Araştırma makalesi

Dengue Virüsü tip 2-enfekte Memeli Hücrelerinden Ekzozomla zenginleştirilmiş ekstraselülük veziküllerin izolasyonu ve karakterizasyonu

DOI:

10.3791/70437

⸱

27 Mart 2026

 ,  ,  ,  , 
1Medical Laboratory Science Program, Texas State University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, Dengue virüsü tip 2 enfekte hücre kültüründen ekzosomla zenginleştirilmiş ekstraselüler veziküllerin izolasyonunu, ardından vezikül bütünlüğü ve boyut dağılımının karakterizasyonunu ve tanımlanmış deneysel koşullarda plak testi ile tespit edilebilir enfeksiyon virüsün yokluğunun değerlendirilmesini anlatıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekzozomla zenginleştirilmiş EV'ler, çeşitli hücre tiplerinden plazma, idrar, tükürük, hücre kültürü ortamları ve diğer vücut sıvıları gibi ekstrasellüler sıvılara salınan veziküllerdir. Çapları 30 nm ile 150 nm arasında değişir. Enfeksiyon sırasında hücresel iletişim ve bağışıklık modülasyonu dahil olmak üzere farklı hücresel süreçlerde rol oynadıkları belirtilmiştir. Bu etkilere dayanarak, çeşitli virüsün patogenezini incelemek için kullanılmıştır. Ekzozom zenginleştirilmiş EV'leri virüsle entelenmiş hücre süpernatantlarından mevcut arıtma teknikleriyle izole etmek zordur. Bu büyük ölçüde bazı virüsler ile Ekzosomla zenginleştirilmiş elektrikli araçlar arasındaki boyut örtüşmesinden kaynaklanıyor. Burada, Dengue tip 2 enfekte hücre kültürü süpernatantından Exozom zenginleştirilmiş EV'leri arındırmayı hedefliyoruz. Ekzosomla zenginleştirilmiş elektrikli araçlar, ticari bir ekzosom izolasyon kiti kullanılarak izole edildi. Bu protokoldeki izole Ekzosomla zenginleştirilmiş EV'ler için, test edilen koşullarda plak testiyle bulaşıcı bir virüs tespit edilmedi. Arıtılmış ekzosomla zenginleştirilmiş EV'ler, tetraspaninler için western blotting, nanopartikül takip analizi ve boyut doğrulaması için geçirimli elektron mikroskopisi kullanılarak karakterize edildi. Ekzosomla zenginleştirilmiş EV'lerimizin sağlam olduğunu ve normal ekzosom çapı aralığı olan 30-150 nm içinde olduğunu gösterdik. Genel olarak, protokolümüz virüsle enfekte hücre kültürü süpernatantından ekzosomla zenginleştirilmiş EV'lerin arındırılması için ucuz bir yöntem sunar; bu yöntem sonraki fonksiyonel testlerde kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekzosomla zenginleştirilmiş EV'ler, vücuttaki her hücre tarafından salınan nanoboy veziküllerdir. Endositik kökenli ekstraselüler veziküllerin (EV) alt tipleridir. Ekzosomla zenginleştirilmiş EV'ler ilk olarak retikülosit kültüründekeşfedildi 1. Son birkaç on yılda, ekzosomla zenginleştirilmiş EV'ler kan, idrar, tükürük, anne sütü, tohum sıvıları ve amniyotik sıvılar dahil olmak üzere çeşitli vücut sıvılarındanarındırıldı 2,3,4,5. Çapları 30 nm'den 150nm 6'ya kadar değişiyor. Bunların hücre dışı kompartmana salınması, hücre plazma zarı ile çoklu veziküler cisimlerin (MVB) birleşmesiyle gerçekleşir. Enfeksiyonlar ve bağışıklık yanıtı bağlamında, ekzosomla zenginleştirilmiş EV'lerin memeli hücrelerinde spesifik bir yanıt tetiklediği bilinmektedir. Bu tepkiler arasında sitokinlerin salınımı veya enfeksiyonayatkınlıkta değişiklikler yer alır 7,8,9.

Ekzosomla zenginleştirilmiş EV'lerin içeriği, onları üreten hücrenin türü ve durumu olmak üzere çeşitli faktörlerdenetkilenir. Ayrıca, içerikleri saf alıcı hücreler üzerindeki etkilerini de belirler. Şu anda biyolojik sıvılardan ekzosomla zenginleştirilmiş EV'leri izole etmek için çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Yaygın yöntemler arasında diferansiyel ultrasantrifüjleme, çökeltme, immünoafinite yakalama, boyut dışlama kromatografisi, manyetik tabanlı izolasyon ve mikrofluidik tabanlı izolasyon bulunur.

Diferansiyel ultrasantrifüj, en çok kullanılan tekniklerden biri olarakkabul edilir 12,13,14. Ultrasantrifüj arıtma yöntemi pahalıdır ve önemli teknik yeterlilik gerektirir. Bu yöntem, çoklu ultrasantrifüj adımları nedeniyle EV'lerde önemli bir kayıp ile sonuçlanır. Son olarak, ortaya çıkan ekzosomla zenginleştirilmiş EV'ler, benzer fenotipik özelliklerinden dolayı aktif viral parçacıklardan arınmış değildir. Bu durum, virüsle ente hücre süpernatantından ekzozom zenginleştirilmiş EV'lerin arındırılmasını zorlaştırdı. Bu nedenle, virüslerin ekzosomlarla zenginleştirilmiş EV çözümünde denge virüsü (DENV) seviyelerini tespit edilemez seviyelere etkili şekilde indirmek için optimize edilmiş bir protokol geliştirmek önemlidir; çünkü virüslerekzosomlar 15,16 ile benzer boyut ve yoğunluklara sahiptir.

Yaygın kullanılan diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, bu protokol daha kısa arıtma süresi, ucuz ve yaygın laboratuvar ekipmanlarına güvenme ve ekzozomla zenginleştirilmiş EV'leri tespit edilebilir canlı viral kontaminasyon olmadan izole etme gibi çeşitli avantajlar sunar. Ayrıca, yoğunluk gradyanı santrifüjü ve manyetik tabanlı izolasyon gibi yöntemler daha yüksek verim ve daha yüksek saflık gibi avantajlar sunabilse de, bu yaklaşımlar başlangıçta bir ultrasantrifüj adımı gerektirir. Bu makalenin amacı, test edilen koşullarda tespit edilemeyen enfekte virüsün tespit edilemeyen süpernatantlarından ekzosomla zenginleştirilmiş EV'lerin plak testi ile izole edilmesi için bir yöntem sunmaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekzosomsuz medyanın hazırlanması

  1. Sınıf II biyogüvenlik kabini (BSC) içindeki alıcı tabanına 0.1 μm bir filtre takın.
  2. Isıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumunu (FBS) filtreye aseptik olarak döküp BSC içindeki vakum pompasına takın.
  3. Flow through ile 1.2. adımı iki kez daha tekrarlayın.
  4. Tam ortam için %10 üçlü filtrelenmiş FBS, %1 penisillin/streptomisin ve %1 L-glutamin içerecek şekilde hazırlanın.
    NOT: Üçlü filtrasyon yöntemi, ultrasantrifüj gibi aletlere ihtiyaç duyulmaması için kullanılır.

2. Memeli hücrelerinde deng virüsü enfeksiyonu

  1. Vero hücreleri, 37 °C'de %5CO2 ile doku kültürü inkübatöründe bir T75cm 2 kültür şişesinde gece boyunca yetiştirin.
  2. Ertesi gün, hücrenin %70 ile %80 arasında birleştiğinden emin olun ve hücreleri 5 mL tam ortamda 0.1 katlık enfeksiyon (MOI) DENV-2 ile enfekte edin ve 37 °C'de %5CO2 ile 2 saat boyunca kuluçka yapın.
  3. 2 saat sonra süpernatantı çıkarın ve termosunu steril Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile 3 kez yıkayın.
  4. Şişeye 50 mL tam ortam ekleyin ve 37 °C'de %5CO2 ile 4 gün boyunca kuluçka yapın (sitopatik etkiler gözlemlenmeden hemen önce).

3. Kit tabanlı ekzozom arıtması

  1. Hücre kültürü ortamını şişeden 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 200 × g boyunca 15 dakika boyunca santrifüj yapın.
  2. Medyayı yeni bir konik tüpe aktarın. 125 μL EV çökeltme reaktivi ekleyin, ardından 600 μL reçine ekleyin. Vortex 10 saniye bekleyin ve oda sıcaklığında BSC'nin içinde 10 dakika bekletin.
  3. Vortex ile 10 saniye daha ve yaklaşık 450 × g sıcaklıkta oda sıcaklığında 2 dakika santrifüj yapın. BSC'ye aktarın, süpernatantı atın ve pellete 600 μL resüspansiyon tamponu uygulayın.
  4. 10 saniye girdabda geçirin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka yapın.
  5. Vortex ile 10 saniye daha ve yaklaşık 25 × g ile oda sıcaklığında 2 dakika santrifüj yapın.
  6. Süpernatantı bir Filtre Dönme kolonuna aktarın ve yaklaşık 4.500 × g sıcaklıkta oda sıcaklığında 1 dakika boyunca santrifüj yapın. Ekzosomla zenginleştirilmiş sağlam EV'leri içeren akış yüzeyini toplayıp -80 °C'de saklamaya hazır hale gelene kadar sakla.
  7. Ekzosomla zenginleştirilmiş EV'nin canlı virüslerden arınmış olduğunu plak testi17 ile doğrulayın.
  8. Boyut için elektron mikroskopi ve boyut dağılımı ilekonsantrasyon 18 için nanopartikül takip analizi kullanarak ekzosomla zenginleştirilmiş EV'yi karakterize edin.

4. Ekzosomla zenginleştirilmiş EV'nin western blot'la karakterizasyonu

  1. Ekzozomla zenginleştirilmiş EV'nin protein konsantrasyonunu BCA gibi testlerle belirleyin.
  2. Ekzosomla zenginleştirilmiş EV çözeltisi ve RIPA tamponunu eşit hacimde karıştırın ve 4x LDS yükleme tamponu (4:1) ekleyin.
  3. Ekzosomla zenginleştirilmiş EV proteinlerini %4-12 Bis-Tris jeli kullanarak ayırın.
  4. Proteinleri nitroselüloz membranına aktarın.
  5. Oda sıcaklığında 1x TBS-Tween tamponunda çözünmüş %5 yağsız süt ile 1 saat blok yapın.
  6. Birincil antikorları %5 yağsız kuru süt kullanarak 1:1.1000 derecesinde seyreldin ve gece boyunca 4 °C'de CD63 ve CD9 gibi ekzosom proteinleri için zarı inceleyin.
  7. Birincil antikoru çıkarın ve 5x 5 dakika boyunca 1x TBS-Tween tamponu ile sallanan bir sallayıcı üzerinde yıka.
  8. İkincil antikoru (anti Rabbit IgG HRP) yağsız kuru sütle 1:5.000 derecesine seyreldin ve bu çözeltiyle zarı oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın.
  9. İkincil antikoru çıkarın ve 1x TBS-Tween tamponu ile 5 x 5 dakika boyunca sallanan bir tampon üzerinde yıkayın.
  10. ECL tespit reaktifi kullanarak zarı geliştirin ve kemimilüminesans görüntüleme cihazı ile protein sinyallerini tespit edin.

5. Eksozom zenginleştirilmiş EV'lerin iletim elektron mikroskobu ile karakterizasyonu

  1. 200 ağlık bakır ızgaralara formvar ve karbon kaplamalı 5 μL ekzozom örneği eklenir ve oda sıcaklığında hava kurumasına izin verilir.
  2. Izgiyi %1 sulu uranil asetat ile 60 saniye boyanıp hava kurut.
  3. Görüntüyü 80 kV18'de TEM ile yakalayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolde tanımlandığı gibi izole ekzosomla zenginleştirilmiş EV'yi, karışımda aktif DENV-2 parçacıklarını tespit edip edemeyeceğimizi belirlemek için plak testi kullanarak analiz ettik. Şekil 1'de gösterildiği gibi, pozitif kontrol koşullarına kıyasla test edilen koşullarda plak tespit edilmemiştir. Bu sonuçlar, enfeksîyoncu virüsün plak testinin tespit eşiğinin altında olduğunu göstermektedir. Plak testi biyolojik üçlükler...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enfeksiyon hastalıkları araştırmalarındaki son ilerlemeler, virüsle enfekte olan naif hücrelerden salınan ekzosomla zenginleştirilmiş EV'lerin konak bağışıklık yanıtını modüle etmede kritik rol oynadığını göstermiştir 7,8,9. Ekzosomla zenginleştirilmiş EV'ler, uygun antiviral yanıt teşvik ederek bağışıklık savunmasını artırabilir ya da aksine, konak savunma mekanizmalarını baskılayarak viral bağ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Amerikan Klinik Laboratuvar Bilimleri Derneği (ASCLS) araştırma hibesi ve Texas State Üniversitesi tarafından sağlanan Araştırma Geliştirme Programı (REP) fonu tarafından desteklenmiştir

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti Tavşan IgG-HRP bağlantılı antikorHücre Sinyalizasyonu7074Sİkincil antikor
CD63Hücre Sinyalizasyonu52090SBirincil antikor
CD9Hücre Sinyalizasyonu13174SBirincil antikor
Hücre kültürü ortamı ekzozom arındırma kitiNorgen60600Ekzozom arıtma kiti
Dengue virüsü 2ATCCVR-1584Virüs
DMEMFisher bilimsel11-995-073Kültür medyası
EMEMATCC30-2003Kültür medyası
FEI Talos F200X İletim Elektron MikroskobuThermofisher Scientific
Fetal Sığır EerumNöromikFBS002Medya Eki
Nano parçacık takip analizörüParçacık Metrixi
Vero hücreleriATCCCCL-81Memeli hücre hattı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation: Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). J Biol Chem. 262 (19), 9412-9420 (1987).
  2. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J Transl Med. 9, 86(2011).
  3. Lässer, C., et al. RNA-containing exosomes in human nasal secretions. Am J Rhinol Allergy. 25 (2), 89-93 (2011).
  4. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).
  5. Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  6. Hessvik, N. P., Llorente, A. Current knowledge on exosome biogenesis and release. Cell Mol Life Sci. 75 (2), 193-208 (2018).
  7. Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected cells stimulate production of pro-inflammatory cytokines through trans-activating response (TAR) RNA. J Biol Chem. 291 (3), 1251-1266 (2016).
  8. Fleming, A., et al. The carrying pigeons of the cell: Exosomes and their role in infectious diseases caused by human pathogens. Pathog Dis. 71 (2), 109-120 (2014).
  9. Olanrewaju, A. A., Hakami, R. M. The messenger apps of the cell: Extracellular vesicles as regulatory messengers of microglial function in the CNS. J Neuroimmune Pharmacol. 15 (3), 473-486 (2020).
  10. Tauro, B. J., et al. Two distinct populations of exosomes are released from LIM1863 colon carcinoma cell-derived organoids. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 587-598 (2013).
  11. Pallet, N., et al. A comprehensive characterization of membrane vesicles released by autophagic human endothelial cells. Proteomics. 13 (7), 1108-1120 (2013).
  12. Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circ Res. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  13. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  14. Ter-Ovanesyan, D., et al. Framework for rapid comparison of extracellular vesicle isolation methods. Elife. 10, e70725(2021).
  15. Sampey, G. C., et al. Exosomes and their role in CNS viral infections. J Neurovirol. 20 (3), 199-208 (2014).
  16. Jeppesen, D. K., et al. Reassessment of exosome composition. Cell. 177 (2), 428-445.e18 (2019).
  17. Shi, L. Z., et al. N-butanol extract of Glycyrrhizae radix et rhizoma inhibits dengue virus through targeting envelope protein. Pharmaceuticals (Basel). 16 (2), 263(2023).
  18. Alem, F., et al. Exosomes originating from infection with the cytoplasmic single-stranded RNA virus Rift Valley fever virus (RVFV) protect recipient cells by inducing RIG-I mediated IFN-β response that leads to activation of autophagy. Cell Biosci. 11 (1), 220(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Exosome Enriched EVsExtracellular VesiclesDengue VirusVirus Infected CellsExosome IsolationCell Culture SupernatantWestern BlottingNanoparticle TrackingTransmission Electron MicroscopyImmune Modulation

İlgili makaleler