Deneysel tasarım ve kurgu hazırlığı
Deney, 2023 ve 2024 yıllarının Temmuz ve Ağustos başlarında gerçekleştirildi. Genellikle Ohio'da soya fasulyesi yetiştirme sezonu yaklaşık olarak Nisan'dan Kasım'a kadar gerçekleşir. 2023 yetiştirme sezonunda kullanılan alanlar Ohio, Clinton County (39.488, -83.769) ve Union County (40.296, -83.283) bölgelerinde bulunuyordu. 2024 yetiştirme sezonunda kullanılan alanlar Clinton County (39.489, -83.762), Preble County (39.893, -84.611) ve Licking County (39.948, -82.501), Ohio'da yer almaktadır.
Deney, soya fasulyesi alanında mekansal etkileri kontrol etmek için rastgele tam blok tasarımı kullandı. Her blok içinde, belirli bir tedavi için 5 saz belirlendi. Tedaviler iki büyüme aşaması (R3 ve R5) ve iki uygulama zamanlaması (sabah ortası ve öğlesi) ile tedavi edilmemiş bir kontrol yöntemini içeriyordu. Bu sonuçta, her bloktaki arazilerde şu 4 pestisit uygulaması yapıldı: R3 sabah ortası, R3 gün ortası, R5 sabah ortası, R5 gün ortası. Sabah ortası veya öğle içi başvurular ~2 saat içinde gerçekleşirken, sabah ortası başvuruları yaklaşık 10:00 civarında, öğle başvuruları ise yaklaşık 12:30 civarında. Her blok içindeki 5 arıtma alanına ek olarak, 3 parde yedek olarak belirlendi ve soya fasulyesi zayıf yerleşmesi veya büyümesi durumunda tedavi alanlarına dönüştürülebilirdi. Soya fasulyesi bitki aşamaları, Minnesota Üniversitesi Extension39 tarafından yayımlanan aşama rehberleri gibi yöntemlerle belirlendi.
Soya fasulyesi alanları blokları, araştırmacıların aralarında kolayca yürüyebilmesi için yaklaşık 1.016 m (40 inç) aralıklarla yerleştirildi. Soya fasulyesi alanları 1,9 m x 8,5 m (0,0016 ha; 6,25 ft x 28 ft) boyutlarında olup, tüm alanlar için kullanılan soya çeşidi Pioneer P35T155E (Corteva, Indianapolis, IN) idi. Her parsa 6 sıra dikildi ve araları 38 cm (15 inç) aralıklarla yerleştirildi. Ekin oranı hektar başına 370.658 tohum (ac başına 150.000 tohum) olarak kullanılmıştır. Deneye katılan arıların hepsi yerel popülasyonlardan geliyordu. Araştırmacılar tarafından ek arılar eklemedi. Yazarlar, deney alanlarının yakınında ne sabit ne de göçmen arılar hakkında hiçbir bilgiye sahipti. Deneyde kullanılan tüm malzemeler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.
Pestisit hazırlığı
Kullanılan pestisitler Fitness fungisid'i (%41,8 propikonazol aktif bileşeni) ve Fastac EC insektisid (%10,9 alfa-sipermetrin aktif bileşeni) idi. Pestisit uygulama oranları SBI fungisid'i için 6 fl oz/ac (438,47 mL/ha) ve piretroid böcek ilacı için 3,8 fl oz/ac (277,70 mL/ha) idi. Pestisitleri uygulamaya hazırlamak için, 9,375 mL SBI fungisit ve 5,937 mL piretroid böcek ilacı suyla karıştırıldı ve tank karışımı olarak 3 L nihai hacim elde edildi. Karışım hazırlanırken kimyasal dirençli eldivenler takıldı. Tanktaki SBI fungisitinin nihai konsantrasyonu litrede 3,125 mL idi. Tanktaki son piretroid insektisil konsantrasyonu 1.979 mL başına L idi.
Pestisit uygulaması
Bu karışım, her blok içindeki bireysel soya fasulyesi alanlarına özel hazırlanmış bir sırt çantası püskürtücüyle uygulandı. Pestisit karışımı, soya fasulyesi örtüsünün üst kısmına ~5 km/saat hızla uygulandı. Belirli bir tedavi için pestisit uygulama sürecine başladıktan sonra, tüm arsaların uygulaması ~10 dakika sürdü. Her 3 L'lik tank için, pestisit karışımıyla ~0,027 hektarlık bir alan kaplanabilir. Hektar başına tüketilen püskürt hacmi yaklaşık 113 L'dir. Bu, her grafik başına ~0.18 L tank karışımı uygulandığı anlamına gelir. Rüzgar nedeniyle pestisitlerin diğer alanlara kaymasını önlemek için, rüzgarlı günlerde uygulamalar kaçınıldı. Pestisit uygulanırken tam kişisel koruyucu ekipmanlar (uzun kollu gömlek ve uzun pantolon, kimyasal dirençli eldivenler, ayakkabılar ve çoraplar ve koruyucu gözlükler) giyildi. Bir pestisit uygulaması tamamlandıktan sonra fazla pestisit karışımı varsa, eyalet çevre kontrol ajansının tavsiyelerine göre bertaraf edilirdi.
Kaydedici kurulum/kullanım
Ses kaydedicilerinin genel kurulumu ve kullanımı, diğer yazarlar tarafından tanımlanan protokolebenzer, 40. Elde taşınabilir ses kaydedicileri (Sony ICD-PX370), plastik basamaklı elektrikli çitlere kanca-halka bantla sabitleniyor ve mikrofonun üzerine açık hücreli köpük ön cam olarak yerleştiriliyordu. Hava koşullarından korumak için kazığa, kayıt cihazının ~3 cm üzerindeki konuk şeklinde 3D baskılı yağmur örtüsü yapıştırıldı.
Ses kaydediciler, ilk pestisit uygulamasından ~24 saat önce her parselin ortasına yerleştirilir ve her uygulamadan sonra en az 24 saat çalışır halde bırakılırdı. Her başvuru günü için on iki kayıt cihazı, her saat grubu için (sabah ortası, öğle, kontrol) dört tane R3 ve R5'te konuşlandırıldı.
Ses veri işleme
Tüm ses kayıtları, makine öğrenimi aracı "buzzdetect"41 aracılığıyla işlenmiştir ve bu araç şu adreste bulunabilir: https://github.com/OSU-Bee-Lab/buzzdetect. Bu araç, böcek vızıltısı seslerini, deneysel ortamda sıkça ortaya çıkan diğer seslerden, örneğin arabalar, kombonlarla veya uçaklardan ayırt etmek için eğitilmiştir. Program, Apis mellifera vızıltısını diğer arı türlerinden ayırt edemiyor. Ancak buzzDetect, vızıltı seslerini diğer vızıltı olmayan böcek seslerinden ayırt edebiliyor, ancak özellikle gece saatlerinde kriket çağrıları gibi belirli sesleri ayırt etmek hâlâ zordur. buzzDetect'in nasıl çalıştırılacağına dair daha spesifik talimatlar şu adreste bulunabilir: https://buzzdetect.readthedocs.io/en/latest/gui/. Ses analizinden sonra, 1 saat ve 8 saatlik zaman aralıkları içinde tespit oranı hesaplamak için R42 kullanıldı.
Yaprak dökülme verileri
Yaprak dökülme değerlendirmeleri, deneye katılan her parselede, Nebraska ÜniversitesiExtension 43 tarafından önerildiği tüm tedaviler ve tedavi edilmemiş kontrol alanları dahil olmak üzere üst soya fasulyesi örtüsünden yaprakların görsel olarak değerlendirilmesiyle gerçekleştirildi. Bu değerlendirmeler, pestisit uygulamasından 24 saat sonra, R5 büyüme aşamasında yapıldı.
Verim verileri
Soya fasulyesi hasat edildi ve verim, bir arazi kombüneti ve tahıl ölçer tartı sistemi kullanılarak dönüm başına bushel cinsinden ölçüldü. Verim ölçümleri %13 nem olarak ayarlandı. Arsalar her biri 6 satırdan oluşuyordu; sadece 4 orta sıra verim ölçümü için hasat edildi.
İstatistiksel analiz
Tüm istatistikler R42'de gerçekleştirildi. Veriler, lme4paketi 44 üzerinden karışık etkili lineer modellerle veya glmmTMB paket45 üzerinden beta regresyonuyla analiz edildi. BuzzDetect'ten alınan ham veriler ek materyallerde mevcuttur. Bu çalışma için üç ana veri türü analiz edilmiştir. Pestisit uygulamasından sonra 1 saat ve 8 saat boyunca ortalama arı aktivite verileri, her soya fasulyesi parlesinin verimi ve R5 büyüme aşamasında gözlemlenen soya fasulyesinin yaprak dökülmesi.
Ortalama arı aktivitesi, arı vızıldamasının pozitif zamanının 8 saatlik veya 1 saatlik bir pencerede hesaplanmasıyla elde edildi. 1 saatlik pencere, pestisit uygulamasının arı aktivitesi üzerindeki akut etkilerini tahmin etmek için, 8 saatlik pencere ise akut ve kalıntı etkileri tahmin etmek için tasarlanmıştır. Alfa-sipermetrin için kalıntı toksisite verileri mevcut değildir, ancak diğer piretroidler için kalıntı toksisitenin ilk uygulamadansonra ~8 saat olduğu bildirilmiştir 46. Arı aktivitesi için hesaplama orantı olduğundan, aktivite farkları R paketi "glmmTMB" ile yapılan beta regresyon kullanılarak analiz edilmiştir. Modeller, pestisit uygulamasından sonra 1 saat veya 8 saat ortalama tespit oranlarını ve bu oranların kontrol alanlarıyla ("püskürtülmüş" durum), soya fasulyesi büyüme aşaması, pestisidin uygulandığı günün saati veya büyüme aşaması ile etkileşim zamanı karşılaştırıldığında nasıl değiştiğini inceledi. İşlenmiş ve kontrol grafikleri arasındaki karşılaştırma, hem 1 saatlik hem de 8 saatlik model formüllerinde "püskürtülen" değişkenle referans alınır.
1 saatlik pencere modelinde sabit etkiler "püskürtülmüş" durum, büyüme aşaması, günün saati ve büyüme aşaması ile günün zaman etkileşim terimi idi. Modelde hem bir yıl hem de bir yıl ile bir yıl aralarındaki etkileşim terimi rastgele etkiler olarak uyguluyordu. Tam model formülü şöyleydi:
(1)
Değişken tespit oranı, toplam gözlem penceresine göre gözlemlenen ortalama arı tespitlerini yansıtır—bu durumda 1 saat. Püskürtülen değişken, bir parselin pestisit uygulanıp uygulanmadığına veya işlenmemiş bir kontrol alanına karşılık gelir. Değişken time_of_day , tespitlerin sabah ortası veya öğle pestisit uygulamalarından sonra istenen zaman diliminde yakalanmadığına karşılık gelir. Değişken aşaması, tespitlerin yakalandığı büyüme aşamasına karşılık gelir.
8 saatlik pencere modelinde sabit etkiler büyüme aşaması ve "püskürtülmüş" durumdu. 8 saatlik model, öğle sprey zamanı için gece saatlerini içeriyor, bu da sabah ortası ile öğle püskürtme saatleri arasında haksız bir karşılaştırma yaratıyor. Bunun nedeni, öğle uygulaması zamanlarının, arıların akşamları hareketsiz kalmasından dolayı tam 8 saatlik kalıntı toksisiteyi test etmemesidir; bu 8 saatlik aralıkların büyük bir parçasıdır. Bu nedenle, öğle uygulamaları modelden çıkarıldı, aynı zamanda "günün saati" ve "günün saati: sahne" terimleri de dahil edildi. Bu modelin tam formülü şuydu:
(2)
Değişkenlerin tespit hızı, püskürtülme ve aşama bu formülde, 1 saatlik pencereler için kullanılan formülle aynı anlamlara sahiptir. Tek fark, değişken tespit oranının 8 saatlik bir pencere için hesaplanmasıdır. Verim verileri karışık etkili doğrusal bir modelle analiz edildi. Model, her parsel için dönüm başına bushel miktarına ve verimin tedaviye göre nasıl değiştiğine baktı. Modeldeki sabit etki tedavi oldu ve site ile yıl rastgele etkiler olarak uyduruldu. Tam model formülü şu şekilde yazılır:
(3)
Soya yaprağı yapraklarının dökülmesi, her bir parsel başına eksik yaprak yüzeyi alanının ortalama yüzdesi olarak ölçüldü. Pestisit uygulamasının günün saatinin yaprak dökülme yüzdesi üzerindeki etkisini karşılaştırmak için karışık etkiler doğrusal bir model kullanıldı. Modeldeki sabit etki, alanların günün ne saatinde püskürtüldüğündü. Site ve yıl rastgele etkiler olarak eşleştirildi. Tam model formülü şöyledir:
(4)
Bu çalışmada kullanılan tüm protokoller Ek Dosya 1'de derlenmiştir.