Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

RA model sıçanlarında moksibustyonun makrofaj polarizasyonu ve göçü üzerindeki düzenleyici etkisi ve TIM-3'ün rolü

175 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70436

⸱

27 Mart 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Acupuncture and Tuina School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, romatoid artritin fare modellerinde moksibustyonun makrofaj polarizasyonu ve göçü üzerindeki düzenleyici etkilerini, T hücresi immünoglobulini ve müsin alanı içeren protein 3'ün (TIM-3) rolüne odaklanarak, bu hastalıkta moksibustyonun terapötik mekanizmalarını açıklamaktadır.

Özet

Bu çalışma, romatoid artritli bir fare modelinde moksibustyonun makrofag polarizasyonu ve göçü üzerindeki düzenleyici etkilerini, ayrıca T hücresi immünoglobulini ve müsin alanı içeren protein 3'ün (TIM-3) bu süreçteki rolünü incelemeyi amaçladı. Deneyin 0. gününde Sprague–Dawley (SD) fareleri beş gruba ayrıldı. Tam Freund adjuvantı (CFA), arka ayak pedlerine enjekte edilerek romatoid artrit modeli oluşturuldu. Ayrıca, lentivirüs aracılı Havcr2 RNA girişimi (LV-Havcr2-RNAi) arka ayak pedlerine enjekte edilip TIM-3 ekspresyonunu inhibe edildi. 7. günden itibaren fareler, altı gün tedavi ve bir gün dinlenmeden oluşan döngüler halinde moxibustion tedavisi gördü ve toplamda üç tam döngü sürdü. Moksibustyon tedavisi tamamlandıktan sonra, inflamatuar durum histolojik analiz ve pati kalınlığı ölçümüyle değerlendirildi. M1 ve M2 makrofajlarının fenotipik belirteçleri, enzimle bağlantılı immünosorbent testi (ELISA) ve immünoflüoresans ile değerlendirildi. TIM-3 ekspresyonu, nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ve Western blot ile tespit edildi. Ayrıca, peritoneal eksüdat makrofajlar (PEM) ek SD farelerden izole edildi ve makrofaj göçü Transwell testi kullanılarak incelendi. Çalışma, CFA enjeksiyonundan sonra farelerde belirgin pati kızarıklığı ve şişlik ile makrofaj fenotip ifadesinde dengesizlik gösterdiğini ortaya koydu. Ayrıca, Transwell göç testleri, CFA kaynaklı model sıçanların kontrol örneklerine göre makrofaj göçünün arttığını ortaya koydu. Ancak, moxibustion tedavisi bu değişiklikleri hafifletmiştir. Sonuçlar ayrıca moksibustyonun TIM-3 ifadesini artırdığını ve lentiviral müdahaleden sonra TIM-3 seviyelerinin belirgin şekilde düştüğünü gösterdi; bu da inflamatuar belirtilerin şiddetlenmesine ve makrofaj dengesizliğine yol açtı. Bu sonuçlar, TIM-3'ün makrofaj polarizasyonu ve göçünün moksibustion düzenlemesinde önemli bir arabulucu olduğunu göstermektedir.

Giriş

Romatoid artrit (RA), klinik olarak simetrik inflamatuar artrit ile ortaya çıkan yaygın bir sistemik otoimmün bozukluktur. İltihap öncelikle sinovial membran, kıkırdak ve kemiği hedef alır; bu da doku hasarına ve geri dönüşü olmayan eklemdeformasyonuna yol açar 1. Mevcut RA'nın farmakolojik yönetimi öncelikle hastalık değiştirici anti-romatik ilaçlara (DMARD'lar)2 dayanır ve bu ilaçlar genellikle ömür boyu kullanım gerektirir. Ancak, bu terapötik ajanlar çeşitli yan etkilerle ilişkilidir. Sonuç olarak, önemli sayıda hasta klinik semptomları hafifletmek ve geleneksel ilaç rejimlerine bağımlılıklarını potansiyel olarak azaltmak için güvenli ve etkili tamamlayıcı tedaviler arıyor. Geleneksel Çin tıbbının önemli bir bileşeni olan moxibustion, RA için umut vadeden bir tamamlayıcı tedavi olarak hizmet edebilir. Terapötik etkilerini sistemik anti-inflamatuar ve immünomodülatörmekanizmalar aracılığıyla gösterir 3. Kanıtlar, moksibustyonun semptomları hafifletebileceğini ve eklem yapılarını koruyabileceğinigöstermektedir 4. Ayrıca, DMARD'larla ilişkili potansiyel hepatorenal toksisite, enfeksiyon riskleri ve yüksek maliyetlerle karşılaştırıldığında, moxibustion üstün güvenlik ve daha düşük maliyet sunar. Ancak, moxibustion bir panacea değildir ve RA'yı yönetmek için DMARD'ların yerini tamamen alamaz. Maksobüstsiyon genellikle etkilerini elde etmek için tekrar, uzun süreli tedavi seansları gerektirir. RA'nın akut alevlenmeleri sırasında, hızlı semptom kontrolü sağlamayabilir. Ayrıca, moksibustyonun terapötik sonucu uygulayıcının beceri ve deneyimine büyük ölçüde bağlıdır ve bu da değişkenlik getirir. Sonuç olarak, DMARD'larla moksibustyonun entegrasyonu, sinerjik bir "azaltılmış toksisiteyle artırılmış etkilik" etkisi elde etmek için değerlendirilmelidir; bu da RA5'in uzun vadeli yönetimi için uygulanabilir bir strateji haline gelir.

Birçok çalışma RA 6,7,8'de moxibustyonun terapötik etkinliğini doğrulamış olsa da, kesin etki mekanizmaları net değildir. Bu çalışma, T hücresi immünoglobulini ve müsin alanı içeren protein 3'ü (TIM-3) mekanik giriş noktası olarak kullanarak RA'da moksibustyonun makrofaj polarizasyonu ve göçü üzerindeki etkilerini araştırmaktadır. Bu yaklaşım, moksibustyonun anti-artritik etkilerini gösterdiği potansiyel bir immünomodülatör yolu aydınlatmak için tasarlanmıştır.

Makrofajlar, kritik bağışıklık hücreleri olarak RA 9,10'un patogenezi ve ilerlemesinde merkezi bir rol oynar. İltihapın başlangıcında, dokuda yaşayan makrofajlar çeşitli sitokinler ve kemokinler salgılar. Bu sinyal molekülleri, vasküler endotel hücrelerine etki ederek, dolaşımdaki monositlerin makrofajlara ayrılmasını ve ardından iltihaplı dokuya katılımınıteşvik eder 11,12. Bu sızan makrofajlar, ek aracılar üreterek inflamatuar yanıtı daha da artırır; bu da daha fazla makrofajı işe alır ve doku infiltrasyonunu kötüleştirir; böylece iltihaplanma ve doku infiltrasyonu için kısır bir döngü oluşturur.

Çevresel uyaranlara bağlı olarak, makrofajlar özellikle M1 (klasik olarak aktive edilmiş) ve M2 (alternatif olarak aktive olmuş) durumları olmak üzere farklı fonksiyonel fenotiplere polarize olarak önemli plastisitelersergiler 13. Fizyolojik koşullarda, makrofaj polarizasyonu M1 ve M2 fenotipleri arasında dinamik bir denge sağlar. Ancak RA'da bu denge bozulur; M1 polarizasyonunun artmasıyla karakterize edilir; inflamör (IFN)-γ ve indüklenebilir nitrik oksit sentazı (iNOS) gibi pro-inflamatuar aracıların salınımının artmasıyla karakterize edilir; bu da inflamatuar yanıtları şiddetlendirir. Aynı zamanda, M2 polarizasyonu zayıflamış olup, interleukin (IL)-4 ve CD206 dahil olmak üzere anti-enflamatuar faktörlerin salınımının azalmasıyla birlikte gelir; bu da T-hücre aktivasyonunu ve çoğalmasını engelleme kapasitesini azaltır ve böylece hastalık ilerlemesinikötüleştirir 14. Birçok araştırma, M1/M2 makrofaj dengesinin modüle edilmesinin RA ilerlemesinihafifletebileceğini ortaya koymuştur 15,16.

TIM-3, T hücresi yüzey glikoproteini olarak tanımlanır ve T hücreleri, makrofajlar ve doğal katil hücreler dahil olmak üzere bağışıklık hücrelerinin bir spektrumunda yaygın olarak eksprese edilir; burada belirli ligandlara bağlanarak immünoregülatif işlevleruygular 17. TIM-3 sinyalizasyonu, makrofaj inflamatuar sitokin ifadesi ve polarizasyonu üzerinde kesin bir etki uygular. Özellikle, TIM-3 M2 makrofajlarında yüksek oranda ekspreslenir; burada M2 fenotipini desteklerken M1 fenotipini bastırır. Buna karşılık, araştırmalar TIM-3 inhibisyonunun tam tersi etki yarattığını, M1 polarizasyonunu tetiklediğini ve M2polarizasyonunu zayıflattığını göstermektedir 18,19,20. Ayrıca, kanıtlar TIM-3'ü makrofaj göç davranışının ana düzenleyicisiolarak öne çıkarmaktadır 21,22. Bu nedenle, makrofaj polarizasyonu ve göç dinamiklerini kontrol etmek için TIM-3'ü hedefleyen terapötik müdahale, bir RA tedavi stratejisi olarak önemli umut vaat ediyor.

Yukarıda belirtilen gerekçeye dayanarak, bu çalışma RA'da moksibustyonun terapötik etkilerini nasıl uyguladığı üzerine artan bilgi birikimine katkıda bulunmak amacıyla yapılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Etik Bildiri ve Güvenlik Önlemleri
Tüm hayvan deneyleri, Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Etik Komitesi (2024029) tarafından onaylanmıştır. CFA ve lentivirüs uygulaması dahil tüm enjeksiyon işlemlerinde, operatörler tek kullanımlık eldiven, gözlük ve laboratuvar önlüğünden oluşan kişisel koruyucu ekipman (PPE) giymek zorundadır. Bu işlemler biyogüvenlik dolabında veya iyi havalandırılmış bir ortamda yapılmalıdır. Reaktiflerle temas eden tüm keskin filikler derhal belirlenmiş keskin kaplara atılmalıdır. Moxibustion tedavisi boyunca operatör hayvanın tepkisini yakından izledi. Moxa külahı, cilde termal hasarı önlemek için hemen değiştirildi. Ayrıca, yangın tehlikelerini ortadan kaldırmak için yanan moxalardan yanan maddelerden uzak tutulmalıdır.

1. RA modelinin kurulması

Altı haftalık (lisans numarası: SCXK 2020-030) otuz erkek SD sıçan (ağırlık: 200 ± 20 g) rastgele beş gruba (n = 6) ayrıldı: kontrol grubu, RA model grubu (RA grubu), RA + moksibustion tedavi grubu (Mox grubu), RA + TIM-3 lentivirüs girişim grubu (RA + TIM-3– grubu) ve RA + TIM-3 lentivirüs girişimi + moksibustyon tedavi grubu (RA + TIM-3– + Mox grubu). Deneyden önce, fareler kontrollü bir ortamda, 22–24 °C sıcaklıkta, %20 nem ve doğal ışık/karanlık döngüsünde yedi gün boyunca aklimatize edildi; serbest yiyecek ve suya erişim sağlandı. Deneyin 23. gününde, aynı şirketten beş adet üç haftalık erkek SD sıçan satın alındı. Bu fareler, PEM çıkarımı için kullanılmadan önce beş gün boyunca aynı barınma koşullarında aklimatize edildi. Deneysel prosedürü özetleyen şematik diyagram ve temsil prosedürel fotoğraflar Şekil 1'de gösterilmiştir.

Deneyin 0. gününde, kontrol grubundaki hariç tüm farelerin arka pençe pedlerine 0.5 mL/kg CFA enjekte edildi ve RA indüklendi. Aynı hacimde tuzlu su, kontrol grubu sıçanlarında aynı yerde verildi. Pati kalınlığı, RA model23'ün başarılı bir şekilde kurulmasını değerlendirmek için kriter olarak kullanılmıştır.

2. Lentivirüs enjeksiyonu

RA + TIM-3- ve RA + TIM-3- + Mox gruplarındaki fareler, deneyin 1. gününde arka pati pedlerine LV-Havcr2-RNAi (94435-1) enjeksiyonu aldı (3.5 × 107 TU/mL; 10 μL per pad). Diğer tüm farelere aynı anatomik bölgede normal salin enjeksiyonlarıyapıldı 24.

3. Moxibustion

Deneyin 7. gününde, Mox ve RA + TIM-3- + Mox gruplarındaki fareler moxibustion tedavisi aldı. İşlemi kolaylaştırmak için, BL23 ve ST36 akupunktur noktalarının çevresinde yaklaşık 1 × 1 cm büyüklüğündeki tüyler tıraş edildi (bu işlem kalan gruplardaki fareler için de uygulandı). Moxibustion sırasında, her sıçan vücut boyutundan biraz daha büyük bir ahşap blokta nazikçe sabitlenerek tedavi alanlarını tamamen açığa çıkarıyordu (diğer gruplardaki fareler de benzer şekilde kısıtlanıyordu). Daha sonra, her iki akupunktur noktasına da tane şeklindeki moxa konileri uygulandı. Bireyler arasında termal uyarımda tutarlılığı sağlamak için, her moxa koni (çap: 2 mm; yükseklik: 5 mm; moxa yünü içeriği: %60) standart 5 mg moxa yünü porsiyonundan hazırlanmıştır. Her gün, vücudun bir tarafındaki iki akupunktur noktasına beş konik uygulanırken, ertesi gün tedavi karşı tarafla dönüşümlü olarak uygulanırdı. Bu alternatif tedavi protokolü üç hafta boyunca sürdürüldü ve her yedinci günde bir gün dinlenme süresi verildi.

Üç döngü moksibustyon tedavisinden sonra, fareler izofluran (%4 indüksiyon, %2 bakım, inhalasyon) kullanılarak anestezi edildi ve abdominal aorttan 5 mL arterial kan alındı. Santrifüjden sonra (2.000 × g, 15 dakika, 4 °C), süperatan serum mikrosantrifüj tüplerine aktarıldı ve −20 °C'de depolandı. Kan örneklemesi sonrası, fareler servikal dislokasyon ile ötenazi edildi. Ayak bileği eklemleri dikkatlice incelenip %4 paraformaldehit ile sabitlendi. Sinovial dokular ve dalaklar sıvı azot kullanılarak hızla dondurulmuş ve −80 °C'de depolanmıştır.

4. Fare pençesinin kalınlığının ölçümü

Farelerin arka patilerinin orta noktaları, tutarlı ölçüm konumunu sağlamak için su geçirmez bir işaretleyici ile işaretlendi. Pati kalınlığı, modellemeden önce, başarılı modellemeden sonra ve her tedavi süreci arasında (deneyin 0, 7, 14, 21 ve 28. günlerlerinde) vernier kaliperlerle ölçüldü.

5. Histolojik analiz

%4 paraformaldehit ile fiksasyondan sonra, fare ayak eklemleri, bol miktarda kalsifikasyon çözeltisi (%10 formik asit) içeren santrifüj tüplerine yerleştirildi. Tüpler bir çalkalayıcıya monte edilip, oda sıcaklığında 30 saat hafif çalkalanmaya tabi tutuldu. Bu dönemde, dekalsifikasyon çözeltisi düzenli aralıklarla değiştirildi ve aşırı kalsifikasyonun önlenmesi için doku durumu izlendi. Daha sonra, dokular 6 saat boyunca nötralizasyon için %5 sodyum tiyosülfat çözeltisine aktarıldı ve ardından akan musluk suyu altında 4 saat boyunca iyice durulamayapıldı 25. Daha sonra dokular kurutulmuş ve parafin bloklarına gömülmüştür. Kesitler 5 μm kalınlıkta enine kesildi. Deparafinizasyon ve hidrasyondan sonra, bölümler 3 dakika boyunca hematoksilinle boyandı, suyla durulandı, kısa süreliğine ayırt edildi (5 saniye), tekrar duruldu ve 5 saniye mavileştirildi, ardından akan musluk suyunda iyice durulandı. Daha sonra, bölümler %95 etanol içinde 1 dakika kurutuldu ve 15 saniye boyunca eosin ile karşı boyandı. Son olarak, bölümler kurutuldu, temizlendi ve ışık mikroskobu altında gözlem için bir kapak kıvılcımıyla monte edildi. Bu boyama ile çekirdekler mavi görünürken, sitoplazma, kolajen lifleri ve kırmızı kan hücreleri farklı pembe tonlarında görselleştirildi; Keratinleşmiş tabaka genellikle parlak kırmızıya boyanırdı.

6. ELISA

Üreticinin protokolüne uygun olarak, her serum örneğinden (önceden seyreltilmiş 1:2) 100 μL aliquot belirlenmiş kuyulara eklendi. Boş ve standart kuyular paralel olarak dahil edildi. Mühürlemeden sonra plaka 37 °C'de 90 dakika kuluçka altına alındı. Yıkama aşamasından sonra, tespit antikoru eklendi ve 37 °C'de 60 dakika boyunca kuluçka edildi. Bir başka yıkamadan sonra streptavidin–HRP konjugatı eklendi. Detaylı yıkamadan sonra, renk gelişimi için alt tabaka çözeltisi eklendi, ancak bu çözüm stop çözeltisi eklenmesiyle durduruldu. Soğurma 450 nm (OD₄₅₀) olarak ölçüldü. IL-4 ve IFN-γ örnek konsantrasyonları standart eğriden interpolasyon ile belirlendi ve nihai konsantrasyonlar ilgili seyrelme faktörü ile çarpılarak hesaplandı.

7. qRT-PCR

Serum örneklerinden TRIzol reaktifi kullanılarak değiştirilmiş bir protokole göre toplam RNA çıkarıldı. Kısaca, 100 μL serum, güçlü pipetleme ile 1 mL TRIzol reaktifiyle homojenleştirildi. Daha sonra 100 μL kloroform eklendi ve karışım 15 saniye boyunca şiddetle çalkalandı, ardından oda sıcaklığında 3 dakika kuluçka yapıldı. Örnek, faz ayrımı sağlamak için 12.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjlendi. Üst sulu faz, dikkatlice yeni bir tüpe aktarıldı, 0,5 mL izopropanol ile karıştırıldı ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka edildi. Daha sonra, toplam RNA 12.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjle peletlendi. Ortaya çıkan RNA peleti bir kez 1 mL %75 etanol ile yıkanmış (8.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika santrifüj) ve nihai çözünmeden önce hava kurutulmuştur. Elde edilen RNA, cDNA sentez kiti kullanılarak ters transkripsiyona tutuldu. Gen ekspresyonu analizi, gerçek zamanlı nicel PCR sistem yazılımı kullanılarak qRT-PCR ile gerçekleştirildi. β-aktin, normalleşme için ev geni olarak kullanıldı. TIM-3 mRNA'nın göreli ekspresyonu, 2−ΔΔCt yöntemiyle hesaplandı. Astarların detayları Tablo 1'de eklenmiştir.

8. Western Blot

Çıkarılan dalak üç kez önceden soğutulmuş fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkanmış, küçük parçalara bölünmüş ve dokudan on kat daha büyük hacimde liz tamponu eklenerek lizleştirilmiştir. Homojenleştirme, homojenizer tüp kullanılarak gerçekleştirildi. Homojenat, lizis için 30 dakika buz üzerinde bırakıldı ve doku tamamen bozulmasını sağlamak için beş ila altı tur girdablar yapıldı. Örnekler 12.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjlendi ve üst yüzey toplam protein ekstraktı olarak toplandı. Hedef protein konsantrasyonları, kit protokolüne göre bicinchoninic acid (BCA) testi kullanılarak ölçüldü.

%10 sodyum dodekil sülfat–poliakrilamid jel elektroforezi (SDS–PAGE) ile ayrıldıktan sonra, çıkarılan protein örnekleri poliviniliden diflorür (PVDF) membranına aktarıldı. Zar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca Tween 20 (TBST) içeren Tris tamponlu tuzlu suyla tıkandı, %5 yağsız sütle takviye edildi ve ardından 4 °C'de primer antikorlarla gece boyunca kuluçka yapıldı. Kapsamlı yıkamadan sonra, zar 37 °C'de 2 saat boyunca yaban turpu peroksidaz (HRP) ile konjuge edilmiş ikincil antikorlarla inkübe edildi. Son olarak, görüntüler kemilyüminsans görüntüleme sistemi kullanılarak çekildi ve ChemiScope analiz yazılımı kullanılarak gri tonlama yoğunluğu açısından analiz edildi. Birincil ve ikincil antikorların detayları Tablo 1'de listelenmiştir.

9. İmmünoflüoresans tespiti

Çıkarılan sinovial doku %4 paraformaldehit içine batırıldı, dehidratlandırıldı ve parafine gömüldü, ardından 5 μm kalınlığında dilimlere ayrıldı. Bölümler sıralı olarak ksilen I, Ksilen II ve Ksilen III ile (her biri 10 dakika) mumdan arındırıldı, ardından mutlak etanolde üç yıkama (her biri 5 dakika) ve son olarak damıtılmış suyla durulandı.

Etilenediaminetetraasetik asitte (EDTA) antijen alındıktan sonra, slaytlar fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) (PBS) (her biri 5 dakika) içinde nazik bir çalkalama ile üç kez yıkandı. Bölümler daha sonra oda sıcaklığında %3 sığır serum albümini (BSA) ile inkubasyon ile 30 dakika boyunca bloklandı. Bloklama sonrasında, anti-indüklenebilir nitrik oksit sentazı (iNOS) (1:500) ve anti-CD206 (1:400) dahil olmak üzere birincil antikorlar uygulandı ve 4 °C'de 24 saat boyunca kuluçka edildi.

Üç adet 5 dakikalık PBS yıkamasından sonra, bölümler 37 °C'de 50 dakika boyunca ikinci bir antikor ile inkubasyon edildi (Cy3 ile konjuge edilmiş keçi anti-tavşan IgG, 1:300). Nükleer boyama, slaytların PBS ile üç kez yıkanması (yıkamada 5 dakika) yapıldı, ardından 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyama çözeltisi ile işlem yapıldı ve oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika kuluçka yapıldı. Görüntüler floresan mikroskobu altında incelendi.

10. PEM'lerin izolasyonu

Servikal dislokasyon yoluyla ötenazi sonrası, sıçanlar %75 etanol içinde 10 dakika dezenfekte edildi ve steril biyogüvenlik dolabına transfer edildi. Karın derisi steril makasla kesildi, ardından bir şırınga kullanılarak 15 mL fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) intraperitoneal enjeksiyon yapıldı. Karın nazikçe masaj yapıldıktan sonra peritoneal sıvı şırıngaya geri çekildi ve makrofaj süspansiyonları elde etmek için santrifüj tüplerine aktarıldı.

Hücre süspansiyonu, %10 fetal sığır serumu (FBS) içeren Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamına (DMEM) ekildikten sonra PBS ile üç kez yıkandı. Hücreler, %5 CO₂ içeren nemli atmosferde 37 °C'de 24 saat boyunca kültürlendi. Bu kuluçka döneminden sonra elde edilen yapışkan hücreler makrofajlar olarak tanımlandı.

11. Transwell

Göç testi 24 kuyu plakaları kullanılarak gerçekleştirildi. 24 saat serum açlığından sonra, üst odaya 300 μL DMEM içeren 4 × 10-4 makrofaj eklendi; %1 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 antibiyotik (50 U/mL penisilin ve 50 μg/mL streptomisin) eklendi; alt odaya ise %10 FBS ve %1 antibiyotik içeren 700 μL DMEM eklendi. Hücreler, farklı fare gruplarından serumla 24 saat önceden işlendi. Daha sonra, plakalar %5 CO₂ ortamında 37 °C'de 24 saat boyunca kuluçka edildi. Kristal mor boyama işleminin ardından, üst oda göç etmemiş hücreler çıkarılması için silme yapıldı. Göç eden hücreler, optik mikroskop altında rastgele seçilmiş dört görüş alanında manuel sayımı ile nicel olarak ölçüldü.

12. İstatistiksel analiz

İstatistiksel analizler SPSS sürüm 25.0 kullanılarak gerçekleştirildi. Veri setleri ilk olarak varyansların normalliği ve homojenliği açısından test edildi. Bu parametrik varsayımlar karşılandığında, gruplar arası karşılaştırmalar tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından en az anlamlı fark (LSD) sonrası analiz kullanılarak yapıldı. Bu varsayımları ihlal eden veriler için ise parazitsiz Kruskal–Wallis testi uygulandı, ardından birden fazla karşılaştırma için uygun düzeltmeyle Mann–Whitney U testleri yapıldı. Tüm değerler ortalama ± standart sapma olarak ifade edildi ve P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Veri erişilebilirliği
Mevcut çalışma sırasında üretilen ham veriler Figshare deposunda (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.31550197) mevcuttur

Moxibustion tedavisi sonrası farelerde eklem patolojisi ve pati kalınlığı
CFA enjekte edilen farelerde belirgin pati şişliği ve kızarıklık gelişti. Hematoksilin ve eosin boyama, kontrol grubunun sağlam eklem yapısı, düzgün ve iyi ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

RA'nın mevcut yönetimi ağırlıklı olarak DMARD'lara dayanmaktadır. Ancak, bu farmakolojik ajanlar genellikle maliyetlidir ve hepatorenal bozulma ve ağır enfeksiyonlar gibi göz ardı edilmeyen yanetkilerle ilişkilidir 2; bu da bireyler ve sağlık sistemleri üzerinde önemli bir yük oluşturur. Buna karşılık, dış tedavi olarak moksibustyon sistemik toksisite riski minimum rapor edilen olumlu bir güvenlik profili sergiler. Tekniği nispeten basittir ve uygun eğitimden sonr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 82374587) ve Sichuan Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 2024NSFSC2113) tarafından desteklendi. Laboratuvar olanakları ve teknik destek sağladığı için Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi'ne teşekkür ederiz. Moxibustion protokolleri konusunda rehberlik ettikleri için Akupunktur ve Tuina Okulu'na özel teşekkürler. Ayrıca hayvan bakım ekibini sıçan modellerinin korunmasındaki yardımlarından dolayı takdir ediyoruz. Son olarak, histolojik ve moleküler analizlere katkıda bulunan tüm meslektaşlarımıza teşekkürlerimizi sunarız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Tam Freund' s Adjuvant (CFA)Sigma-AldrichF5881Farelerde romatoid artrit (RA) modelini indüklemek için kullanılır
Lentivirüs (TIM-3 RNAi)GenChem Biotechnology, Şanghay3.5& kez; 107 TU/mLTIM-3 gen ifadesini susturmak için kullanılır
Moxa Konileri (Buğday boyutunda)Geleneksel Çin Tıbbı TedarikçisiYokBL23 ve ST36 akupunktur noktalarında moxibustion için kullanılır

Kaynaklar

  1. Gravallese, E. M., Firestein, G. S. Rheumatoid Arthritis - Common Origins, Divergent Mechanisms. N Engl J Med. 388 (6), 529-542 (2023).
  2. Di Matteo, A., Bathon, J. M., Emery, P. Rheumatoid arthritis. Lancet. 402 (10416), 2019-2033 (2023).
  3. Hao, F., et al. Effect of moxibustion on autophagy and the inflammatory response of synovial cells in rheumatoid arthritis model rat. J Tradit Chin Med. 42 (1), 73-82 (2022).
  4. Chen, Y., et al. Moxibustion of Zusanli (ST36) and Shenshu (BL23) Alleviates Cartilage Degradation through RANKL/OPG Signaling in a Rabbit Model of Rheumatoid Arthritis. Evid Based Complement Alternat Med. 2019, 6436420(2019).
  5. Shang, J., et al. The efficacy and safety of warming acupuncture and moxibustion on rheumatoid arthritis: A protocol for a systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 99 (34), e21857(2020).
  6. Gong, Y., et al. Effect of Moxibustion on HIF-1α and VEGF Levels in Patients with Rheumatoid Arthritis. Pain Res Manag. 2019, 4705247(2019).
  7. Liao, C., et al. The Effects and Potential Mechanisms of Moxibustion for Rheumatoid Arthritis-Related Pain A Randomized, Controlled Trial. J Pain Res. 16, 1739-1749 (2023).
  8. Tao, S., et al. The Efficacy of Moxibustion on the Serum Levels of CXCL1 and β-EP in Patients with Rheumatoid Arthritis. Pain Res Manag. 2021, 7466313(2021).
  9. Zheng, Y., et al. Macrophage polarization in rheumatoid arthritis: signaling pathways, metabolic reprogramming, and crosstalk with synovial fibroblasts. Front Immunol. 15, 1394108(2024).
  10. Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S. Synovial tissue macrophages in joint homeostasis, rheumatoid arthritis and disease remission. Nat Rev Rheumatol. 18 (7), 384-397 (2022).
  11. Kemble, S., Croft, A. P. Critical Role of Synovial Tissue-Resident Macrophage and Fibroblast Subsets in the Persistence of Joint Inflammation. Front Immunol. 12, 715894(2021).
  12. Huang, Q. Q., et al. Critical role of synovial tissue-resident macrophage niche in joint homeostasis and suppression of chronic inflammation. Sci Adv. 7 (2), eabd0515(2021).
  13. Mosser, D. M., Hamidzadeh, K., Goncalves, R. Macrophages and the maintenance of homeostasis. Cell Mol Immunol. 18 (3), 579-587 (2021).
  14. Tardito, S., et al. Macrophage M1/M2 polarization and rheumatoid arthritis: A systematic review. Autoimmun Rev. 18 (11), 102397(2019).
  15. Liu, X., et al. KLF11 alleviates rheumatoid arthritis by regulating M1 macrophage polarization via downregulation of YAP1 expression. Arthritis Res Ther. 27 (1), 171(2025).
  16. Wen, Y., et al. Wuwei Ganlu and Myricetin alleviate rheumatoid arthritis by inhibiting M1 macrophage polarization through modulation of SHBG/SREBP1-mediated lipid metabolism. Phytomedicine. 146, 157167(2025).
  17. Zhao, L., Cheng, S., Fan, L., Zhang, B., Xu, S. TIM-3: An update on immunotherapy. Int Immunopharmacol. 99, 107933(2021).
  18. Du, X., et al. Increased Tim-3 expression alleviates liver injury by regulating macrophage activation in MCD-induced NASH mice. Cell Mol Immunol. 16 (11), 878-886 (2019).
  19. Ni, X., et al. Interrogating glioma-M2 macrophage interactions identifies Gal-9/Tim-3 as a viable target against PTEN-null glioblastoma. Sci Adv. 8 (27), eabl5165(2022).
  20. Yang, H., et al. Tim-3 aggravates podocyte injury in diabetic nephropathy by promoting macrophage activation via the NF-κB/TNF-α pathway. Mol Metab. 23, 24-36 (2019).
  21. Guo, Q., et al. Cancer cell intrinsic TIM-3 induces glioblastoma progression. iScience. 25 (11), 105329(2022).
  22. Li, G., et al. Peripheral Injection of Tim-3 Antibody Attenuates VSV Encephalitis by Enhancing MHC-I Presentation. Front Immunol. 12, 667478(2021).
  23. Haiyan, Z., et al. Efficacy of Moxa-burning heat stimulating Zusanli (ST36) and Shenshu (BL23) on expressions of macrophage migration inhibitory factor and macrophage apoptosis in rabbits with adjuvant-induced arthritis. J Tradit Chin Med. 42 (6), 980-987 (2022).
  24. Tang, Q., et al. RNAi Silencing of IL-1β and TNF-α in the Treatment of Post-traumatic Arthritis in Rabbits. Chem Biol Drug Des. 86 (6), 1466-1470 (2015).
  25. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18 (Suppl 3), S17-S23 (2010).
  26. Miao, W., Yan, Z., Hui, Z., Hongfang, Z. Moxibustion enables protective effects on rheumatoid arthritis-induced myocardial injury transforming growth factor beta1 signaling and metabolic reprogramming. J Tradit Chin Med. 43 (6), 1190-1199 (2023).
  27. Tao, S. Y., et al. Moxibustion as an adjunctive treatment for rheumatoid arthritis and its effects on the serum levels of SOST and β-catenin. Zhongguo Zhen Jiu. 43 (12), 1384-1389 (2023).
  28. Hao, F., et al. [Effect of moxibustion on PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in foot-pad synovium in rats with rheumatoid arthritis]. Zhongguo Zhen Jiu. 40 (11), 1211-1216 (2020).
  29. Zhong, Y. M., Zhang, L. L., Lu, W. T., Shang, Y. N., Zhou, H. Y. Moxibustion regulates the polarization of macrophages through the IL-4/STAT6 pathway in rheumatoid arthritis. Cytokine. 152, 155835(2022).
  30. Linlin, Z., et al. Moxibustion of Zusanli (ST36) and Shenshu (BL23) alleviates the inflammation of rheumatoid arthritis in rats through regulating macrophage migration inhibitory factor/glucocorticoids signaling. J Tradit Chin Med. 44 (2), 353-361 (2024).
  31. Zhu, L., et al. Effect of moxibustion at "Xinshu" (BL15) and "Feishu" (BL13) on expression of TRPV1 and CGRP in the myocardial tissue of chronic heart failure rats. Zhen Ci Yan Jiu. 49 (6), 551-557 (2024).
  32. Zhang, X. N., et al. Electroacupuncture and moxibustion-like stimulation activate the cutaneous and systemic hypothalamic-pituitary-adrenal axes in the rat. Acupunct Med. 40 (3), 232-240 (2022).
  33. Zhu, Y., et al. [Effect of moxibustion at "Zusanli"(ST36) and "Shenshu"(BL23) on miR-155-mediated TLR4/NF-κB signaling involving amelioration of synovitis in rheumatoid arthritis rats]. Zhen Ci Yan Jiu. 46 (3), 194-200 (2021).
  34. Wu, R., et al. Effects of Tim-3 silencing on the viability of fibroblast-like synoviocytes and lipopolysaccharide-induced inflammatory reactions. Exp Ther Med. 14 (3), 2721-2727 (2017).
  35. Nozaki, Y., et al. Inhibition of the TIM-1 and -3 signaling pathway ameliorates disease in a murine model of rheumatoid arthritis. Clin Exp Immunol. 218 (1), 55-64 (2024).
  36. Li, X., Zhao, Y. Q., Li, C. W., Yuan, F. L. T cell immunoglobulin-3 as a new therapeutic target for rheumatoid arthritis. Expert Opin Ther Targets. 16 (12), 1145-1149 (2012).
  37. Skejoe, C., et al. T-cell immunoglobulin and mucin domain 3 is upregulated in rheumatoid arthritis, but insufficient in controlling inflammation. Am J Clin Exp Immunol. 11 (3), 34-44 (2022).
  38. Zhang, Y., et al. Tim-3 negatively regulates IL-12 expression by monocytes in HCV infection. PLoS One. 6 (5), e19664(2011).
  39. Kun, L., et al. Moxibustion inhibits the macrophage M1 polarization toll-like receptor 4/myeloid differentiation factor 88/nuclear factor kappa B signaling pathway by regulating T-cell immunoglobulin and mucin-containing protein-3 in rheumatoid arthritis. J Tradit Chin Med. 44 (6), 1227-1235 (2024).
  40. Liu, X., et al. Tim-3 Regulates Tregs' Ability to Resolve the Inflammation and Proliferation of Acute Lung Injury by Modulating Macrophages Polarization. Shock. 50 (4), 455-464 (2018).
  41. Wang, F., et al. Overexpression of Tim-3 reduces Helicobacter pylori-associated inflammation through TLR4/NFκB signaling in vitro. Mol Med Rep. 15 (5), 3252-3258 (2017).
  42. Dixon, K. O., Lahore, G. F., Kuchroo, V. K. Beyond T cell exhaustion: TIM-3 regulation of myeloid cells. Sci Immunol. 9 (93), eadf2223(2024).
  43. Paul, S., Chhatar, S., Mishra, A., Lal, G. Natural killer T cell activation increases iNOS(+)CD206(-) M1 macrophage and controls the growth of solid tumor. J Immunother Cancer. 7 (1), 208(2019).
  44. Luo, M., Zhao, F., Cheng, H., Su, M., Wang, Y. Macrophage polarization: an important role in inflammatory diseases. Front Immunol. 15, 1352946(2024).
  45. Peng, Y., et al. Regulatory Mechanism of M1/M2 Macrophage Polarization in the Development of Autoimmune Diseases. Mediators Inflamm. 2023, 8821610(2023).
  46. Lazarov, T., Juarez-Carreño, S., Cox, N., Geissmann, F. Physiology and diseases of tissue-resident macrophages. Nature. 618 (7966), 698-707 (2023).
  47. Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  48. Chang, J. W., et al. Nesfatin-1 Stimulates CCL2-dependent Monocyte Migration And M1 Macrophage Polarization: Implications For Rheumatoid Arthritis Therapy. Int J Biol Sci. 19 (1), 281-293 (2023).
  49. Takayanagi, H. Osteoimmunology: shared mechanisms and crosstalk between the immune and bone systems. Nat Rev Immunol. 7 (4), 292-304 (2007).
  50. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423 (6937), 349-355 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Moksib syon TedavisiMakrofaj MigrasyonuRomatoid Artritli S anlarTIM 3 EkspresyonuLentiviral RNA nterferansTranswell AnaliziELISA Analizimm nofloresan BoyamaWestern Blot
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.