Method Article

Yaşlanmış gözyaşı ve tükürük bezlerinden miyoepitel hücreleri ve fibroblastların tek hücre ayrımı, RNA dizileme ve izolyasyonu protokolü

DOI:

10.3791/70441

⸱

April 24th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Scripps Research Institute

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yaşlı fare gözyaşı bezlerinin ayrıştırılmasında optimize edilmiş bir yöntem tanımlayarak tek hücreli RNA dizileme için canlı tek hücreler elde edilir. Ardışık enzimatik sindirim ve nazik kullanım, hücre bütünlüğünü korur ve hücre tipine özgü izolasyon ve yaşlanmaya bağlı değişikliklerin lakrimal bez popülasyonlarındaki transkriptomik analizi için uygun yüksek kaliteli süspansiyonlar sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gözyaşı bezinin (LG) yaşlanması, gözyaşı salgısının azalması ve kronik iltihaplanma ile ilişkilidir; bu da kuru göz hastalığına katkıda bulunur. Yaşa bağlı LG değişiklikleri arasında bağışıklık hücresi sızması, hücresel hasar, acinar hücrelerde lipid birikimi, ekstrasellüler matriks birikimi ve kanal genişleme bulunur. Tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq), yaşlanma sırasında hücresel heterojenliği ve transkripsiyonel değişiklikleri profillemek için güçlü bir yaklaşım sunar; ancak yaşlı LG dokusundan uygulanabilir tek hücreli süspansiyonlar üretmek, artan fibroz, hücresel kırılganlık ve lipid birikimi nedeniyle teknik olarak zordur. Bu çalışma, yaşlı fare LG'lerinin etkin ayrıştırılması ve birden fazla hücre tipinin izolasyonu için optimize edilmiş, tekrarlanabilir bir protokol sunar; bu protokol aşağı akış scRNA-seq analizi için uygundur. Önemli olarak, bu protokol genç gözyaşı bezleri, konjunktiva ve diğer ekzokrin dokular için de geçerlidir. İş akışı, ilk doku sindirimi için Collagenase IV, Dispase II ve DNase I kullanılarak kademeli enzimatik dissosiyasyon stratejisi uygulanır; ardından kalan hücre kümelerini ayırmak için Accutase ve temiz tek hücreli süspansiyon elde etmek için son DNase I tedavisi uygulanır. Hücre hasarını en aza indirmek için, tüm plastik ürünler sığır serum albumini içeren PBS ile önceden kaplanır ve doku işleme kontrollü sıcaklık ve ajitasyon koşulları altında gerçekleştirilir. Kırmızı kan hücresi lizisi ve birkaç süzgüç üzerinden ardışık filtrasyon hücre saflığını daha da artırır. Hücre tipine özgü izolasyon, reporter fare hatları ile floresansla aktive hücre sıralaması (FACS) kullanılarak sağlanır. Acta2GFP ve PdgfraEGFP farelerini kullanarak, EpCAM antikoru ile immünboyamanın ardından sırasıyla miyoepitel hücreleri ve fibroblastları başarıyla izole ettik. FACS, EpCAM⁺/αSMA⁺ miyoepitel popülasyonunun ayrılmasını sağlarken, PdgfraEGFPfarelerinden alınan EGFP⁺ hücreleri fibroblast popülasyonunu temsil etti. Bu protokol, yaşlı LG'lerden yüksek kaliteli, uygulanabilir tek hücreli süspansiyonlar elde eder ve nazik ayrışma ve hedefli hücre izolasyonu gerektiren diğer fibrotik veya yaşlanan ekzokrin dokulara kolayca uyarlanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lakrimal bez (LG), gözyaşı filminin sulu tabakasını salgılamaktan sorumlu ekzokrin bir tubuloasinar bezdir. Yaşam boyunca, kornea yüzeyi ve LG bakteriyel ve viral enfeksiyonlara maruz kalır; bu enfeksiyonlar epitel hücrelerinin sistemsel bozulmasına, kronik inflamatuar yanıtların indükasyonuna, bağışıklık hücresinin LG'ye sızmasına ve rejenerasyon eksikliğine yol açabilir. Yaşlanma, kronik inflamatuar hastalıkların sıknlığının artmasıyla birliktegelir 1. Bunlar arasında, kuru göz hastalığı (DED), dünya genelinde en yaygın on görme bozukluğundan biridir ve yaşlı nüfusta bağımsızlık, hareket kabiliyeti ve günlük işlevselliğin azalmasına büyük katkı sağlar2. DED'nin başlıca nedeni LG disfonksiyonudur3.

Yaş ilerledikçe, fare ve insan LG'si belirgin yapısal ve fonksiyonel değişiklikler geçirir; bunlar arasında asinar hücre atrofisi, kanal genişleşmesi, bağışıklık hücresi infiltrasyonu, fibroz ve lipidbirikimi 4,5,6,7 bulunur. Bu dejeneratif değişikliklere ayrıca LG'nin kronik iltihabı ve doku fibrozisi 3,5,8,9 eşlik eder. Yaşlanma ile LG patolojisi arasındaki açık ilişkiye rağmen, bu değişiklikleri tetikleyen moleküler ve hücresel mekanizmalar hâlâ yeterince anlaşılmamaktadır.

Tek hücreli RNA dizilemesi, hücre popülasyonlarının ve onların transkripsiyon değişikliklerinin10 yaşlanma sırasında kapsamlı profillenmesini sağlar. Bu yaklaşım, yaşlanmanın gen ifade profillerini, bağışıklık hücre infiltrasyonunu ve epitelal-mezenkimal etkileşimleri nasıl değiştirdiğini ortaya koyarak gözlüklü bezdeki farklı hücre tipleri ve durumların tarafsız tanımlanmasını sağlar.

Şu anda, mekanik dissosiyasyonyöntemleri 11 ve 37 °C'de Kollajenaz, Dispaz veya Tripsin12 gibi enzimlerle sıcak enzimatik sindirim protokolleri dahil olmak üzere birçok doku dissosiyasyon yöntemi mevcuttur. Karaciğer, akciğer, böbrek, kalp ve çoklu tümörtipleri 13,14,15 dahil olmak üzere geniş bir doku yelpazesi için çeşitli dissosiyasyon stratejileri tanımlanmıştır. Ancak, yaşlı göz yaşı gland bezi dokusundan uygulanabilir tek hücreli süspansiyonlar hazırlamak, artan fibroz ve hücresel kırılganlık nedeniyle teknik olarak zordur. Ayrıca, daha önce bildirdiğimiz gibi, hassas asinar hücrelerin iyileşmesi zor olabilir; çünkü dissosiyasyonla ilişkili membran geçirgenliğindeki değişiklikler, bu büyük, salgılayıcı hücrelerden çevresel RNA salınımını artırabilir ve bu da aşağı akış tek hücre veri setlerinde arka plan sinyaline katkıdabulunabilir 16. Birçok çalışma yaşlanan lacrimal bezlerin scRNA-seq atlaslarını raporlamış olsa da, bu veri setlerinin kalitesi optimal olmayan dissosiyasyon yöntemleri nedeniyle sınırlı kalmış ve epitel hücrelerinin stromal popülasyonlara göre daha düşük verimine yol açmıştır. Burada, yaşlı fare LG'nin etkin ayrıştırılması ve aşağı akış scRNA-seq ile toplu RNA-seq analizleri için farklı hücre popülasyonlarının izolasyonu için detaylı, optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz (Şekil 1). Bu yaklaşım, yaşa bağlı lacrimal bez disfonksiyonunun altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Protokol, yaşlanmış gözyaşı bezlerinden yüksek kaliteli, uygulanabilir tek hücreli süspansiyonların oluşturulmasını sağlar ve kapsamlı transkriptomik analizler için güvenilir bir temel sağlar. Miyoepitel hücreleri, fibroblastlar ve yaşa bağlı değişiklikler geçiren diğer epitel ve stromal hücre tipleri dahil olmak üzere çeşitli hücre popülasyonlarının ayrıntılı tanımlanması ve moleküler karakterizasyonu mümkün olur. Optimize edilmiş iş akışı hücre bütünlüğünü korur ve stres kaynaklı transkripsiyonel artefaktları en aza indirerek in vivo hücresel durumların doğru temsilini sağlar. Ayrıca, metodoloji geniş çapta uygulanabilir ve diğer dış bezler veya fibrotik dokulara uyarlanabilir; burada nazik doku ayrışması ve farklı hücre popülasyonlarının hassas izolasyonu sonraki tek hücre çalışmaları için kritik öneme sahiptir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri, Scripps Araştırma Enstitüsü'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan protokollere uygun olarak gerçekleştirildi (protokol no. 08-0123; 29 Ağustos 2023'te onaylandı). Scripps Araştırma Enstitüsü'ndeki hayvan bakımı, Uluslararası Laboratuvar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından akredite edilmiştir. Fareler, standart 12 saat ışık/12 saat karanlık döngü altında beslenmiş, yiyecek ve su ile libitum sağlanmıştır. PdgfraEGFP ve Acta2GFP transgenik fare hatları deneylerde kullanılmıştır. Fare çizgileri hakkında ayrıntılı bilgiler "Materyal Tablosu" bölümünde verilmiştir.

1. Genel Hususlar

  1. Biyotehlike maddeler ve hayvan dokularıyla çalışırken NIH EvrenselÖnlemleri 17'yi takip edin. Tüm hayvan çalışmalarını onaylanmış IACUC protokollerine ve belirlenmiş Hayvan Biyogüvenlik Seviyelerine uygun olarak gerçekleştirin.
  2. Ağız pipetinden kaçınarak, keskin maddelerin kullanımını en aza indirerek, aerosol üretme işlemleri için biyolojik güvenlik dolabı kullanarak, uygun PPE giyerek, keskin silahları delinmeye dayanıklı kaplara atarak ve bertaraf edilmeden önce tüm biyotehlike atıkları doğru şekilde etiketleyip dezinfekte ederek standart laboratuvar güvenlik uygulamalarını takip edin.
  3. İş yüzeylerini ve ekipmanlarını uygun dezenfektanlarla (örneğin %10 çamaşır suyu) rutin olarak dezenfekte edin.
  4. Tüm santrifüj adımlarını 4 °C'de önceden soğutulan, soğutmalı bir santrifüjde gerçekleştirin; böylece hücrenin canlılığını koruyun ve sıcaklık kaynaklı stresi en aza indirin.
  5. Akış sitometresi ve hücre ayırıcı ayarlarını özel cihaz konfigürasyonu için optimize edin ve her antikor-florofor konjugatı için uygun kontrol örnekleri kullanarak parametreleri ayarlayın. Aynı sitometre ve ayırma cihazını, sabit, optimize edilmiş ayarlarla, değişkenliği en aza indirmek için deneysel seri boyunca kullanın.
  6. Seçilmiş çözeltileri bir gün önceden hazırlayın ve kullanılana kadar uygun şekilde saklayın. Tüm çözeltileri steril koşullarda bir biyogüvenlik dolabında hazırlayın.
  7. Ca2+/Mg 2+ içeren çözeltileri, enzimatik adımlarda şelatasyonu önlemek için EDTA içeren tamponlardan ayrı tutun. Bu işlem için gereken tüm reaktifler Malzeme Tablosu'nda gösterilmiştir.

2. Plastik eşyalar

  1. Steril koşullarda, kapları, tüpleri ve şırıngaları 1x PBS + %1 BSA ile oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca önceden kaplama yapın. Aspirasyon yapın ve her şeyi steril tutun, ta ki kullanılana kadar.
  2. Pipet uçlarını önceden kaplama. Her uçla 1x PBS + %1 BSA üç kez iç yüzeyi kaplamak için aspirasyon yapın ve dağıtın. Kaplı uçları steril uç kutusuna geri koyun ve steril kuluçka içinde gece boyunca kurumasına izin verin. Bu önceden kaplanmış uçları ertesi gün hücre izolasyonu sırasında kullanın.

3. Çözümler ve tamponlar

  1. DNase I Stoku (5 mg/mL)
    1. 5M NaCl dipçikten 150 mM NaCl hazırlayın ve çözeltiyi steril filtreleyin.
    2. Filtrelenmiş 150 mM NaCl çözeltisine 1 M CaCl₂ ekleyerek 5 mM CaCl₂ nihai konsantrasyon elde edilir.
    3. 100 mg DNase I'yi 20 ml 150 mM NaCl / 5 mM CaCl₂ tamponunda yeniden askıya alın, böylece 5 mg/mL DNase I stok çözeltisi elde edin.
    4. 500 μL alikot hazırlayın ve onları −20 °C'de 6 aya kadar saklayın. Enzim aktivitesinin kaybını önlemek için tekrar tekrar donma-çözülme döngülerinden kaçının.
  2. Sindirim ortamı
    1. Deneyden bir gün önce, orta bazlı karışımı DMEM/F12 ile %0,5 BSA karıştırarak hazırlayın ve filtreleyin.
    2. Baz ortam DMEM/F12 / %0,5 BSA eklemek için sırasıyla 15 mM ve 3 mM nihai konsantrasyonlar elde edilmek için 1M HEPES ve 1M CaCl₂ ekleyin.
    3. Kullanımdan hemen önce aşağıdaki enzimleri ekleyin: Kollajenaz IV (1 mg/mL; 125 U/mL), Dispase II (2,5 mg/mL; 1,25 U/mL) ve DNase I (20 U/mL; 5 mg/mL stoktan 0,05 mg/mL).
  3. Bloklama Aracı 1 (BM1)
    1. 1x HBSS'ye 1M HEPES ve 0.5M EDTA ekleyerek sırasıyla 15 mM ve 3 mM nihai konsantrasyonlar elde edilir.
  4. Bloklama Aracı 2 (BM2)
    1. FBS ve 1M HEPES'i DMEM/F12'ye ekleyerek sırasıyla %10 ve 15 mM nihai konsantrasyon elde edilir.
  5. DNaz tedavisi için medium
    1. Deneyden bir gün önce, 1x HBSS ile %0,5 BSA karıştırarak temel ortamı hazırlayın ve filtreleyin.
    2. Baz ortama 1 M HEPES, 1M CaCl₂ ve 1M MgCl₂ ekleyerek sırasıyla 10 mM, 1,5 mM ve 2 mM nihai konsantrasyonları elde edinebilirsiniz.
    3. Kullanımdan hemen önce, hazırlanan karışıma DNase I (200 U/mL; 5 mg/mL stoktan 0.5 mg/mL) ekleyin.
  6. Bloklama Medium 3 (BM3)
    1. Aynı filtrelenmiş baz ortamı 1x HBSS / %0,5 BSA kullanın ve sırasıyla 10 mM ve 1 mM nihai konsantrasyonları elde etmek için 1M HEPES ve 0,5M EDTA ekleyin.
  7. Bloklama Orta 4 (BM4)
    1. Aynı filtrelenmiş baz ortamı 1x HBSS / %0,5 BSA kullanın ve 1M HEPES ekleyin, böylece 10 mM nihai konsantrasyon elde edinin.
  8. FACS Tamponu
    1. Deneyden bir gün önce, temel ortamı %0,5 BSA ile 1x DPBS karıştırarak hazırlayın ve filtreleyin.
    2. 1 M HEPES ve 0.5M EDTA'yı 1x DPBS / %0.5 BSA ile ekleyerek sırasıyla 25 mM ve 1 mM nihai konsantrasyonlar elde edilir.
  9. scRNAseq için medium (MSC)
    1. Deneyden bir gün önce, 1x DPBS ile %0,4 BSA karıştırarak ortamı hazırlayın ve filtreleyin.

4. Doku hasadı ve mikrodiseksiyon (~ 40 - 50 dakika)

  1. Fareyi izofloran ile anestezi yapın ve kurumsal IACUC yönergelerine uygun olarak servikal dislokasyon ile ötenazi yapın.
  2. Göz ile kulak arasındaki deriyi ince forseps ve makas kullanarak kesin ve göz yaşları bezini açığa çıkarmak için nazikçe geri çekin.
  3. Bezi izole etmek için, mat uçlu forseps kullanarak hafifçe kaldırın ve çevresindeki bağ dokusunu nazikçe dairesel hareketlerle ayırın. Göz yaş bezinin sınırları net görünür ve parotis bezi dahil olmak üzere bitişik dokulardan kolayca ayrılmanızı sağlar.
  4. Lakrimal bezi (her bez fare ağırlığı, cinsiyet ve yaşa bağlı olarak yaklaşık 10-25 mg ağırlığında) buz üzerinde 2 mL soğuk 1x PBS içeren 35 mm Petri kabına transfer edin. Bir diseksiya mikroskobu altında, kalan yağı çıkarın ve iki forseps ile bağ dokusu kapsülünü dikkatlice soyun.
  5. Hücre etiketlemesini, küçük bir doku parçasını floresan mikroskopu altında inceleyip beklenen raporlayıcı veya floresan sinyali doğrulayarak doğrulamak, ardından enzimatik sindirime geçin.
  6. Steril 35 mm Petri kabını buz üzerine koyun ve kabın ortasına 800-1000 μL soğuk 1x PBS (hacim bez boyutuna göre ayarlanmış) ekleyin. Bir lakrimal bezi 1x PBS'ye aktarın.
  7. İki steril bistüri kullanarak, bezi küçük parçalara ince kıvamına getirerek yumuşak, pasta benzeri bir kıvam elde elde etmeye başlayın. Doku parçalarının doğranma işlemi boyunca PBS'nin altında kaldığından emin olun, ancak onların kabın üzerinde serbestçe dolaşmasına izin vermeyin.
  8. Kabın bir tarafındaki doku parçalarını toplayın, kalan PBS'yi aspire edin ve parçaları 1 mL taze soğuk PBS ile yıkayın.
  9. Yıkanmış doku parçalarını, her kuyu için önceden ısıtılmış sindirim ortamı için 2 mL içeren 6 kuyu bir plakaya aktarın. Tüm örnekler işlenene kadar plakayı buzda tutun.

5. İlk enzimatik sindirim (~1.5 - 2 saat)

  1. Plakayı 37 °C, 60 rpm'de sallanan su banyosunda 30 dakika kuluçka yapın.
  2. Geniş delikli 1 mL uçla dokuyu 15 kez nazikçe tritüre ile geçirin, ardından plakayı 37 °C, 60 rpm'de sallanma su banyosuna geri döndürün ve ek 30 dakika boyunca.
  3. Numuneyi normal 1 mL uçla 10 kez nazikçe tritüre yapın, ardından plakayı 37 °C, 60 rpm'de sallanma su banyosuna geri getirin ve ek 30 dakika boyunca.
  4. Örneği 10 kez nazikçe tritüre ile geçirin ve hücre süspansiyonunu 2 mL Dolphin mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
  5. Plakanın her bir kuyusuna 1 ml soğuk BM1 ekleyin; böylece kalan sindirim ortamı toplanabilir. Plakayı bir sonraki adıma kadar buzun üzerine koyun.
    NOT: Bu aşamada hâlâ büyük hücre kümeleri veya doku parçaları gözlemleniyorsa, her kuluçka aşamasını ek 10-20 dakika uzatın. Belirtilen triturasyon geçiş sayısını (en fazla 10-15 hafif geçiş) aşmayın, çünkü ek mekanik stres hücre canlılığını tehlikeye atacaktır.

6. Enzimatik aktivitenin ve birincil yıkamaların sonlandırılması (~ 15 dakika)

  1. Hücre süspansiyonunu içeren tüpleri 300 × g sıcaklıkta 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj edin.
  2. Üst yüzeyi at. Başlangıç plakasının her bir kuyusundan (kalıntı hücreleri içeren) BM1'i ilgili tüpe aktarın ve hücre pelletlerini nazikçe yeniden süzüldürün.
  3. Her kuyuyu ek olarak 600 μL soğuk BM1 ile durulayın ve yıkamayı ilgili tüple birleştirerek kalan tüm hücreleri toplayın.
  4. Hücre süspansiyonunu nazikçe yeniden askıya alın, tekrar 300 × g ile 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı atın.

7. Aktüza ve DNaz tedavisi (~ 30 - 35 dakika)

  1. Hücre pelletlerine 1 mL Accutase ekleyin ve nazikçe yeniden süzülün. Tüpü sadece 5-10 dakika boyunca 37 °C ve 60 rpm'de inkübe edin.
    NOT: Tüpü kuluçka sırasında yan yatarak hücrelerin dibine yapışmasını önleyin.
  2. 1 mL pipet ucu kullanarak nazikçe 10 kez tritürleyin.
  3. Accutase'yi seyrelterek enzimatik reaksiyonu sonlandırmak için 1 mL soğuk BM2 ekleyin.
  4. Santrifüj 300 × g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca kullanın ve üst yüzeyi atın.
  5. Hücreleri DNaz tedavisi için ortamda yeniden askıya alın, tüpü üst kısmına kadar doldurun.
  6. RT'de 10 dakika kuluçka yapın, 5 dakika sonra bir kez nazikçe tekrar süzülün.
  7. Bu arada, 1 mL BM3 ile 15 mL konik bir tüp üzerine yerleştirilmiş 70 μm hücre süzgeci önceden ıslatıldı.
  8. Hücre süspansiyonunu süzgeceye aktarın.
  9. Orijinal toplama tüpünü 1 mL BM3 ile durulayın ve durulamayı aynı süzgeceye aktarın.
  10. Süzgeci ek 5 mL BM3 ile yıkayın.

8. Hücre sayımı ve canlılık kontrolü

  1. BM3'te 10 μL filtrelenmiş hücre süspansiyonu alın ve 10 μL Trypan Blue ile karıştırın. Trypan Blue hariç tutulmasını kullanarak hücre konsantrasyonunu ve canlılığı belirleyin ve manuel sayım veya otomatik hücre sayacı ile (örneğin, Countess 3 Otomatik Hücre Sayacı) niceliklerini ölçebilirsiniz. Sadece uygulanabilirlik aşağı akış uygulamaları için gereken eşik değerini karşılarsa (genellikle %70-80) ≥(%70-80) daha ileri ilerleyin.
    NOT: Verim hesaplarken 15 mL'lik tüpteki toplam hacmi ~7-9 mL olarak göz önünde bulundurun.
  2. Aşağı akış uygulamasına göre devam edin. scRNA-seq için 9. Bölüme devam edin. Akış sitometrisine dayalı hücre sıralaması için Bölüm 10'a devam edin.
    NOT: scRNA-seq iş akışı, kalıntı ve çevresel RNA'yı azaltmak ve veri kalitesini artırmak için RBC lizisi ve manyetik ölü hücre çıkarımı içerir. Ancak, bu adımlar, hassas veya nadir epitel popülasyonlarını, özellikle asinar hücreler dahil, tercihen etkileyerek hücre tipi temsili önyargılayabilir. Akış sitometrisine dayalı sıralamada, bu adımlar en iyi iyileşmeyi maksimize etmek ve hücre yüzeyi epitoplarını korumak amacıyla çıkarılmıştır. Bu nedenle iş akışı seçimi, deneysel hedeflere göre yönlendirilmelidir; scRNA-seq veya hücre kurtarımı için veri kalitesini önceliklendirir ve ayırma ile sonraki uygulamalar için kullanılabilirlik önceliklendirilmelidir.

9. ScRNA-seq için hücrelerin hazırlanması (~ 1 - 1,5 saat)

  1. 1x RBC çözeltiyi miliq suyla yeniden oluşturarak 10x RBC çözeltisi hazırlayın.
  2. Hücre süspansiyonunu içeren 15 mL tüpü 400 × g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjle yapın ve süpernatantı atın.
  3. Hücre pelletini 5 mL 1x RBC tamponunda yeniden askıya alın ve RT'de 5 dakika kuluçka yapın.
  4. Tekrar 300 × g ile 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve üst kısmı atın.
  5. Hücre pelletini 2 mL soğuk BM4'te yeniden süzülür.
  6. BM4 içinde 10 μL filtrelenmiş hücre süspansiyonu alın ve hücre konsantrasyonu ile canlılığı değerlendirilmek için 10 μL Trypan Blue ile karıştırın.
  7. MACS 30 μm süzgeci 1 mL 1x HBSS ile önceden ıslatın ve hücre süspansiyonunu süzgeçten 15 mL bir tüpe filtreleyin.
  8. Önceki toplama tüpünü 2 mL soğuk BM4 ile durulayın ve yıkamayı aynı süzgeçten geçirin ve 15 mL tüpe geçirin.
  9. Süzgeci ek olarak 10 mL soğuk BM4 ile yıkayın.
  10. 15 mL'lik tüpü 400 × g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjle yapın ve üst kısmı tamamen çıkarın.
  11. Pelleti 100 μL MACS Mikroboncuklarında nazikçe tekrar süzültü ve RT'de 15 dakika kuluçka yapın.
  12. Bu arada, steril çift damıtılmış su kullanarak Ölü Hücre Temizleme Kitinden 1x Bağlama Tamponu (BB) hazırlayın.
  13. Dengelemek için bir MACS MS kolonunu 500 μL 1x BB ile yıkayın.
  14. Numuneye 400 μL BB ekleyin, hücreleri Mikroboncuklarla yeniden süzülün ve tüm hacmi dengelenmiş MS kolonuna uygulayın. Akışı 15 mL'lik bir tüpe toplayın.
  15. Kolonu dört kez 500 μL BB ile yıkayarak tüm akış kesirlerini toplayın.
  16. Toplanan akışı 400 × g'de 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj edin ve üst yüzeyi atın.
  17. Hücreleri 400 μL MSC tamponunda yeniden süspansiyon ile 1.5 mL bir tüpe aktarın.
  18. Önceki tüpü 700 μL MSC tamponu ile durulayın ve durulamayı numuneyle birleştirin.
  19. 400 × g sıcaklıkta 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın ve üst yüzeyi atın.
  20. Hücre peletini geniş delikli bir uç kullanarak MSC tamponunda yaklaşık 1,5 mL nihai hacme kadar yeniden askıya alın.
  21. Tekrar 400 × g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın ve üst yüzeyi atın.
  22. ~100 μL süpernatan bırakın, peleti nazikçe tekrar süsküyünüz ve 6 μL hücreyi 6 μL Trypan Blue ile karıştırarak hücreleri tekrar sayın.
  23. MSC tamponu ile son hacmi ayarlayarak 700-1200 hücre/μL elde edin ve hücre konsantrasyonunu doğrulamak için hücreleri yeniden sayın.
  24. RBC lizisinden ve ölü hücre çıkarmasından sonra hücre canlılığının %70 (genellikle %70-9≥5) 10x Krom işleme (Krom Tek Hücre 3' Çözelti V3) için yüklemeden önce %70 (genellikle %70-95) olduğundan emin olun.
  25. Temel scRNA-seq kalite kontrol kriterlerini uygulayın: nUMI > 500, nGen > 200 ve mitokondriyal gen fraksiyonu <%15. Daha yüksek metabolik aktiviteye sahip epitel popülasyonlarını korumak için izin veren mitokondriyal eşik (%15) kullanın. Sonraki analizlere yalnızca tüm QC kriterlerini karşılayan hücreleri dahil edin.
    NOT: Bu kalite kontrol eşikleri, veri setlerimizden (Ek Şekil 1) türetilen örnek değerleri temsil ediyor ve öncekiyayınımız 18'de rapor edilmişti.

10. Akış sitometrisine dayalı hücre sıralaması için hücrelerin hazırlanması (~ 1 - 1,5 saat)

  1. MEC ve fibroblastların akış sitometrisine dayalı izolasyonu için, her popülasyonun kesin tanımlanmasını sağlamak için sırasıyla PdgfraEGFP ve Acta2GFP raporlayıcı fare hatları kullanıldı.
  2. 15 mL'lik tüpü hücre süspansiyonu ile 400 × g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve üst süspansiyonu atın.
  3. Hücre pelletini soğuk FACS tamponunda 100 μL'de 5 x 10⁵ ile 2 x 106 hücre arasında nihai konsantrasyona kadar yeniden askıya alın.
  4. FACS telafisi için gereken kontrolleri hazırlayın: negatif kontrol - vahşi tip fareden lekelenmemiş hücreler, arka plan floresans kontrolü - Acta2GFP ve PdgfraEGFP farelerinden lekelenmemiş hücreler, tek boyalı kontrol - deneyde kullanılan her antikorla ayrı ayrı boyanmış vahşi tip fare hücreleri.
    NOT: Her kontrol örneği için en az 1 × 10⁵ hücre 100 μL FACS tamponunda yeniden süspansiyon kullanın.
  5. FcBlock (1:100) ekleyin ve buzda 5 dakika kuluçka yapın.
  6. CD326 (EpCAM)-APC monoklonal antikor (1:100) veya CD140a (PDGFRα) monoklonal antikor (1:100) ekleyin. Buz üzerinde, ışıktan korunarak 45 dakika kuluçka yapın.
  7. Antikor kuluçkası sırasında hücreleri her 15 dakikada bir nazikçe yeniden süzüldürün.
  8. Her tüpü üstüne kadar soğuk FACS tamponu ve santrifüj ile 300 × g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de doldurun.
  9. FACS tamponunda FxCycle çalışma çözümünü (1:1000) hazırlayın.
  10. Numuneleri 1 mL'de yeniden askıya alın ve FxCycle ile 500 μL soğuk FACS tamponunda kontrol edilir.
  11. Tüm örnekleri FACS tüplerine aktarın ve ışığa karşı korunarak buz üzerinde tutun.
  12. Sıralama için hemen Akış Sitometri Çekirdeği'ne geçin. Sıralanmış hücreleri FACS tamponu, kültür ortamı, liz tamponu veya RNAlater'a toplayın; bu uygulama sonrası uygulamalara bağlı olarak gerçekleşir.
    NOT: Cihaz ayarları (örneğin nozul boyutu ve basıncı) ve olay oranları sorter konfigürasyonu ve hedef hücre popülasyonuna bağlıdır; bu nedenle, her deney için optimal parametreleri belirlemek amacıyla ön pilot çalışması önerilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaşlı ekzokrin bezlerin dissosiyasyonu, lipid birikimi ve yoğun ECM birikimi nedeniyle zordur. Yaşlı bezler, doku ayrışmasını karmaşıklaştıran yapısal ve inflamatuar değişiklikleri yansıtan intraluminal materyalle belirgin lenfositik infiltrasyon ve belirgin kanal genişleme gösterir. Lakrimal bez, üç ana epitel hücre tipinden oluşan ekzokrin bir organdır: asinar, kanal ve miyoepitel hücreler. Asinar hücreler, korneanın hidratasyonunu koruyan ve antimikrobiyal ile yara iyileştirme işlevle...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, ekzokrin dokulardan tek hücreli süspansiyonlar üretmek için gözyaşı bezine odaklanarak önemli ölçüde geliştirilmiş bir protokolü optimize ettik ve değerlendirdik. Bu yaklaşımı kullanarak, hem eski hem de genç LG'lerden temiz, yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonlar ürettik; bu süspansiyonlar tek hücreli dizileme ve diğer sonraki uygulamalar için uygundur.

Birçok doku ayrıştırma protokolünün mevcut olmasına rağmen, izolasyon sırasında en savunmasız ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını belirtir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, Ulusal Göz Enstitüsü (NEI), ABD tarafından 5R01EY026202, R01EY035333; Ulusal Diş ve Kraniofasiyal Araştırma Enstitüsü (NIDCR) tarafından R01DE031044, 2R01DE014756 ve Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) 5R01CA271500 hibeleri tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Malzeme
BSA Sigma-AldrichA4919
CaCl2 (1  M çözümü)BioVisionB1010-100
Kollagenaz IVSigma-AldrichC5138
Ölü Hücre Temizleme KitiMiltenyi biyotec130-090-101
Ölü Hücre Temizleme KitiMiltenyi biyotec130-090-101
Dispase IIRocheC756V28
DNase ISigma-AldrichDN25-100MG
DPBS Gibco, Thermo Fisher Scientific14190-144
Fetal Sığır Serumu, ultra düşük IgGGibco# 16250078
Hank'in Dengeli Tuz Çözümü (HBSS)Corning (Thermo Fisher Scientific)21-022-CV
HEPES (1  M çözümü)Sigma-AldrichH0887
İzofluran ÇözeltisiCovertus# 11695067772
MACS® SmartStrainers (30 yaş ve mikro; m)Miltenyi biyotec130-098-458
MACS® SmartStrainers (70 yaş ve mikro; m)Miltenyi biyotec130-110-916
Orta/F12 (DMEM/F12)MilliporeDF-042-B
MgCl2 1MSigma-AldrichM1028-100ML
MS SütunlarıMiltenyi biyotec130-042-201
NaCl (5M stok)Invitrogen™AM9759
Fosfat Tamponlu Salin (PBS) tabletleriSigma-AldrichP8920-500ML
Kırmızı Kan Hücresi Lizis Çözeltisi (10 Kez;)Miltenyi biyotec130-094-183
StemPro Accutase Gibco, Thermo Fisher ScientificA1110501
Trypan Blue Solution, %0,4Gibco, Thermo Fisher Scientific15250061
Ultra-saf EDTA (0.5M, pH 8.0)Invitrogen15575020
antikorlar
CD140a (PDGFRA) Monoklonal Antikor (APA5), APC-eFluor™ 780, Rat / IgG2a, kappaeBioscience47-1401-82; RRID:AB_2784706
FcBlock (CD16/CD32 Fc bloker)BD Biosciences 553141; RRID:AB_394656
FxCycle™ Mor LekeThermo Fisher ScientificF10347
Fare CD326 (EpCAM)-APC monoklonal antikor (G8.8), sıçan IgG2a, kappaeBioscience17-579182; RRID:AB_2716944
Fare
Acta2GFP  Dr. Ivo Kalajzic'ten nazik bir hediyePMID: 18571490
PdgfraEGFP  - B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/JJackson laboratuvarıRRID:IMSR_JAX:007669
Ekipman
Invitrogen™   Kontes&ticaret; 3 Otomatik Hücre SayacıFisher ScientificA49862; RRID:SCR_026963

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guo, J., et al. Aging and aging-related diseases: from molecular mechanisms to interventions and treatments. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 391(2022).
  2. Zhang, X., Wang, L., Zheng, Y., Deng, L., Huang, X. Prevalence of dry eye disease in the elderly: A protocol of systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 99 (37), e22234(2020).
  3. Donthineni, P. R., et al. Aqueous-deficient dry eye disease: Preferred practice pattern guidelines on clinical approach, diagnosis, and management. Indian J Ophthalmol. 71 (4), 1332-1347 (2023).
  4. Yuksel, S., et al. Aging Affects Lipid Homeostasis in Lacrimal Glands by Upregulating Lipogenesis and Changing Its Specificity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (13), 1(2025).
  5. Galletti, J. G., et al. Ectopic lymphoid structures in the aged lacrimal glands. Clin Immunol. 248, 109251(2023).
  6. Delcroix, V., et al. Lacrimal Gland Epithelial Cells Shape Immune Responses through the Modulation of Inflammasomes and Lipid Metabolism. Int J Mol Sci. 24 (5), 4309(2023).
  7. Mauduit, O., et al. Spatial transcriptomics of the lacrimal gland features macrophage activity and epithelium metabolism as key alterations during chronic inflammation. Front Immunol. 13, 1011125(2022).
  8. Prasad, D., et al. Assessing the Independent and Combined Effects of Hyperosmolarity and Inflammatory Stress on Human Corneal Epithelial Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (13), 47(2025).
  9. Scholand, K. K., et al. Heterochronic Parabiosis Causes Dacryoadenitis in Young Lacrimal Glands. Int J Mol Sci. 24 (5), 4897(2023).
  10. Molla Desta, G., Birhanu, A. G. Advancements in single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics: transforming biomedical research. Acta Biochim Pol. 72, 13922(2025).
  11. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. J Vis Exp. (29), e1266(2009).
  12. Jankelow, A., Almeida-Porada, G., Atala, A., Sawyer, S. W., Porada, C. D. Recent advancements in tissue dissociation techniques for cell manufacturing single-cell analysis and downstream processing. Stem Cells Transl Med. 14 (11), szaf055(2025).
  13. Duong, A., et al. A Rapid Human Lung Tissue Dissociation Protocol Maximizing Cell Yield and Minimizing Cellular Stress. Am J Respir Cell Mol Biol. 71 (5), 509-518 (2024).
  14. Koenitzer, J. R., Wu, H., Atkinson, J. J., Brody, S. L., Humphreys, B. D. Single-Nucleus RNA-Sequencing Profiling of Mouse Lung: Reduced Dissociation Bias and Improved Rare Cell-Type Detection Compared with Single-Cell RNA Sequencing. Am J Respir Cell Mol Biol. 63 (6), 739-747 (2020).
  15. Ikeuchi, T., et al. Dissociation of murine oral mucosal tissues for single cell applications. J Immunol Methods. 525, 113605(2024).
  16. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  17. Kahwaji, N. Universal Precautions. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2024).
  18. Delcroix, V., et al. The First Transcriptomic Atlas of the Adult Lacrimal Gland Reveals Epithelial Complexity and Identifies Novel Progenitor Cells in Mice. Cells. 12 (10), 1435(2023).
  19. Mauduit, O., et al. A closer look into the cellular and molecular biology of myoepithelial cells across various exocrine glands. Ocul Surf. 31, 63-80 (2024).
  20. Zyrianova, T., Basova, L. V., Makarenkova, H. P. Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands. J Vis Exp. (148), e59602(2019).
  21. Montanari, M., et al. Automated-Mechanical Procedure Compared to Gentle Enzymatic Tissue Dissociation in Cell Function Studies. Biomolecules. 12 (5), 701(2022).
  22. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. J Immunol Methods. 425, 69-78 (2015).
  23. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  24. Reichard, A., Asosingh, K. Best Practices for Preparing a Single Cell Suspension from Solid Tissues for Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  25. Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neurosci. 17 (1), 30(2016).
  26. Lai, T. Y., et al. Different methods of detaching adherent cells and their effects on the cell surface expression of Fas receptor and Fas ligand. Sci Rep. 12 (1), 5713(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell RNA SequencingLacrimal Gland DissociationMyoepithelial Cell IsolationFibroblast IsolationFlow CytometryAged Lacrimal GlandTissue DigestionCell SortingEpCAM ImmunostainingPDGFR Alpha Fibroblasts

Related Articles