Burada, fosfomisinin seftriakson, meropenem ve gentamisin ile birlikte karbapenem-dirençli Escherichia coli izolatlarına karşı agar seyreltme yöntemiyle sinergistik etkinliğinin değerlendirilmesi için bir protokol sunuyoruz. Meropenem ve gentamisin ile sinerji gözlemlendi, ancak seftriakson ile gözlemlenmedi.
Derleme makalesi
Karbapenem-dirençli Escherichia coli'ye karşı Fosfomisin Bazlı Antibiyotik Kombinasyonlarının Agar Sulandırma Checkerboard Analizi Protokolü
Yeni sekmede açılır
Bu makalede
Özet
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Özet
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Karbapenem-dirençli Enterobakteriyeller için sınırlı tedavi seçenekleri nedeniyle, kombinasyon tedavi rejimleri giderek daha fazla önem kazanmıştır. Bu çalışma, fosfomisin direnç oranlarını araştırmayı ve fosfomisinin meropenem, gentamisin ve seftriakson ile kombinasyon halinde karbapenem-dirençli Escherichia coli izolatlarına karşı in vitro sinerjistik etkileşimlerini değerlendirmeyi amaçladı. Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanelerinin klinik servisleri ve yoğun bakım ünitelerinde bulunan hastalardan alınan çeşitli klinik örneklerden (idrar, kan, aspirat, yara, beyinomurilik sıvısı, endotrakeal aspirat) izole edilen altmış karbapenem-dirençli E. coli suşu çalışmaya dahil edilmiştir. Tür tanımlama otomatik bir mikrobiyal tanımlama sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Antibiyotik duyarlılık testi ve karbapenem direncinin doğrulanması ertapenem, imipenem ve meropenem ile disk difüzyonu ile gerçekleştirildi. Fosfomisin direnci ve antibiyotikler arasındaki etkileşimler agar seyreltmesiyle değerlendirildi. Ayrıca, agar seyreltme tabanlı protokol kullanılarak seri iki katlı konsantrasyon gradyanları boyunca antibiyotik kombinasyonları değerlendirildi ve sinerji, kayıtsızlık veya antagonizmi belirlemek için fraksiyonel inhibitör konsantrasyon indeksleri (FICI) hesaplandı. Direnç oranları fosfomisin için %76,6, meropenem için %61,6, gentamisin için %85,0 ve seftriakson için %98,3 idi. Fosfomisin–meropenem kombinasyonu için izolatların %35'inde, fosfomisin–gentamisin kombinasyonunda %33,4'te ve fosfomisin–seftriakson kombinasyonunda %1,7'de sinerjik etkileşimler gözlemlendi. Antagonizm, fosfomisin–meropenem kombinasyonunda yalnızca bir izolette tespit edilmiştir. Fosfomisin ile meropenem ve gentamisin kombinasyonları, karbapenem-dirençli E. coli'ye karşı in vitro sinerjistik aktivite göstermiştir. Bu bulguları doğrulamak için daha fazla in vitro çalışmalar yapılmalıdır.
Giriş
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Enterobacterales ailesi, çok çeşitli gram-negatif basil grubundan oluşur ve bunların çoğu klinik olarak önemliöneme sahiptir 1. Bunlar arasında, Escherichia coli klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında en sık izole edilen türdür ve idrar yolu enfeksiyonları, yara enfeksiyonları, bağışıklık sistemi zayıf hastalarda zatürre, gastroenterit ve yenidoğan menenjit gibi neredeyse tüm organ sistemlerini kapsayan enfeksiyonlarla yaygın olarak ilişkilendirilir. Ayrıca gram-negatif sepsis ve endotoksin aracılı septik şokun başlıca nedenlerinden biridir. İnsan tıbbının ötesinde, E. coli aynı zamanda önemli bir veteriner patojenidir; atlar da dahil olmak üzere çeşitli hayvan türlerinde solunum ve sistemik enfeksiyonlara neden olur; bu da E. coli patogenezinin insan ve hayvan konakçıları arasında konak alanınıgenişletir 2,3,4.
Özellikle E. coli ve Klebsiella pneumoniae gibi genişletilmiş spektrumlu beta-laktamaz (ESBL) üreten enterobakteriyeller, artan ölüm, uzun süreli hastaneye yatış ve daha yüksek sağlık masraflarıyla ilişkilendirilmiştir. Antibiyotiklerin yaygın kullanımı, bu organizmalar arasında çoklu ilaç direncinin (MDR) önemli bir itici gücüdür1. Direnç mekanizmaları arasında karbapenemaz üretimi, ESBL'ler, aminoglikozid modifiye edici enzimler (AME'ler), kinolon direnci sağlayan mutasyonlar ve porin ile efıs sistemlerinde değişiklikler yer alır. E. coli ve Klebsiella pneumoniae'de direnç ağırlıklı olarak plazmid aracılıdır ve yatay gen transferini kolaylaştırır. Bu direnç özellikleri, hayvan kökenli E. coli'de, sığır izolatıları da dahil olmak üzere, giderek daha fazla bildirilmekte olup, Tek Sağlık kavramını desteklemekte ve potansiyel zoonotik bulaşma riskini 2,3 göstermektedir.
Karbapenemler, şiddetli çok ilaçlı dirençli enfeksiyonlar için son hat ajanları olarak kabul edilir. Ancak, karbapenem-dirençli Enterobakteriyeller (CRE) önemli bir küresel sağlık sorunu olarak ortayaçıkmıştır 4. Bu direnç esas olarak karbapenemazlar tarafından sağlanır; bunlar arasında sınıf B metallo-beta-laktamazlar da bulunur ve bu da yaygın şekilde ilaç ve pan dirençli fenotiplerekatkıda bulunur 5.
MDR E. coli türleri, tedavi seçeneklerini önemli ölçüde sınırlar ve enfeksiyon yönetimini zorlaştırır. Bu, klinik sonuçları iyileştirmek için kombinasyon tedavileri gibi alternatif tedavi stratejilerine olan ihtiyacı vurgulamaktadır. Ayrıca, bu dirençli suşlar giderek daha fazla sadece klinik ortamlardan değil, süt ürünleri gibi gıda kaynaklarından da bildirilmektedir. Bu, antimikrobiyal direnç yayılımının epidemiyolojik bağlamını genişletir ve kombinasyon tedavisinin yayılmasını ve klinik etkisini azaltmak için potansiyel bir strateji olarakdestekler 6,7. Aminoglikozitler, tigesiklin ve polimiksinler, MDR enfeksiyonlarında yaygın olarak kullanılan terapötikajanlardır 8. Fosfomisin, özellikle idrar yolu enfeksiyonlarında ESBL üreten E. coli'ye karşı da aktivitegöstermiştir 9.
1969'da ilk kez keşfedilen Fosfomycin, erken bakteriyel hücre duvarı sentezini engeller ve kombinasyon tedavisinde umut vadeden bir ajan olarak yeniden ortayaçıkmıştır 10. MDR organizmalarında fosfomisin ile aminoglikozidler veya β-laktamlar arasında sinerjik etkilerbildirilmiştir 11,12. Ayrıca, fosfomisin büyük klinik gruplarda değerlendirilmiş olup, tek başına veya kombinasyon rejimlerde şiddetli enfeksiyonlarda etkinliğigöstermiştir 13. Ancak, önceki çalışmaların çoğu heterojen bakteriyel popülasyonları içermekte olup, özellikle karbapenem-dirençli E. coli'ye yönelik veriler sınırlı kalır.
Standart antimikrobiyal duyarlılık test yöntemleri arasında agar seyreltme, et suyu sulandırılması ve disk difüzyonu bulunur. Agar seyreltme tabanlı kombinasyon testi, MIC'leri belirleyip FICI'leri hesaplayarak antimikrobiyal etkileşimlerin nicel olarak değerlendirilmesini sağlar. Zaman öldürme ve gradyan difüzyonu gibi alternatif yöntemler dinamik veya basitleştirilmiş etkileşim verileri sağlar, ancak tekrarlanabilirlik ve standartlaştırma açısından farklılıkgösterebilir 13,14. Bu protokol, tanımlanmış antibiyotik kombinasyonlarının kontrollü in vitro değerlendirmesi için en uygundur. Ancak, in vivo farmakokinetik durumları tam olarakyansıtmaz 15. Bunlar arasında, agar seyreltmesi MIC belirlemesi için referans yöntem olarak kabul edilir; ancak, karbapenem-dirençli E. coli'ye karşı fosfomisin kombinasyon aktivitesinin değerlendirilmesinde kullanımı sınırlı kalmaktadır.
Bu çalışma, klinik olarak doğrulanmış karbapenem-dirençli E. coli izolatlarına karşı fosfomisin bazlı kombinasyonların sistematik bir değerlendirmesini sunmaktadır. Kontrollü in vitro koşullarda doğrudan karşılaştırmalı etkileşim verileri üreten standartlaştırılmış agar seyreltme dama tahtası yaklaşımı kullanıldı.
Bu nedenle, bu çalışma fosfomisinin meropenem, gentamisin veya seftriakson ile birlikte CRE E. coli izolatılarına karşı in vitro sinerjistik aktivite gösterdiği hipotezini test etmektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
İnceleme ve perspektif
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu çalışma için onay, Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Girişimsiz Klinik Araştırma Etik Komitesi'nden alınmıştır (Karar No: 100, Tarih: 01.01.2021).
Aşağıdaki protokol, karbapenem-dirençli E. coli izolatılarına karşı fosfomisin kombinasyon sinerjisini değerlendirmek için standartlaştırılmış bir agar seyreltme kontrol tahtası yöntemini tanımlar.
İzolat koleksiyonu
15.02.2021 ile 15.12.2021 arasında, Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanelerinde yatan hastalardan alınan çeşitli klinik örneklerden (idrar, kan, aspirat, yara, beyinomurilik sıvısı ve endotrakeal aspirat) izole edilen toplam 60 karbapenem-dirençli E. coli suşu dahil edilmiştir. Tanımlama, MALDI-TOF kütle spektrometrisi sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Aynı hastadan birden fazla izole alındığında, sadece ilk izole dahil edilmiştir. Ayaktan kliniklerden ve 48 saatten kısa süre hastanede yatan hastalardan alınan örnekler hariç tutuldu. Çalışma döneminde önceden tanımlanmış dahil etme kriterlerini karşılayan tüm karbapenem-dirençli E. coli izolatları ardışık olarak dahil edilmiştir; Bu nedenle, örneklem büyüklüğü mevcut uygun izolatın toplam sayısına göre belirlendi ve önceden örneklem büyüklüğü hesaplaması yapılmadı. E. coli ATCC 13846 ve E. coli ATCC 25922 kalite kontrol suşları olarak kullanıldı. Kalite kontrol suşları, aynı agar seyreltme koşulları altında klinik izolatlarla paralel olarak test edildi. Tüm çalışmalar iki bağımsız gözlemci tarafından değerlendirildi. Kalite kontrol suşlarının sonuçları, tüm deneylerde beklenen büyüme inhibitörü desenlerini gösterdi ve aralık dışı veya geçersiz sonuçlar gözlemlenmedi.
Klinik izolatları içeren tüm işlemler biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL-2) koşullarında gerçekleştirilmiştir. Uygun kişisel koruyucu ekipmanlar (laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruma) kullanıldı ve tüm manipülasyonlar sertifikalı biyolojik güvenlik dolabında gerçekleştirildi.
Tür tanımlama ve antimikrobiyal duyarlılık testi
Karbapenem direnci ve antimikrobiyal duyarlılık testi, otomatik mikrobiyal tanımlama ve duyarlılık testi sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Sistem tarafından tespit edilen karbapenem direnci, ertapenem, imipenem ve meropenem diskleriyle disk difüzyon testleriyle doğrulandı. Bölge çapları, EUCAST kırılmanoktaları 16,17 (Tablo 1) olarak yorumlanmıştır. Tüm izolasyonlar, %20 gliserol içeren triptik soya çorbasında korunmuş ve −20 °C sıcaklıkta saklanmıştır.
Tablo 1: Disk difüzyon testi (DDT) ile E. coli için karbapenemler için bölge çapı kırılma noktaları. Karbapenem hassasiyet testi için kullanılan disk difüzyonu yorumlayıcı kriterler. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Pediatrik ve aerobik örnekler için uygun kan kültürü şişeleri otomatik bir kan kültür sisteminde kuluçka edildi. Pozitif şişeler EMB agar, %5 Koyun Kanı Agar ve Sabouraud Dekstroz Agar'a alt kültüre dönüştürüldü.
İdrar ve endotrakeal aspirat örnekleri nicel yöntemlerle kültürlenmiş, diğer örnekler ise yarı nicel yöntemlerle işlenmiştir. Endotrakeal aspirat örnekleri Gram boyama kullanılarak değerlendirildi ve yalnızca Bartlett skoru > 0, Murray skoru > 3 olan örnekler anlamlı olarak değerlendirildi ve18 skorunu içerdi.
Yara örnekleri için Gram boyama değerlendirmesi Q puanlama sistemine göre yapıldı; Q puanı 0'dan yüksek olan örnekler19 dahil edildi.
Bakteriyel izolasyonlar, Matrix Destekli Lazer Desorpsiyonu/İyonizasyon-Uçuş Zamanı Kütle Spektrometrisi ile tanımlanmıştır. Cins ve tür düzeyinde tanımlama için ≥2.0 puan güvenilir kabul edilirken, 1.7 ile 2.0 arasındaki puanlar güvenilir cins düzeyindetanımlamayı 20,21 gösterdi. Sadece ≥2.0 puanlı izolasyonlar dahil edildi.
Fosfomisin hassasiyetinin agar seyreltme yöntemiyle belirlenmesi
Avrupa Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Komitesi'ne (EUCAST) göre, Enterobacteralesailesi 16 üyelerinde fosfomisin hassasiyetini belirlemek için agar sulandırma yöntemi önerilir.
Fosfomisin ve diğer antibiyotik çalışan çözeltilerinin hazırlanması
Agar seyreltme yöntemi için toz halinde fosfomisin disodyum tuzu hidrat kullanıldı ve seyreltme oluşturulmak için steril damıtılmış su kullanıldı. Her antibiyotik için sekiz farklı seyreltme planlandı; EUCAST tarafından belirlenen MIC sınır değerinin 4 kat altında ve 3 kat üzerinde değişiyordu.
Fosfomisin stok çözeltisi (2560 μg/mL fosfomisin içerir) 51,2 mg steril fosfomisin disodyumu çözünerek hazırlanmış, hacim/ağırlık/güç formülü kullanılarak (Hacm/mL) = Ağırlık (mg) × Güç (μg/mg)/ Konsantrasyon (μg/mL)) steril koşullarda 20 mL steril damıtılmış suda tartılmıştır. Son konsantrasyonun 256 μg/mL olması planlandı; bu, MHA eklendiğinde stok çözeltinin 10 kat seyreltilmesiyle sonuçlandı.
Buna göre, fosfomisin (2-256 μg/mL), meropenem ve gentamisin (0.125–16 μg/mL) ile seftriakson (0.0625–8 μg/mL) için seyreltme aralıkları belirlendi.
Sulandırmalar, 10 mL steril distile su içeren steril konik tüplerde seri iki katlı seyreltileştirmelerle hazırlanırdı. Tüplerde toplam 7 seri iki katlı seyreltme yapıldı ve 2 μg/mL konsantrasyonuna ulaşıldı. Son tüpteki kalan 10 mL atıldı. Bu sonucunda sekiz farklı antibiyotik konsantrasyonu oluştu: 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4 ve 2 μg/mL.
Fosfomisin için kullanılan yöntem, diğer antibiyotikler için de ilk stok çözeltiyi hazırlamak için kullanıldı. 1,6 mg toz halindeki antibiyotik seftriakson için, 3,2 mg ise meropenem ve gentamisin için hassas bir tartı kullanılarak tartıldı. Her antibiyotik için yedi seyreltme yapıldı. Böylece, meropenem, gentamisin ve seftriakson için sekiz farklı antibiyotik sulandırması konsantrasyonu elde edilmiştir (Şekil 1).
Şekil 1: Fosfomisin seyreltme çözeltilerinin hazırlanma adımları. Çalışma konsantrasyonlarını elde etmek için kullanılan seri seyreltme adımları. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Agar ortamının hazırlanması
Katyonla ayarlanmış Mueller-Hinton Agar (CAMHA), üreticinin talimatlarına uygun olarak hazırlandı. 121 °C ve 1 atm sıcaklıkta, bir otoklav kullanılarak 15–20 dakika boyunca sterilize edildi, ardından su banyosunda 45–55 °C'de tutuldu.
Tüm biyolojik malzemeler, bertaraf edilmeden önce 121 °C'de 15–20 dakika boyunca otoklavlama ile sterilize edilmiştir. Antibiyotik içeren atıklar, kurumsal biyogüvenlik ve kimyasal atık protokollerine uygun olarak bertaraf edilmiştir.
Kritik Adım: Antibiyotik eklemeden önce agar sıcaklığını 45–55 °C arasında tutun. Aşırı ısı, fosfomisin aktivitesini azaltabilir ve MIC sonuçlarını etkileyebilir.
G6P'nin ortama eklenmesi
Fosfomisin hassasiyetini belirlemek için EUCAST, agar ve et suyuortamı 5'e 25 μg/mL glikoz-6-fosfat (G6P) eklenmesini önerir. Her litre agar için, 25 mg G6P 20 mL MHA'da çözünür, sterilize edilmek üzere filtrelenir ve ana agar partisine karıştırılır.
Agar seyreltme plakalarının hazırlanması
Fosfomisin, meropenem, gentamisin ve seftriakson için monoterapi MIC değerlerini belirlemek için, her seyreltme için bir Petri plakası kullanıldı (örneğin, fosfomisin için 8 seyreltme, 2–256 μg/mL arasında değişen). Plakalarda antibiyotik konsantrasyonları not edildi.
Kombine çalışmada, fosfomisin ve incelenen diğer antibiyotik konsantrasyonları plakalarda not edildi (örneğin, fosfomisin 256 μg/mL ve meropenem 32 μg/mL). Böylece, her kombinasyon için 64 plaka hazırlanmış ve kullanılan fosfomisin ile diğer antibiyotik konsantrasyonu plakalarda not edilmiştir. Monoterapi için toplam 32 meropenem-gentamicinetri plakası ve kombinasyon için 192 plaka hazırlandı. Mermer yüzey üzerine 56 küçük 1 cm kare içeren standart bir çizim yapılmıştır. Tüm plakalar doğrudan bu çizim üzerine aşılanmıştır. Böylece, okuma ve aşılama standartlaştırıldı (Şekil 2 ve Şekil 3).
Şekil 2: Aşılama ve okuma amaçları için oluşturulan standart diyagram. Aşılama ve değerlendirme için kullanılan standart şema. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Agar seyreltme plakalarının değerlendirme yöntemi. MIC belirlemesi için bakteriyel büyümenin değerlendirilmesi. F = fosfomisin; M = meropenem. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
İki mililitre antibiyotik çözeltisi 18 mL erimiş CAMHA ile karıştırıldı ve nihai çalışma konsantrasyonu elde edildi. Bu ortam, üreticinin paket ekine göre hazırlanır ve sıcak su banyosunda 45−55 °C'ye soğutuluyordu. Antibiyotik karışımının bir kısmı (2 mL) kullanıldı ve Petri kablarında 9 parça (18 mL) MHA karıştırıldı (antibiyotik 1/10 seyreltildi). Son agar plaka hacmi yaklaşık 20 mL olarak standartlaştırıldı (18 mL agar + 2 mL antibiyotik çözeltisi) ve nihai antibiyotik konsantrasyonları seyreltme sonrası hesaplandı. Bu şekilde, agar seyreltme plakalarında antibiyotik konsantrasyonları sağlanmıştır (fosfomisin için 2–256 μg/mL, seftriakson için 0,0625–8 μg/mL ve meropenem ile gentamisin için 0,125–16 μg/mL). Antibiyotik çözeltisi olmadan ortamdan hazırlanan plakalar büyüme kontrolü olarak kullanılmıştır (Şekil 4). Orta ve antibiyotik çözelti karışımları oda sıcaklığında katılaşmaya bırakıldı.
Şekil 4: Antibiyotik çözeltisi olmayan kontrol ortamı. Bakteriyel canlılığı doğrulamak için antibiyotiksiz ortam kullanılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Kritik Adım: Eşit olmayan agar derinliği veya antibiyotiklerin yetersiz karıştırılması, yanlış MIC yorumuna ve yanlış etkileşim sonuçlarına yol açabilir.
İzolat hazırlama ve aşılama
Daha önce depolanmış saf suşlar, oda sıcaklığında %5 koyun kanı agarina geçirilir ve 37 °C'de 16–24 saat kuluçka altına alınır. Taze kültürlerden alınan koloniler steril tuzlu çözeltide askıya alındı ve optik okuyucu kullanılarak 0,5 McFarland bulanıklığı elde edildi.
Agar seyreltme yöntemi, her nokta başına yaklaşık 10-4 CFU bakteri aşısı gerektiriyordu. 0.5 McFarland değeri yaklaşık 108 CFU/mL bakteri içerir. Bakteriyel yoğunluğu, 1:10 oranında steril tuzlu su ile seyreltilerek 107 CFU/mL olarak elde edilmiştir.
Her bakteri süspansiyondan 2 μL otomatik pipet kullanılarak tüpten toplandı. Bu hacim, spot başına yaklaşık 2 × 104 CFU ile karşılık gelir. Aşılama, agar yüzeyinin hedef alanlarında, en düşük fosfomisin konsantrasyonunu içeren plakadan başlayıp en yüksek seviyeye kadar ilerleyen bölgelerde gerçekleştirildi.
Bu nedenle, aşılama, her nokta başına CFU olarak tanımlandı ve her aşılama noktası yaklaşık 10-4 CFU içeriyordu. Her bakteriyel süspansiyonun aşılanması 15 dakika içinde tamamlandı.
Fosfomisin içeren plakalar aşılanmadan önce, kontaminasyon kontrolü için bir büyüme kontrol plakası aşılanmıştır. Aşı oda sıcaklığında kurutulmaya bırakıldı. Kuluçka 35–37 °C'de aerobik koşullarda 16–24 saat boyunca gerçekleştirildi ve bulanıklık kalibre edilmiş densitometre ile ölçüldü.
Aşırı inokulum yoğunluğu, izleyici büyümeye ve uç nokta belirlemede zorluklara yol açabilir. Bulanıklığı 0.5 McFarland'a yeniden ayarlayın ve birleşim büyümesi gerçekleşirse aşılamayı tekrarlayın.
Kombine testler
Toz halindeki antibiyotikler meropenem, fosfomisin, gentamisin, seftriakson ve glikoz-6-fosfat kullanıldı.
Antibiyotik miktarları hacim/ağırlık/güç formülü kullanılarak hesaplandı. Stok çözeltileri hazırlandıktan sonra, antibiyotik çözeltileri hassas MIC aralığının üstünde üç iki kat seyreltme ve dört adet iki kat seyreltme konsantrasyonlarında hazırlandı. Sulandırma aralıkları fosfomisin için 2–256 μg/mL, seftriakson için 0,0625–8 μg/mL ve gentamisin ile meropenem için 0,125–16 μg/mL olarak hesaplandı (Tablo 2, Tablo 3 ve Tablo 4).
Tablo 2: Fosfomisin-Gentamisin Kombinasyonu için Antibiyotik Çözelti Hazırlanma. Stok ve çalışma çözeltileri için kullanılan hazırlık adımları ve konsantrasyonları. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 3: Fosfomisin-Meropenem Kombinasyonu için Antibiyotik Çözelti Hazırlanması. Stok ve çalışma çözeltileri için kullanılan hazırlık adımları ve konsantrasyonları. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 4: Fosfomisin-Seftriakson Kombinasyonu için Antibiyotik Çözelti Hazırlanma. Stok ve çalışma çözeltileri için kullanılan hazırlık adımları ve konsantrasyonları. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Bu çalışmada, agar tabanlı testlerde nihai seyreltme faktörlerindeki farkları telafi etmek amacıyla monoterapi ve kombinasyon deneyleri için ayrı fosfomisin stok çözeltileri hazırlanmıştır. Monoterapi deneylerinde standart bir stok çözeltisi kullanılırken, antibiyotik ön karışımı sırasında eklenen seyrelmeyi telafi etmek için kombinasyon deneylerinde ayarlanmış, daha yüksek konsantrasyonlu stok çözeltisi kullanıldı.
Seri seyreltme için ilk adım olarak stok çözeltileri hazırlandı. Fosfomisin için, 256 mg toz, steril koşullarda analitik bir turuşla doğru şekilde tartıldı ve 50 mL steril damıtılmış suda sürekli karıştırma (manyetik karıştırıcı) ile çözünerek tam çözünmeye ulaştı; böylece nihai konsantrasyon 5120 μg/mL fosfomisin disodium elde edildi. Gentamisin, meropenem ve seftriaksondan oluşan ayrı stok çözeltileri hazırlandı.
Seri iki katlı seyreltmeler için, 25 mL steril damıtılmış su içeren yedi steril konik tüp hazırlandı. Stok çözeltisinden, 25 mL ayarlanabilir pipet kullanılarak ilk tüpe aktarıldı, ardından ardışık olarak sonraki tüplere aktarıldı ve böylece iki kat seri seyreltme sağlandı. Her tüp, transfer adımından sonra 5–10 saniye boyunca vorteks mikseriyle iyice karıştırıldı. Son tüpten itibaren 25 mL hap atıldı ve hacim eşit kalındı. Bu şekilde, en düşük konsantrasyon olan 40 μg/mL bir seyreltme serisi elde edildi ve toplamda sekiz farklı fosfomisin konsantrasyonu hazırlandı.
Aynı prosedür gentamisin, meropenem ve seftriakson için de uygulandı. Ancak, hedef konsantrasyon aralıklarındaki farklılıklar nedeniyle, 16 mg gentamisin ve meropenem (0,125–16 μg/mL aralığı için) ve 8 mg seftriakson (0,0625–8 μg/mL aralığı için) tartıldı ve oda sıcaklığında aseptik koşullarda 50 mL steril damıtılmış suda ayrı ayrı çözüldü. Seri iki katlı seyreltmeler yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirilmiştir. Son en düşük konsantrasyonlar gentamisin ve meropenem için 2,5 μg/mL, seftriakson için ise 1,25 μg/mL idi. Her antibiyotik için farklı konsantrasyonlarda 25 mL içeren sekiz tüp hazırlandı. Fosfomisin üç antibiyotikle birlikte test edildiğinden, toplamda 24 fosfomisin sulandırma tüpü (8 × 3) hazırlandı.
Agar hazırlığı için, 18 mL Mueller–Hinton agar glikoz-6-fosfat (25 μg/mL) ile takviye edilmiş, 45–50 °C'ye kadar önceden soğutulmuş ve steril Petri kaplarına dağıtılmıştır. Daha sonra, steril pipetlerle 1 mL fosfomisin çözeltisi ve 1 mL ikinci antibiyotik çözeltisi eklendi. Plakalar, homojen dağılımın sağlanması için dairesel dönüşle nazikçe karıştırıldı ve oda sıcaklığında katılaşmasına izin verildi. Eşit hacimli karıştırma ve agar ekleme nedeniyle antibiyotik konsantrasyonları yaklaşık 9 kat azaldı.
Kombine testler için, en düşük fosfomisin konsantrasyonundan (40 μg/mL) 1 mL ile sekiz gentamisin seyreltmesinden (2,5–320 μg/mL) 1 mL birleştirildi, ardından ayrı Petri kaplarına eklenip nazikçe karıştırıldı. Aynı prosedür bir sonraki fosfomisin konsantrasyonu (80 μg/mL) için tekrarlandı ve adım adım 5120 μg/mL'ye kadar devam ederek tüm olası konsantrasyon kombinasyonlarının test edilmesini sağladı. Her transferde çapraz kontaminasyonu önlemek için yeni steril pipet ucu kullanıldı. Toplamda, fosfomisin–gentamisin kombinasyonu için 64 Petri kabı (8 × 8 kombinasyon) hazırlanmıştır (Tablo 5).
Aynı prosedür, fosfomisin için meropenem ve seftriakson kombinasyonu olarak uygulandı ve her antibiyotik kombinasyonu için 64 plaka elde edildi (Tablo 6 ve Tablo 7).
Tablo 5: MHA ortamında fosfomisin-gentamisin kombinasyonunun düzeni. Mueller–Hinton agar'ında antibiyotik konsantrasyonlarının düzeni. FF = fosfomisin; GN = gentamicin. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 6: MHA ortamında fosfomisin-meropenem kombinasyonunun düzenlenmesi. Mueller–Hinton agar'ında antibiyotik konsantrasyonlarının düzeni. FF = fosfomisin; MEM = meropenem. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 7: MHA ortamında fosfomisin-seftriakson kombinasyonunun düzeni. Mueller–Hinton agar'ında antibiyotik konsantrasyonlarının düzeni. FF = fosfomisin; CRO = seftriakson. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Antibiyotik karışımları hazırlandıktan sonra, her plakaya 1 mL antibiyotik karışımı içeren her plakaya 18 mL erimiş Mueller–Hinton agar (45–50 °C) eklendi; böylece sıcaklık koşulları antibiyotik aktivitesini bozmadı. Bu, başlangıç antibiyotik çözeltisinin yaklaşık 9 kat seyrelmesine yol açtı.
Sistematik değerlendirme için plakalar dama tahtası (iki boyutlu seyreltme) formatında düzenlenmiştir. Fosfomisin konsantrasyonları dikey eksen boyunca (A–H sıraları) düzenlenmiş, en yüksek konsantrasyon A satırında ve konsantrasyonlar H satırına doğru azalmıştır. İkinci antibiyotik, yatay eksen boyunca (1–8 sütunlar) düzenlenmiş, konsantrasyonları 1. sütundan 8. sütuna kadar artmıştır. Her kuyu eşdeğer pozisyon, iki antibiyotik konsantrasyonunun benzersiz bir kombinasyonunu temsil eder ve etkileşim etkilerinin kapsamlı değerlendirilmesine olanak tanır.
Sonuç değerlendirmesi
Minimum Inhibitör Konsantrasyon sonuçları EUCAST v.11 önerilerine göre değerlendirildi. Büyüme kontrol plakalarında görünür bakteri büyümesi varken, sterillik kontrol plakalarında (aşılanmamış) büyüme yoktu. MIC, görünür bir büyüme yaşanmayan en düşük konsantrasyon olarak tanımlandı. Kombine testler için, etkileşim etkileri FICI değerleri kullanılarak yorumlandı. Sinerji FICI ≤ 0.5, kayıtsızlık > 0.5–4 ve antagonizm > 4 olarak tanımlandı. Fosfomisin için MIC değerleri ≤ 32 μg/mL duyarlı olarak kabul edildi ve 32 μg/mL > dirençli olarak kabul edildi. Menenjit enfeksiyonlarında gentamisin ve meropenem için MIC değerleri ≤ 2 μg/mL hassasiyetli, 2 μg/mL > olanlar dirençli olarak kabul edildi. Meropenem için (menenjit dışı enfeksiyonlarda), MIC değerleri ≤ 2 μg/mL hassas kabul edildi. 8 μg/mL > değerleri dirençli olarak kabul edildi, MIC ≤ seftriakson için (menenjit dışı enfeksiyonlar için) 1 μg/mL hassas kabul edildi, seftriakson için MIC ≤ 2 μg/mL (menenjit enfeksiyonları için) ve MIC > seftriakson için 1 μg/mLdirençli 16 olarak değerlendirildi.
Çalışma verilerinin istatistiksel analizi istatistiksel yazılım kullanılarak gerçekleştirildi.
İstatistikler: Kategorik değişkenler sayılar ve yüzdeler olarak ifade edildi. Pearson'ın ki-kare testi, tüm beklenen hücre sayılarının ≥5 olduğu karşılaştırmalar için kullanıldı. Fisher'ın tam testi, küçük örneklem büyüklüklerinde veya beklenen hücre sayısı <5 olduğunda yapılan analizlerde kullanıldı. Özellikle, fosfomisin direnç oranlarının genel karşılaştırmaları için ki-kare testi kullanılırken, Fisher'ın tam testi bazı kombinasyonlarda düşük frekanslı dağılımlar nedeniyle sinerjik, katkı ve antagonistik etkileşim oranlarının alt grup analizlerinde kullanıldı. P-değeri ≤ 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.
Yorum Notu: Inhibisyon bölgelerindeki küçük tek koloniler, tekrar edilen testlerde birleşmedikçe veya tekrarlanamadıkça büyüyecek sayılmamıştır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Çalışmaya toplam 60 karbapenem-dirençli E. coli izolat dahil edildi. Tüm izolasyonlar, Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanelerinin yoğun bakım ünitelerinde veya klinik servislerinde yatan hastalardan alınmıştır. Yetişkin hastalar vakaların %83,3'ünü oluştururken, pediatrik hastalar %16,7'sini oluşturuyordu (Tablo 8 ve Tablo 9). Çoklu ilaç direnci izolatların %80'inde (n = 48) gözlemlenmiştir.
Tablo 8: E. coli
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Yazarlar, çıkar çatışması olmadığını belirtir.
Teşekkürler
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu çalışma, Dicle Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi (DÜBAP) tarafından SBE.21.004 proje numarasıyla desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste