Tüm vücut manyetik stimülasyonu, fare modelinde aşırı yemeyi azaltıyor

Özet

Tüm vücut manyetik uyarısı (WB-MS), aralıklı olarak lezzetli bir diyete erişimi içeren aşırı besleme modelinde kullanıldı. WB-MS, simülasyon sırasında yemeği değiştirmeden alımını geçici olarak azalttı. Yine de etkiler devam etmedi; tedavi sonrası aşırı bağımlılık davranışları yeniden ortaya çıktı; kilo, yağlanma veya c-Fos ifadesinde hiçbir değişiklik olmadı.

Özet

Tüm vücut manyetik uyarısı (WB-MS), aralıklı olarak lezzetli bir diyete erişimi içeren aşırı besleme modelinde kullanıldı. WB-MS, simülasyon sırasında yemeği değiştirmeden alımını geçici olarak azalttı. Yine de etkiler devam etmedi; tedavi sonrası aşırı bağımlılık davranışları yeniden ortaya çıktı; kilo, yağlanma veya c-Fos ifadesinde hiçbir değişiklik olmadı.

Giriş

Aşırı yeme, fizyolojik açlık olmadan yüksek miktarda çok lezzetli yiyeceklerin hızlı tüketilmesiyle karakterize edilen düzensiz bir beslenme düzenidir. Bu, obezite ve metabolik disfonksiyonla güçlü şekilde ilişkilendirilen binge eating bozukluğunun (BED) temel bir^{özelliğidir 1,2}. Artan kanıtlar, mezolimbik ödül devrelerinin beslenme davranışı üzerindeki kontrolün kaybındaki rolünü^{ortaya koymaktadır 3,4}. BED, giderek kortikostriyatal sinyal değişimi bozukluğu olarak kavramsallaşmaktadır; bu bozuklukta, ödülle ilgili ve yürütücü kontrol sistemleri arasındaki düzensiz iletişim, zorunlu gıda alımını teşvik eder. Nörobiyolojik düzeyde, mezolimbik yol içindeki dopaminergik sinyal ve glutamaterjik girdiler, lezzetli yiyecekler için artan motivasyon ve teşvik göstergesi değişikliğine katkıda^{bulunur 5,6}. Ayrıca, GLP-1, insülin ve ghrelin gibi çevresel metabolik sinyaller bu devrelerle etkileşime girerek ödül değerlemesini ve beslenme davranışını^{modüle eder 7}. Son kanıtlar, binge-benzeri davranışın NAc içindeki sinir dinamiklerindeki değişikliklerle ilişkili olduğunu göstermektedir; bunlar delta ve theta aralıklarındaki (2–8 Hz) düşük frekanslı salınımlar da dahil, kontrol kaybından önceki ödül beklentisi ve arzu^{durumlarıyla} bağlantılıdır 8.

NAc, limbik, kortikal ve motor sistemleri birbirine bağlayan bütünleşik bir merkez olarak hareket eder ve motivasyon sinyallerini hedefe yönelik davranışa dönüştürür. Bu sistemin bozulması, özellikle lezzetli yiyeceklere tekrar tekrar maruz kalma durumunda, tüketimde kompulsif ve alışkanlık benzeri alışkanlıkları^{teşvik eder 9,10}. Lezzetli yiyeceklere aralıklı erişim kullanan deneysel modeller, NAc'nin artan aktivasyonuyla ilişkilidir ve bu da kompulsif beslenme davranışındaki rolünü^{destekler 11–14}. İnvaziv olmayan nöromodülasyon, cerrahi müdahale olmadan beyin aktivitesini değiştiren teknikleri ifade eder; bunlara transkraniyal manyetik uyarım gibi manyetik alan tabanlı^{yaklaşımlar da dahildir.} Bu stratejiler, nöropsikiyatrik bozukluklarda sinirsel uyarılabilirliği ve ağ aktivitesini modüle etme yetenekleriyle klinik önem^{kazanmıştır 16,17}. İnsanlarda nöromodülasyonun aşırı yeme belirtilerini azalttığı, davranış kontrolünü iyileştirdiği ve metabolik düzenlemeyi etkilediği^{gösterilmiştir 18,19}.

Bu kanıta dayanarak, tüm vücut manyetik stimülasyonu (WB-MS), kompulsif beslenmede yer alan devreleri modüle edebilen invaziv olmayan bir terapötik yaklaşımı temsil edebilir. Odak tekniklerinin aksine, düşük frekanslı manyetik alanlar nöronal uyarılabilirliği ve dağıtık beyin ağlarını etkileyebilir; bu da^{NAc 8} gibi subkortikal yapılar üzerinde potansiyel bir etki işareti verir. Deneysel çalışmalar, bu tür alanların dopaminergik ve glutamaterjik nörotransmisyonları 6,7,8,19 modüle ettiğini ve ödülle ilgili devreleri etkilemek için makul bir mekanizma sağladığını göstermiştir. Ancak, aşırı yeme davranışı üzerindeki etkileri bilinmemektedir. Bu nedenle, mevcut çalışma, fare modelinde düşük frekanslı WM-MS'nin etkilerini, lezzetli yiyeceklere aralıklı erişimle indüklenen aşırı yeme modelinde değerlendirerek, gıda alımı, vücut ağırlığı, pipozite ve NAc'de c-Fos ifadesini değerlendirmiştir.

Protokol

Tüm prosedürler, Meksika Resmi Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Standardı (NOM-062-ZOO-199) ile uyumlu şekilde yürütüldü ve Meksika Ulusal Otonom Üniversitesi (UNAM) Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kurumsal Komitesi (CICUAL) tarafından 035-CIC-2023 protokol numarası kapsamında onaylandı. Çalışmada kullanılan tüm malzemeler Materyaller Tablosu'nda belirtilmiştir.

Nüfus tanımı ve edinimi

Doğum sonrası 30 gün (P30) tarihinde toplam 30 C57BL/6 fare (9 dişi ve 21 erkek) kullanıldı, başlangıçta vücut ağırlığı 15–18 g idi. Fareler, kontrollü çevresel koşullar altında ev kafeslerinde bireysel olarak tutuldu: 12:12 saat ışık-karanlık döngüsü (ışıklar sabah 6:00'da yanıyor), ortam sıcaklığı 23 ± 2 °C ve bilgili nem %70 ± 10%.

Alışkanlık

P30 seviyesinde hayvanlar bireysel olarak su ve standart yiyeceğe imkansız erişimi olan ev kafeslerinde tutuldu. Tüm kafesler çevre açısından karton tüplerle zenginleştirildi ve yatak malzemesi olarak ahşap talaşları kullanıldı. 7 günlük alışkanlık döneminde, vücut ağırlığı, yiyecek alımı ve su tüketimi her 24 saatte bir kaydedildi.

Aşırı tüketim gibi

Bu çalışmada kullanılan deneysel model, araştırmacılar tarafından tanımlanan aralıklı aşırı tüketim paradigmasına^{dayanmaktadır 14}. Grup dağılımı öncesinde, tüm hayvanlar temel değişkenliği azaltmak için karşılaştırılabilir ortalama vücut ağırlığına (17 g) getirildi. Hayvanlar (N = 30) daha sonra dijital bir "tekerlek döndürme" aracı kullanılarak deneysel gruplara rastgele atandı; bu araçlarda bireysel denekler listelenip sıralı olarak üç gruptan birine dağıtıldı. Standart grup, standart kadın grubu (SFG; n = 3) ve erkekleri (standart erkek grubu, SMG; n = 7) içeriyordu ve sürekli standart yemek ve suya erişimi vardı. Sürekli erişim grubu, standart yemek, su ve lezzetli yiyeceklere (M&M'ler) sürekli imtiyaz erişimine sahip erkekleri (sürekli erkek grubu, CMG; n =7) içeriyordu. Aralıklı erişim grubu, kadınlar (aralıklı kadınlar grubu, IFG; n =3) ve erkekler (aralıklı erkek grubu, IMG; n = 7) içeriyordu; bunlar standart yemek ve suya imek olarak erişebiliyordu ve haftada üç kez (Pazartesi, Çarşamba ve Cuma) 2 saat (16:00-18:00) lezzetli yiyeceklere erişim sağlanıyordu. Bu beslenme koşulları 35 gün boyunca korundu.

Tüm vücut manyetik uyarısı (WB-MS)

Bu uyarılma paradigması, benzer deneysel koşullar altında C57BL/6 farelerinde düşük frekanslı elektromanyetik alanlar (50 Hz, 1 mT) kullanılarak yapılan önceki çalışmalara dayanarak^{seçilmiştir (20,21}). WB-MS, 50 Hz'de 10 Gauss (1 mT) sinüzoidal alternatif manyetik alan üreten darbeli bir manyetoterapi cihazı (Dhan 1000, manyetoterapi ünitesi) kullanılarak gerçekleştirildi. Uyarım seansları için fareler, her kafesin zıt tarafında iki elektromanyetik plaka arasında yerleştirilen ev kafeslerinde bireysel olarak kaldı. Manyetik alan parazitini önlemek için, uyarım sırasında tel kafes, ızgara ve su şişesi gibi metal bileşenler geçici olarak çıkarıldı. Bu düzenleme, hayvanların işlem boyunca kısıtlama veya ek stres olmadan özgürce hareket etmesini sağlıyordu.

Deneysel tutarlılığı sağlamak için, hem uyarma hem de uyarılmamış oturumlarda aynı tutuş ve çevresel koşullar korundu. Kontrol seanslarında (15–21. günler), manyetik plakalar aynı şekilde konumlandırıldı ancak hareketsiz kalırdı; böylece kullanım, kafes manipülasyonu, çevresel gürültü veya elektromanyetik plaka yerleşiminin potansiyel etkileri kontrol edilirdi.

WB-MS, yedi gün ardışık olarak 15:40'tan 16:00'a kadar günlük 20 dakikalık maruziyetlerden oluşuyordu (deneysel protokolün 22–28. günleri), aşırı yeme değerlendirme döneminden hemen önce (16:00–18:00). 29. ile 35. günler arasında fareler tekrar uyarılmadan seanslara maruz bırakıldı ve ardından besin alımları değerlendirildi.

Yağ dokusu koleksiyonu

Deneysel protokolün sonunda (36. gün, saat 8:00), tüm deneysel gruplardan yağ dokusu toplandı. SG üç dişi ve iki erkekten (n = 5), CG üç dişi ve üç erkekten (n = 6), IG ise üç dişi ve dört erkekten (n = 7) oluşuyordu. Tüm hayvanlar ketamin (60 mg/kg) ve ksilazin (5 mg/kg)² ile anestezi edildi ve ayak sıkıştırma uyarısına nosiseptif yanıt olmaması, anestezi derinliğinin yeterli olduğunu doğruladı. Daha sonra ventral orta hat kesi, subkostal, inguinal ve orta hattı karın bölgelerinden geçen No. 3 skalpel bıçağı kullanılarak yapıldı, ardından deri nazikçe lateral geri çekilerek karın boşluğu ortaya çıktı.

Gonadal, retroperitoneal ve deri altı yağ dokusu depoları, standart koşullarda dikkatlice tanımlandı, disekize edildi ve numuneler arası değişkenliği en aza indirmek için çıkarıldı. Diseksiyon sonrası, dokular kalibre edilmiş analitik bir tartı kullanılarak (maksimum kapasite 220 g, okunabilirlik 0,1 mg) tartıldı; bu tartı, üreticinin spesifikasyonlarına^{göre daha önce doğrulanmıştı 23}. Tüm örnekler, deneysel tutarlılığı sağlamak için gruplar arasında aynı koşullarda işlendi.

Beyin dokusu hazırlığı ve immünoflüoresans

Fareler, son gıda tüketme^{seansından 90 dakika sonra 24}. dakikada ötenazi edildi. Beyinler, %4 paraformaldehit ile intrakardiyak perfüzyon sonrası toplandı ve ardından histolojik analiz için işlendi. Koronal beyin kesitleri (30 μm), −18 °C'de tutulan bir kriyostat kullanılarak alındı ve işleme kadar sodyum azid içeren PBS içinde saklandı. Her deneysel gruptan bir alt hayvan kümesi, immünoflüoresans analizleri için beyin dokusu hazırlığına tahsis edildi (SG, n = 4; CG, n = 4; IG, n = 4), kalan hayvanlar ise yağ dokusu toplama için kullanıldı. Bu diferansiyel dağılım öncesinden belirlenmiştir; çünkü paraformaldehit ile intrakardiyak perfüzyon, yağ dokusu bütünlüğünün bozulması nedeniyle sonraki yağ dokusu hasafatıyla uyumsuz olan doku fiksasyonuna yol açar. Bu nedenle, örnek dağılımı tamamen teknik kısıtlamalarla yönlendirildi ve deneysel grup atamalarından veya biyolojik sonuçlardan bağımsızdı.

C-Fos immünofluoresansı için, bölümler 72 saat boyunca %0,25 domuz derisi jelatini ve %0,5 Triton X-100 içeren PBS ile seyreltilmiş bir fare monoklonal anti-c-Fos antikoru (1:1000, sc-166940) ile inkübe edildi; bu anti-c-100 bloklama ve permeabilizasyon çözeltisi olarak kullanıldı. Birincil antikor kuluçkası oda sıcaklığında 24 saat, ardından 4 °C'de 48 saat uygulandı. Kuluçkadan sonra, bölümler PBS'de iyice durulandı ve aynı çözeltide seyreltilmiş eşek poliklonal anti-fare ikincil antikoru (Alexa Fluor 488-konjugasyonlu, 1:500, AB_2338840) ile 2 saat kuluçka içinde kullanıldı. Son olarak, bölümler montaj ortamı kullanılarak cam sürgülere monte edildi.

Görüntü edinimi ve niceliklendirme

Konfokal görüntüleme, 488 nm lazer ve 20x objektif lens ile donatılmış bir mikroskop kullanılarak gerçekleştirildi. Z-yığını görüntüleri NIS-Elements C yazılımı kullanılarak alındı ve kör analiz için kodlanmış tanımlayıcılar altında saklandı. c-Fos-pozitif çekirdeklerin nicelenmesi ImageJ (ImageJ 2.9.0 / 1.53t) kullanılarak gerçekleştirildi. Sayımlara yalnızca tamamen kapalı çekirdekler dahil edildi ve bireysel hücrelerin çift sayımını önlemek için dörtre tabanlı bir yaklaşım uygulandı. Her hayvan için, tüm deneysel gruplarda aynı alım parametreleri kullanılarak üç bağımsız immünboyalı bölümden her birinden bir görüntü alındı. C-Fos-pozitif çekirdek sayısı her görüntü için tek tek nicelendi ve aynı hayvana karşılık gelen üç bölümden elde edilen değerler toplandı. Bu toplam değer daha sonra analiz edilen toplam alana normalleştirilmiş ve c-Fos yoğunluğu (pozitif çekirdek/mm²) olarak ifade edilmiştir. Kullanılan deneysel prosedürlerin genel şeması Şekil 1A–H'de gösterilmiştir.

Şekil 1: Aşırı yeme protokolü ve WB-MS müdahalesinin deneysel tasarımı ve zaman çizelgesi. (A), ilk barınma koşullarını gösteren bir fare tasvirini gösterir. Toplamda 30 fare (9 dişi ve 21 erkek) P30'dan itibaren bireysel olarak ev kafeslerinde yerleştirildi ve 1 haftalık alışkanlık dönemi geçirdi. (B) deneysel 1. günden 35. güne kadar aşırı yeme protokolü boyunca uygulanan diyet koşullarını gösterir. Kontrol grubu standart yemek ve suya ima kadar imkansız erişime sahipti. Sürekli erişim grupları standart yemek, su ve lezzetli yiyeceklere ima ederek erişim sağladı. Aralıklı erişim grupları, standart yemek ve suya imkansız erişim hakkına sahipti. Aynı zamanda, lezzetli yiyecekler sadece Pazartesi, Çarşamba ve Cuma günleri saat 16:00-18:00 arasında verildi. (C), 15-21. günler arasında hayvanların aynı diyet koşullarında devam ettiğini, manyetik uyarılma plakalarının ise kafeslerin altına yerleştirildiğini (sahte maruz kalma) gösterir. (D), 22-28. günler arasında, WB-MS'nin lezzetli gıda maruziyetinden 20 dakika önce uygulandığını ve her grup için ilgili diyet koşullarının korunduğunu göstermektedir. (E), 29. ila 35. günler arasında WB-MS'nin durduğunu, ancak beslenme koşullarının değişmediğini gösterir. (F), beyinlerin doğum sonrası 72. günde (P72) toplandığını, ardından doğum sonrası günün 73'ünde (P73) yağ dokusu toplandığını göstermektedir. (G) beyin kesitlerini kriostat ve immünohistokimyasal prosedürlerle gösterir. Son olarak, (H) c-Fos immünoreaktivitesinin konfokal mikroskopi analizini gösterir. Görseller yazarlar tarafından Biorender kullanılarak oluşturulmuş ve uygun bir lisans alınmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

İstatistiksel analiz

İstatistiksel analizler SPSS versiyon 25 kullanılarak gerçekleştirildi. Normal dağılım varsayılamadığı için, çalışma boyunca parametrik olmayan testler kullanıldı. SG, CG ve IG arasındaki farklar Kruskal–Wallis testi kullanılarak değerlendirildi. Her deneysel grup içinde tekrarlanan karşılaştırmalar Friedman testi kullanılarak analiz edildi ve uygun olduğunda çoklu karşılaştırma testleri yapıldı. Bazı deneysel uç noktalar için sınırlı örneklem büyüklükleri nedeniyle, özellikle dişilerde (grup başına n = 3), erkek ve dişi C57BL/6 farelerinden alınan veriler, Şekil 2, Şekil 3 ve Şekil 4'te sunulan analizler için bir toplandı; böylece istatistiksel dayanıklılık artırıldı ve deneysel sonuçların keşif amaçlı değerlendirilmesini destekledi. Ayrıca, erkek ve dişi C57BL/6 farelerinden toplanan aşırı tüketim verileri iki taraflı ANOVA ile analiz edildi ve ardından WB-MS uyarı haftası dahil beslenme protokolü boyunca deneysel grup ve zamanın etkilerini değerlendirmek için çoklu karşılaştırma testleri yapıldı. İstatistiksel anlamlılık p ≤ 0.05 olarak tanımlandı.

Sonuçlar

Binge boyunca, aralıklı erişim gruplarındaki (erkekler için IMG, kadınlar için IFG) katılımcılar, 15, 17 ve 19. günlerde standart (SFG ve SMG) ve sürekli gruplar (CFG ve CMG) (CFG ve CMG) olanlara göre anlamlı derecede yüksek kalori alımı gösterdiler (Kruskal-Wallis testi; p < 0.05; Şekil 2A–B). WB-MS, gri bandın gösterdiği gibi, yedi gün ardışık günde 20 dakika boyunca 1 mT yoğunlukta ve 50 Hz frekansta uygulandı. Bu uyarılma aşama...

Tartışma

Mevcut bulgular, WB-MS'nin bir fare modelinde geçici olarak lezzetli yiyeceklere erişim nedeniyle aşırı yeme davranışını geçici olarak modüle edebileceğini göstermektedir. NAc'de nöronal aktivitede anlamlı değişiklikler tespit edilmese de, uyarma döneminde aralıklı erişim seansları boyunca lezzetli gıda alımı kademeli olarak azaldı ve son aşırı yeme seansında anlamlı bir azalma ile sonuçlandı. Bu gözlemler, manyetik uyarımın kompulsif besleme davranışının altında yatan pekiştirme veya mo...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
ImageJ	imagej.net	Public Domain, BSD-2	Yazılım. Java tabanlı görüntü işleme programı. Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Optik ve Hesaplamalı Enstrümanlar Laboratuvarı (LOCI, Wisconsin Üniversitesi) tarafından geliştirilmiştir
Coverslips	Corning	2935	Kaplama camı 24 x 50 mm (Kalınlık 0.13–0.17)
Secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	AB_2340758	Donkey poliklonal anti-mouse ikincil antikoru
Laboratory Rodent Diet 5001	LabDiet	1320	Standart gıda. https://di.facmed.unam.mx/comisiones/Composici%C3%B3n%20del%20alimento%20Laboratory%20Rodent%20Diet%205001.pdf
Leica CM1510 S	Leica	CM1510 S	Rutin histoloji için kriyosat.
M&Ms 43.8g (Brown packaging)	M&M´s	NA	Lezzetli yiyecek. Besin içeriği 100 başına: 480 kcal, 19 g yağ, 70 g karbonhidrat, 5.1 g protein, 0.13 g tuzMalzemeler: şeker, kakao kitlesi, yağsız süt tozu, kakao yağı, laktoz, nişasta, süt yağı, palm yağı, glikoz şurubu, shea yağı, stabilizatör (gum arabic), dekstrin, sırlama maddeleri (balmumu, karnauba mumu), renkler (E100, karmin, E132, E133, E150a, E150c, E150d, E153, E160a, E160e, E162, E163, E170), pancar konsantresi, emülgatörler (soya lesitini, E445), tuz, aroma maddeleri, palm çekirdeği yağı, antioksidan (E306). (Fıstık, fındık, badem içerebilir). Sütlü çikolata minimum %14 süt katı içerir. Sütlü çikolata kakao yağına ek olarak bitkisel yağlar içerir.
Dhan 1000	Magnetoterapia SA de CV	MAG1000	Darbeli manyetoterapi cihazı
PBS	MEYER	Monobasic 2415. Dibasic 2410.  NaCl S3014	Sodyum Fosfat Monobazik monohidrat . Sodyum Fosfat Dibazik heptahidrat. Kristal Sodyum Klorid moleküler biyoloji derecesi.
Nikon Mikroskop	Nikon Instruments, Inc	A1R+ STORM	Konfokal Mikroskop
Polikarbonat fare kafesi	Orchid Scientific	EM01	WB-MS maruziyeti için kullanılan demir içermeyen polikarbonat kafes, tamamen şeffaf ve otoklavl (373 x 190 x 138 mm).
Anesket	Pisa	040.000.0226.00	Ketamine enjekte edilebilir solüsyon
Procin Equus	Pisa	Q-7833-111	Xilazin enjekte edilebilir solüsyon
c-Fos antikoru	Santa Cruz Biotechnology	sc-166940	Mouse monoklonal anti-c-Fos antikoru
Laboratuvar terazisi	Sartorius		Analitik terazi
VECTASHIELD Montaj Ortamı	Vector Laboratories	H-1000-10	Antifade montaj ortamı, immünfloresan (IF) mikroskopi için floresans sinyallerini korumak üzere özel olarak formüle edilmiştir ve fotobleaching'i en aza indirir.
Cam slaytlar	VELAB	VE-P30	Bir tarafı buzlu mikroskop cam slaytları 26 x 76 mm (Kalınlık 0.8–1.1 mm)
Sodyum asit		K 6048.0100	%99 Sodyum asit