Burada, >90% işlem süresi azalması, yüksek hücre canlılığı ve geniş uyumlulukla karakterize edilen yağ kaynaklı kök hücreleri ve adipositleri verimli şekilde izole etmek için standart bir yöntem sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Domuz yağ dokusundan yağ kök hücrelerinin ve adipositlerin etkili izolasyonu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Yağ kök hücreleri (ADSC), bol kaynakları, minimal invaziv hasamı, çoklu hatlı farklılaşma potansiyeli ve immünomodülatör özellikleri sayesinde rejeneratif tıpta ideal tohum hücreleri olarak ortaya çıkmıştır. Uygulamaları doku onarımı, hastalık modellemesi ve hücre tedavisini kapsamaktadır; ancak, yüksek canlılıklı ADSC'lerin verimli izolasyonu, araştırmaların ilerlemesi ve klinik çevirinin ilerlemesi için kritik olmaya devam etmektedir. Enzimatik sindirim ile pipetleme yoluyla mekanik ayrışma gibi geleneksel izolasyon yöntemleri, uzun işlem süreleri (1–3 saat), zayıf hücre canlılığı (genellikle %<70) ve partiden partiye önemli değişkenlikle sınırlıdır; bu da sonraki deneyleri tehlikeye getirir.
Burada, mekanik dalga ve enzimatik sindirimi birleştirerek bu zorlukları ele alan SoniConvert sistemini (mekanik dalga tabanlı hücre ayırma sistemi) sunuyoruz. Sistem, dijital geri besleme yoluyla mekanik dalga aracılı ayrışmayı düzenleyen mikroişlemci tabanlı bir kontrol ünitesini ve yağ dokusu için optimize edilmiş dokuya özgü gevşetme reaktifiyle (5–15 dakika kuluçka) entegre eder. Bu yaklaşım, dokunun hızlı bir şekilde tek hücreli bir süspansiyona dönüşmesini sağlar ve mekanik ayrışma 3–9 saniyede tamamlanır.
Sistemin üç avantajı vardır: (1) ultra hızlı işleme, enzimatik sindirimden hücre fraksiyon ayrımına kadar çekirdek izolasyon süreci yaklaşık 30 dakikada tamamlanır (geleneksel yöntemlere göre %>90 azalma); (2) yüksek canlılık koruması, tripan mavisi boyama ile hücre yaşamlılığını %80–95 doğruldur ve geleneksel protokolleri aşmaktadır; ve (3) ortaya çıkan tek hücreli süspansiyonlar, birincil hücre kültürü, akış sitometrisi, sitotoksisite testleri ve yağ organoid yapısı gereksinimlerini karşıladığı için geniş uyumluluk. İşlem süresini azaltarak, hücre bütünlüğünü artırarak ve değişkenliği sınırlayarak bu sistem, yağla ilgili araştırmalar için pratik bir platform sağlar.
Giriş
Yağ dokusundan izole edilen mezenkimal kök hücrelerin (MSC) kritik bir alt kümesi olan adipoz kök hücreleri (ADSC), erişilebilirlikleri, minimal invaziv hasamı, sağlam proliferatif kapasitesi, çoklu hatlı farklılaşma potansiyeli ve güçlü parakrin ve immünomodülatör özellikleri nedeniyle önemli terapötik potansiyel sergiler 1,2,3,4 . Bu özellikler, ADSC'leri rejeneratif tıp, doku mühendisliği ve immünoterapi için umut vadeden adaylar olarak konumlandırmıştır. Ancak, ADSC'lerin translasyonel faydası, işlevsel olarak sağlam ve yüksek saflıkta popülasyonları izole etme yeteneğine bağlıdır—bu süreç teknik olarak hâlâ zordur. Yağ dokusunun benzersiz biyolojisi iki ana engel getirir: (1) adipositlerin yüksek lipid içeriği, mekanik işlem sırasında onları yırtılmaya yatkın hale getirir; bu da stromal damar fraksiyonunu (SVF) kirleten serbest lipidler salgılar, hücrelerin yaşamını tehlikeye atır ve 5,6 verimi verir; ve (2) dokunun yapısal karmaşıklığı, fasiya, endotel hücreleri, bağışıklık hücreleri ve kanbileşenleri 7, yağ köklü hücrelerin ayrılmasını zorlaştırır. Bu sınırlamalar, metabolik hastalık modellemesi ve hücre tabanlı tedaviler gibi sonraki uygulamalar için de aynı derecede kritik olan yüksek kaliteli ADSC ve adipositleri izole etmek için verimli, hızlı ve yaşamlılığı koruyan bir yönteme acil ihtiyaç olduğunu vurguluyor.
Şu anda yağ köklü hücrelerin izole edilmesi için enzimatik sindirim, ekplant kültürü ve mekanikayrıştırma 8,9,10 gibi yerleşik yöntemler mevcuttur. En yaygın benimsenen yaklaşım olan enzimatik sindirim, ekstrasellüler matriks (ECM) bileşenlerini parçalamak için kollajenaz kullanır ve kapsüllenmiş kök hücreler serbest bırakılır. Bu yöntem genellikle doku doğrama, kollajenaz sindirimi (37 °C, 1–2 saat), santrifüjle SVF izolasyonu ve yapışkan kültür saflatmasını içerir. ECM parçalanması için etkili olmasına rağmen, enzimatik sindirim önemli dezavantajlara sahiptir: uzun işlem süresi (toplamda 3–4 saat), büyük örnek hacmlerine bağımlılık ve hayvan kaynaklı kollajenazlardan kaynaklanan enzimatik sitotoksisite veya partiden partiye değişkenlik riskleri—bunların hepsi klinik translasyonu engeller. Doku parçalarından kök hücre göçünü kullanan Explant kültürü, korunmuş canlılığa sahip hücreler verir, ancak düşük verimlilik ve gecikmeli hücre iyileşmesi (7–10 gün) yaşar. Fiziksel bozulmaya (örneğin, salınım, kesme) dayanan mekanik ayrışma, işlem süresini azaltır ancak genellikle hücre bütünlüğünü tehlikeye atar, bu da yaşamabilirliğin azalmasına ve saf popülasyonlara yol açar. Bu yöntemler birlikte, klinik düzeyde hücre izolasyonu için kritik kriterler olan verimlilik, saflık ve canlılığı bir arada uyuşturmakta başarısız olur. Bu nedenle, enzimatik sindirimi mekanik dalga aracılı ayrışma ile birleştiren adipoz köken hücrelerini (adipositler ve ADSC'ler) izole etmek için yeni bir yöntem öneriyoruz11. Bu yaklaşım iki önemli ilerleme sağlar: (1) zaman verimliliği: önceden optimize edilmiş, hayvansız enzim kokteylleri düşük frekanslı mekanik dalgalarla birleştirilerek toplam işlem süresi 3–4 saatten ~30 dakikaya indirilir (Şekil 1); (2) Yaşam Koruma: Nazik mekanik dispersiya, adiposit yırtılmasını ve lipid salınımını en aza indirir. Önemli olarak, 30 dakikalık zaman dilimi, ham adiposit ve SVF fraksiyonlarının elde edilmesi için çekirdek izolasyon iş akışını (sindirim, mekanik ayrışma, filtreleme ve ilk santrifüjleme) ifade eder; Kırmızı Kan Hücresi (RBC) lizisi gibi isteğe bağlı arındırma adımları ek işlem süresi gerektirir.
Optimize edilmiş yağ hücresi izolasyonu yöntemimiz, birden fazla araştırma ve klinik alanda önemli uygulama potansiyeli göstermektedir. Temel araştırmalarda, elde edilen yüksek canlılıklı hücreler, adipojenik ve osteojenik farklılaşma çalışmalarında olağanüstü performans sergileyerek doku mühendisliği uygulamaları için güvenilir bir hücre kaynağı sağlar. Translasyonel tıpta, klinik çalışmalar ADSC'lerinosteoartrit 12, kardiyovaskülerhastalıklar 13, multipl skleroz14 ve inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD)/Crohn hastalığı gibi hastalıkların tedavisinde terapötikpotansiyelini göstermiştir. Hızla izole edilen ADSC'ler, yağ dokusu organoidleri oluşturmak ve hücre tedavisi uygulamalarını uygulamak için ideal yapı taşları olarak hizmet eder; ilaç taraması ve hastalık modelleme araştırmalarını önemli ölçüde ilerletir. Ayrıca, yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonlar tek hücreli RNA dizileme için uygundur. Sonuç olarak, bu entegre yaklaşım, yağ dokusu için sağlam bir teknolojik platform oluşturur ve hem temel araştırmaları hem de rejeneratif tıpta klinik çeviriyi destekler.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan araştırmaları, Çin Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, Mart 2017'de revize edilen Deneysel Hayvanlarla İlgili İşler İdarişleri Yönetmeliği'ne uygun olarak yürütüldü ve Sichuan Tarım Üniversitesi Hayvan Etik ve Refah Komitesi tarafından onaylandı (İzin numarası: 20230089). Bu protokol, mekanik dalga destekli doku ayrıştırması için ticari olarak mevcut olan SoniConvert sisteminin kullanılmasını gerektirir (bundan sonra mekanik ayrışma sistemi olarak adlandırılacaktır). Protokol, domuz yağ dokusu için optimize edilmiştir ve bu özel ekipmana bağımlılığı önemli bir sınırlamadır.
1. Yağ dokusu toplama ve hazırlanması
- Ameliyat öncesi dezenfeksiyon ve tüy alma
- Domuzu damar içi aşırı dozda pentobarbital sodyum (100 mg/kg vücut ağırlığı) ötenazi yapın. Doku toplamadan önce ölümü doğrulayın.
- Domuz sırtının orta hattından 15 cm uzanarak spiral dezenfekte etmek için %2 iyodoforla ıslatılmış steril gazlı bez uygulanır. 30 saniye kurutmaya izin verin.
- 16 cm × 8 cm arasındaki bir alandan steril bir tıraş makinesi kullanın. Ameliyat bölgesinden tüm tüylerin alındığından emin olun.
- Arka kısmı steril gazlı bezle %75 etanol ile iki kez silin.
- Yağ dokusu koleksiyonu
- Steril bir skarpelle dorsal orta hat boyunca 20 cm enine bir kesi yapın.
- Kesi kenarını steril forsepsle kaldırın. Yağ dokusu ile dermis arasındaki doğal düzlem boyunca diseksiye edilip, yaklaşık 2–3 mm kalınlığında tam üst üst tabaka elde edilecek şekilde sırt altı yağ dokusu (ULB) tabakası elde edilir.
- ULB'yi buz gibi steril salinte bir kez durulayın ve steril bir kültür kabına yerleştirin (Şekil 2).
Şekil 2: Hücre izolasyonu için domuz ULB koleksiyonu. (A) Domuz sırtı yağ dokusunun yapısının açıklaması; (B) Bama minipig'in kesim alanı; (C) Sırt yağ dokusunun sunumu ile domuz sırtı deri altı yağ iki katman içerir: üst tabaka (ULB) ve iç tabaka (ILB); (D) ULB topladı. Kısaltma: ULB = sırtın üst katmanı; ILB = sırtın iç katmanı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Duraklama noktası: Toplanan yağ dokusu, daha fazla diseksiyondan önce kısa bir süre buz gibi steril tuzlu veya D-Hanks çözeltisinde 4 °C sıcaklıkta tutulabilir.
NOT: Amaç ULB'yi toplamaktır. Disekyon sırasında alt deri altı yağ dokusu (ILB) tabakasını dahil etmekten kaçının.
- Yağ dokusu diseksiyonu ve temizliği
- Her 1,8 g doku için 10 mL buz gibi soğuk D-Hanks Buffer ekleyin ve dokunun tamamen suya battığından emin olun.
- Steril cerrahi makas kullanarak tüm görünür kan damarlarını dokudan ayırın ve çıkarın. Bağ dokularını ve fibrotik bileşenleri çıkarın. Çıkarılan malzemeleri belirlenmiş biyolojik tehlike kaplarına atın.
NOT: Keskin aletleri kullanırken son derece dikkatli olun; Her zaman vücuttan kesilin ve kullanılmış bıçaklar ile makasları hemen kullandıktan sonra keskin kaplara atın. - D-Hanks Buffer içindeki dokuyu durulayarak kalan kan ve kalıntıları temizleyin.
NOT: Aşırı hematomlu örneklerde, görsel netlik sağlamak için tamponu gerektiğinde 1–3 kez değiştirin. Tüm diseksiyon adımlarını doku canlılığını korumak için buz üzerinde kalın.
- Yağ dokusu mekanik ayrışması
- Durulan doku parçalarından 1,8 g steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpe 800 μL A Tipi Doku Dissosiyasyon Tamponu (A-Buffer) ekleyin.
- Steril oftalmik makas kullanılarak, tüpteki dokuyu yaklaşık 1–2 mm3 boyutunda küçük parçalara doğra.
NOT: Doğrama sırasında veya sonrasında önemli lipid sızıntısı gözlemlenirse, dokuyu tekrar 1 mL önceden soğutmuş D-Hanks çözeltisi ile yıkayın ve ardından enzimatik sindirime geçilerek kırılmış adipositlerden lipidleri çıkarabilirsiniz. Bu adım, aşağı akış analizi için adiposit bütünlüğünü korur.
2. Hücre izolasyonu ve homojenleşme
- Enzimatik İşleme
- Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne 200 μL A Tipi Doku Dissosiyasyon Ajanı (A-Tipi Çözeltisi) eklenin. Tüpü 3 kez nazikçe döndürüp elle sallayın, içeriği karıştırın ve yağ parçalarının dissosiyasyon çözeltisine tamamen batırıldığından emin olun.
- Tüp kapağının sıkıca kapalı olduğundan emin olun. Tüpü 37 °C'lik metal bir banyoya yerleştirin ve 5–10 dakika kuluçka yapın.
NOT: Çözeltiyi bulanık hale gelene ve doku parçaları kısmen sindirilmiş görünene kadar izleyin. A-Tipi Çözelti kollagenaz ve nötr proteaz içerir. Tutuşturma sırasında nitril eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük takın. Cilt temasından kaçının; Maruz kalırsa, hemen bol suyla 15 dakika boyunca durulayın. A-Buffer, A-Tipi Çözüm eklendikten sonra atılmaz.
- Ultrasonik destekli mekanik dissosiyasyon
- Kısmen sindirilmiş yağ dokusu parçalarını, mikrosantrifüj tüpünden çevresindeki tampon ile birlikte mekanik ayrıştırma sistemi için tasarlanmış steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Mekanik dissosiyasyon sisteminde Adipose Dokusu için önceden ayarlanmış programı çalıştırarak 200 Hz sinüzoidal dalga kullanarak mekanik dissosiyasyon gerçekleştirin.
3. Tek hücreli süspansiyon elde etmek için filtrasyon
- Filtreleme ve santrifüjleme
- Hücre süspansiyonunu toplayın ve 200 μm'lik hücre süzgecinden yeni bir 50 mL'lik santrifüj tüpüne geçirerek büyük kalıntıları ve sindirilmemiş doku kümelerini çıkarabilirsiniz.
- Süzgeciye 5 mL önceden soğutmalı (4 °C) D-Hanks çözeltisi ekleyin. Süzgeçi D-Hanks çözeltisiyle 2 kez durulayarak hücre verimini en üst düzeye çıkarın.
- Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 500 × g sıcaklığında 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
Duraklama noktası: Santrifüjlemeden sonra hücre süspansiyonu hemen işlenebilir veya katman ayrılmadan önce kısa bir süre buzda tutulabilir. - Adiposit toplama: Adipositleri toplamak için, steril bir pasteur pipeti kullanarak süper lipid tabakasını aspire edip atarak adiposit tabakasını korumak için 1 mL tampon bırakılır. Adipositlerin aşağı akış analizi için ikinci katmanı toplayın. Üçüncü ve dördüncü katmanları rahatsız etmekten kaçının.
- SVF (stromal vasküler fraksiyon) toplama: Üst katmanlar çıkarıldıktan sonra, stromal vasküler fraksiyonu (SVF) içeren alt pelleti 1 mL D-Hanks/PBS içinde nazikçe yeniden askıya alın. Hücre pelletini 1 mL D-Hanks/PBS içinde nazikçe yeniden süzülerek 2–5 × 106 hücre/mL hücre konsantrasyonu elde edilir.
NOT: İdeal olarak, santrifüjlemeden sonra dört katman gözlemlenebilir: üstteki lipid tabakası; ikinci katman adipositleri içerir; üçüncüsü hidrofilik tampon tabakasıdır; alt tabaka ise kök hücreleri içeren SVF'dir (Şekil 1).
- RBC lizisi
- NOT: Hücre pelleti belirgin kırmızı renk gösterirse ve bu RBC kontaminasyonunu gösterirse, RBC lizisi yapılsın.
Hücre pelletini, geniş delikli uçlu P1000 pipeti kullanılarak 1–3 mL Kırmızı Kan Hücresi (RBC) liz tamponunda yeniden askıya alın. Ara sıra karıştırarak 15 dakika buzda kuluçka yapın. - İşlem sırasında metabolik aktiviteyi en aza indirmek için tüm çözeltiler ve santrifüj rotorlarını 4 °C'ye kadar önceden soğutun.
- Santrifüj 500 × g'de 4 °C'de 10 dakika boyunca koyun. Süpernatantı tamamen aspire edin.
- Hücreleri bir kez daha peleti 5 mL önceden soğutmuş D-Hanks çözeltisiyle yeniden süper hale getirin ve 500 × g sıcaklığında 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Üst yüzeyi at.
- NOT: Hücre pelleti belirgin kırmızı renk gösterirse ve bu RBC kontaminasyonunu gösterirse, RBC lizisi yapılsın.
- Son yeniden süspansiyon
- Son hücre pelletini D-Hanks/PBS'de sonraki uygulamalar için yeniden askıya alın.
4. Sonraki uygulamalar ve analiz
- SVF hücre canlılığı ve hücre verimi değerlendirmesi
- 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde elde edilen SVF hücre süspansiyonunu hazırlayın. Süspansiyonu kullanana kadar buzda tutun.
- 10 μL SVF hücre süspansiyonu ile 10 μL %0,4 Trypan Blue çözeltisi ile steril 0,5 mL mikrosantrifüj tüpünü karıştırın. Düzenli karışım için 3 kat yukarı ve aşağı nazikçe pipet yapın.
NOT: Karışımdaki Trypan Blue'nun nihai konsantrasyonu %0,2'dir. Karıştırma sırasında hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının, çünkü bunlar otomatik hücre sayımı engelleyebilir.
Boyalı hücre karışımından 10 μL'yi Otomatik Hücre Sayacı için uygun bir sayma slaytına aktarın. Numunenin odayı tamamen taşmadan doldurduğundan emin olun. - Sayma slaytını Hücre Sayacı'na yerleştirin. Trypan Blue test tipini seçin ve gerekirse hücre konsantrasyon aralığını ayarlayın.
- Otomatik hücre sayımı başlatmak için Sayma düğmesine basın. Cihaz, sayma odasının görüntülerini yakalayacak ve canlı hücreleri ölü hücrelerden otomatik olarak ayırt edecek.
- Hücre canlılık yüzdesini kaydedin ve cihaz ekranında gösterilen toplam canlı hücre sayısını sayın. Her örnek için üç bağımsız ölçüm yapın ve ortalama canlılık ile yağ dokusu başına hücre verimini hesaplayın.
NOT: Her kullanımdan sonra sayım kaydırması ve cihaz yükleme portunu %70 etanol ile temizleyin, böylece örnekler arasında çapraz kontaminasyon oluşmasını önleyin.
- Adiposit morfolojisinin gözlemi
- İzole adipositleri çekirdekler için 5 μg/mL Hoechst ve lipidler için 1 μM BODIPY ile D-Hanks/PBS ile 15 dakika boyunca 37 °C'de boyandırın.
Duraklama noktası: Boyamadan sonra örnekler hemen görüntülenmelidir; gerekirse, mikroskopiden önce kısa bir süre 4 °C'de ışıktan korunabilirler. - Hücrelerin sıkışmasını önlemek için slayt hazırlığında kendi yapımı adiposit dostu bir slayt kapaklı cam sistemi kullanın.
- Çekirdekleri (Hoechst ile boyanmış) ve lipid damlacıklarını (BODIPY ile boyanmış) floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
NOT: Büyük boyutları (20–300 μm) ve yüksek lipid içeriği nedeniyle, adipositler kırılgandır, yüzer ve birden fazla katmana yığılır; bu da geleneksel montaj yöntemlerini net mikroskobik gözlem için uygun kılmaz hale getirir (Şekil 3A). Bunu çözmek için, standart kaydırmalar ve örtü sürgüleri kullanarak ev yapımı adiposit dostu bir montaj sistemi geliştirildi (Şekil 3B).
- İzole adipositleri çekirdekler için 5 μg/mL Hoechst ve lipidler için 1 μM BODIPY ile D-Hanks/PBS ile 15 dakika boyunca 37 °C'de boyandırın.
- Stromal vasküler bileşenlerin arındırılması ve ADSC'lerin morfolojik gözlemi
- Taze izole edilmiş SVF'yi, %10 FBS ve %1 penisillin-streptomisin takviyesi içeren 5 mL DMEM içeren bir T25 hücre kültürü şişesine tohumlayın. %5 CO₂ ile 37 °C'de kuluçka yapın.
- 48 saat sonra, yapışmayan hücreleri çıkarmak için termostayı önceden ısıtılmış PBS ile 2 kez nazikçe yıkarın. Taze kültür ortamı ekleyin ve kuluçkaya devam edin.
- Kültür ortamını her 2–3 günde bir değiştirin. Hücre morfolojisi ve birleşimini ters mikroskop altında izleyin.
- Hücreler %80–90 birleşime ulaştığında (genellikle 7–10 gün sonra), hücreleri %0,25 tripsin-EDTA ile 37 °C'de 3–5 dakika boyunca ayırın. Kültür ortamıyla nötralize edin ve hücre süspansiyonunu toplayın.
- FACS tespit ve ayırmadan önce hücrenin canlılığını tespit etmek için Trypan Blue boyama işlemi yapılabilir.
- Temizlenmiş kültürlenmiş ADSC'lerin morfolojisini optik mikroskop altında gözlemleyin.
- Toplanan hücre süspansiyonunu 70 μm hücre eleğinden geçirerek kalan agregaları çıkarır. Hücreleri %2 FBS içeren PBS içindeki hücreleri FACS analizi için yeniden süzüldürün.
- Hücreleri, karanlıkta 4 °C sıcaklıkta 30 dakika boyunca CD73, CD90, CD11b ve CD45'e karşı florokrom ile konjuge edilmiş antikorlarla boyandırın.
- Hücreleri boyama tamponu ile 2 kez yıkayın ve %2 FBS içeren PBS ile tekrar süzülün.
- 20 psi ve 3.0'ın altında bir akış hızında 70 μm nozul kullanarak akış sitometrik analizi yapın.
- Ana popülasyonda ileri saçılma alanı (FSC-A) ve yan saçılma alanı (SSC-A) parametreleriyle kapaj yaparak hücre kalıntılarını dışlayın.
- FSC-A ile FSC-H kapı ile çift çiftlikleri çıkarın ve aşağı akış analizi için uygulanabilir tekil popülasyonunu seçin.
- Yüzey işaretleyici ifadesine göre kapılı hücreleri analiz edin. ADSC fenotipini doğrulamak için CD73 ve CD90'ı pozitif belirteçler olarak, CD11b ve CD45'i negatif belirteç olarak kullanın.
- Zenginleştirilmiş ve kültürlenmiş ADSC'lerin morfolojisini optik mikroskop altında gözlemleyin. Karakteristik iğne şeklinde, fibroblast benzeri morfoloji, başarılı ADSC zenginleşmesini gösterir.
- ADSC adipojenik farklılaşma
- Üçüncü nesil ADSC'leri 1 ×10 4 hücre/cm2 yoğunlukta tohumlayın. Hücre birleşimi yaklaşık %90'a ulaştığında, adipojenik indüksiyon başlatılır.
- %10 fetal sığır serumu (FBS), 0,5 mM 3-izobütil-1-metilksantin (IBMX), 1 μM deksametazon, 10 μg/mL insülin ve 1 μM roziglitazon içeren yüksek glikozlu Dulbecco's modified Eagle's ortamı (DMEM) kullanılarak adipojenik indüksiyon ortamı hazırlanır.
- 3 gün indüksiyondan sonra, ortamı bakım aracıyla değiştirin ve çözeltiyi her 2 günde bir değiştirin.
- 14 günlük indüksiyondan sonra hücreleri Yağ Kırmızı O ile boyandırın ve lipid damlacıklarını ters mikroskop altında gözlemleyin.
- ADSC osteojenik farklılaşması
- Hücre birleşimi %80–90'a ulaştığında osteojenik indüksiyon başlar. %10 FBS, 10 mM β-gliserofosfat, 50 μg/mL askorbik asit, 10 μM kalsitriol ve 1 μM deksametazon içeren yüksek glikozlu DMEM içeren osteojenik indüksiyon ortamı formüle edin.
- Malzemeyi her 2–3 günde bir değiştirin ve indüksiyon sürecine yaklaşık 14 gün devam ettirin.
- Hücreleri %2 Alizarin Red S (pH 5.2) ile boyandırın ve ters mikroskop altında gözlemleyin.
- Organoid yapısı ve tanımlaması
- Tam kültür ortamında tek hücreli ADSC süspansiyonu hazırlanır ve hücre konsantrasyonunu 2 × 104 hücre/20 μL olarak ayarlayın.
- 100 mm'lik bir kültür kabının kapağını ters çevirin ve hücre süspansiyonundan 20 μL damlasını kapağın iç yüzeyine bırakın.
- Kabın altına steril PBS ekleyerek nemi koruyun, kapağı dikkatlice kapatın ve asılı damlaları standart kültür koşullarında kuluçka yapın.
- Damlaları günlük olarak gözlemleyin ve hücrelerin 6 gün boyunca toplanıp küreler oluşturmasına izin verin.
- Küreleri pipet kullanarak nazikçe toplayın ve buzun üzerinde önceden soğutulmuş Matrigel'e aktarın.
- Sferoidleri Matrigel'e gömüp karışımı kültür plakalarına tabakalayıp standart kültür koşullarında kuluçkaya geçirin.
- Ortamı düzenli olarak değiştirin ve organoid büyümesini 18–28 günlere kadar izleyin; o zaman yapılar sıkışıp olgunlaşır.
- Organoidleri %4 paraformaldehit ile sabitleyin, %0,1 Triton X-100 ile geçirimli hale getirin ve %5 BSA ile spesifik olmayan bağlanmayı engelleyin.
- Örnekleri CD73, CD90, CD11b ve CD45'e karşı birincil antikorlarla kuluçka altına alın ve ardından ilgili floresan ikincil antikorlarla kuluçka yapın.
- Organoid maddeleri Hoechst ve BODIPY ile boyanarak sırasıyla çekirdekler ve lipid damlacıkları görselleştirin ve boyalı örnekleri floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
NOT: Hücre ayırtma ve açık kültürlerle ilgili tüm manipülasyonları, tohumlama, besleme ve boyama hazırlığı dahil, biyolojik güvenlik dolabında sıkı aseptik koşullar altında gerçekleştirin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1: Yağdan türetilen hücre izolasyonu sürecinin şematik illüstrasyonu. Diyagram, geleneksel yöntemi ve mevcut yöntemi örnek iş akışları olarak tasvir eder. Yağ kaynaklı hücrelerin izole edilmesinde üç ana adım vardır: ilki ön tedavidir; ikincisi ise hücreleri serbest bırakmak için yağ dokusunu ayırmaktır...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışma, geleneksel yöntemlerin kritik sınırlamalarını ele alan, yağ köken türeyden köken hücrelerin (çoğunlukla ADSC) izole edilmesi için yeni bir entegre yaklaşım sunmaktadır. Dokuya özgü enzimatik gevşemeyi hassas mekanik dalga ayrıştırmasıyla birleştirerek, bu sistem hızlı (toplam işlem süresi ~30 dakika), yüksek canlılık (%80–95) ve tekrarlanabilir hücre izolasyonu sağlar.
Geleneksel enzimatik sindirim yaygın olarak kullanılsa da, uzun süreli kollajena...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazar Ziyi Zhao ve Jiaying Yu, bu protokolde kullanılan SoniConvert sistemi (SC-L1W) ve Yağ Dokusu Dissosiyasyon Kiti (TM008) üreten Chengdu DosSense Biotech Co., Ltd ile bağlantılıdır. Diğer yazarlar ise rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (Li M: 32421005 ve 32225046, Lu L: 32472857) hibelerle desteklendi; Çin'in Xizang Özerk Bölgesi Bilim ve Teknoloji Projeleri (XZ202501ZY0147 M.L.'den); Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (Lu L: 2024M763881); Chongqing Doktora Sonrası Özel Fonu (Lu L: 2023CQBSHTB3098); Ulusal/İl Lisans Eğitim Programı (Lu L: 202510626001); ve Tarımsal Bilim ve Teknoloji Ana Projesi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Bir Tip Doku Dissosiyasyon Kiti | Docsense | TM001 | Bir tip doku dissosiyasyon ajanı (A-tipi çözeltisi) ve bir tip doku dissosiyasyon tamponu (A-tampon) içerir. |
| Adipojenik Farklılaşma Malzeme Kiti | OriCell | GUXMD-90031 | Adipogenik farklılaşma için kullanılır; yüksek glikozlu Dulbecco'nun modifiye Eagle's ortamı (değiştirilmemiş) ve bakım ortamı da dahil olmak üzere |
| Alizarin Red S | OriCell | A5533ALIR-10001 | Ostejenik farklılaşma için mineralizasyon boyama (pH 5.2) |
| Askorbin asit | Sigma-Aldrich | A4544 | L-Askorbin asit, hücre kültürü testlenmiş, osteojenik indüksiyon için |
| Bama minipigs | Chengdu Dossy Deneysel Hayvanlar Şirketi, Ltd | Bir yaşında, erkek, SPF sınıfı hayvanlar standart aşılama, soluşta temizleme ve temizlik prosedürleri altında tutulur.https://www.cd-dossy.cn/animalpl_detail/12606067609851863 04.html | |
| Bio-Rad TC20 Otomatik Hücre Sayacı | Bio-Rad Laboratuvarları | 1450011 | Uygulanabilirlik ve verim değerlendirmesi için otomatik hücre sayacı |
| BODIPY | Thermo Fisher Scientific | D3922 | Nötr lipid leke |
| BSA (%5) | Sigma-Aldrich | A9418 | Sığır serumu albümini, liyofilize toz, bloklama için |
| Kalsitriol | Sigma-Aldrich | C9756 | 1α,25-Dihidroksivitamin D3, osteojenik indüksiyon için |
| hücre elek (70 μ m) | Corning | 352350 | Falcon 70 & mu; m hücre süzgeci, steril, FACS örnek hazırlığı için |
| hücre süzgeci (200 μ m) | pluriSelect | 43-50200-03 | pluriStrainer, PET ağı, 50 mL tüplere uyar, steril ve steril; |
| Santrifüj tüpü (50 mL) | Corning | 352098 | Falcon 50 mL yüksek berraklıkta konik tüp, steril, polipropilen |
| Sayma slaytı (Bio-Rad TC20 için) | Bio-Rad Laboratuvarları | 1450011 | TC20 otomatik hücre sayacı için çift odalı sayma slaytı |
| Kültür tabağı (100 mm) | Corning | 430167 | Askı damlalı organoid oluşumu için steril polistiren tabak |
| Deksametazon | Sigma-Aldrich | D4902 | ≥ %98, adipojenik ve osteojenik indüksiyon için |
| D-Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi veya PBS | Gibco | 10010015 | 4 derece dereceye kadar önceden soğutulmuş; C, pH 7.4. |
| DMEM | Gibco | 11965084 | Bu, taze, izole SVF yetiştiriciliği için kullanılır |
| DNase I | Beyotime | D7073 | İsteğe bağlı, topaklanma gözlemlenirse önerilir. |
| etanol | Sigma-Aldrich | 459836 | %75 yüzey dezenfeksiyonu için. |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Gibco | A4736201 | Tet sistemi onaylı, ABD kökenli, steril |
| Akış Sitometresi | BD Biosciences | BD FACSanto II | 3 lazer (405 nm, 488 nm, 633 nm), 8 floresan kanalı, yüzey işaretleyici analizi için (CD73, CD90, CD11b, CD45), 70  m nozul gereksinimi 20 psi'de |
| Floresans Mikroskobu | Olympus | FITC ve DAPI filtre setleri kullanabilen ters veya dik model. | |
| Floresan ikincil antikorlar | Thermo Fisher Scientific | A-11001 (fare karşıtı), A-11008 (tavşan karşıtı) | Alexa Fluor konjuge, immünoflüoresans için |
| Fluorokrom ile konjuge edilmiş antikorlar (CD73, CD90, CD11b, CD45) | BD Biosciences | 561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45) | ADSC fenotipinin akış sitometrik analizi için |
| Hoechst | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Canlı/ölü hücre değerlendirmesi için nükleer leke. |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | ≥ %99 (HPLC), adipojenik indüksiyon ortamı için |
| Buz gibi steril salin | Baxter | 2F7124 | %0,9 Sodyum Klorür enjeksiyonu, USP, doku durulama için |
| İnsülin | Sigma-Aldrich | I9278 | Rekombinant, maya içinde ifade edilir, adipojenik indüksiyon için |
| iodophor | Sigma-Aldrich | 25104 | %2 dezenfektan solüsyesi. |
| Matrigel | Corning | 354230 | Büyüme faktörü azaltılmış, fenol kırmızısı içermemiş, sferoidler gömülmesi için; |
| Metal Banyo | Servicebio | SMB-H | 37 derece ve C sıcaklıkta kuluçka için kullanılır. |
| Yağlı Kırmızı O | OriCell | OILR-10001 | Adiposit farklılaşması için lipid boyama |
| Optik mikroskop | Olympus | 10x&ndash özellikli standart parlak alan mikroskobu; 40 kat hedef. | |
| Osteojenik Farklılaşma Ortamı Kiti | OriCell | GUXMD-90021 | Osteojenik farklılaşma için kullanılır; yüksek glikozlu Dulbecco'nun modifiye Eagle's ortamı (değiştirilmemiş) ve bakım ortamı da dahil olmak üzere |
| Geniş delikli uçlu P1000 pipeti | Beckman Coulter | B01113 | Biomek P1000 Span-8 geniş delik uçları, steril |
| Paraformaldehit (%4) | Thermo Fisher Scientific | J61899 | Sulu çözelti organoidleri sabitlemek için |
| Pasteur pipeti | Corning | 7095S-5C | Steril, tek kullanımlık. |
| Penisillin-Streptomisin | Gibco | 15070063 | 10.000 U/mL penisillin, 10.000 μ g/mL streptomisin, steril |
| Pentobarbital sodyum | Hikma Pharmaceuticals USA Inc. | 24201-010-20 | Enjekte edilebilir, ötenazi için (100 mg/kg vücut ağırlığı, damar damarı). ANDA 203619 |
| Birincil antikorlar (CD73, CD90, CD11b, CD45) | BD Biosciences | 561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45) | Organoid immünboyama için |
| Kırmızı Kan Hücresi (RBC) Liz Tamponu | Solarbio | R1010 | Gerekirse sonraki uygulamalar için. |
| Soğutmalı santrifüj | Eppendorf | 5702R | 4 & derece C sıcaklıkta santrifüj adımları için kullanılır. |
| Roziglitazon, | Cayman Chemical | 71740 | ≥ %98, PPARγ adipojenik indüksiyon için agonist |
| Sharps kabı | Becton Dickinson | 305270 | Kullanılmış bıçak ve makas için delinmeye dayanıklı kap |
| SoniConvert Tek Hücreli Süspansiyon Hazırlık Sistemi | Docsense | SC-L1W | Doku mekanik ayrıştırılması için kullanılır. |
| Boyama Tamponu (Akış Sitometrisi Boyanma Tamponu) | eBioscience (Thermo Fisher Scientific) | 00-4222-57 | 200 mL, kullanıma hazır, FBS ve %0,09 sodyum azid içerir; bu koruma maddesi antikor ve hücre seyreltmesi, yüzey boyama ve akış sitometrisinde yıkama aşamaları için; |
| Steril 1.5 mL Eppendorf tüp | Eppendorf | 30121.517 | Safe-Lock mikrosantrifüj tüpü, steril, doku doğramak için |
| Steril kültür kabı | Corning | 430167 | 100 mm x 20 mm steril kültür kabı, doku toplama için |
| Steril forseps | Sklar | 96-1719 | Steril başparmak forsepsleri, dişli, doku kullanımı ve kullanım için; |
| Steril gazlı bez | Dukal Şirketi | 7060033 | Dezenfeksiyon ve silme için steril gazlı bez pedleri |
| Steril oftalmik makas | Sklar | 10023-580 | Vannas tarzı yay makas makineleri, doku 1-2 mm ve sup3 parçalamak için; Parçalar |
| Steril jilet | 3M | 9681 | Ameliyat bölgesinden tüy almak için cerrahi hazırlık tıraş makinesi |
| Steril bistürpel | Integra Miltex | 4-415 | Kesi yapmak için steril tek kullanımlık bistüri |
| Steril cerrahi makas | Sklar | 10022-580 | Merit Sterile Iris Scissors, kan damarlarını ve bağ dokusunu disseksiye etmek için; |
| T25 hücre kültürü şişesi | Corning | 430639 | Falcon T25 hücre kültürü şişesi, havalandırmalı kapsül, steril |
| Triton X-100 (%0,1) | Sigma-Aldrich | T8787 | Laboratuvar derecesi, permeabilizasyon & nbsp için; |
| Trypan Mavisi | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Hücre canlılığı sayımı için %0,4 çözüm. |
| Tripsin-EDTA (%0,25) | Gibco | 25200056 | %0,25 tripsin, 1 mM EDTA, ADSC'lerin ayrılması için |
| β-Gliserofosfat | Sigma-Aldrich | G9422 | Osteojenik indüksiyon için disodyum tuzu pentahidrat |
Kaynaklar
- Qin, Y., et al. An update on adipose-derived stem cells for regenerative medicine: where challenge meets opportunity. Adv Sci. 10 (20), 1-27 (2023).
- Wang, L., et al. A review of adipose-derived mesenchymal stem cells’ impacts and challenges: metabolic regulation, tumor modulation, immunomodulation, regenerative medicine and genetic engineering therapies. Front Endocrinol. 16, 1606847(2025).
- Suchanecka, M., et al. Adipose derived stem cells – sources, differentiation capacity and a new target for reconstructive and regenerative medicine. Biomed Pharmacother. 186, 118036(2025).
- Su, H., et al. Bridging the gap: clinical translation of adipose-derived stem cells - a scoping review of clinical trials. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 288(2025).
- Alexandersson, I., Harms, M. J., Boucher, J. Isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (MAAC). J Vis Exp. (156), e60485(2020).
- Attané, C., Estève, D., Moutahir, M., Reina, N., Muller, C. A protocol for human bone marrow adipocyte isolation and purification. STAR Protoc. 2 (3), 100629(2021).
- Emont, M. P., Rosen, E. D. Exploring the heterogeneity of white adipose tissue in mouse and man. Curr Opin Genet Dev. 80, 102045(2023).
- Uguten, M., et al. Comparing mechanical and enzymatic isolation procedures to isolate adipose-derived stromal vascular fraction: a systematic review. Wound Repair Regen. 32 (6), 1008-1021 (2024).
- Villanueva-Carmona, T., Cedó, L., Núñez-Roa, C., Maymó-Masip, E., Vendrell, J., et al. Protocol for the in vitro isolation and culture of mature adipocytes and white adipose tissue explants from humans and mice. STAR Protoc. 4 (4), 102693(2023).
- Cohen, M., et al. Adipose tissue explant culture using PDMS flow chambers: an alternative to static explant culture. Adipocyte. 14 (1), (2025).
- Liu, Y., Zhao, H., Yu, J., et al. A novel laboratory-based strategy for single adipocyte and adipose-derived stem cells extraction for transplantation: an experimental research. Aesthet Plast Surg. 49, 367-379 (2025).
- Tangkanjanavelukul, P., et al. Cartilage regeneration potential in early osteoarthritis of the knee: a prospective, randomized, open, and blinded endpoint study comparing adipose-derived mesenchymal stem cell (ADSC) therapy versus hyaluronic acid. Int J Mol Sci. 26 (17), 8476(2025).
- Qayyum, A. A., et al. Effect of allogeneic adipose tissue-derived mesenchymal stromal cell treatment in chronic ischaemic heart failure with reduced ejection fraction – the SCIENCE trial. Eur J Heart Fail. 25 (4), 576-587 (2023).
- Arab, F. L., et al. Safety and feasibility of intravenous fresh adipose-derived mesenchymal stem cells in secondary progressive multiple sclerosis: phase I/IIa clinical results. Stem Cell Res Ther. 17, 120(2026).
- Sheykhhasan, M., et al. Therapeutic potential and mechanistic insights into adipose-derived stem cells and mesenchymal stem cell-derived exosomes in patients with Crohn’s disease-associated fistulas: challenges and future perspectives. Stem Cell Res Ther. 16, 664(2025).
- Dufau, J., et al. In vitro and ex vivo models of adipocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 320 (5), C822-C841 (2021).
- Ghazal, S. K., et al. Adipose tissue-derived stem cells: a comparative review on isolation, culture, and differentiation methods. Cell Tissue Bank. , 1-16 (2021).
- Zhu, R., et al. Isolation methods, proliferation, and adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells from different fat depots in bovines. Mol Cell Biochem. , (2023).
- Benitez, G. J., Shinoda, K. Isolation of adipose tissue nuclei for single-cell genomic applications. J Vis Exp. (160), e61230(2020).
- Basatvat, S., Bach, F. C., Barcellona, M. N., et al. Harmonization and standardization of nucleus pulposus cell extraction and culture methods. JOR Spine. 6 (1), e1238(2023).
- Escudero, M., et al. Scalable generation of pre-vascularized and functional human beige adipose organoids. Adv Sci. 2301499, 1-20 (2023).
- Mandl, M., et al. An organoid model derived from human adipose stem/progenitor cells to study adipose tissue physiology. Adipocyte. 11 (1), 164-174 (2022).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
