gece boyunca 4 saat buzda kuluçka yapın.
    NOT: Antikor kuluçkasının optimal zamanı ve sıcaklığı antikora bağlıdır. Birçok durumda, oda sıcaklığında 1–2 saat yeterli olur, ancak bazı antikorlar 4 °C'de kuluçkadan sonra daha iyi sonuçlar verir ve genellikle gece boyunca 4 °C'de kuluçka yapmak pratik olabilir. Mikro kuyu kapağının sızdırmazlığı sadece ~4 saatten uzun kuluçkalar için gereklidir.

5. Mikroskopi için doku yıkama ve montaj

  1. İkincil antikor kuyusundan sonraki üç kuyu sütununu 13 μL NSG ile hazırlayın. Örnekleri her kuyiden 5 dakika boyunca aktarın.
  2. Örnekleri 9. kuyudaki son yıkamaya 13 μL 0.1M sodyum fosfat tamponu (pH 7.2) kullanarak aktar. Bu tampon yıkama, yıkama tamponlarında montaj ortamında çökeltilen bileşenler içerdiğinde gereklidir.
  3. . Kuyunun son (10.) kolonuna 13 μL montaj ortamı ekleyin. Montaj ortamı, %2 n-propil gallatının %75 gliserol ve %25 0,1 M sodyum fosfat tamponunda (pH 7,2) çözünmesiyle yapılır. Her hafta bileşenleri döner bir platformda karıştırarak taze montaj ortamı hazırlayın. Kullanmadan önce hava kabarcıklarının uzaklaşmasına izin verin.
    NOT: Montaj medyaları ticari olarak da mevcuttur.
  4. 20 μL montaj ortamını temiz bir mikroskop slaytına pipet yapın. Örnekleri slayttaki ortama aktarın. Bu, istenmeyen dokuları çıkarmak için son bir fırsattır. Kütiküler ağız parçaları göz antenli disklerden çıkarılmalıdır.
  5. Örnekleri kapak camı üzerine konduğunda kaymaması için tel aracı kullanarak numuneleri montajın ana damlasından dışarı çekin. Temiz #1.5 kalınlığında, 22 mm x 40 mm ölçümdeki bir örtü camını sürgüye forseps ile nazikçe indirin, hava kabarcıkları oluşmadan kullanın.
  6. Sürgüleri karton sürgü tutucuda 1 saat bekletin ki montaj ortamı yerleşsin. Kaydırakları rahatsız etmekten kaçının, çünkü kapak camı hareket ederse kırılgan örnekler zarar görebilir.
  7. Kapak camı yerleştikten sonra kenarları oje ile kapatın. Bunu yaparken kapak camını hareket ettirmeyin veya basmayın. Tırnak ojesinin en az 1 saat kurumasına izin verin.
    NOT: Ne yazık ki, çoğu kozmetik oje artık cam slaytlara eşit şekilde yayılmayan ve işe yaramayan çözücüler kullanıyor, bu yüzden bilimsel oje elde edilmelidir.
  8. Slaytları 4 °C'de sakla. Örnekler genellikle aylarca görüntülenip yeniden görüntülenebilir.
    NOT: Slaytlar ayrıca -20 °C'de de saklanabilir.

6. Kanat hayali disklerinin disseksiyonu ve sabitlenmesi

  1. Kanat imaginal disklerini göz-antenli hayal diskler yerine disseksiye etmek için, yukarıdaki 2.3–2.5 adımlar yerine aşağıdaki adımları takip edin.
  2. Bir diseksiya mikroskobu altında, larva ağız kısımlarını ince forsepsle tutun. Mikrodiseksiyon makası kullanarak, larvaları önden %30–%40 boyunca ikiye bölebilirsiniz.
  3. Larvanın ön kısmını, larvaların açık, kesilmiş ucunu ikinci bir penseps ile açarak ve baş ile ağız kısımlarını iterek ters çevirin; bu, çorap ters çevirmeye benzer şekilde
  4. Ters çevrilmiş ön larvaları fiksatora çevirmek için forseps kullanın; bu kapta ~2,5 mL fiksator içeren küçük bir Petri kabına (35 mm çapı), örneğin, %3,7 formaldehit içeren 0,1 M sodyum fosfat tamponu (pH 7,2) içinde, %37 formaldehit stok çözeltisi ile PBS'de seyreltilerek üretilmiştir.
    NOT: İstenilirse, ters çevrilmiş karkaslar mikrofuge tüpünde 400 μL fiksasyona aktarılabilir; bu da duman başlıkta fiksasyonu kolaylaştırır. Göz imgesel disk fiksasyonu için mevcut olan aynı fiksatif seçenekler kanat disk fiksasyonu için de geçerlidir (bkz. NOT: adım 2.4). Optimal fiksasyon ve göz-antenal imaginal disklerin etiketlenmesi genellikle kanat diskleri için aynıdır.
  5. Oda sıcaklığında 15–20 dakika sonra, diseksiyon edilen dokuyu 0,1 M sodyum fosfat tamponu (pH 7,2) içeren başka bir Petri kabına aktarın.
    NOT: Göz hayali disk fiksasyonu için mevcut olan aynı yıkama tamponu seçenekleri kanat disk fiksasyonu için de geçerlidir (bkz. NOT: 2.4. adım). Göz antenli imaginal diskleri etiketlemek için optimal yıkama tamponu genellikle kanat diskleri için aynıdır.
  6. Larvalardan kanat disklerini ince forseps kullanarak çıkarın. Hâlâ varsa, daha küçük haltere disk ve bacak diski şimdi çıkarılabilir veya transferi kolaylaştırmak için kanat disklerine bağlı kalabilir.
    NOT: Kanat diskleri, yağ gövdesi veya diğer dokular çekilene kadar karkasın içinde kolayca görünür olmayabilir (her zaman bir dokuyu çıkarmadan önce tespit edin). Kanat diskleri en büyük hayali disklerdir ve vücut duvarına bağlıdır, trakea ile yakından ilişkilidir. Gözyaşı şekline sahiptirler, tıpkı GüneyAmerika 1'in konturu gibi (Şekil 4).
  7. Yukarıdaki gibi 3–5. adımlarla devam edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tomlinson ve Ready işlemi düzenli olarak mükemmel antikor boyama sonuçları verir. Burada, üçlü etiketli göz, anten ve kanat hayali diskleri gösterilmiştir. Şekil 5A'da, üçüncü instar göz antenli imaginal disk, transkripsiyon faktörü Senseless (mavi), sinir öncül belirteç Elav (kırmızı) ve Ocho transkripti için RNAi ifade eden hücre klonlarının anti-GFP etiketlemesi için üçlü etiketlenmiştir. Şekil 5B'de, üçüncü bir inst...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tomlinson ve Ready yöntemiyle 60 kuyuklu konik kuyu plakaları kullanılarak Drosophila dokularının antikor boyamaları mükemmel sonuçlar verir ve son derece güvenilirdir; çünkü her imaginal disk her manipülasyon sırasında diseksiyon mikroskobu altında takip edilir. Bu yöntem sadece az miktarda antikor reaktifi gerektirir ve her adımda çözümler çok az sıvı ile aktarıldığından daha kapsamlı bir çözüm değişimi sağlar. Özellikle toplu yöntemlerde, her adımda tek tek gözlemlenmeyen ve ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.

Teşekkürler

NEB, yöntemi paylaştığı için Andrew Tomlinson'a ve iyileştirmeler için Lucy Firth'e teşekkür ediyor. Şekil 5A'yı katkıda bulunduğu için Abhishek Bhattacharya'ya teşekkür ederiz. Joyner Cruz, Jonathan Gonzalez, Chelsea Nguyen ve Jensen Northrup'a teşekkür ederiz. Yazarların laboratuvarındaki araştırmalar, NIH (GM120451 ve CA284362) hibeleriyle finanse edilmektedir. Şekil 2 ve Şekil 4 Biorender ile oluşturulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Disodyum FosfatFisher7558-79-4Na2HPO4 - sodyum fosfat dibazik ansuit. Moleküler ağırlığı değiştiren başka hidratasyon durumları da kullanılabilir
Penset: Dumont #5 Biyolojik pensepsGüzel bilim araçları11252-20Stil: #5
           Uç şekli: Düz
               Uzunluk: 11cm
           Autoclave Kasasi: Evet
           İpuçları: Biyoloji
           Uç Boyutları:
         0.05 x 0.02mm
           Alaşım / Malzeme: Inox
FormaldehitFisherBP531-500Moleküler Biyoloji sınıfı, %37 formaldehit. 500ml
Formaldehit FiksativeFisherBP531-500%3,7 formaldehit içinde %37 stoktan seyreltilerek yapılan 0,1M Sodyum Fosfat Tamponu pH7,2.
GliserolFisher BiyoreagentleriBP229-1
BuzKullanıcı Tercihi
L-Lizin, %98TermobilimselJ62225.22
mAb40-1DHSB40-1A-sAnti-beta galaktosidaz
Mikrosantrifüj tüpleriABD bilimsel1615-5520Numuneleri tutmak için 1.5mL tüpler.
Mikrodiseksiyon MakasıGüzel Bilim Araçları15003-085mm kesme kenarı, düz uç, 8.5cm
Monosodyum FosfatFisher7558-80-7NaH2PO4 - Sodyum Fosfat Monobazik Ansutiz. Eğer hidretli bir form kullanılırsa, 0.1M bir çözelti yapmak için gereken ağırlık değişir.
Montaj Ortamı%75 gliserol çözeltisi, %2,5 n-propil gallat ile 0,1M sodyum fosfat tamponu pH7,2'de. Kabarcıkları en aza indirmek için ters çevirme ile karıştırın.
NSG0.1M sodyum fosfat tamponu pH7.2, %0.1 saponin, %5 NGS
n-propil gallatMP Biyomedikal210274780
Tırnak ojesiTed Pella, Fisher'dan Satın AlındıNC0381432Sürgü sızdırmazlığı için
İğne tutacağıFisherNC0099380Mikrodiseksiyon iğneleri için. İçi boş paslanmaz çelik; Sap uzunluğu: 4 3/4" uzunluğunda
Nunc Microwell MiniTraysTermo Bilimsel12565155Serolojik uygulamalar için MicroWell MiniTray. Saymak 60
ParafilmStatLabPM996StatLab ParaFilm M Kendi Kendini Kapatan Esnek Film
ParaformaldehitPolysciences, Inc.00380-250
10x PBSKullanıcı Tercihi800 mL damıtılmış suyu uygun bir kapta hazırlayın.
           Çözeltiye 1,37M Sodyum klorür ekleyin.
             Çözeltiye 26,8 mM potasyum klorür ekleyin.
             Çözeltiye 101 mM Sodyum Fosfat Dibazi ekleyin.
         Çözeltiye 18,0 mM potasyum fosfat monobazik ekleyin.
         Çözeltiyi istenen pH (genellikle pH & asimp; 7.4) ayarlayın.
           Hacmi 1 L olana kadar damıtılmış su ekleyin.
PBTKullanıcı Tercihi0,1M sodyum fosfat tamponu pH7,2, %0,1 sığır serum albümini ve %0,2 Triton X-100.
PDTKullanıcı Tercihi0,1M Sodyum Fosfat tamponu (pH = 7,2), %0,3 deoksikolat ve %0,3 Triton x-100
Petri KabıFalconCorning 351007Petri Dish; 60mm; Muamele edilmez
Petri KabıFalconCorning 351008Petri Dish; 35mm; Muamele edilmez
PenseKullanıcı Tercihi
PLPN/a%2 paraformaldehit %1,35 lizin 0,05M sodyum fosfat tamponu pH7,2
İkincil AntikorlarJackson ImmunoResearch715-545-1510.5mg Alexa Fluor 488 Eşek Fare Karşıtı IgG.
Kaydırma KapaklarıVWR48393-172VWR Kapak Cam #1.5 22x40 (CASE)
SlaytlarFisher125442Fisher Cam Slaytları 10bx/CS
Sodyum DeoksikolatTermo Balıkçı Bilimi89904Sodyum Deoksikolat Deterjan; 5mg
Sodyum PeriyodSigma Aldrich71859-25GSodyum Peryodik – 25 gram
Sodyum Fosfat Tamponu0.1M NaPO4 tampon pH 7.2. 28ml 0,1M herhangi bir monosodyum fosfat stoku (11,998g NaH2PO4 ile 1L damıtılmış su) 72ml 0,1M herhangi bir hidroz disodyum fosfat stoku (14,196g Na2HPO4 ile 1L damıtılmış su) karıştırarak 100ml 0,1M NaPO4 tamponu elde edin. Alternatif olarak, PBS de kullanılabilir.
Tungsten telTed Pella27-11.005" Dia.
Triton x-100Termo Balıkçı BilimiA16046AE
VortexKullanıcı Tercihi

Kaynaklar

  1. Bate, M., Martinez Arias, A. The development of Drosophila melanogaster. , CSHL Press. 747-841 (1993).
  2. Tripathi, B. K., Irvine, K. D. The wing imaginal disc. Genetics. 220 (4), iyac020(2022).
  3. Baker, N. E., Li, K., Quiquand, M., Ruggiero, R., Wang, L. H. Eye development. Methods. 68 (1), 252-259 (2014).
  4. Treisman, J. E. Retinal differentiation in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).
  5. Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
  6. Held, L. I. J. Imaginal discs: The genetic and cellular logic of pattern formation. , Cambridge University Press. (2002).
  7. Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium. Developmental Biology. 120, 366-376 (1987).
  8. Rubin lab methods book. , Wellcome Collection. https://wellcomecollection.org/works/u7msrkak (1990).
  9. Rubin lab manual. , The Rubin Lab. https://www.yumpu.com/en/document/view/12357776/rubin-lab-manual-jfly-home-page (1990).
  10. Mitchison, T. J., Sedat, J. Localization of antigenic determinants in whole Drosophila embryos. Dev Biol. 99 (1), 261-264 (1983).
  11. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  12. Mclean, I. W., Nakane, P. K. Periodate-lysine-paraform-aldehyde fixative a new fixative for immunoelectron microscopy. J. Histochem. Cytochem. 22, 1108-1077 (1974).
  13. Jarman, A. P., Grell, E. H., Ackerman, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Atonal is the proneural gene for Drosophila photoreceptors. Nature. 369, 398-400 (1994).
  14. Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. Tie-dye: A combinatorial marking system to visualize and genetically manipulate clones during development in Drosophila melanogaster. Development. 140 (15), 3275-3284 (2013).
  15. Blanco, J., Cooper, J. C., Baker, N. E. Roles of c/ebp class bzip proteins in the growth and cell competition of rp ('minute') mutants in Drosophila. Elife. 9, e50535(2020).
  16. Jennings, B., Preiss, A., Delidakis, C., Bray, S. The notch signalling pathway is required for enhancer of split bhlh protein expression during neurogenesis in the Drosophila embryo. Development. 120 (12), 3537-3548 (1994).
  17. Kiparaki, M., Baker, N. E. Protocol for assessing translation in living Drosophila imaginal discs by o-propargyl-puromycin incorporation. STAR Protoc. 4 (4), 102653(2023).
  18. Spratford, C. M., Kumar, J. P. Dissection and immunostaining of imaginal discs from Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (91), e51792(2014).
  19. Yan, S. J., Li, W. X. Using Drosophila larval imaginal discs to study low-dose radiation-induced cell cycle arrest. Methods Mol Biol. 782, 93-103 (2011).
  20. Klein, T. Immunolabeling of imaginal discs. Methods Mol Biol. 420, 253-263 (2008).
  21. Phalle Bde, S. Immunostaining of whole-mount imaginal discs. Methods Mol Biol. 247, 373-387 (2004).
  22. Morimoto, K., Tamori, Y. Induction and diagnosis of tumors in Drosophila imaginal disc epithelia. J Vis Exp. (125), e55901(2017).
  23. Brown, N. L. Confocal microscopy methods and protocols. Methods in molecular biology. Paddow, S. W. , Humana Press. 75-91 (1999).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Drosophila majinal DiskleriG z Anten DiskleriDoku DiseksiyonuProtein EkspresyonuEpitel Geli imimmunobellemeK k Doku Belleme60 Mikrokuyu Plakalar

İlgili makaleler