Yöntem makalesi

Hiyerarşik olarak gözenekli UiO-66 nanopartiküllerinde oksijen dağıtımı uygulamaları için sentez, hemoglobin kapsülasyonu ve biortogonal PEGilasyon

DOI:

10.3791/70445

⸱

8 Mayıs 2026

 , 
1Department of Health Technology, Technical University of Denmark

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, oksijen teslimatı için tasarlanmış hiyerarşik olarak gözenekli UiO-66 nanopartiküllerinin sentezini, hemoglobin kapsüllenmesini ve yüzey PEGilasyonunu detaylandırır. Bu yöntem, kusur mühendisliğini zorlanma destekli biortogonal konjugasyon ile birleştirerek biyomedikal uygulamalara uygun yüksek geçirgenlikli ve fizyolojik olarak stabil taşıyıcılar üretir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemoglobin bazlı oksijen taşıyıcıları (HBOC'lar), çeşitli biyomedikal bağlamlarda oksijen teslimatı için hipoksiyi azaltmak için önemli bir platformdur. Ancak, serbest hemoglobin (Hb) kırmızı kan hücreleri dışında kararsız ve vazoaktiftir. Burada, Hb'yi kapsülleyen ve biyoortogonal polietilen glikol (PEG) kabuklarıyla stabilize edilen hiyerarşik olarak gözenekli UiO-66 nanopartiküllerinin (HP-UiO-66 NP'ler) üretimi için tekrarlanabilir, ölçeklenebilir adım adım bir protokol sunuyoruz. Hiyerarşik mezoporozite, dodekanoik asit modülasyonu ve ardından asit yıkama ile ortaya çıkar; kristallitesi korunmuş HP-UiO-66-NH₂ NP'ler ve birleşik tip I/IVN 2 izotermleri elde edilir. Yüzey aminleri azidlere (HP-UiO-66-N₃ NP'ler) dönüştürülür; bu da katalizörden arındırılmış strain ile desteklenen alkin-azid sikloek (SPAAC) ile Hb@HP-UiO-66-PEG NP'ler üretmesini sağlar. İş akışı şunları içerir: i) UiO-66-NH₂ NP'lerin hata mühendisliği, ii) modülatör çıkarma, iii) azid kurulumu, iv) tamponlu sulu ortamda Hb yüklemesi ve v) SPAAC aracılı PEGilasyon. Her aşamada kritik deneysel parametreler, standart arıza modları ve sorun giderme stratejileri laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği artırmak için detaylandırılmıştır. Protokol, parti başına HP-UiO-66-NH₂ NP'lerinin gram ölçekli üretimine uygundur. Hb için ~%35 kapsülleme verimliliği (yükleme içeriği ~24% %24), PEGilasyondan sonra ~140 nm hidrodinamik çaplı ve düşük polidispersiteli yeniden dispersibilebilir NP'lerle elde edilir. Kapsamlı fizikokimyasal karakterizasyon, çerçevenin bütünlüğünü, mezoporozitesini, başarılı yüzey kimyasını ve ~12 nm genişliğinde yayılan bir PEG koronasını doğrular. Fonksiyonel testler, kapsüllenmiş Hb'nin geri dönebilir oksijenlenmesi/deoksijenlenmesini göstererek oksijen taşıma kapasitesinin korunduğunu gösterir. PEGilasyon, tuzlu sönüm, HEPES ve serumda kolloidal ve yapısal stabiliteyi belirgin şekilde artırır ve PEGillenen olmayan muadillerde gözlemlenen fosfat kaynaklı bozulmayı önler. Detaylı sorun giderme rehberliği, kritik adımların video destekli görselleştirmesi ve ölçeklendirme konularını entegre ederek, bu modüler protokol metal-organik çerçeve tabanlı HBOC'lara sağlam ve erişilebilir bir yol sunar. Strateji, terapötik teslimat için koruyucu ama erişilebilir mikro ortamlar gerektiren diğer biyomakromoleküller veya enzimlere kolayca uyarlanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeterli oksijenlenme, çeşitli biyomedikal ortamlarda etkili tedavi ve doku iyileşmesi içinkritiktir 1. Travma ve cerrahi kanamada, şiddetli oksijen kaybı hayatı tehdit edebilir ve donör kanı bulunmadığında güvenli kan ikamelerine ihtiyaç olduğunuvurgular. Onkolojide, hipoksik tümör bölgeleri oksijene bağımlı tedavilerin etkinliğini sınırlar ve ek oksijen teslimatı terapötik etkinliği belirgin şekildeartırabilir 3,4,5,6. Oksijen ayrıca yara iyileşmesinde merkezi bir rol oynar; artan oksijen bulunabilirliği anjiyogenez ve dokuonarımını teşvik eder 7. Benzer şekilde, iskemik durumlarda ve organ nakilinde oksijen taşıyıcıları hipoksik hasarı azaltabilir ve doku canlılığı ile iyileşmeyiartırabilir 8,9.

Sentetik hemoglobin (Hb) bazlı oksijen taşıyıcıları (HBOC'lar), hipoksiyi azaltmak için umut verici biryaklaşımdır 10. Ancak, kırmızı kan hücreleri (RBC) dışındaki Hb, doğası gereği kararsızdır ve hızla dimerlere ayrılır; bu da nitrik oksit temizleyici11 nedeniyle nefrotoksisite, oksidatif hasar ve vazokonstriksiyona neden olabilir. Bu zorlukları hafifletmek için, lipozom 12, polimersom13 ve polimerik nanopartiküller (NP) gibi biyouyumlu nanotaşıyıcılar içinde Hb'yi stabilize etmek için kapsülleme stratejileri geliştirilmiştir. Bu sistemler Hb stabilitesini artırsa da, doğal oksijen bağlanma fonksiyonunu koruyarak yüksek kapsülleme verimliliği elde etmek hâlâzordur 18. Ayrıca, oksidatif olarak methemoglobine dönüşüm ve hem sızıntısı oksijen taşıma performansınızayıflatabilir 19. Hızlı boşalma ve erken Hb sızıntısı dolaşım süresini ve klinik translasyonudaha da sınırlar 20.

Metal-organik çerçeveler (MOF'lar), kristal mimarisi, geniş yüzey alanı ve ayarlanabilir gözenekliliği nedeniyle ilaç ve biyomakromolekül dağıtımı için çok yönlünanoplatformlar olarak son zamanlarda ortaya çıkmıştır. Organik bağlantılarla koordine edilen metal düğümlerden oluşan MOF'lar, moleküler difüzyon ve yapısal özelleştirme sağlar ve biyomedikal uygulamalar için cazip hale getirir. Ancak, çoğu MOF'da ağırlıklı olarak mikrogözenekli boşluklar (<2 nm) bulunur; bu boşluklar, proteinler, nükleik asitler veya enzimler gibi makromoleküllerin sentetik sonradan kapsüllenmesiniciddi şekilde kaçırır. 22,23,24,25. Bu sınırlamayı aşmak için bir yaklaşım, biyomoleküllerin MOF'un büyümesi sırasında çekirdeklenme merkezi olarak görev yaptığı in situ biyomimetik mineralizasyondur; bu durum ZIF-8 ve ZIF-90 26,27,28 için gösterilmiştir. Etkinliğine rağmen, bu strateji hafif sentez koşulları gerektirir ve bu da uyumlu MOF kimyalarının aralığını sınırlar29,30.

UiO-66, Zr6O4(OH)4 oktahedral düğümler ve 1,4-benzenedikarboksilat (BDC) bağlantılarından oluşan zirkonyum bazlı bir MOF olup, olağanüstü kimyasal stabilitesi ve biyouyumluluk31 ile öne çıkar. Sağlam yapısı, sulu ve fizyolojik ortamlarda ayrışmaya karşı dirençlidir, bu da onu biyomedikal uygulamalar için idealkılmaktadır 32. Bununla birlikte, içsel mikrogözenekli yapısı, biyomakromolekül kapsülasyonu için kullanımını sınırlar. ~5 nm moleküler boyutuna sahip olan Hb, tertemiz UiO-66'nın iç gözeneklerinde yer alamaz. Buna karşılık, UiO-66'yı Hb ile ilgili sistemlerde inceleyen sınırlı sayıda çalışma, MOF'ların öncelikle çerçeve kapsülasyonu için değil, yüzey tabanlı Hb algılamasıiçin kullanıldığı 33,34. Sonuç olarak, Hb kapsülasyonu için UiO-66 tabanlı platformlar nispeten gelişmemiş durumda kalır.

Çok yakın zamanda, Hb'yi barındırabilen mezoporöz alanlar dahil ederek bu gözenek boyutu kısıtlamasını aşan hiyerarşik olarak gözenekli bir UiO-66 NP (HP-UiO-66 NP) tanıttık; böylece Hb'yi barındırabilen mezoporöz alanlar dahil ediliyor ve böylece HBOCgeliştirme 35 için UiO-66'nın işlevsel kapsamını genişletiyor. Hiyerarşik gözeneklilik, özellikle sentez sırasında modülatör olarak dodekanoik asit (DA) gibi uzun zincirli monokarboksilik asitlerin kullanılmasıyla hata mühendisliği yoluylagetirilir. Bu modülatör, Zr4+ ile koordinasyon için BDC ligandı ile rekabet eder ve defekt oluşumuna ve mezoporların büyümesine yol açar. Modülatörün sonraki çıkarılması, modülatör konsantrasyonu veya zincir uzunluğu36 ile ayarlanabilir gözenek boyutuna sahip mikro- ve mezoporöz alanlara sahip HP-UiO-66 NP'leri ortaya çıkar.

Mezoporozitenin eklenmesi moleküler erişilebilirliği artırsa da, fosfat içeren tamponlarda çerçeve bütünlüğünü de tehlikeye atabilir. Fosfat iyonları Zr kümeleriyle koordine olabilir ve bu da kısmi veya tam yapısalparçalanmaya yol açar 38,39. Buna göre, yüzey stabilizasyon stratejileri, fizyolojik koşullarda kolloidal ve kimyasal stabiliteyi korumak için gereklidir40. Genel olarak, MOF'un yüzey stabilizasyonu kovalent olmayan etkileşimler (örneğin, van der Waals etkileşimi ve hidrojen bağları)41, açıkta kalan metal sitelerle koordinasyonetkileşimleri 42 veya organik bağlantılara kovalent bağlanmayoluyla sağlanabilir. Farklı bağlayıcılar arasında, polietilen glikol (PEG) özellikle geniş erişilebilirliği ve minimal sentetik karmaşıklığı nedeniyleçekicidir 44. Önemli olarak, PEG yüzey modifikasyonu, yaygın olarak PEGilasyon olarak adlandırılır, ilaç dağıtım sistemlerine mükemmel biyouyumluluk, azalmış spesifik olmayan protein adsorpsiyonu ve azalan bağışıklık tanıma ile makrofaj alımı gibi birkaç avantajlı özelliksağlar 45,46. Bu etkiler topluca, immünojenik yanıtları azaltır ve sistemik dolaşımıuzatır 47.

Geleneksel PEGilasyon teknikleri genellikle karbodiimid veya maleimid kimyasına dayanır; bunlar genellikle katalizörler veya Hb gibi hassas biyomoleküllere zarar verebilen reaktif ara maddeler gerektirir. Bu sınırlamayı aşmak için, azid-ve dibenzilsikloktin (DBCO) fonksiyonelleştirilmiş türler arasında katalizörsüz, biyoortogonal bir reaksiyon olan suş kaynaklı alkin-azid sikloek (SPAAC) kullanıyoruz ve hafif sulu koşullarda site özelleşik konjugasyonu mümkünkılmaktadır 35,48. Bu yaklaşım, kapsüllenmiş Hb fonksiyonunu tehlikeye atmadan verimli yüzey modifikasyonunu sağlar.

Daha önce rapor ettiğimiz HP-UiO-66 NPs35 üzerine inşa edilen ve yapısal tasarım ve biyofonksiyonel doğrulamaya odaklanan mevcut protokol, tanımlanmış parametre aralıkları ve kritik işleme konularıyla detaylı, adım adım deneysel bir iş akışı sunarak metodolojik şeffaflık ve tekrarlanabilirliği vurgulamaktadır. Sorun giderme rehberi, sentezin ana aşamaları, Hb kapsüllenmesi ve SPAAC kimyası yoluyla PEGilasyon için yer almaktadır; nihayetinde stabil Hb@HP-UiO-66-PEG NP'leri elde edilir ( bkz. Şekil 1).

İş akışı şunları içerir: (i) amino-modifiye HP-UiO-66-NH2 NP'leri sentezlemek için DA'yı modülatör olarak kullanarak kusur mühendisliği; (ii) yüzey amin gruplarının azid işlevselleşmesi; (iii) hafif, sulu koşullarda Hb'nin kapsüllenmesi; (iv) SPAAC ile kovalent PEG konjugasyonu.

Her ana adım için, bu protokol parçacık toplama, gözenek çökmesi veya verimsiz yüzey işlevselleştirmesi gibi yaygın deneysel zorlukları belirler ve laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği artırmak için pratik sorun giderme stratejileri sunar. Önemli olarak, bu makale HP-UiO-66 NP'lerinin sentezinin kolayca ölçeklenebilir olduğunu ve parti başına güvenilir gram ölçekli üretimi mümkün kıldığını kapsamlı şekilde göstermektedir.

Son PEGillenmiş nanotaşıyıcılar, tuzlu sönüm, 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineethanesülfonik asit (HEPES) ve serumda yüksek kolloidal stabilite sergilerken, Hb'nin oksijen bağlama ve salınımkapasitesini 35 korur. Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi (FTIR), nükleer manyetik rezonans (NMR), toz X-ışını kırınımı (PXRD), azot (N 2) sorpsiyonu, zeta (ζ)-potansiyel analizi, dinamik ışık saçılması (DLS), taramalı elektron mikroskopisi (SEM) ve geçirim elektron mikroskopisi (TEM) gibi analitik yöntemler, kimyasal dönüşümü, çerçeve bütünlüğünü, gözenekliğini, nano ölçekli morfolojiyi ve başarılı yüzey işlevselleştirmesini doğrular.

Tekrarlanabilirlik, ölçeklenebilirlik ve operasyonel netliği vurgulayarak, teknik açıdan hassas adımların video tabanlı görselleştirmesiyle desteklenerek, bu metodoloji, stabil MOF tabanlı oksijen taşıyıcıları üretmek için tekrarlanabilir, sağlam ve erişilebilir bir yol sunar. Önemli olarak, yaklaşım modüler olup işlevselliğini korumak için korunan ama oksijen geçirimli mikro ortama ihtiyaç duyan diğer biyomakromoleküller veya enzimlere kolayca uyarlanabilir. Buna göre, Hb@HP-UiO-66-PEG NP'ler, biyolojik sıvılarda bozulmaya dirençli oksijen üretebilen HBOC'ların oluşturulmasına yönelik umut verici bir adımı temsil etmektedir.

Pratik açıdan, bu strateji Hb dışındaki diğer biyomakromoleküllere de genişletilebilir; tabii ki boyutları yaklaşık 20 nm'nin altında olan ve maksimum erişilebilir mezopor boyutuna karşılık gelir ve aşağıdaki özelliklerden birini veya birkaçını sergiliyorlarsa: (i) sert kimyasal koşullara duyarlılık, hafif sentez ve yüzey modifikasyonunu desteklemek; (ii) işlevsel aktiviteyi sürdürmek için hidratlı, oksijen geçirenli bir mikro ortam gereksinimi; ve (iii) fosfat kaynaklı MOF bozulmasına karşı duyarlılık, bu da yüzey stabilizasyonunu gerektirir. Yaklaşım, mezopor erişilebilirliği ile çerçeve bütünlüğü arasında denge sağlamak için orta düzeyde kusur yoğunluklarına dayanır. Biyomolekül fonksiyonunu korumak için katalizörsüz, siteye özgü yüzey modifikasyonu gerektiğinde, SPAAC tabanlı PEGilasyon açık avantajlar sunar. Sonuç olarak, bu protokol fizyolojik koşullarda verimli biyomakromolekül yüklemesi, fonksiyonel koruma ve uzun vadeli kolloidal stabilite için uygundur; oysa aşırı termal veya asit stabilitesi gerektiren çok daha büyük biyomoleküller veya sistemler alternatif MOF platformlarına ihtiyaç duyabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hb ekstraksiyonu (Beklenen süre: 2 gün)

NOT: Ticari olarak mevcut sığır kanından (SSI Diagnostica A/S, Hillerød, DK) Hb ekstraksiyonu, daha önce bildirilen protokol49'a göre gerçekleştirilmektedir.

  1. Sığır kanını (genellikle ekstraksiyon başına 10 mL) 50 mL'lik konik santrifüj tüpüne aktarın. Kanı seyreltmek ve viskoziteyi azaltmak için %0,9 (w/v) tuzlu bir çözelti ekleyin. Homojen bir süspansiyon elde edilene kadar birkaç kez nazikçe ters çevirin.
  2. Sulandırılmış kanı 1.500 x g ile 20 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, yoğun kırmızı bir peletin (RBC) üzerinde şeffaf sarı bir süpernatant (plazma) belirir. Tam pelletleme sağlanamazsa, gerekirse santrifüjasyona devam edin.
  3. Plazma tabakasını dikkatlice boşaltıp pelleti rahatsız etmeden at. Taze salin (10 mL) ekleyin, RBC pelletini nazikçe ters çevirerek tekrar askıya alın ve aynı koşullarda santrifüj adımını tekrarlayın. Plazma proteinleri ve trombositleri çıkarmak için toplamda iki yıkama döngüsü uygulayın.
    NOT: Yıkama süreci, aşağı akış toluen ekstraksiyonuna müdahale edebilecek plazma kirleticilerinden arındırılmış saf RBC'ler elde etmek için çok önemlidir.
  4. İkinci yıkamadan sonra, süpernatantı atın ve temizlenmiş RBC pelletini toluen, ultrasaf su ve tuzlu su karışımında 1:0.4:1 hacim oranında yeniden askıya alın. Örneğin, pellet eklemeden önce 10 mL toluen, 4 mL ultra saf su ve 10 mL tuzlu suyu 50 mL'lik ayırıcı hunide karıştırın.
  5. Huniyi mühürleyin ve fazları karıştırmak için birkaç kez nazikçe ters çevirin. Huni gece boyunca (~12-16 saat) 4 °C sıcaklığa yerleştirilerek tam faz ayrımı sağlanır. Toluen fazı, lipid zarlarını çıkarır ve Hb ile zenginleştirilmiş berrak sulu bir faz bırakır.
  6. Ertesi gün, ayırıcı huninin stoplock'u kullanarak alt sulu tabakayı dikkatlice toplayın. Bu tabaka şeffaf ve koyu kırmızı görünür.
  7. Sulu Hb çözeltisini santrifüj tüplerine aktarın ve 4 °C'de 20 dakika boyunca 8.000 x g döndürerek kalan hücre kalıntıları veya emülsifikasyonlu materyalleri temizleyin.
  8. Süpernatantı vakum filtreleme sistemi kullanarak diatomlu toprak fritinden filtreleyin. Sadece nazik vakum uygulayın (köpüklenmeye veya protein denatürasyonuna neden olabilecek yüksek negatif basınçtan kaçının).
  9. Stromasız Hb içeren filtratı toplayın. Bu stoku hemen kullanılırsa buzda saklayın veya aliquot (~1 mL) ile uzun süreli kullanım için −80 °C'de dondurun.
    NOT: Hb aliquotları birkaç ay boyunca buzlu saklanabilir ve tespit edilebilir bozulma yaşanabilir.
  10. Hb konsantrasyonunu, üreticinin protokolüne göre bir bicinchoninic asit protein testi ile nicelikle, saf sığır Hb'sini kalibrasyon standardı olarak kullanarak. Son Hb stokunu istenen çalışma konsantrasyonuna ayarlayın (genellikle 20 mg mL-1 HEPES tamponunda, pH 7.4).
    NOT: Hücresel maddeden arındırılmış net, kırmızı bir Hb çözümü bekleyin.
  11. Isteğe bağlı: Çıkarılan Hb'nin UV-vis emilim spektrumlarını (375-700 nm) ölçüp oksijen bağlanma ve salgılama yeteneğini değerlendirin. İlk UV-vis spektrumunu kaydedin. Sodyum ditionit ekleyin ve oksijen salınması için 10 dakika boyuncaN2 gazıyla temizleyin ve oksijensizleştirilmiş Hb spektrumunu kaydedin. Daha sonra, 10 dakika boyunca havayla temizlenerek yeniden oksijenlenme sağlanır ve spektrum yeniden kaydedilir.
    NOT: Hava ile temizlendikten sonra sırasıyla oksijenli (~412 nm; Q-bantları için ~541 ve ~577 nm) ve oksijensiz (~430 nm, Q-bandı için ~557 nm) Hb ve N2 ile havayla temizlendikten sonra Hb'nin işlevsel kaldığını gösterir (Ek Şekil 1).
    DIKKAT: Toluene, uygun kişisel koruyucu ekipmanlar (örneğin laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve eldiven) takarak buharlı bir kaputu içinde dikkatle kullanın. Mevcut çalışmada, tüm toluen içeren atık sıvılar, Danimarka Çevre Bakanlığı'nın yönergelerine uygun olarak "toluen ve karışım" etiketli belirlenmiş kaplarda (Grup C) organik kimyasal sıvı atık olarak toplandı ve bertaraf edildi. İlgili atık bertaraf belgeleri Ek Dosya 1'de sağlanmıştır.

2. HP-UiO-66-NH2 NP üretimi (Beklenen süre: 3 gün)

DIKKAT: HCl (%37) aşındırıcıdır; Bir duman başlığı içinde, laboratuvar önlüğü, asite dayanıklı eldivenler ve uygun göz koruma ile tutun. Yavaşça asit ekleyin ve buhar solumaktan kaçının.

  1. ZrCl4 (400 mg, 1.715 mmol) 250 mL'lik yuvarlak tabanlı bir şişeye tartın. Yavaşça DMF (80 mL) ekleyin ve ultrasonla 5 dakika boyunca ultrason uygulayarak ZrCl4'ü tamamen çözebilirsiniz. DA (12 g, 60 mmol) ekleyin ve berrak, homojen bir çözelti elde edilene kadar ekstra 30 dakika ultrason yapın. Toplam çözelti hacmini dereceli bir silindir kullanarak ölçün ve gerektiğinde DMF ekleyerek nihai hacmi 100 mL'ye ayarlayın. DA, kontrollü kafes kusurları getirerek rekabetçi bir modülatör olarak görev yapar.
    NOT: ZrCl4'ü çözerken DMF yavaşça ekleyin, çünkü koordinasyon süreci ekzotermiktir ve hafif bir tüfüze oluşabilir; Tüm işlemleri bir duman davlumbazında gerçekleştirin. DA'nın dahil edilmesiyle oluşan hacim artışını, ZrCl4 ve DA'yı çözmek için başlangıçta 80 mL DMF hacmi kullanarak hesaba katabilir ve tam çözünmeden sonra son hacmi ancak tam çözünmeden sonra 100 mL'ye ayarlayarak doğru konsantrasyon kontrolünü sağlar.
  2. Aynı şişeye 2-amino-1,4-benzenedikarboksilik asit (BDC-NH2, 155 mg, 0.857 mmol) ekleyin ve ekstra 30 dakika sonikasyon yapın. Homojen soluk sarı bir çözelti elde edilene kadar devam edin.
  3. Karışımı, solvotermal senteze uygun 150 mL Teflon kaplı otoklav veya yuvarlak tabanlı basınç kapına aktarın. Sıkıca mühürleyin ve 120 °C'de 18 saat boyunca önceden ısıtılmış bir susturucusa koyun. Kontrolsüz çekirdekleşmeyi önlemek için ısıtma sırasında reaktörü rahatsız etmeyin.
  4. Reaksiyondan sonra fırını kapatın ve kabın doğal olarak oda sıcaklığına (~2 saat) soğumasına izin verin. Ortam boyunca eşit şekilde ince sarı bir süspansiyon gözlemleyin.
  5. Ürünü santrifüjle (11.000 x g, 10 dakika, oda sıcaklığında) toplayın ve üst yüzeyi atın. Pelleti DMF (100 mL) ile aynı santrifüj koşullarıyla üç kez yıkayarak fazla ligand ve reaksiyona girmemiş DA'yı çıkarın. Ürün tamamen peletlenmemişse, santrifüj süresini gerektiğinde uzatın.
  6. 0,5 mL konsantre HCl (%37) içeren DMF (100 mL) içeren bir asit çıkarma çözeltisi hazırla. Yıkanmış peleti tamamen bu çözeltiye batırın ve 90 °C'de 12 saat boyunca bir susturucu fırında ısıtın. Bu adım, DA modülatörü kaldırılır ve yapı içinde mezopurlar oluşturur.
  7. 12 saat sonra santrifüj yapın (11.000 x g, 5 dakika, oda sıcaklığında) ve süpernatantı atın. DA'nın tamamen çıkarılmasını sağlamak için 0,5 mL HCl içeren yeni bir DMF partisi kullanarak asit tedavisini tekrarlayın. Ürün tamamen peletlenmemişse, santrifüj süresini gerektiğinde uzatın.
  8. Pelleti ardışık olarak DMF, aseton ve etanol (100 mL, 11.000 x g, 5 dakika, oda sıcaklığında) ile yıkayarak kalan asit ve çözücü gider. Çökelti tamamen peletlenmemişse, santrifüj süresini gerektiğinde uzatın. Her yıkama arasında, peleti girdablandırma veya hafif sonikasyon ile nazikçe yeniden dağıtın.
  9. Ürünü bir hava ortamında bir gazlı kaptan içinde kuruduktan sonra gece boyunca vakum fırında (140 °C) kurutun. Son malzemeler (HP-UiO-66-NH2 NP'ler) ince sarı toz olarak görünür. Tipik bir verim ~428 mg bekleyin.
  10. PXRD'nin 2θ = 7.3°, 8.4°, 25.7° olarak zirve noktalarının keskin kaldığını doğrulayın (Şekil 2A), bu da kristalin UiO-66 topolojisinin korunduğunu gösterir. DA'nın tam olarak alınmasını alkalin (2 M KOH D2O'da 2 O) sindirimden sonra (metilen 1.2 ppm'de zirve noktası yok) 1H NMR ile doğrulayın (Şekil 2B).
  11. Gözenekliliği N2 adsorpsiyon-desorpsiyon ile 77 K50'de karakterize edin. Eğri, histerezis döngüsü ile birleşik Tip I/IV izotermi gösterir (Şekil 2C), mezopor oluşumunu doğrular.
    NOT: Eksik yüksek sıcaklık kurutma veya yetersiz örnek kütlesi, N2 adsorpsiyon-desorpsiyon izotermleri kullanılarak hatalı gözeneklilik ölçümlerine yol açar; Vakumla kurutma işlemi 140 °C'de tekrarlanır ve Brunauer−Emmett−Teller (BET) alanı 1.000 m2 g-1 < ise örnek ağırlığının 100 mg'yi aştığından emin olur.
  12. Isteğe bağlı: NP'lerin morfolojisini SEM ile değerlendirin. HP-UiO-66-NH2 NP'ler, ~100 nm dar boyut dağılımıyla küresel morfolojiye sahiptir (Şekil 2D).
    NOT: HP-UiO-66-NH2 NP'lerin hem mikro hem de mezoporlara sahip olmasını bekleyebilirsiniz; bu hücreler sonraki Hb kapsülasyonu için uygundur.
  13. HP-UiO-66-NH2 NP'lerin sentezi, 2.1 - 2.9 adımlarında kullanılan tüm reaktif ve çözücülerin orantılı olarak artırılması ve birden fazla paralel solvotermal reaksiyon gerçekleştirilmesiyle ölçeklendirilebilir. Aynı azı dişleri oranlar, konsantrasyonlar, reaksiyon sıcaklığı ve reaksiyon süresi korunarak ve reaktif ile çözücü miktarlarını 1,5 kat artırarak, iki veya daha fazla 150 mL Teflon kaplı otoklav veya yuvarlak tabanlı basınç kapı aynı anda çalıştırılabilir ve HP-UiO-66-NH2 NP'lerin gram ölçeğinde üretimini mümkün kılarak (Şekil 3).
    NOT: Tüm organik çözücüleri bir duman başlıkında laboratuvar önlüğü, asite dayanıklı eldiven ve uygun göz koruması takarak kullanın. Tüm DMF içeren atık sıvıları toplanıp organik kimyasal sıvı atıkları olarak Danimarka Çevre Bakanlığı yönergelerine uygun olarak "DMF ve karışım" etiketli (Grup C) kaplara atmak. İz miktarda ZrCl4 ve HCl içeren atık çözeltileri buna göre işlendi. İlgili atık bertaraf belgeleri Ek Dosya 1'de sağlanmıştır.

3. HP-UiO-66-NH2 NP'nin (HP-UiO-66-N3 NP) azide fonksiyonelleştirilmesi (Beklenen süre: 1 gün)

DIKKAT: Trimetilsilil azid (TMSN₃) ve tert-bütil nitrit (tBuONO) toksik ve uçucudur. Tüm adımları bir duman kapüşonuyla laboratuvar önlüğü, nitril eldiven ve göz koruyucu takarak yapın.

  1. HP-UiO-66-NH2 NP (50 mg) tabletlerini 25 mL'lik yuvarlak tabanlı bir şişeye doğru tartın. THF (10 mL) ekleyin ve partiküllerin tamamen dağılması için 5 dakika ultrason yapın. Süspansiyon opak ama tekdüze hale geliyor.
    NOT: Sonikasyon sonrası NP'lerin eşit şekilde dağılması, reaktantlarla etkili temas için kritiktir. Eğer dağılım eksikse, çözelti hacmini artırın ve sonikasyonu tekrarlayın.
  2. Matayı 400 rpm'ye ayarlanmış manyetik karıştırıcı üzerinde buzlu su banyosuna (0 °C) yerleştirin. Cam bir şırınga, sıcaklığı 5 °C'nin altında tutarken 5 dakika boyunca damla olarak tBuONO (0.4 mL) ekleyin.
  3. Aynı soğuk koşullarda hemen TMSN₃ (0.35 mL) damlalı ekleyin. Hafif bir kabarcık oluşabilir ve bu nitrozasyon ilerlemesini gösterebilir. Yanığı ışıktan korumak için alüminyum folyo ile sarın..
  4. Reaksiyon karışımını buzlu su banyosunda gece boyunca (~16 saat) karıştırmaya devam edin; böylece MOF yüzeyinde amin gruplarının tam azid ikamesi sağlanır.
  5. Buz banyosunu çıkarın ve süspansiyonun oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin. Santrifüj (11.000 x g, 5 dakika, oda sıcaklığında) ve modifiye edilmiş NP'leri toplamak için kullanılır. Çökelti tamamen peletlenmemişse, santrifüj süresini gerektiğinde uzatın.
  6. Peleti THF (10 mL) ile üç kez iyice yıkayın, her yıkamadan sonra santrifüjle (11.000 x g, 5 dakika, oda sıcaklığında) toplayın. Bunu aynı koşullar altında santrifüjle yapılan aseton (10 mL) ile üç ek yıkama ile takip edin; böylece kalıntı reaktifler ve yan ürünler giderilir. Çökelti tamamen peletlenmemişse, santrifüj süresini gerektiğinde uzatın.
  7. Ürünü (HP-UiO-66-N3 NP) bir fırında (140 °C) vakum altında gece boyunca kurutarak hava davlumbazında kurutabilirsiniz. Tipik bir verim ~45 mg bekleyin.
  8. Kimyasal dönüşümü FTIR spektroskopisiyle doğrulayın: ~2122 cm-1 civarında keskin asimetrik bir azid uzanması görülür (Şekil 4A). Bant yoğunluğu, yüzey ikame verimliliğiyle korelasyondur.
    NOT: Eksik dönüşüm, sonraki tıklama çekimini bozabilir. Azide bandı zayıfsa, fonksiyonalizasyonu tBuONO ve TMSN₃'nun 2 katı miktarları kullanılarak tekrarlayın. Azido sonlu HP-UiO-66-N3 NP'ler, korunmuş kristalliliğe ve mezoporlu mimariye sahip (Şekil 4B-D), Hb kapsülasyonu ve SPAAC PEGilasyonu için hazır olabilir.
    DIKKAT: Danimarka Çevre Bakanlığı yönergelerine uygun olarak, diğer reaktiflerle (örneğin, tBuONO ve THF) yapılan karışımlar dahil olmak üzere TMSN₃ içeren tüm atık sıvıları, belirlenmiş Grup O tehlikeli atık konteynerlerinde toplayın. Tüm kapları TMSN₃ ve karışımlarının varlığını belirtmek için açıkça etiketleyin. İlgili atık bertaraf belgeleri Ek Dosya 1'de sağlanmıştır.

4. Hb Yükleme ve Niceliklendirme (Beklenen süre: 2 gün)

  1. HP-UiO-66-N3 NP (5 mg) 2 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın ve ardından ~2 dakika sonikasyon ile 0,5 mL HEPES tamponunda (20 mM, pH 7,4) geçirilin. 0,5 mL Hb (20 mg mL-1) içeren HEPES tamponu ekleyin ve tüpü birkaç kez nazikçe ters çevirerek NP'leri tamamen dağıtın.
  2. Tüpü bir termoshaker üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında (22-25 °C) 1.000 rpm altında 2 saat boyunca sallayarak inkübe edin.
  3. İnkubasyondan sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 13.500 x g santrifüjle yaparak ortaya çıkan Hb@HP-UiO-66-N3 NP'leri pellet edilir. Süpernatantı dikkatlice toplayarak hapsedilmemiş Hb'nin miktarını ölçerin. Çökelti tamamen peletlenmemişse, santrifüj süresini gerektiğinde uzatın.
  4. Pelleti ultrasaf suyla (1 mL) nazikçe yıkayarak gevşek adsorbe edilmiş Hb'yi çıkarmak için yukarı aşağı pipet ile yapın ve yıkamayı iki kez tekrarlayın. Her yıkamanın üst yüzeyini dikkatlice toplayarak hapsedilmemiş Hb'nin miktarını ölçin. Son peleti karakterizasyon için 0,5 mL ultrasaf suya yeniden askıya alın. Oksidasyonu önlemek için örnekleri buzdolabında (4 °C) tutun.
  5. Toplanan süpernatantlarda hapsedilmemiş Hb'yi sodyum lauril sülfat (SLS)-Hb testi51 kullanarak belirleyin. Her üst maddeden 10 μL 96 delikli mikroplakaya pipetleyin ve 100 μL SLS reaktifi (ultra saf suda 0,6 mg mL-1 ) ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın, ardından UV-vis spektrofotometre ile 412 nm'de absorbansı okuyun.
  6. HEPES tamponunda Hb stok çözeltilerini (0-10 mg mL-1) kullanarak absorbans değerlerini konsantrasyona dönüştürmek için standart bir eğri hazırlayın.
  7. Kapsülleme verimliliği (EE) ve yükleme içeriğini (LC) şu şekilde hesaplayın:
    EE (%) = [(başlangıç Hb - üstsel Hb)/başlangıç Hb] × 100
    LC (%) = [(kapsüllenmiş Hb)/(kapsüllenmiş Hb + NP kütle)] × 100
  8. Hb kapsülasyonunu ölçeklendirmek için, 100 mg NP ile 20 mL Hb çözeltisi (10 mg mL⁻¹) kuluçka yapın. Kapsülleme sonrası gözenekliği değerlendirmek için, ortaya çıkan NP'leri 24 saat etanole batırın, ardından 140 °C'de vakum fırında gece boyunca kurutulacak ve gözenekliliği değerlendirmek için N2 adsorpsiyon-desorbsiyon izotermini kaydedeceksiniz. Tozun kırmızı rengi, Hb'nin başarılı kapsüllenmesini gösterir (Şekil 5A) veN2 alımındaki belirgin azalma mezoporların Hb ile başarılı doldurulduğunu doğrular (Şekil 5B).
  9. Zetasizer Nano ZS ile ζ potansiyeli ölçün. Yüzey yükü ~+40 mV'den (HP-UiO-66-N3 NP) ~+20 mV'ye (Hb@HP-UiO-66-N3 NP) düşer; bu da Hb adsorpsiyonu ile tutarlıdır (Şekil 5C).
  10. Isteğe bağlı: morfolojik bütünlük ve yapısal stabiliteyi sağlamak için SEM mikrografı (Şekil 5D) ve PXRD difraktogramı (Şekil 5E) alın.
  11. NP'lerin geri dönebilir oksijen bağlanmasını değerlendirmek için UV-vis spektrumlarını (375-700 nm) kaydedin. Sodyum ditionit ekleyin ve oksijen salınması için N2 ile 10 dakika boyunca temizleyin, spektrumu kaydedin, ardından tekrar bağlanma için 10 dakika hava ile temizleyin ve spektrumu tekrar kaydedin (Şekil 5F).
    NOT: Hava ile temizlendikten sonra oksijenli (~412 nm; Q-bantlar için ~541 ve ~577 nm) ve oksijensiz (~430 nm, Q-bandı için ~557 nm) Hb'nin karakteristik Soret ve Q-bantlarının varlığı, sırasıyla Hb'nin işlevsel kaldığını gösterir.
  12. Fonksiyonel olarak aktif Hb içeren ve geri dönebilir oksijenlenme davranışına sahip tekdüze kırmızı Hb@HP-UiO-66-N3 NP'ler beklenmektedir.

5. Hb@HP-UiO-66-PEG NP'lerin Üretimi: SPAAC ile PEGilasyon (Beklenen süre: 2 gün)

  1. 0,5 mL ultrasaf suda dağıtılmış Hb@HP-UiO-66-N₃ NP (10 mg) içeren 2 mL'lik bir santrifüj tüpü hazırlayın. DBCO-PEG (Mw ~2.000, 0,5 mL ultrasaf suda 20 mg) ekleyin ve PEG ile NP arasında 2:1 (w/w) oranı elde edin. Tam karışana kadar nazikçe girdabla yapın.
  2. Karışımı oda sıcaklığında ve 1.000 rpm'de termoshaker üzerinde 1 saat inkübe edin, ardından gece reaksiyonu için buzdolabına (4 °C) aktarın (~16 saat). Bu katalizör içermeyen SPAAC tık reaksiyonu, DBCO'yu azid gruplarına kovalent olarak bağlayarak kararlı triazol bağlantıları oluşturur.
  3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 12.000 x g ile santrifüj yapın ve PEGilasyonlu Hb@HP-UiO-66-PEG NP'leri pellet edilsin. Çökelti tamamen peletlenmemişse, santrifüj süresini gerektiğinde uzatın. Reaksiyona girmemiş PEG içeren süpernatantı atın.
  4. Peleti aynı santrifüj koşullarında ultrasaf suyla (her biri 2 mL pipetle) üç kez yıkayın. Bu, serbest PEG zincirlerinin ve küçük moleküler yan ürünlerin kaldırılmasını sağlar.
  5. Saflaştırılmış Hb@HP-UiO-66-PEG NP'leri 2 mL ultrasaf suda tekrar askıya alın ve 4 °C'de saklanın.
    Kolloid homojen ve hafif opalesans görünür, bu da iyi bir dispersyon stabilitesini gösterir.
  6. FTIR spektroskopisiyle başarılı PEGilasyonun teyit edilmesi (Şekil 6A): 2122 cm-1'de azid bandının kaybolması ve sırasıyla 2883 ve 1097 cm-1'de PEG kaynaklı metilen (−CH2−) ile eter bağı (−O−) sinyallerinin ortaya çıkması.
  7. 2 M KOH/D 2O içinde alkali sindirimden sonra 1saat NMR (Şekil 6B) ile doğrulan; PEGillenmiş örnekler, PEG'in oksietilen protonlarına karşılık gelen ek bir sinyal δ = 3.53 ppm olarak gösterir.
  8. Hidrodinamik çapı ve polidispersite indeksini (PDI) DLS ile ölçün (Şekil 6C).
    ~115 nm (PDI ~0.1) ile ~140 nm (PDI ~0.17) arasında artış, yüzey kaplamayı ince bir polimer tabaka ile doğrular.
  9. Isteğe bağlı: Zetasizer Nano ZS kullanarak yüzey ζ potansiyelini ölçerek yüzey yükü üzerindeki yüzey PEGilasyonunun önemsiz etkisini doğrulayın (Şekil 6D). PEGilasyondan sonra küçük bir değişiklik (~+20 mV'den ~+17 mV'ye), yüzey yükü üzerinde minimal etkiyi gösterir.
  10. TEM'e göre morfolojiyi gözlemleyin (Şekil 6E). TEM, parçacık kenarının etrafında PEG koronasını temsil eden diffuz ~10-12 nm kenar ortaya koyar.
  11. Oksijen salınım testi yapmak için oksijen elektrotu (Şekil 6F) kullanılarak PEGilasyondan sonra Hb fonksiyonunun sağlam kaldığını gösterin; bu, PEGilasyon olmayan forma benzer şekilde. Uzun vadeli fizyolojik testler için uygun, güçlü kolloidal stabilite ve korunmuş oksijen bağlama kapasitesi sergileyen kararlı, kırmızımsı-kahverengi dispersiyalı Hb@HP-UiO-66-PEG NP'ler beklenmektedir.
  12. Isteğe bağlı: Hb@HP-UiO-66-PEG NP'lerde kapsüllenmiş serbest Hb ve Hb'nin oksijen ayrışma eğrilerini (ODC) geçirerek %50 Hb oksijen doygunluğu (p50) ve Hill-n katsayısı (Hill-n) kısmi oksijen basıncını tespit eder (Şekil 7).

6. NP'nin stabilitesinin değerlendirilmesi (Beklenen süre: 7 gün)

  1. Hb@HP-UiO-66-PEG NP (~5 mg) yedi adet 2 mL santrifüj tüpüne dağıtın. Her ortamdan 2 ml ekleyin: ultrasaf su, tuzlu (%0,9 NaCl), HEPES (20 mM), fare serumu, insan plazması, Dulbecco'nun modifiye Eagle's orta-yüksek glikozu (DMEM) ve fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS). Santrifüj tüp kapaklarının sıkıca kapalı olduğundan emin olun, inkubasyon sırasında orta buharlaşmanı önleyin. CD-1 fare serumu ve insan plazması Innovative Research (Novi, MI, ABD) tarafından satın alınmaktadır.
  2. Örnekleri 37 °C sıcaklığında bir termoshaker'da 1.000 rpm'de 7 güne kadar kuluçka edin.
  3. 3 ve 7 gün sonra, partikülleri santrifüjle (12.000 g, 10 dakika, oda sıcaklığında) toplayın, bir kez ultra saf suyla yıkayın ve PXRD için kurutun (Şekil 8A). Çökelti tamamen peletlenmemişse, santrifüj süresini gerektiğinde uzatın.
  4. 0, 24, 72 ve 168 saatte aliquotları (~50 μL) çekip DLS analizi (boyut ve PDI) için 20 kat seyreldin (Şekil 8B).
  5. Isteğe bağlı: PBS'de 48 saat sonra SEM örnekleri hazırlayarak morfolojiyi görsel olarak kontrol eder (Şekil 8C).
    NOT: NP'lerin süspansiyonunu (PBS'de) ultrasaf suyla seyreltmek, tampon bileşenlerden kaynaklanan arka plan parazitini azalttığı ve NP'lerin net görüntülenmesini sağladığı için SEM analizi için gereklidir.
  6. Aynı koşullarda PEGillenmemiş Hb@HP-UiO-66-N3 NP'lerle karşılaştırın; karakteristik kristal yansımaların hızlı kaybolması ve geniş amorf saçılma özelliklerinin ortaya çıkması, PEG kaplaması olmadan kararsızlık anlamına gelir.
    NOT: PEGillenmiş örnekler tüm ortamlarda 7 gün sonra yapısal olarak sağlam kalırken, PEGilasyonsuz örnekler PBS veya DMEM'de 24 saat içinde bozunur.

7. Fizikokimyasal karakterizasyon (Beklenen süre: ~15 gün)

NOT: Bu bölüm, NP'lerin morfolojisini, bileşimini, gözenekliliğini ve Hb bütünlüğünü doğrulamak için gereken analitik yöntemleri açıklar. Bu karakterizasyon teknikleri, sentez ve modifikasyon süreçlerinin tekrarlanabilirliğini topluca doğrular.

  1. PXRD
    1. Her NP örneğini bir gece boyunca dondurucu kurutucuda kurutarak adsorbe edilmiş nemi gidermek için kurutun.
    2. Örneği düz bir sıfır arka plan silikon tutucuya yükleyin ve temiz bir cam sürgüyle nazikçe düzleştirerek ince, tekdüz bir tabaka oluşturun.
      NOT: Çok sert basmaktan kaçının, bu tercih edilen yönelim etkilerini yaratabilir.
    3. PXRD desenlerini, Cu Kα radyasyonu (λ = 1.5418 Å) ile donatılmış bir tezgah üstü difraktometre kullanarak kaydedin. Tarama parametreleri 2θ = 4-50°, adım boyutu = 0.02°, dwell = 1 s her adım olarak ayarlanır.
    4. Elde edilen desenleri, daha önce bildirilen kristal verilerine dayanarak Mercury yazılımı kullanılarak oluşturulan simüle edilmiş UiO-66yapısıyla karşılaştırın. 7.3°, 8.4° ve 25.7° keskin zirvelerin varlığı kristal bütünlüğü gösterir.
  2. N2 Adsorpsiyon-Desorpsiyon (BET Yüzey Alanı ve Gözenek Boyutu Dağılımı)
    1. Her NP örneğinden ~100 mg ga, ultra yüksek saflıkta N2 arındırıcı Micromeritics Smart VacPrep sistemi kullanılarak 24 saat boyunca vakumda geçirilir.
    2. Gazdan çıkarılan örnekleri hemen Micromeritics Tristar yüzey alanı analizörünün analiz portuna aktarın. 0-1 arası göreli basınç aralığı (P/P₀) içinde 77 K'da N2 izotermleri kaydedilir.
    3. Genişletilmiş Rouquerolkriterleri 52'yi takip ederek BET yöntemiyle yüzey alanlarını hesaplayın. Micromeritics yazılımında uygulanan yerel olmayan yoğunluk fonksiyonel teorisi aracılığıyla gözenek boyutu dağılımını hesaplayın.
    4. Origin 2022 kullanarak adsorpsiyon/desorpsiyon eğrileri ve gözenek boyutu dağılım grafiklerini oluşturun. Adsorpsiyon/desorpsiyon verilerini yazılıma aktarın; X ekseninde göreceli basınç (P/P₀) ve Y ekseninde N2 adsorbe hacmi ile alın.
    5. Gözenek boyutu dağılımı verilerini, gözenek genişliği X ekseni ve Y ekseni olarak artan gözenek hacmi ile çizin. Sonuçları "Çizgi + Sembol" grafikleri olarak sunun. Tüm analizleri varsayılan yazılım ayarlarıyla yapın.
  3. FTIR Spektroskopisi
    1. Her kurutulmuş numuneden ~5 mg temiz agat harç kullanarak ince bir toz haline getirin. Tozu bir ALPHA-P Brukerspektrometresi 53'ün ATR kristaline yerleştirin.
    2. 4.000-400 cm-1 aralığında 2 cm-1 çözünürlüklü spektrumlar toplayın.
    3. Karakteristik zirveleri belirleyin: ~2122 cm-1 civarında N3 uzanışının ortaya çıkışı azid oluşumunu doğrular (Şekil 4A). PEGLIZASYONDAN sonra, sırasıyla ~2883 cm-1 ve ~1097 cm-1 seviyelerinde −CH2− ve C-O-C bantları ile birlikte N3 uzanışının kayboluşunu gözlemleyin (Şekil 6A). Azid bandının kaybolması ve PEG kaynaklı metilen (−CH2−) ile eter kemiği (−O−) sinyallerinin ortaya çıkması SPAAC reaksiyonunun tamamlandığını doğrular.
    4. FTIR eğrilerini Origin 2022 kullanarak çizin. Ham verileri X (dalga sayısı) ve Y (geçirim) değerleriyle yazılıma aktarın. Yazılımın varsayılan ayarlarını kullanarak grafikleri "Line" formatında oluşturun.
  4. 1H NMR
    1. Cam şişeye yerleştirilmiş D2O içindeki 0,5 mL 2 M KOH'a ~10 mg NP ekleyin ve çerçevenin sindirilmesi için 80 °C'de 1-2 saat ısıtın.
    2. Çözünmemiş kalıntıları döndürmek için santrifüj (12.000 x g, 10 dakika, oda sıcaklığında) kullanılır. Süpernatantı 5 mm NMR tüpüne aktarın.
    3. 400 MHz Bruker Avance spektrometresiyle 1H NMR spektrumunu kaydedin.
    4. MestReNova'nın yazılımını kullanarak BDC-NH2'nin aromatik protonları (δ = 6-8 ppm) ve PEG sinyalleri (δ = ~3,53 ppm, Şekil 6B) dahil olmak üzere karakteristik kimyasal kaymaları atanın. NMR verilerini, yazılımın NMR işlem modülünü varsayılan ayarlarıyla analiz edin.
  5. SEM
    1. ~5 μL NP süspansiyon damlasını silikon levhaya yatırmak; tozsuz bir dolapta hava kurumasına izin verin. Şarj olursa, 5 nm altınla sputter kaplama yapın.
    2. 10-20 kV hızlandırma voltajında bir FEI Quanta 200 SEM ile görüntü.
    3. ImageJ kullanarak görüntüleri analiz edin. Gömülü ölçek bilgisiyle orijinal TIFF görüntülerini yazılıma aktarın ve sadece görselleştirme için parlaklık ile kontrastı ayarlayın. Boyutsal bilgiyi etkileyebilecek ek işlem uygulamayın. Ölçek çubuklarını yazılımın Analyze fonksiyonunu kullanarak oluşturun.
  6. TEM
    1. ~5 μL NP dispersyonu dantelli-karbon Cu ızgarasına (300 ağ) yerleştirin. Fazla kağızı filtre kağıdıyla lekeleyin ve ortam koşullarında kurutulun.
    2. 200 kV'da FEI Tecnai T20 G2 TEM altında incelenin.
    3. ImageJ kullanarak görüntüleri analiz edin. Görüntü işleme, Bölüm 7.5.3'te tanımlanan prosedürleri takip eder.
  7. DLS ve ζ-Potansiyel
    1. Boyut ve PDI analizi için ultrasaf suda NP'leri ~20 kat seyreltirin; ζ potansiyeli için HEPES tamponu (20 mM, pH 7.4) içinde seyreltirin.
    2. 25 °C'de bir Zetasizer Nano ZS ile ölçün. En az üç bağımsız örnek (n = 3) hazırlanır ve her örnek üçlü olarak ölçülür.
    3. DLS ve ζ potansiyel verilerini Origin 2022 kullanarak çizin. Yoğunluk ağırlıklı parçacık boyut dağılımını "Çizgi + Sembol" grafikleri olarak, ζ potansiyel sonuçlarını ise "Sütun" grafikleri olarak sunun. Verileri ortalama ± standart sapma (n = 3) olarak bildirin. Tüm analizleri yazılımın varsayılan ayarlarıyla yapın.
  8. Hb işlevselliği için UV-vis spektroskopisi
    1. 3 mL ultrasaf suya 3 mg serbest Hb veya karşılık gelen miktarda NP (yani eşdeğer miktarda kapsüllenmiş Hb içeren) dağıtın. Süspansiyonları kuvars bir küvete aktarın. UV-2600 UV−vis spektrofotometre kullanılarak 375-700 nm aralığında UV-vis spektrometresi kaydedin.
    2. Hb çözeltisine veya NP süspansiyonuna bir tutam sodyum ditionit ekleyin ve numuneyi oksijensizleştirmek için N2 ile 10 dakika boyunca temizleyin. Soret bandının 412'den 430 nm'ye kaymasını ve Q-bantlarının birleşmesini kaydet. Geri dönüşü gözlemlemek için 10 dakika boyunca hava köpükleriyle numuneyi yeniden oksijenlenin (Şekil 5F ve Ek Şekil 1).
    3. Verileri Origin 2022 kullanarak grafiklendirin. Spektrumları "Çizgi" grafikleri olarak sunun; dalga boyu X ekseninde, absorbans ise Y ekseninde olur.
  9. Serbest bırakılan oksijenin nicelendirilmesi
    1. 1 mg serbest Hb veya karşılık gelen miktarda Hb@HP-UiO-66-N3 ve Hb@HP-UiO-66-PEG NP (eşdeğer miktarda kapsüllenmiş Hb içeren) 600 μL ultrasaf suya dağıtın. Süspansiyonları 2 mL'lik cam şişelere aktarın ve kauçuk kapaklarla sıkıca kapatın.
    2. Oksijen elektrodunun iğne probunu kauçuk kapağın içinden süspansiyona dikkatlice yerleştirerek iğne tipi O2 ölçü kullanarak çözünmüş oksijen seviyesini izleyin.
    3. Hızla K3[Fe(CN)6] çözeltisini (100 μL ultrasaf suda %10) süspansiyona bir şırınga iğnesi ile ekleyin ve oksijen seviyesindeki değişimi sürekli kaydedin.
    4. K3[Fe(CN)6] eklendikten sonra gözlemlenen maksimum değeri, toplanmadan önceki ilk değerden çıkarılarak serbest bırakılan oksijeni hesaplayın. Elde edilen değerleri, aynı miktarda serbest Hb'den (Şekil 6F) salınan oksijenle normalleştirin, Origin 2022 kullanarak. Serbest Hb veya her NP için üç bağımsız örnek (n = 3) ölçün.
      NOT: Hb@HP-UiO-66-N3 ve Hb@HP-UiO-66-PEG NP'leri, serbest Hb'nin salındığı oksijenin ~%60'ını salgılayan benzer oksijen salınımına sahiptir.
  10. ODC'lerin ölçümü ve p50 ile Hill-n'nin hesaplanması
    1. Serbest sığır Hb veya Hb@HP-UiO-66-PEG NP'leri, 3 mL HEPES-salin tamponunda ~1 mg mL-1 nihai Hb konsantrasyonu ile (20 mM HEPES, %0,9 (w/v) NaCl, pH 7,4) hazırlanır. Örneği, manyetik karıştırma çubuğu ile donatılmış bir kuvars küvetine aktarın.
    2. Kuveti bir Hemox analizörüne yerleştirin. Ölçüm sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın ve sistemin sürekli karıştırma altında dengelenmesine izin verin, ta ki stabil bir baz çizgisi elde edilene kadar.
    3. ODC'leri 1-148 mmHg kısmi basınç aralığında aşamalı oksijensizleştirme ile kaydedin. ODC'leri ölçmek ve varsayılan analiz ayarlarıyla p50 ile Hill-n'i hesaplamak için önceden yüklü Hemox analizör yazılımını kullanın. Her örnek için üç bağımsız örneklem (n = 3) ölçün.
    4. İşlenen verileri dışa aktarın ve ODC'leri Origin 2022 kullanarak varsayılan "Line" grafik formatında çizin.

8. Tekrarlanabilirlik ve istatistiksel analiz

  1. Bu protokolte tanımlanan tüm prosedürleri en az üç bağımsız kez gerçekleştirin. Sonuçları bu tekrarlarda gözlemlenen tipik sonuçlar olarak bildirin. Reaksiyon süreleri ve sıcaklıklar gibi temel deneysel parametreleri makul bir aralıkta tutarak diğer kullanıcılar için tekrarlanabilirlik ve güvenilirlik sağlanır.
  2. Nitel doğrulama için statistiksel analiz yapmadan temsil eden yapısal karakterizasyonu (PXRD, N2 adsorpsiyon-desorpsiyon, FTIR , 1H NMR, SEM, UV-VIS) sunun.
  3. Nicel ölçümleri (DLS, ζ-potansiyel, p50, Hill-n) ortalama SD ± (n ≥ 3) olarak bildirin. İstitiksel anlamlılığı uygun olduğunda eşleşmemiş iki kuyruklu Welch t-testi veya tek yönlü ANOVA'yı kullanarak belirleyin. Anlamlılık seviyeleri ns (anlamlı değil), * = p < 0.05, ** = p < 0.005, *** = p < 0.001, **** = p < 0.0001 olarak belirtin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HP-UiO-66-NH2 NP'lerin başarılı sentezi, PXRD (Şekil 2A) ile doğrulandı; bu seviyede karakteristik kırınım tepeleri 2θ = 7.3°, 8.4° ve 25.7° olarak gösterildi ve bu da simüle edilen UiO-66 yapısı36 ile iyi uyum sağladı. Simüle edilen desene göre hafif zirve genişleme, parçacıkların nano ölçekli boyutlarına atfedildi vesentezden sonra kristal bütünlüğün korunması doğrulandı 54. DA'nın tamamen alınması...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Hb kapsülleme ve oksijen dağıtımı uygulamaları için tasarlanmış HP-UiO-66 NP'lerini sentezlemek, işlevselleştirmek ve karakterize etmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir yol sunar. İçten dışa mühendislik yaklaşımını benimseyerek, bu çalışma, biyomedikal uygulamalar için MOF'un NP'lerinin tasarımı için genellenebilebilir bir çerçeve oluşturur; biyomakromolekül ve ilaç teslimatı dahil. Temel materyal kavramı ve işlevsel performans daha önce bildirilmiş olsa da, mevcut protoko...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden bir finansal çıkar belirtmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Avrupa Araştırma Konseyi'nin Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı (Hibe No. 101002060) kapsamındaki desteği minnettarlıkla takdir ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2-amino-1,4-benzenedikarboksilik asit Merck Yaşam Bilimleri A/S (Sø borg, DK)381071-25G
4-(2-Hidroksietil)piperazin-1-etansülfonik asitMerck Yaşam Bilimleri A/S (Sø borg, DK)H3375-100G
Aseton (%99)VWR International (Sø borg, DK)23J244030
Bisinkoninik asit protein testi  Thermo Fisher Scientific (Roskilde, DK)23235
Sığır kanı SSI Diagnostica A/S (Hillerø d, DK)77667
Santrifüj tüpü
Santrifüj Thermo Fisher Scientific Inc (Massachusetts, ABD)75009903Megafuge ST Plus serisi 
Döteryum oksitMerck Yaşam Bilimleri A/S (Sø borg, DK)151882
Dibenzosiskooktin-polietilen glikolBroadPharmBP-23949
Dodekanoik asit Merck Yaşam Bilimleri A/S (Sø borg, DK)L556-1KG
Dulbecco' s modifiye kartal' s orta&eksi; yüksek glikoz & nbsp;Merck Yaşam Bilimleri A/S (Sø borg, DK)11965092
Etanol (%100)VWR International (Sø borg, DK)24L044013
Fourier dönüşümü kızılötesi spektroskopisi Bruker (Billerica, ABD)
Hemox analizörü TSC Bilimsel Kredi Komisyonu (PA, ABD)
İnsan sitratlı plazmasıTebuBioSER-PLP25
Hidroklorik asit (%37)Merck Yaşam Bilimleri A/S (Sø borg, DK)320331-500ML
ImageJ yazılımıUlusal Sağlık Enstitüleri (ABD)Sürüm 1.47t
Dantelli-karbon Cu ızgarası (300 ağ)Agar Scientific Ltd., (Stansted Essex, Birleşik Krallık)AGS166-3H
Manyetik karıştırıcıIKA-Werke GmbH & Şirket KG (,DE)Tanım. Hayır: 0010011496
MestReNova sofewareMestrelab Araştırmaları (İspanya)Sürüm 12
Micromeritics Tristar yüzey alanı analizörüThermo Fisher Scientific IncASAP 2020 Plus
Mini santrifüjEppendorf Nordic (Hø rsholm, DK)Katalog No.  5452000010
Fare serumuYenilikçi Araştırma (Novi, MI, ABD)IGMSCD1SER10ML
Muffle furnace Nabertherm GmbH (Bremen, DE)Muffle fırını LE 6/11
N,N′-dimetilformamid (%99,9)VWR International (Sø borg, DK)250131a008
Nanodrop 2000c ekipman & nbsp;Thermo Fisher
Nükleer manyetik rezonans Bruker (Billerica, ABD)
O2 meter PreSens (Regensburg, Almanya)
Origin 2022 yazılımıOriginLab Corporation (MA, ABD)Sürüm 2022 
Oksijen sensörüPreSens (Regensburg, DE)OXY-1 ST izi
Fosfatla tamponlanmış tuzlu sıvı Merck Yaşam Bilimleri A/S (Sø borg, DK)P4417-50TAB
Plaka okuyucuTecan Group Ltd.  (Mä nnedorf, CH)
Potasyum heksasiyanoferatMerck Yaşam Bilimleri A/S (Sø borg, DK)60299-100G
Potasyum hidroksitMerck Yaşam Bilimleri A/S (Sø borg, DK)221473-500G
Toz X-ışını difraksiyonu Malvern Panalytical Ltd., (Malvern, Birleşik Krallık)Model: Malvern Panalytical Aeris Research 600W XRD toz ölçümleri için (2020 yayımlandı)
Yuvarlak tabanlı basınç kabı Merck Yaşam Bilimleri A/S (Sø borg, DK)SYNP170004-1EA
Taramalı elektron mikroskopisi FEI Şirketi (Hillsboro, ABD)Çift Işınlı FEI Helios Nanolab 600
sodyum klorid Merck Yaşam Bilimleri A/S (Sø borg, DK)71376
Sodyum ditionit Merck Yaşam Bilimleri A/S (Sø borg, DK)71699-250G
Sodyum dodesil sülfat Merck Yaşam Bilimleri A/S (Sø borg, DK)L4509-100G
Synthware™ yuvarlak tabanlı basınç kabıMerck Yaşam Bilimleri A/S (Sø borg, DK)SYNP170003
Tert-butil nitrit Merck Yaşam Bilimleri A/S (Sø borg, DK)20370-100ml-F
Tetrahidrofuran (%99,7)VWR International (Sø borg, DK)201022A004
TermoshakerGrant Instruments (Cambridge) Ltd (Birleşik Krallık)PHMT-PSC18 (01012015020119)
Geçirim elektron mikroskopisi FEI Şirketi (Hillsboro, ABD)FEI Tecnai T20
Trimetilsilil azid Merck Yaşam Bilimleri A/S (Sø borg, DK)155071-10G
TSC HEMOX DAQ SistemiTSC Bilimsel Kredi Komisyonu (PA, ABD)Hemox analizör yazılımı 
Ultrosound sonikator Branson Ultrasonics Corporation (Danbury, ABD)SKU: 2410240003
UV-Vis spektrofotometresi Shimadzu (Kyoto, JP)
Vakumlu fırın Thermo Fisher Scientific Inc (Massachusetts, ABD)
Zetasizer Nano ZSMalvern Panalytical Ltd., (Malvern, Birleşik Krallık)Seri NUMARA. MAL1188530
Zirkonyum(IV) klorürMerck Yaşam Bilimleri A/S (Sø borg, DK)357405-100G

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sen Gupta, A., Doctor, A. Oxygen Carriers. Damage Control Resuscitation. , Springer International Publishing. Cham, Switzerland. (2020).
  2. Sen Gupta, A. Bio-inspired nanomedicine strategies for artificial blood components. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (6), e1464(2017).
  3. Ding, L., et al. Engineered Red Blood Cell Biomimetic Nanovesicle with Oxygen Self-Supply for Near-Infrared-II Fluorescence-Guided Synergetic Chemo-Photodynamic Therapy against Hypoxic Tumors. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (44), 52435-52449 (2021).
  4. Sang, W., et al. Oxygen-Enriched Metal-Phenolic X-Ray Nanoprocessor for Cancer Radio-Radiodynamic Therapy in Combination with Checkpoint Blockade Immunotherapy. Advanced Science. 8 (4), 2003338(2021).
  5. Kim, H., et al. Upconverting nanoparticle-containing erythrocyte-sized hemoglobin microgels that generate heat, oxygen and reactive oxygen species for suppressing hypoxic tumors. Bioactive Materials. 22, 112-126 (2023).
  6. Wang, Y., et al. Highly Penetrable and On-Demand Oxygen Release with Tumor Activity Composite Nanosystem for Photothermal/Photodynamic Synergetic Therapy. ACS Nano. 14 (12), 17046-17062 (2020).
  7. Liu, L., et al. Hemoglobin based oxygen carrier and its application in biomedicine. Coordination Chemistry Reviews. 532, 216508(2025).
  8. Mohanto, N., Mondal, H., Park, Y. -J., Jee, J. -P. Therapeutic delivery of oxygen using artificial oxygen carriers demonstrates the possibility of treating a wide range of diseases. Journal of Nanobiotechnology. 23 (1), 25(2025).
  9. Cao, M., et al. Hemoglobin-Based Oxygen Carriers: Potential Applications in Solid Organ Preservation. Frontiers in Pharmacology. 12, 760215(2021).
  10. Jansman, M. M. T., Hosta-Rigau, L. Recent and prominent examples of nano- and microarchitectures as hemoglobin-based oxygen carriers. Advances in Colloid and Interface Science. 260, 65-84 (2018).
  11. Coll-Satue, C., Bishnoi, S., Chen, J., Hosta-Rigau, L. Stepping stones to the future of haemoglobin-based blood products: clinical, preclinical and innovative examples. Biomaterials Science. 9 (4), 1135-1152 (2021).
  12. Taguchi, K., Maruyama, T., Otagiri, M. Pharmacokinetic properties of hemoglobin vesicles as a substitute for red blood cells. Drug Metabolism Reviews. 43 (3), 362-373 (2011).
  13. Rameez, S., Alosta, H., Palmer, A. F. Biocompatible and Biodegradable Polymersome Encapsulated Hemoglobin: A Potential Oxygen Carrier. Bioconjugate Chemistry. 19 (5), 1025-1032 (2008).
  14. Pacheco, M. O., et al. Silk Fibroin Particles as Carriers in the Development of Hemoglobin-Based Oxygen Carriers. Advanced NanoBiomed Research. 3 (9), 2300019(2023).
  15. Taguchi, Y., Cu, Y., Fei, J., Dai, L., Li, J. Yang Construction and Evaluation of Hemoglobin-BasedCapsules as Blood Substitutes. Advanced Functional Materials. 22, 1446-1453 (2012).
  16. Coll-Satue, C., Jansman, M. M. T., Thulstrup, P. W., Hosta-Rigau, L. Optimization of Hemoglobin Encapsulation within PLGA Nanoparticles and Their Investigation as Potential Oxygen Carriers. Pharmaceutics. 13 (11), 1958(2021).
  17. Jansman, M. M. T., et al. Hemoglobin-based oxygen carriers camouflaged with membranes extracted from red blood cells: Optimization and assessment of functionality. Biomaterials Advances. 134, 112691(2022).
  18. Liu, X., Jansman, M. M. T., Hosta-Rigau, L. Haemoglobin-loaded metal organic framework-based nanoparticles camouflaged with a red blood cell membrane as potential oxygen delivery systems. Biomaterials Science. 8 (21), 5859-5873 (2020).
  19. Grzegorzewski, W., et al. Hemoglobin-Based Oxygen Carriers: Selected Advances and Challenges in the Design of Safe Oxygen Therapeutics (A Focused Review). International Journal of Molecular Sciences. 26 (19), 9775(2025).
  20. Zhu, K., et al. Nanomaterial-related hemoglobin-based oxygen carriers, with emphasis on liposome and nano-capsules, for biomedical applications: current status and future perspectives. Journal of Nanobiotechnology. 22 (1), 336(2024).
  21. Lawson, H. D., Walton, S. P., Chan, C. Metal-Organic Frameworks for Drug Delivery: A Design Perspective. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (6), 7004-7020 (2021).
  22. Lian, X., Chen, Y. -P., Liu, T. -F., Zhou, H. -C. Coupling two enzymes into a tandem nanoreactor utilizing a hierarchically structured MOF. Chemical Science. 7 (12), 6969-6973 (2016).
  23. Jin, W., et al. Surface engineering of metal-organic framework nanoparticles-based miRNA carrier: Boosting RNA stability, intracellular delivery and synergistic therapy. Journal of Colloid and Interface Science. 677, 429-440 (2025).
  24. Wang, Q., et al. Hemoglobin coated oxygen storage metal-organic framework as a promising artificial oxygen carrier. Journal of Materials Chemistry B. 9 (19), 4002-4005 (2021).
  25. Jin, W., et al. Small RNA stabilization via non-covalent binding with a metalloporphyrin nanocage to accomplish synergistic gene and photodynamic therapy. Cell Reports Physical Science. 3 (12), 101187(2022).
  26. Douka, D., et al. Hemoglobin-loaded ZIF-8 nanoparticles functionalized with human serum albumin as stealth, stable, and biocompatible oxygen carriers. Nanoscale Advances. 7 (24), 8058-8073 (2025).
  27. Liang, K., et al. Biomimetic mineralization of metal-organic frameworks as protective coatings for biomacromolecules. Nature Communications. 6 (1), 7240(2015).
  28. Douka, D., Jin, W., Cantallops-Iglesias, C., Dieste-Izquierdo, A., Thulstrup, P. W., Hosta-Rigau, L. Optimization and Investigation of Hemoglobin-Loaded ZIF-90 Metal-Organic Framework Nanoparticles as Artificial Oxygen Carriers. Particle & Particle Systems Characterization. 42 (3), 2400189(2025).
  29. Noori, R., Maarof, N. N. N., Alshatteri, A. H. High-efficiency encapsulation and pH-triggered release of docetaxel from folic acid-functionalized ZIF-90 nanocarriers. RSC Advances. 15 (53), 45347-45358 (2025).
  30. Poryvaev, A. S., et al. Guest Leakage from ZIF-8 Particles under Drug Delivery Conditions: Quantitative Characterization and Guest-Induced Framework Stabilization. The Journal of Physical Chemistry C. 125 (28), 15606-15613 (2021).
  31. Valenzano, L., et al. Disclosing the Complex Structure of UiO-66 Metal Organic Framework: A Synergic Combination of Experiment and Theory. Chemistry of Materials. 23 (7), 1700-1718 (2011).
  32. Jarai, B. M., Stillman, Z., Attia, L., Decker, G. E., Bloch, E. D., Fromen, C. A. Evaluating UiO-66 Metal-Organic Framework Nanoparticles as Acid-Sensitive Carriers for Pulmonary Drug Delivery Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (35), 38989-39004 (2020).
  33. Hou, T., Huang, Y., Wang, X., Hu, X., Guan, P. Preparation of lysozyme-imprinted mesoporous Zr-based metal-organic frameworks with remarkable specific recognition. Talanta. 265, 124896(2023).
  34. Parvizifard, G., Alipour, E., Soltani, S., Hosseini, M. G. Development of a novel voltammetric aptasensor for highly sensitive detection of cardiac troponin I, utilizing ciprofloxacin-loaded UIO-66 metal-organic frameworks. Talanta. 296, 128471(2026).
  35. Jin, W., et al. Biorthogonal PEGylation of Hierarchical Porous Metal-Organic Frameworks as Robust, Functional Nanocarriers for Hemoglobin-Based Oxygen Delivery. Journal of the American Chemical Society. 147 (47), 43400-43414 (2025).
  36. Cai, G., Jiang, H. -L. A Modulator-Induced Defect-Formation Strategy to Hierarchically Porous Metal-Organic Frameworks with High Stability. Angewandte Chemie International Edition. 56 (2), 563-567 (2017).
  37. Wen, S., Fu, Q., Yan, L., Zhao, X. Hierarchically porous three-dimensional-ordered macro-microporous metal-organic frameworks: Design, precise synthesis, and applications. Coordination Chemistry Reviews. 517, 215996(2024).
  38. Bunzen, H. Chemical Stability of Metal-Organic Frameworks for Applications in Drug Delivery. ChemNanoMat. 7 (9), 998-1007 (2021).
  39. Bůžek, D., Adamec, S., Lang, K., Demel, J. Metal-organic frameworks vs. buffers: case study of UiO-66 stability. Inorganic Chemistry Frontiers. 8 (3), 720-734 (2021).
  40. Chen, X., Argandona, S. M., Melle, F., Rampal, N., Fairen-Jimenez, D. Advances in surface functionalization of next-generation metal-organic frameworks for biomedical applications: Design, strategies, and prospects. Chem. 10 (2), 504-543 (2024).
  41. Sanità, G., Carrese, B., Lamberti, A. Nanoparticle Surface Functionalization: How to Improve Biocompatibility and Cellular Internalization. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 587012(2020).
  42. Chen, X., et al. Formulation of Metal-Organic Framework-Based Drug Carriers by Controlled Coordination of Methoxy PEG Phosphate: Boosting Colloidal Stability and Redispersibility. Journal of the American Chemical Society. 143 (34), 13557-13572 (2021).
  43. Wang, S., McGuirk, C. M., d'Aquino, A., Mason, J. A., Mirkin, C. A. Metal-Organic Framework Nanoparticles. Advanced Materials. 30 (37), 1800202(2018).
  44. Abánades Lázaro, I., Haddad, S., Sacca, S., Orellana-Tavra, C., Fairen-Jimenez, D., Forgan, R. S. Selective Surface PEGylation of UiO-66 Nanoparticles for Enhanced Stability, Cell Uptake, and pH-Responsive Drug Delivery. Chem. 2 (4), 561-578 (2017).
  45. Verhoef, J. J. F., Anchordoquy, T. J. Questioning the use of PEGylation for drug delivery. Drug Delivery and Translational Research. 3 (6), 499-503 (2013).
  46. Sheffey, V. V., Siew, E. B., Tanner, E. E. L., Eniola-Adefeso, O. PLGA's Plight and the Role of Stealth Surface Modification Strategies in Its Use for Intravenous Particulate Drug Delivery. Advanced Healthcare Materials. 11 (8), 2101536(2022).
  47. Suk, J. S., Xu, Q., Kim, N., Hanes, J., Ensign, L. M. PEGylation as a strategy for improving nanoparticle-based drug and gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 28-51 (2016).
  48. Siegel, N., et al. Universal Click-Chemistry Approach for the DNA Functionalization of Nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 146 (25), 17250-17260 (2024).
  49. Chen, J., Liu, X., Jansman, M. M. T., Thulstrup, P. W., Hosta-Rigau, L. Metal-Phenolic Networks as Broad-Spectrum Antioxidant Coatings for Hemoglobin Nanoparticles Working as Oxygen Carriers. Chemistry of Materials. 34 (20), 9200-9211 (2022).
  50. Evans, T. G., Salinger, J. L., Bingel, L. W., Walton, K. S. Determining Surface Areas and Pore Volumes of Metal-Organic Frameworks. Journal of Visualized Experiments. (205), e65716(2024).
  51. Coll-Satue, C., Jansman, M. M. T., Hosta-Rigau, L. Comparative Evaluation of UV-Vis Spectroscopy-Based Approaches for Hemoglobin Quantification: Method Selection and Practical Insights. Biomolecules. 14 (9), 1046(2024).
  52. Osterrieth, J. W. M., et al. How Reproducible are Surface Areas Calculated from the BET Equation. Advanced Materials. 34 (27), 2201502(2022).
  53. Drenchev, N. L., et al. In situ FTIR Spectroscopy as a Tool for Investigation of Gas/Solid Interaction: Water-Enhanced CO2 Adsorption in UiO-66 Metal-Organic Framework. Journal of Visualized Experiments. (156), e60285(2020).
  54. Li, F., Zheng, K., Zhang, H., Duan, C., Xi, H. Nanoscale Hierarchically Porous Metal-Organic Frameworks: Facile Synthesis, Mechanism Research, and Application. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 7 (13), 11080-11087 (2019).
  55. Liu, G., Luo, Q., Wang, H., Zhuang, W., Wang, Y. In situ synthesis of multidentate PEGylated chitosan modified gold nanoparticles with good stability and biocompatibility. RSC Advances. 5 (86), 70109-70116 (2015).
  56. Ben-Haim, A. E., et al. DNA Delivery to Intact Plant Cells by Casein Nanoparticles with Confirmed Gene Expression. Advanced Functional Materials. 34 (16), 2314756(2024).
  57. Gourianov, N., Kluger, R. Conjoined Hemoglobins. Loss of Cooperativity and Protein−Protein Interactions. Biochemistry. 44 (45), 14989-14999 (2005).
  58. Doustkhah, E., Hassandoost, R., Khataee, A., Luque, R., Assadi, M. H. N. Hard-templated metal-organic frameworks for advanced applications. Chemical Society Reviews. 50 (5), 2927-2953 (2021).
  59. Li, C., et al. Metal Organic Framework Cubosomes. 62 (11), Angewandte Chemie International Edition. e202215985(2023).
  60. Peng, S., et al. Metal-Organic Framework Encapsulating Hemoglobin as a High-Stable and Long-Circulating Oxygen Carriers to Treat Hemorrhagic Shock. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (39), 35604-35612 (2019).
  61. Gu, X., Palmer, A. F. ZIF-8 Metal-Organic Framework Nanoparticles Loaded with Hemoglobin as a Potential Red Blood Cell Substitute. ACS Applied Nano Materials. 5 (4), 5670-5679 (2022).
  62. Pullen, S., Clever, G. H. Mixed-Ligand Metal-Organic Frameworks and Heteroleptic Coordination Cages as Multifunctional Scaffolds-A Comparison. Accounts of Chemical Research. 51 (12), 3052-3064 (2018).
  63. Pastore, V. J., Cook, T. R., Rzayev, J. Polymer-MOF Hybrid Composites with High Porosity and Stability through Surface-Selective Ligand Exchange. Chemistry of Materials. 30 (23), 8639-8649 (2018).
  64. Obeso, J. L., Huxley, M. T., De Los Reyes, J. A., Humphrey, S. M., Ibarra, I. A., Peralta, R. A. Low-Valent Metals in Metal-Organic Frameworks Via Post-Synthetic Modification. Angewandte Chemie International Edition. 62 (49), e202309025(2023).
  65. Zhang, X., Malhotra, S., Molina, M., Haag, R. Micro- nanogels with labile crosslinks - from synthesis to biomedical applications. Chemical Society Reviews. 44 (7), 1948-1973 (2015).
  66. Biscarat, J., Charmette, C., Masquelez, N., Sanchez, J., Pochat-Bohatier, C. Crosslinking of gelatin membranes with ferulic acid or glutaraldehyde: Relationship between gas permeability and renaturation level of gelatin triple helices. Journal of Polymer Science Part B: Polymer Physics. 53 (4), 280-287 (2015).
  67. Kurian, P., et al. Synthesis, permeability and biocompatibility of tricomponent membranes containing polyethylene glycol, polydimethylsiloxane and polypentamethylcyclopentasiloxane domains. Biomaterials. 24 (20), 3493-3503 (2003).
  68. Liu, X., Jansman, M. M. T., Li, W., Kempen, P., Thulstrup, P. W., Hosta-Rigau, L. Metal-organic framework-based oxygen carriers with antioxidant protection as a result of a polydopamine coating. Biomaterials Science. 9 (21), 7257-7274 (2021).
  69. Srinivasu, B. Y., Bose, B., Mitra, G., Kurpad, A. V., Mandal, A. K. Adsorption Induced Changes of Human Hemoglobin on Ferric Pyrophosphate Nanoparticle Surface Probed by Isotope Exchange Mass Spectrometry: An Implication on Structure-Function Correlation. Langmuir. 33 (32), 8032-8042 (2017).
  70. Chen, K., et al. Low Modulus Biomimetic Microgel Particles with High Loading of Hemoglobin. Biomacromolecules. 13 (9), 2748-2759 (2012).
  71. Dyachenko, A., Gruber, R., Shimon, L., Horovitz, A., Sharon, M. Allosteric mechanisms can be distinguished using structural mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7235-7239 (2013).
  72. Coll-Satue, C., et al. A novel PEG-mediated approach to entrap hemoglobin (Hb) within ZIF-8 nanoparticles: Balancing crystalline structure, Hb content and functionality. Biomaterials Advances. 163, 213953(2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Hiyerar ik G zeneklilikBiyoortogonal KimyaGerinimle Tetiklenen SikloeklemeMetal Organik er evelerOksijen Ta y c larKolloidal Stabilite

İlgili makaleler