Domuz yağ dokusundan yağ kök hücrelerinin ve adipositlerin etkili izolasyonu

Summary

Burada, >90% işlem süresi azalması, yüksek hücre canlılığı ve geniş uyumlulukla karakterize edilen yağ kaynaklı kök hücreleri ve adipositleri verimli şekilde izole etmek için standart bir yöntem sunuyoruz.

Abstract

Yağ kök hücreleri (ADSC), bol kaynakları, minimal invaziv hasamı, çoklu hatlı farklılaşma potansiyeli ve immünomodülatör özellikleri sayesinde rejeneratif tıpta ideal tohum hücreleri olarak ortaya çıkmıştır. Uygulamaları doku onarımı, hastalık modellemesi ve hücre tedavisini kapsamaktadır; ancak, yüksek canlılıklı ADSC'lerin verimli izolasyonu, araştırmaların ilerlemesi ve klinik çevirinin ilerlemesi için kritik olmaya devam etmektedir. Enzimatik sindirim ile pipetleme yoluyla mekanik ayrışma gibi geleneksel izolasyon yöntemleri, uzun işlem süreleri (1–3 saat), zayıf hücre canlılığı (genellikle %<70) ve partiden partiye önemli değişkenlikle sınırlıdır; bu da sonraki deneyleri tehlikeye getirir.

Burada, mekanik dalga ve enzimatik sindirimi birleştirerek bu zorlukları ele alan SoniConvert sistemini (mekanik dalga tabanlı hücre ayırma sistemi) sunuyoruz. Sistem, dijital geri besleme yoluyla mekanik dalga aracılı ayrışmayı düzenleyen mikroişlemci tabanlı bir kontrol ünitesini ve yağ dokusu için optimize edilmiş dokuya özgü gevşetme reaktifiyle (5–15 dakika kuluçka) entegre eder. Bu yaklaşım, dokunun hızlı bir şekilde tek hücreli bir süspansiyona dönüşmesini sağlar ve mekanik ayrışma 3–9 saniyede tamamlanır.

Sistemin üç avantajı vardır: (1) ultra hızlı işleme, enzimatik sindirimden hücre fraksiyon ayrımına kadar çekirdek izolasyon süreci yaklaşık 30 dakikada tamamlanır (geleneksel yöntemlere göre %>90 azalma); (2) yüksek canlılık koruması, tripan mavisi boyama ile hücre yaşamlılığını %80–95 doğruldur ve geleneksel protokolleri aşmaktadır; ve (3) ortaya çıkan tek hücreli süspansiyonlar, birincil hücre kültürü, akış sitometrisi, sitotoksisite testleri ve yağ organoid yapısı gereksinimlerini karşıladığı için geniş uyumluluk. İşlem süresini azaltarak, hücre bütünlüğünü artırarak ve değişkenliği sınırlayarak bu sistem, yağla ilgili araştırmalar için pratik bir platform sağlar.

Introduction

Yağ dokusundan izole edilen mezenkimal kök hücrelerin (MSC) kritik bir alt kümesi olan adipoz kök hücreleri (ADSC), erişilebilirlikleri, minimal invaziv hasamı, sağlam proliferatif kapasitesi, çoklu hatlı farklılaşma potansiyeli ve güçlü parakrin ve immünomodülatör özellikleri nedeniyle önemli terapötik potansiyel ^sergiler 1,2,3,4 . Bu özellikler, ADSC'leri rejeneratif tıp, doku mühendisliği ve immünoterapi için umut vadeden adaylar olarak konumlandırmıştır. Ancak, ADSC'lerin translasyonel faydası, işlevsel olarak sağlam ve yüksek saflıkta popülasyonları izole etme yeteneğine bağlıdır—bu süreç teknik olarak hâlâ zordur. Yağ dokusunun benzersiz biyolojisi iki ana engel getirir: (1) adipositlerin yüksek lipid içeriği, mekanik işlem sırasında onları yırtılmaya yatkın hale getirir; bu da stromal damar fraksiyonunu (SVF) kirleten serbest lipidler salgılar, hücrelerin yaşamını tehlikeye atır ve ^5,6 verimi verir; ve (2) dokunun yapısal karmaşıklığı, fasiya, endotel hücreleri, bağışıklık hücreleri ve kan^{bileşenleri 7}, yağ köklü hücrelerin ayrılmasını zorlaştırır. Bu sınırlamalar, metabolik hastalık modellemesi ve hücre tabanlı tedaviler gibi sonraki uygulamalar için de aynı derecede kritik olan yüksek kaliteli ADSC ve adipositleri izole etmek için verimli, hızlı ve yaşamlılığı koruyan bir yönteme acil ihtiyaç olduğunu vurguluyor.

Şu anda yağ köklü hücrelerin izole edilmesi için enzimatik sindirim, ekplant kültürü ve mekanik^{ayrıştırma 8,9,10} gibi yerleşik yöntemler mevcuttur. En yaygın benimsenen yaklaşım olan enzimatik sindirim, ekstrasellüler matriks (ECM) bileşenlerini parçalamak için kollajenaz kullanır ve kapsüllenmiş kök hücreler serbest bırakılır. Bu yöntem genellikle doku doğrama, kollajenaz sindirimi (37 °C, 1–2 saat), santrifüjle SVF izolasyonu ve yapışkan kültür saflatmasını içerir. ECM parçalanması için etkili olmasına rağmen, enzimatik sindirim önemli dezavantajlara sahiptir: uzun işlem süresi (toplamda 3–4 saat), büyük örnek hacmlerine bağımlılık ve hayvan kaynaklı kollajenazlardan kaynaklanan enzimatik sitotoksisite veya partiden partiye değişkenlik riskleri—bunların hepsi klinik translasyonu engeller. Doku parçalarından kök hücre göçünü kullanan Explant kültürü, korunmuş canlılığa sahip hücreler verir, ancak düşük verimlilik ve gecikmeli hücre iyileşmesi (7–10 gün) yaşar. Fiziksel bozulmaya (örneğin, salınım, kesme) dayanan mekanik ayrışma, işlem süresini azaltır ancak genellikle hücre bütünlüğünü tehlikeye atar, bu da yaşamabilirliğin azalmasına ve saf popülasyonlara yol açar. Bu yöntemler birlikte, klinik düzeyde hücre izolasyonu için kritik kriterler olan verimlilik, saflık ve canlılığı bir arada uyuşturmakta başarısız olur. Bu nedenle, enzimatik sindirimi mekanik dalga aracılı ayrışma ile birleştiren adipoz köken hücrelerini (adipositler ve ADSC'ler) izole etmek için yeni bir yöntem öneriyoruz¹¹. Bu yaklaşım iki önemli ilerleme sağlar: (1) zaman verimliliği: önceden optimize edilmiş, hayvansız enzim kokteylleri düşük frekanslı mekanik dalgalarla birleştirilerek toplam işlem süresi 3–4 saatten ~30 dakikaya indirilir (Şekil 1); (2) Yaşam Koruma: Nazik mekanik dispersiya, adiposit yırtılmasını ve lipid salınımını en aza indirir. Önemli olarak, 30 dakikalık zaman dilimi, ham adiposit ve SVF fraksiyonlarının elde edilmesi için çekirdek izolasyon iş akışını (sindirim, mekanik ayrışma, filtreleme ve ilk santrifüjleme) ifade eder; Kırmızı Kan Hücresi (RBC) lizisi gibi isteğe bağlı arındırma adımları ek işlem süresi gerektirir.

Optimize edilmiş yağ hücresi izolasyonu yöntemimiz, birden fazla araştırma ve klinik alanda önemli uygulama potansiyeli göstermektedir. Temel araştırmalarda, elde edilen yüksek canlılıklı hücreler, adipojenik ve osteojenik farklılaşma çalışmalarında olağanüstü performans sergileyerek doku mühendisliği uygulamaları için güvenilir bir hücre kaynağı sağlar. Translasyonel tıpta, klinik çalışmalar ADSC'lerin^{osteoartrit 12}, kardiyovasküler^{hastalıklar 13}, multipl skleroz¹⁴ ve inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD)/Crohn hastalığı gibi hastalıkların tedavisinde terapötik^{potansiyelini göstermiştir.} Hızla izole edilen ADSC'ler, yağ dokusu organoidleri oluşturmak ve hücre tedavisi uygulamalarını uygulamak için ideal yapı taşları olarak hizmet eder; ilaç taraması ve hastalık modelleme araştırmalarını önemli ölçüde ilerletir. Ayrıca, yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonlar tek hücreli RNA dizileme için uygundur. Sonuç olarak, bu entegre yaklaşım, yağ dokusu için sağlam bir teknolojik platform oluşturur ve hem temel araştırmaları hem de rejeneratif tıpta klinik çeviriyi destekler.

Protocol

Tüm hayvan araştırmaları, Çin Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, Mart 2017'de revize edilen Deneysel Hayvanlarla İlgili İşler İdarişleri Yönetmeliği'ne uygun olarak yürütüldü ve Sichuan Tarım Üniversitesi Hayvan Etik ve Refah Komitesi tarafından onaylandı (İzin numarası: 20230089). Bu protokol, mekanik dalga destekli doku ayrıştırması için ticari olarak mevcut olan SoniConvert sisteminin kullanılmasını gerektirir (bundan sonra mekanik ayrışma sistemi olarak adlandırılacaktır). Protokol, domuz yağ dokusu için optimize edilmiştir ve bu özel ekipmana bağımlılığı önemli bir sınırlamadır.

1. Yağ dokusu toplama ve hazırlanması

1. Ameliyat öncesi dezenfeksiyon ve tüy alma
   1. Domuzu damar içi aşırı dozda pentobarbital sodyum (100 mg/kg vücut ağırlığı) ötenazi yapın. Doku toplamadan önce ölümü doğrulayın.
   2. Domuz sırtının orta hattından 15 cm uzanarak spiral dezenfekte etmek için %2 iyodoforla ıslatılmış steril gazlı bez uygulanır. 30 saniye kurutmaya izin verin.
   3. 16 cm × 8 cm arasındaki bir alandan steril bir tıraş makinesi kullanın. Ameliyat bölgesinden tüm tüylerin alındığından emin olun.
   4. Arka kısmı steril gazlı bezle %75 etanol ile iki kez silin.
2. Yağ dokusu koleksiyonu
   1. Steril bir skarpelle dorsal orta hat boyunca 20 cm enine bir kesi yapın.
   2. Kesi kenarını steril forsepsle kaldırın. Yağ dokusu ile dermis arasındaki doğal düzlem boyunca diseksiye edilip, yaklaşık 2–3 mm kalınlığında tam üst üst tabaka elde edilecek şekilde sırt altı yağ dokusu (ULB) tabakası elde edilir.
   3. ULB'yi buz gibi steril salinte bir kez durulayın ve steril bir kültür kabına yerleştirin (Şekil 2).

Şekil 2: Hücre izolasyonu için domuz ULB koleksiyonu. (A) Domuz sırtı yağ dokusunun yapısının açıklaması; (B) Bama minipig'in kesim alanı; (C) Sırt yağ dokusunun sunumu ile domuz sırtı deri altı yağ iki katman içerir: üst tabaka (ULB) ve iç tabaka (ILB); (D) ULB topladı. Kısaltma: ULB = sırtın üst katmanı; ILB = sırtın iç katmanı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Duraklama noktası: Toplanan yağ dokusu, daha fazla diseksiyondan önce kısa bir süre buz gibi steril tuzlu veya D-Hanks çözeltisinde 4 °C sıcaklıkta tutulabilir.
NOT: Amaç ULB'yi toplamaktır. Disekyon sırasında alt deri altı yağ dokusu (ILB) tabakasını dahil etmekten kaçının.

3. Yağ dokusu diseksiyonu ve temizliği
   1. Her 1,8 g doku için 10 mL buz gibi soğuk D-Hanks Buffer ekleyin ve dokunun tamamen suya battığından emin olun.
   2. Steril cerrahi makas kullanarak tüm görünür kan damarlarını dokudan ayırın ve çıkarın. Bağ dokularını ve fibrotik bileşenleri çıkarın. Çıkarılan malzemeleri belirlenmiş biyolojik tehlike kaplarına atın.
      NOT: Keskin aletleri kullanırken son derece dikkatli olun; Her zaman vücuttan kesilin ve kullanılmış bıçaklar ile makasları hemen kullandıktan sonra keskin kaplara atın.
   3. D-Hanks Buffer içindeki dokuyu durulayarak kalan kan ve kalıntıları temizleyin.
      NOT: Aşırı hematomlu örneklerde, görsel netlik sağlamak için tamponu gerektiğinde 1–3 kez değiştirin. Tüm diseksiyon adımlarını doku canlılığını korumak için buz üzerinde kalın.
4. Yağ dokusu mekanik ayrışması
   1. Durulan doku parçalarından 1,8 g steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpe 800 μL A Tipi Doku Dissosiyasyon Tamponu (A-Buffer) ekleyin.
   2. Steril oftalmik makas kullanılarak, tüpteki dokuyu yaklaşık 1–2 mm³ boyutunda küçük parçalara doğra.
      NOT: Doğrama sırasında veya sonrasında önemli lipid sızıntısı gözlemlenirse, dokuyu tekrar 1 mL önceden soğutmuş D-Hanks çözeltisi ile yıkayın ve ardından enzimatik sindirime geçilerek kırılmış adipositlerden lipidleri çıkarabilirsiniz. Bu adım, aşağı akış analizi için adiposit bütünlüğünü korur.

2. Hücre izolasyonu ve homojenleşme

1. Enzimatik İşleme
   1. Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne 200 μL A Tipi Doku Dissosiyasyon Ajanı (A-Tipi Çözeltisi) eklenin. Tüpü 3 kez nazikçe döndürüp elle sallayın, içeriği karıştırın ve yağ parçalarının dissosiyasyon çözeltisine tamamen batırıldığından emin olun.
   2. Tüp kapağının sıkıca kapalı olduğundan emin olun. Tüpü 37 °C'lik metal bir banyoya yerleştirin ve 5–10 dakika kuluçka yapın.
      NOT: Çözeltiyi bulanık hale gelene ve doku parçaları kısmen sindirilmiş görünene kadar izleyin. A-Tipi Çözelti kollagenaz ve nötr proteaz içerir. Tutuşturma sırasında nitril eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük takın. Cilt temasından kaçının; Maruz kalırsa, hemen bol suyla 15 dakika boyunca durulayın. A-Buffer, A-Tipi Çözüm eklendikten sonra atılmaz.
2. Ultrasonik destekli mekanik dissosiyasyon
   1. Kısmen sindirilmiş yağ dokusu parçalarını, mikrosantrifüj tüpünden çevresindeki tampon ile birlikte mekanik ayrıştırma sistemi için tasarlanmış steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   2. Mekanik dissosiyasyon sisteminde Adipose Dokusu için önceden ayarlanmış programı çalıştırarak 200 Hz sinüzoidal dalga kullanarak mekanik dissosiyasyon gerçekleştirin.

3. Tek hücreli süspansiyon elde etmek için filtrasyon

1. Filtreleme ve santrifüjleme
   1. Hücre süspansiyonunu toplayın ve 200 μm'lik hücre süzgecinden yeni bir 50 mL'lik santrifüj tüpüne geçirerek büyük kalıntıları ve sindirilmemiş doku kümelerini çıkarabilirsiniz.
   2. Süzgeciye 5 mL önceden soğutmalı (4 °C) D-Hanks çözeltisi ekleyin. Süzgeçi D-Hanks çözeltisiyle 2 kez durulayarak hücre verimini en üst düzeye çıkarın.
   3. Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 500 × g sıcaklığında 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
      Duraklama noktası: Santrifüjlemeden sonra hücre süspansiyonu hemen işlenebilir veya katman ayrılmadan önce kısa bir süre buzda tutulabilir.
   4. Adiposit toplama: Adipositleri toplamak için, steril bir pasteur pipeti kullanarak süper lipid tabakasını aspire edip atarak adiposit tabakasını korumak için 1 mL tampon bırakılır. Adipositlerin aşağı akış analizi için ikinci katmanı toplayın. Üçüncü ve dördüncü katmanları rahatsız etmekten kaçının.
   5. SVF (stromal vasküler fraksiyon) toplama: Üst katmanlar çıkarıldıktan sonra, stromal vasküler fraksiyonu (SVF) içeren alt pelleti 1 mL D-Hanks/PBS içinde nazikçe yeniden askıya alın. Hücre pelletini 1 mL D-Hanks/PBS içinde nazikçe yeniden süzülerek 2–5 × 10⁶ hücre/mL hücre konsantrasyonu elde edilir.
      NOT: İdeal olarak, santrifüjlemeden sonra dört katman gözlemlenebilir: üstteki lipid tabakası; ikinci katman adipositleri içerir; üçüncüsü hidrofilik tampon tabakasıdır; alt tabaka ise kök hücreleri içeren SVF'dir (Şekil 1).
2. RBC lizisi
   1. NOT: Hücre pelleti belirgin kırmızı renk gösterirse ve bu RBC kontaminasyonunu gösterirse, RBC lizisi yapılsın.
      Hücre pelletini, geniş delikli uçlu P1000 pipeti kullanılarak 1–3 mL Kırmızı Kan Hücresi (RBC) liz tamponunda yeniden askıya alın. Ara sıra karıştırarak 15 dakika buzda kuluçka yapın.
   2. İşlem sırasında metabolik aktiviteyi en aza indirmek için tüm çözeltiler ve santrifüj rotorlarını 4 °C'ye kadar önceden soğutun.
   3. Santrifüj 500 × g'de 4 °C'de 10 dakika boyunca koyun. Süpernatantı tamamen aspire edin.
   4. Hücreleri bir kez daha peleti 5 mL önceden soğutmuş D-Hanks çözeltisiyle yeniden süper hale getirin ve 500 × g sıcaklığında 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Üst yüzeyi at.
3. Son yeniden süspansiyon
   1. Son hücre pelletini D-Hanks/PBS'de sonraki uygulamalar için yeniden askıya alın.

4. Sonraki uygulamalar ve analiz

1. SVF hücre canlılığı ve hücre verimi değerlendirmesi
   1. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde elde edilen SVF hücre süspansiyonunu hazırlayın. Süspansiyonu kullanana kadar buzda tutun.
   2. 10 μL SVF hücre süspansiyonu ile 10 μL %0,4 Trypan Blue çözeltisi ile steril 0,5 mL mikrosantrifüj tüpünü karıştırın. Düzenli karışım için 3 kat yukarı ve aşağı nazikçe pipet yapın.
      NOT: Karışımdaki Trypan Blue'nun nihai konsantrasyonu %0,2'dir. Karıştırma sırasında hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının, çünkü bunlar otomatik hücre sayımı engelleyebilir.
      Boyalı hücre karışımından 10 μL'yi Otomatik Hücre Sayacı için uygun bir sayma slaytına aktarın. Numunenin odayı tamamen taşmadan doldurduğundan emin olun.
   3. Sayma slaytını Hücre Sayacı'na yerleştirin. Trypan Blue test tipini seçin ve gerekirse hücre konsantrasyon aralığını ayarlayın.
   4. Otomatik hücre sayımı başlatmak için Sayma düğmesine basın. Cihaz, sayma odasının görüntülerini yakalayacak ve canlı hücreleri ölü hücrelerden otomatik olarak ayırt edecek.
   5. Hücre canlılık yüzdesini kaydedin ve cihaz ekranında gösterilen toplam canlı hücre sayısını sayın. Her örnek için üç bağımsız ölçüm yapın ve ortalama canlılık ile yağ dokusu başına hücre verimini hesaplayın.
      NOT: Her kullanımdan sonra sayım kaydırması ve cihaz yükleme portunu %70 etanol ile temizleyin, böylece örnekler arasında çapraz kontaminasyon oluşmasını önleyin.
2. Adiposit morfolojisinin gözlemi
   1. İzole adipositleri çekirdekler için 5 μg/mL Hoechst ve lipidler için 1 μM BODIPY ile D-Hanks/PBS ile 15 dakika boyunca 37 °C'de boyandırın.
      Duraklama noktası: Boyamadan sonra örnekler hemen görüntülenmelidir; gerekirse, mikroskopiden önce kısa bir süre 4 °C'de ışıktan korunabilirler.
   2. Hücrelerin sıkışmasını önlemek için slayt hazırlığında kendi yapımı adiposit dostu bir slayt kapaklı cam sistemi kullanın.
   3. Çekirdekleri (Hoechst ile boyanmış) ve lipid damlacıklarını (BODIPY ile boyanmış) floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
      NOT: Büyük boyutları (20–300 μm) ve yüksek lipid içeriği nedeniyle, adipositler kırılgandır, yüzer ve birden fazla katmana yığılır; bu da geleneksel montaj yöntemlerini net mikroskobik gözlem için uygun kılmaz hale getirir (Şekil 3A). Bunu çözmek için, standart kaydırmalar ve örtü sürgüleri kullanarak ev yapımı adiposit dostu bir montaj sistemi geliştirildi (Şekil 3B).
3. Stromal vasküler bileşenlerin arındırılması ve ADSC'lerin morfolojik gözlemi
   1. Taze izole edilmiş SVF'yi, %10 FBS ve %1 penisillin-streptomisin takviyesi içeren 5 mL DMEM içeren bir T25 hücre kültürü şişesine tohumlayın. %5 CO₂ ile 37 °C'de kuluçka yapın.
   2. 48 saat sonra, yapışmayan hücreleri çıkarmak için termostayı önceden ısıtılmış PBS ile 2 kez nazikçe yıkarın. Taze kültür ortamı ekleyin ve kuluçkaya devam edin.
   3. Kültür ortamını her 2–3 günde bir değiştirin. Hücre morfolojisi ve birleşimini ters mikroskop altında izleyin.
   4. Hücreler %80–90 birleşime ulaştığında (genellikle 7–10 gün sonra), hücreleri %0,25 tripsin-EDTA ile 37 °C'de 3–5 dakika boyunca ayırın. Kültür ortamıyla nötralize edin ve hücre süspansiyonunu toplayın.
   5. FACS tespit ve ayırmadan önce hücrenin canlılığını tespit etmek için Trypan Blue boyama işlemi yapılabilir.
   6. Temizlenmiş kültürlenmiş ADSC'lerin morfolojisini optik mikroskop altında gözlemleyin.
   7. Toplanan hücre süspansiyonunu 70 μm hücre eleğinden geçirerek kalan agregaları çıkarır. Hücreleri %2 FBS içeren PBS içindeki hücreleri FACS analizi için yeniden süzüldürün.
   8. Hücreleri, karanlıkta 4 °C sıcaklıkta 30 dakika boyunca CD73, CD90, CD11b ve CD45'e karşı florokrom ile konjuge edilmiş antikorlarla boyandırın.
   9. Hücreleri boyama tamponu ile 2 kez yıkayın ve %2 FBS içeren PBS ile tekrar süzülün.
   10. 20 psi ve 3.0'ın altında bir akış hızında 70 μm nozul kullanarak akış sitometrik analizi yapın.
   11. Ana popülasyonda ileri saçılma alanı (FSC-A) ve yan saçılma alanı (SSC-A) parametreleriyle kapaj yaparak hücre kalıntılarını dışlayın.
   12. FSC-A ile FSC-H kapı ile çift çiftlikleri çıkarın ve aşağı akış analizi için uygulanabilir tekil popülasyonunu seçin.
   13. Yüzey işaretleyici ifadesine göre kapılı hücreleri analiz edin. ADSC fenotipini doğrulamak için CD73 ve CD90'ı pozitif belirteçler olarak, CD11b ve CD45'i negatif belirteç olarak kullanın.
   14. Zenginleştirilmiş ve kültürlenmiş ADSC'lerin morfolojisini optik mikroskop altında gözlemleyin. Karakteristik iğne şeklinde, fibroblast benzeri morfoloji, başarılı ADSC zenginleşmesini gösterir.
4. ADSC adipojenik farklılaşma
   1. Üçüncü nesil ADSC'leri 1 ×^{10 4} hücre/^cm2 yoğunlukta tohumlayın. Hücre birleşimi yaklaşık %90'a ulaştığında, adipojenik indüksiyon başlatılır.
   2. %10 fetal sığır serumu (FBS), 0,5 mM 3-izobütil-1-metilksantin (IBMX), 1 μM deksametazon, 10 μg/mL insülin ve 1 μM roziglitazon içeren yüksek glikozlu Dulbecco's modified Eagle's ortamı (DMEM) kullanılarak adipojenik indüksiyon ortamı hazırlanır.
   3. 3 gün indüksiyondan sonra, ortamı bakım aracıyla değiştirin ve çözeltiyi her 2 günde bir değiştirin.
   4. 14 günlük indüksiyondan sonra hücreleri Yağ Kırmızı O ile boyandırın ve lipid damlacıklarını ters mikroskop altında gözlemleyin.
5. ADSC osteojenik farklılaşması
   1. Hücre birleşimi %80–90'a ulaştığında osteojenik indüksiyon başlar. %10 FBS, 10 mM β-gliserofosfat, 50 μg/mL askorbik asit, 10 μM kalsitriol ve 1 μM deksametazon içeren yüksek glikozlu DMEM içeren osteojenik indüksiyon ortamı formüle edin.
   2. Malzemeyi her 2–3 günde bir değiştirin ve indüksiyon sürecine yaklaşık 14 gün devam ettirin.
   3. Hücreleri %2 Alizarin Red S (pH 5.2) ile boyandırın ve ters mikroskop altında gözlemleyin.
6. Organoid yapısı ve tanımlaması
   1. Tam kültür ortamında tek hücreli ADSC süspansiyonu hazırlanır ve hücre konsantrasyonunu 2 × 10⁴ hücre/20 μL olarak ayarlayın.
   2. 100 mm'lik bir kültür kabının kapağını ters çevirin ve hücre süspansiyonundan 20 μL damlasını kapağın iç yüzeyine bırakın.
   3. Kabın altına steril PBS ekleyerek nemi koruyun, kapağı dikkatlice kapatın ve asılı damlaları standart kültür koşullarında kuluçka yapın.
   4. Damlaları günlük olarak gözlemleyin ve hücrelerin 6 gün boyunca toplanıp küreler oluşturmasına izin verin.
   5. Küreleri pipet kullanarak nazikçe toplayın ve buzun üzerinde önceden soğutulmuş Matrigel'e aktarın.
   6. Sferoidleri Matrigel'e gömüp karışımı kültür plakalarına tabakalayıp standart kültür koşullarında kuluçkaya geçirin.
   7. Ortamı düzenli olarak değiştirin ve organoid büyümesini 18–28 günlere kadar izleyin; o zaman yapılar sıkışıp olgunlaşır.
   8. Organoidleri %4 paraformaldehit ile sabitleyin, %0,1 Triton X-100 ile geçirimli hale getirin ve %5 BSA ile spesifik olmayan bağlanmayı engelleyin.
   9. Örnekleri CD73, CD90, CD11b ve CD45'e karşı birincil antikorlarla kuluçka altına alın ve ardından ilgili floresan ikincil antikorlarla kuluçka yapın.
   10. Organoid maddeleri Hoechst ve BODIPY ile boyanarak sırasıyla çekirdekler ve lipid damlacıkları görselleştirin ve boyalı örnekleri floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
       NOT: Hücre ayırtma ve açık kültürlerle ilgili tüm manipülasyonları, tohumlama, besleme ve boyama hazırlığı dahil, biyolojik güvenlik dolabında sıkı aseptik koşullar altında gerçekleştirin.

Results

Şekil 1: Yağdan türetilen hücre izolasyonu sürecinin şematik illüstrasyonu. Diyagram, geleneksel yöntemi ve mevcut yöntemi örnek iş akışları olarak tasvir eder. Yağ kaynaklı hücrelerin izole edilmesinde üç ana adım vardır: ilki ön tedavidir; ikincisi ise hücreleri serbest bırakmak için yağ dokusunu ayırmaktır...

Discussion

Bu çalışma, geleneksel yöntemlerin kritik sınırlamalarını ele alan, yağ köken türeyden köken hücrelerin (çoğunlukla ADSC) izole edilmesi için yeni bir entegre yaklaşım sunmaktadır. Dokuya özgü enzimatik gevşemeyi hassas mekanik dalga ayrıştırmasıyla birleştirerek, bu sistem hızlı (toplam işlem süresi ~30 dakika), yüksek canlılık (%80–95) ve tekrarlanabilir hücre izolasyonu sağlar.

Geleneksel enzimatik sindirim yaygın olarak kullanılsa da, uzun süreli kollajena...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bir Tip Doku Dissosiyasyon Kiti	Docsense	TM001	Bir tip doku dissosiyasyon ajanı (A-tipi çözeltisi) ve bir tip doku dissosiyasyon tamponu (A-tampon) içerir.
Adipojenik Farklılaşma Malzeme Kiti	OriCell	GUXMD-90031	Adipogenik farklılaşma için kullanılır; yüksek glikozlu Dulbecco'nun modifiye Eagle's ortamı (değiştirilmemiş) ve bakım ortamı da dahil olmak üzere
Alizarin Red S	OriCell	A5533ALIR-10001	Ostejenik farklılaşma için mineralizasyon boyama (pH 5.2)
Askorbin asit	Sigma-Aldrich	A4544	L-Askorbin asit, hücre kültürü testlenmiş, osteojenik indüksiyon için
Bama minipigs	Chengdu Dossy Deneysel Hayvanlar Şirketi, Ltd		Bir yaşında, erkek, SPF sınıfı hayvanlar standart aşılama, soluşta temizleme ve temizlik prosedürleri altında tutulur.https://www.cd-dossy.cn/animalpl_detail/12606067609851863 04.html
Bio-Rad TC20 Otomatik Hücre Sayacı	Bio-Rad Laboratuvarları	1450011	Uygulanabilirlik ve verim değerlendirmesi için otomatik hücre sayacı
BODIPY	Thermo Fisher Scientific	D3922	Nötr lipid leke
BSA (%5)	Sigma-Aldrich	A9418	Sığır serumu albümini, liyofilize toz, bloklama için
Kalsitriol	Sigma-Aldrich	C9756	1α,25-Dihidroksivitamin D3, osteojenik indüksiyon için
hücre elek (70 μ m)	Corning	352350	Falcon 70 & mu; m hücre süzgeci, steril, FACS örnek hazırlığı için
hücre süzgeci (200 μ m)	pluriSelect	43-50200-03	pluriStrainer, PET ağı, 50 mL tüplere uyar, steril ve steril;
Santrifüj tüpü (50 mL)	Corning	352098	Falcon 50 mL yüksek berraklıkta konik tüp, steril, polipropilen
Sayma slaytı (Bio-Rad TC20 için)	Bio-Rad Laboratuvarları	1450011	TC20 otomatik hücre sayacı için çift odalı sayma slaytı
Kültür tabağı (100 mm)	Corning	430167	Askı damlalı organoid oluşumu için steril polistiren tabak
Deksametazon	Sigma-Aldrich	D4902	≥ %98, adipojenik ve osteojenik indüksiyon için
D-Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi veya PBS	Gibco	10010015	4 derece dereceye kadar önceden soğutulmuş; C, pH 7.4.
DMEM	Gibco	11965084	Bu, taze, izole SVF yetiştiriciliği için kullanılır
DNase I	Beyotime	D7073	İsteğe bağlı, topaklanma gözlemlenirse önerilir.
etanol	Sigma-Aldrich	459836	%75 yüzey dezenfeksiyonu için.
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Gibco	A4736201	Tet sistemi onaylı, ABD kökenli, steril
Akış Sitometresi	BD Biosciences	BD FACSanto II	3 lazer (405 nm, 488 nm, 633 nm), 8 floresan kanalı, yüzey işaretleyici analizi için (CD73, CD90, CD11b, CD45), 70 m nozul gereksinimi 20 psi'de
Floresans Mikroskobu	Olympus		FITC ve DAPI filtre setleri kullanabilen ters veya dik model.
Floresan ikincil antikorlar	Thermo Fisher Scientific	A-11001 (fare karşıtı), A-11008 (tavşan karşıtı)	Alexa Fluor konjuge, immünoflüoresans için
Fluorokrom ile konjuge edilmiş antikorlar (CD73, CD90, CD11b, CD45)	BD Biosciences	561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45)	ADSC fenotipinin akış sitometrik analizi için
Hoechst	Thermo Fisher Scientific	H3570	Canlı/ölü hücre değerlendirmesi için nükleer leke.
IBMX	Sigma-Aldrich	I5879	≥ %99 (HPLC), adipojenik indüksiyon ortamı için
Buz gibi steril salin	Baxter	2F7124	%0,9 Sodyum Klorür enjeksiyonu, USP, doku durulama için
İnsülin	Sigma-Aldrich	I9278	Rekombinant, maya içinde ifade edilir, adipojenik indüksiyon için
iodophor	Sigma-Aldrich	25104	%2 dezenfektan solüsyesi.
Matrigel	Corning	354230	Büyüme faktörü azaltılmış, fenol kırmızısı içermemiş, sferoidler  gömülmesi için;
Metal Banyo	Servicebio	SMB-H	37 derece ve C sıcaklıkta kuluçka için kullanılır.
Yağlı Kırmızı O	OriCell	OILR-10001	Adiposit farklılaşması için lipid boyama
Optik mikroskop	Olympus		10x&ndash özellikli standart parlak alan mikroskobu; 40 kat hedef.
Osteojenik Farklılaşma Ortamı Kiti	OriCell	GUXMD-90021	Osteojenik farklılaşma için kullanılır; yüksek glikozlu Dulbecco'nun modifiye Eagle's ortamı (değiştirilmemiş) ve bakım ortamı da dahil olmak üzere
Geniş delikli uçlu P1000 pipeti	Beckman Coulter	B01113	Biomek P1000 Span-8 geniş delik uçları, steril
Paraformaldehit (%4)	Thermo Fisher Scientific	J61899	Sulu çözelti organoidleri sabitlemek için
Pasteur pipeti	Corning	7095S-5C	Steril, tek kullanımlık.
Penisillin-Streptomisin	Gibco	15070063	10.000 U/mL penisillin, 10.000 μ g/mL streptomisin, steril
Pentobarbital sodyum	Hikma Pharmaceuticals USA Inc.	24201-010-20	Enjekte edilebilir, ötenazi için (100 mg/kg vücut ağırlığı, damar damarı). ANDA 203619
Birincil antikorlar (CD73, CD90, CD11b, CD45)	BD Biosciences	561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45)	Organoid immünboyama için
Kırmızı Kan Hücresi (RBC) Liz Tamponu	Solarbio	R1010	Gerekirse sonraki uygulamalar için.
Soğutmalı santrifüj	Eppendorf	5702R	4 & derece C sıcaklıkta santrifüj adımları için kullanılır.
Roziglitazon,	Cayman Chemical	71740	≥ %98, PPARγ adipojenik indüksiyon için agonist
Sharps kabı	Becton Dickinson	305270	Kullanılmış bıçak ve makas için delinmeye dayanıklı kap
SoniConvert Tek Hücreli Süspansiyon Hazırlık Sistemi	Docsense	SC-L1W	Doku mekanik ayrıştırılması için kullanılır.
Boyama Tamponu (Akış Sitometrisi Boyanma Tamponu)	eBioscience (Thermo Fisher Scientific)	00-4222-57	200 mL, kullanıma hazır, FBS ve %0,09 sodyum azid içerir; bu koruma maddesi antikor ve hücre seyreltmesi, yüzey boyama ve akış sitometrisinde yıkama aşamaları için;
Steril 1.5 mL Eppendorf tüp	Eppendorf	30121.517	Safe-Lock mikrosantrifüj tüpü, steril, doku doğramak için
Steril kültür kabı	Corning	430167	100 mm x 20 mm steril kültür kabı, doku toplama için
Steril forseps	Sklar	96-1719	Steril başparmak forsepsleri, dişli, doku kullanımı ve kullanım için;
Steril gazlı bez	Dukal Şirketi	7060033	Dezenfeksiyon ve silme için steril gazlı bez pedleri
Steril oftalmik makas	Sklar	10023-580	Vannas tarzı yay makas makineleri, doku 1-2 mm ve sup3 parçalamak için; Parçalar
Steril jilet	3M	9681	Ameliyat bölgesinden tüy almak için cerrahi hazırlık tıraş makinesi
Steril bistürpel	Integra Miltex	4-415	Kesi yapmak için steril tek kullanımlık bistüri
Steril cerrahi makas	Sklar	10022-580	Merit Sterile Iris Scissors, kan damarlarını ve bağ dokusunu disseksiye etmek için;
T25 hücre kültürü şişesi	Corning	430639	Falcon T25 hücre kültürü şişesi, havalandırmalı kapsül, steril
Triton X-100 (%0,1)	Sigma-Aldrich	T8787	Laboratuvar derecesi, permeabilizasyon & nbsp için;
Trypan Mavisi	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15250061	Hücre canlılığı sayımı için %0,4 çözüm.
Tripsin-EDTA (%0,25)	Gibco	25200056	%0,25 tripsin, 1 mM EDTA, ADSC'lerin ayrılması için
β-Gliserofosfat	Sigma-Aldrich	G9422	Osteojenik indüksiyon için disodyum tuzu pentahidrat