Shengdu Pingmu formülünün PI3K/AKT sinyalizasyonu ve bağırsak mikrobiyotası düzenlemesi yoluyla sıçanlarda loperamid kaynaklı kabızlık üzerindeki terapötik etkileri

Özet

Bu çalışma, Shengdu Pingmu Formülünün sıçanlarda kabızlığı hafiflettiğini göstererek dışkı suyu içeriğini ve bağırsak itişini artırdığını göstermektedir. Etkiler, PI3K/AKT yolunun aktivasyonu, AQP3 ve AQP8'in yukarı regülasyonu ve bağırsak mikrobiyotasının bileşiminin modülasyonuyla ilişkilidir.

Özet

Kabızlık yaygın bir gastrointestinal bozukluktur ve mevcut tedaviler genellikle sınırlamalara sahiptir. Geleneksel Çin Tıbbından türetilen modifiye bir formülasyon olan Shengdu Pingmu Formülü (SDPF), kabızlığı tedavi etmek için klinik olarak kullanılmıştır, ancak etki mekanizması hâlâ belirsizdir. Bu çalışma, SDPF'de 188 bileşiği belirlemek için UPLC-Q/TOF-MS analizini kullandı ve bunların 50'si kesin olarak doğrulandı. Hayvan deneylerinde, SDPF tedavisi bağırsak itkisini önemli ölçüde artırdı, dışkı suyu içeriğini artırdı ve ilk siyah dışkıya kadar süreyi kısalttı. Ağ farmakolojisi ve moleküler kenetlenme analizleri, PI3K/AKT yolunun katılımını gösterdi; bu yolun gözlemlendiği yukarı regülasyon ve rektumda AQP3 ile AQP8'in artan ekspresyonuyla doğrulandı. Ayrıca, 16S rRNA gen dizilemesi, SDPF'nin Lactobacillus ve Bacteroides gibi faydalı bakterileri yükselterek iltihaplanma ile ilişkili bakterileri azaltarak bağırsak mikrobiyotasının homeostazını yeniden sağladığını ortaya koydu. Toplu olarak, SDPF PI3K/AKT yolunu düzenleyen ve bağırsak mikrobiyotasını modüle eden mekanizmalarla kabızlığı etkili bir şekilde hafifletmektedir.

Giriş

Kabızlık, nadir bağırsak hareketleri, zorlanma ve sert dışkılarla karakterize edilen yaygın bir gastrointestinal bozukluktur ve dünya nüfusunun yaklaşık %20'sini etkiler ve önemli sosyoekonomik etkiler^{içerir 1}. Kronik kabızlık sadece hemoroid, anal çatlaklar ve dışkı sıkışması gibi fiziksel komplikasyonlara yol açmakla kalmaz, aynı zamanda anksiyete ve depresyon gibi psikolojik sıkıntıya katkıda bulunur ve hastaların yaşam kalitesini ciddi şekilde^{düşürür 2}. Osmotik müshiller ve diyet lifi takviyeleri dahil olmak üzere geleneksel tedaviler, sınırlı etkililik, potansiyel yan etkiler ve bağımlılık riski nedeniyle genellikle optimal olmayan sonuçlar verir^. Geleneksel Çin Tıbbı (TCM), bağırsak hareketliliğini düzenlemek için bitkisel formülasyonlar ve akupunktur kullanarak Qi akışını ve visseral homeostazı geri^{kazandırarak} bütüncül bir yaklaşım sunar 4. Ancak, standart protokollerin ve mekanik netliğin eksikliği, daha geniş klinik benimsenmeyi sınırlamaktadır. Gelişmekte olan araştırmalar, bağırsak mikrobiyotası modülasyonu ve biyoaktif TCM kaynaklı bileşikler gibi bağırsak fonksiyonunu sinerjik olarak en az yan etkilerle geliştirebilen yeni müdahalelerin potansiyelini^{gözler önüne sermektedir 5}. Sonuç olarak, TCM prensiplerini modern farmakoterapiyle birleştiren kanıta dayalı entegre bir terapinin geliştirilmesi, kabızlık yönetiminde devrim niteliğinde değişiklikler yaratma umudunu taşır.

Yavaş geçişli kabızlık (STC), temel araştırmalarda hayati bir patolojik modeldir ve insan kabızlığının belirgin hareketlilik bozukluğunu—önemli ölçüde gecikmiş kolon^{geçişi 6'yı} etkili bir şekilde simüle eder. Kabızlığın moleküler mekanizmalarını aydınlatmak için bir "kod çözücü" olarak hizmet veriyor; araştırmacıların rektal^{doku 7}, enterik sinir^{sistemi 8}, Cajal^9'un interstisyel hücreleri ve ana sinyal yolları^10'daki patolojik değişiklikleri doğrudan incelemelerini sağlıyor; böylece makroskobik semptomlar ile klinik çalışmaların erişemeyeceği hücresel ve moleküler anormallikler arasında köprü^{kurar 11}. Uluslararası alanda, STC fare modellerinin geliştirilmesi için yerleşik yöntemler öncelikle kimyasal olarak indüklenen^{yaklaşımları 12} içerir; özellikle loperamid (nöron aktivitesini ve asetilkolin salımını baskılayan periferik opioid reseptör agonisti olarak 5–7 gün içinde gecikmeli transiti sürekli tetiklemek) ve etyolojik taklit^{stratejileri 13} (örneğin uzun vadeli, yüksek doz uyarıcı müshil uygulaması, bu da kolonik sinir bozulmasına yol açar, melanoz coli) gibi yöntemlerdir. ve ardından müshile bağlı kolon ataleti yaşandı. Böylece, STC sıçan modeli sadece kabızlığın karmaşık etiyolojisine bir pencere sunmakla kalmaz, aynı zamanda temel mekanik içgörülerin klinik uygulamalarla bağlantısını önemli bir köprü olarak da hizmet eder.

Radix Paeoniae Alba (Baishao), Curcuma longa (Jianghuang), Rhizoma cibotii (Tanggouji), Siegsbeckia orientalis L. (Xixiancao) ve Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian) içeren Shengdu Pingmu Formülü (SDPF), Geleneksel Çin Tıbbı teorisinden türetilen modifiye bir hastane preparatıdır ve bölümümüzde uzun süredir ilgili hastalıklar için kullanılmaktadır. Hastanemizden alınan ön klinik gözlemler, SDPF'nin kabızlık belirtilerini hafifletebileceğini gösterdi (yayımlanmamış veriler). Araştırmalar, PI3K/AKT sinyal yolunun kolon hareketliliğinin¹⁴ düzenlenmesinde rol oynadığını göstermiştir; bu süreçte bağırsak mikrobiyotası ve metabolitleri, enterik sinir ve düz kas aktivitelerini modüle ederek kritik bir rol oynayabilir^. Buna rağmen, kesin düzenleyici mekanizmalar tam olarak anlaşılmamıştır. PI3K/AKT yolu ile bağırsak mikrobiyotasının birlikte kolon hareketliliğini düzenlemek için temel bir eksen oluşturduğunu öneriyoruz. TCM formülasyonlarının kolon dismotilitesi üzerindeki terapötik etkilerinin, PI3K/AKT yolunun modülasyonu ve mikrobiyota-bağırsak ekseninin yeniden dengelenmesi ile ilişkili olabileceği varsayılmaktadır. Bu çalışma, PI3K/AKT yolu ile bağırsak mikrobiyotasının kolon hareketliliği için kritik, birbirine bağımlı bir eksen olarak işlev gördüğü yeni, entegre bir hipotezi önerip test ederek bu boşluğu ele almaktadır. Bu çalışmanın birincil amacı, SDPF'nin yavaş geçişli kabızlık üzerindeki terapötik etkisinin, bu eksenin çift modülasyonu yoluyla mı sağlandığını belirlemektir. Özellikle, bir fare modeli kullanarak SDPF'nin anahtar PI3K/AKT sinyal proteinleri, bağırsak mikrobiyota bileşimindeki değişimler ve kolon hareketliliği fonksiyonu üzerindeki etkilerini inceledik. Bu birleşik mekanizmayı aydınlatarak, bildiğimiz kadarıyla bu araştırma, mikrobiyota-PI3K/AKT ekseninin TCM tabanlı müdahalenin birleşik hedefi olduğuna dair ilk deneysel kanıtı sunar ve böylece kolonik hareketlilik bozukluklarının tedavisi için daha kapsamlı bir moleküler temel sunar.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ne (Ulusal Sağlık Enstitüleri, 2011 revize edilmiştir) uygun olarak gerçekleştirildi ve Shandong Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Etik İnceleme Kurulu tarafından onaylandı (Refah Etik Lisans numarası: SDUTCM20250421238).

SDPF'nin Hazırlanması
Bitkisel karışım, Radix Paeoniae Alba (Baishao) 20 g, Curcuma longa (Jianghuang) 10 g, Rhizoma Cibotii (Tanggouji) 10 g, Siegsbeckia orientalis L. (Xixiancao) 30 g ve Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian) 30 g içerir. Bu kombinasyon oranı klinik deneyime dayanarak belirlendi. Formül, önce 30 dakika boyunca 1:9 (g/mL) katı-sıvı oranında deiyonize suda bekletilerek ve ardından 60 dakika kaynatıldı. Ortaya çıkan çözelti hemen gazlı bezden süzülür ve süpernatantı toplamak için 4.500 × g sıcaklığında 5 dakika santrifüjlenmiştir. Kalıntı daha sonra aynı koşullarda (1:9 oranı, deiyonize su) iki kez yeniden çıkarıldı ve her sonraki ekstraksiyonda kaynama süresi 30 dakika azaltıldı. Üç ekstraksiyondan elde edilen süperatanlar birleştirilip konsantre edilip 5–7 gün boyunca vakumda dondurularak SDPF tozu elde edildi; toz daha fazla kullanılmak üzere buzdolabında saklandı.

SDPF'nin bileşen analizi
Katı örnekler hazırlamak için, uygun miktarda homojenize malzeme 2 mL'lik santrifüj tüpüne aktarılır, 1 mL suda %70 metanol ve 3 mm paslanmaz çelik boncuklarla birleştirilir, ardından otomatik bir öğütücüde 3 dakika işlenilir ve ardından 10 dakika vortexleme yapılır. Sıvı örnekler saf metanol ile seyreltilip 10 dakika girdablandırıldı. Daha sonra, tüm örnekler 12.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjlendi ve ortaya çıkan süpernatantlar 0,22 μm filtreden filtrelendi. Enstrümantal analizden önce, 2-klorofenilalanin (dahili standart, 100 μg/mL) filtrata dahil edilerek nihai konsantrasyon 1 mg/L elde edildi. Kromatografik ayrım, 30 °C'de tutulan ve 0,3 mL/dakika akış hızıyla C18 kolonu (1,8 μm × 2,1 mm × 100 mm) ile donatılmış LC-MS sisteminde gerçekleştirildi. Hareketli faz, suda %0,1 formik asit (A) ve temiz asetonitril (B) içeriyordu. Enjeksiyon hacmi 2 μL olarak ayarlandı ve otosampler 4 °C'de tutuldu. Kütle spektrometrisi tespiti, hem pozitif hem de negatif iyonizasyon modlarında aşağıdaki koşullarda gerçekleştirildi: ısıtıcı sıcaklığı 325 °C, kılıf gazı 45 rastgele birimde, yardımcı gaz 15 arb, süpürme gazı 1 arb, elektrosprey voltajı 3,5 kV, kapiler sıcaklık 330 °C ve S-Lens RF seviyesi %55. Veriler, tam tarama MS modunda 120.000 çözünürlükte 100–1500 m/z aralığında elde edilirken, MS/MS parçalanması ise daha yüksek enerjili çarpışma ayrışması kullanılarak 60.000 çözünürlükte veriye bağlı toplama modunda (dd-MS², TopN=5) gerçekleştirildi.

Hayvan deneyi
Yetmiş iki erkek Sprague-Dawley sıçanı (6 haftalık, başlangıç vücut ağırlığı 180–200 g; RRID: IMSR_JAX:000664) SPF koşullarında (24 ± 1 °C, 12 saat ışık/karanlık döngü) ve ücretsiz yiyecek ve suya erişimle barındırıldı. Bir haftalık alışma sürecinden sonra, vücut ağırlığına göre rastgele altı gruba (n=12/grup) ayrıldılar: (1) boş kontrol (normal salin), (2) kabızlık model grubu (10 mg/kg loperamid hidroklorür), (3) düşük (SDPF-L)-, (4) orta (SDPF-M)- ve (5) yüksek (SDPF-H) dozlu SDPF grupları (sırasıyla 6, 9 ve 12 g/kg) ve (6) pozitif kontrol (2 mg/kg mosaprid sitrat). SDPF, damıtılmış suda 3, 4,5 ve 6 g/mL konsantrasyonlarda taze süspansiyon olarak hazırlanmış ve 2 mL/kg sabit hacimde ağızdan yapılan garajla uygulanmıştır; bu dozlar sırasıyla 6, 9 ve 12 g/kg dozlara karşılık gelmektedir. Loperamid hidroklorür, damıtılmış suda 5 mg/mL konsantrasyonda süspansiyon olarak taze hazırlanmış ve 2 mL/kg (10 mg/kg eşdeğer) sabit hacimde oral gavaj ile uygulanmıştır. Bir haftalık aklimatizasyonun ardından, kabızlık (2) – (6) gruplar halinde günde bir kez loperamid hidrokloridin ağızdan gavajı ile bir hafta boyunca indüklendi. Boş kontrol grubu ise normal salin hacmi eşdeğer miktarda aldı. Sonrasında, sonraki hafta boyunca, (3)–(5) gruplardaki fareler günde bir kez oral gazajla SDPF tedavisi gördü, pozitif kontrol grubu (6) ek olarak mosapride sitrat (2 mg/kg) aldı, gruplar (2) – (6) ise kabızlık modelini korumak için günde bir kez loperamid hidroklorürit (10 mg/kg) almaya devam etti. Boş kontrol grubu normal salin almaya devam etti. Tedavi süresinin sonunda, tüm fareler gece boyunca oruç tutulur ve suya ücretsiz erişim sağlanırdı. Hayvanlar daha sonra sodyum pentobarbital (vücut ağırlığı 40 mg/kg) intraperitoneal enjeksiyonla anestezi edildi. Pedal reflekslerinin olmaması ile doğrulanan derin anesteziden sonra, fareler servikal dislokasyon yoluyla ötenazi edildi. Hemen ardından rektal dokular hızla alındı. Histolojik ve immünohistokimyasal analizler için doku segmentleri %4 paraformaldehit ile sabitlenmiştir. Protein ifade analizi için, doku örnekleri sıvı azotta dondurulmuş ve -80 °C sıcaklıkta depolanarak daha fazla kullanıma sunulmuştur.

İlk siyah tabure
İlk siyah dışkıdan dışkı süresi, her grup için üç sıçan için kaydedilmiştir. Deneyden önce, tüm fareler 12 saat oruçta tutuldu ve suya serbest erişim sağlandı. Her hayvana daha sonra 10 mL/kg vücut ağırlığı dozda hazırlanmış bir mürekkebi süspansiyon (%5 aktif kömür ve %5 Arap sakızı) intragastrik bir uygulama verildi ve uygulama zamanı kaydedildi. Taşınmanın ardından fareler ayrı kafeslerde tek tek tutuldu ve yiyecek ve suya imkansız erişim sağlandı. Her sıçanın ilk siyah dışkısının ortaya çıkışı dikkatlice gözlemlenip kaydedilerek bağırsak geçiş süresi hesaplandı.

Dışkı suyu içeriği
Başarılı model oluşturulmasının ardından ve tedavi sonunda, her fare grubundan (n = 6) 2 saat içinde dışarı atılan taze dışkı örnekleri toplandı ve önceden tartılmış kuru EP tüplerine yerleştirildi. Dışkıların ıslak ağırlığı hemen kaydedildi. Daha sonra örnekler kurutma fırınına aktarıldı ve 60 °C'de 36 saat boyunca kurutuldu. İlk kurutma döneminden sonra örnekler tartıldı ve fırına geri getirildi; ağırlık ölçümleri her 2 saatte bir tekrarlanarak sabit ağırlık sağlanana kadar (tam dehidratasyon anlamına gelir). Dışkı su içeriği yüzdesi ise aşağıdaki formülle hesaplandı:

Dışkı suyu içeriği (%) = [(Islak ağırlık - Kuru ağırlık) / Islak ağırlık] × %100

Bağırsak itiş hızı
12 saatlik oruç döneminin (suya serbest erişimle) ardından, her gruptan (n = 6) farelere %5 aktif kömür ve %5 sakız Arap içeren intragastrik dozda (10 mL/kg) mürekkep süspansiyonu verildi. Yirmi beş dakika sonra, hayvanlar intraperitoneal %5 kloral hidrat enjeksiyonuyla anestezi edildi. Karın bölgesi, doku toplanmadan önce %75 etanol ile silinerek dezenfekte edildi ve uzuvlar bir diseksiyon tahtasına sabitlendi. Karın boşluğu cerrahi makasla dikkatlice açıldı ve pilorus'tan ileosekal birleşime kadar olan bağırsak yolu kesildi. İzole edilen bağırsak steril filtre kağıdına düzeltildi ve iki ölçüm kaydedildi: (1) ince bağırsağın toplam uzunluğu ve (2) mürekkep cephesinin kat ettiği mesafe. Bağırsak itiş oranı ise aşağıdaki formülle hesaplandı:

Bağırsak itiş hızı (%) = (Mürekkebi göç mesafesi / Toplam bağırsak uzunluğu) × %100

HE boyama
Kontrol, model, SDPF-M ve Mos grupları (n = 3 grup başında) için rektal örnekler toplandı ve hematoksilin ile eozin (HE) boyama için işlendi. Örnekler %4 paraformaldehit ile sabitlenmiş, dereceli etanolde kurutulmuş ve parafin bloklarına gömülmüştür. 4–5 μm kalınlığında ince kesitler, geleneksel hematoksilin ve eozin boyama yapılmadan önce cam slaytlara hazırlanıp yapıştırıldı. İşlem, ksilen kullanılarak deparafinizasyon ile başladı ve ardından bir dizi azalan etanol konsantrasyonu ile rehidrasyon yapıldı. Çekirdekler, kesimlerin hematoksilin ile 5–8 dakika boyunca boyanmasıyla boyandı. %1 asit alkolde farklılaşma ve %0,2 amonyak suyla mavileştirme yapıldıktan sonra, sitoplazma ve ekstrasellüler matriks 1–2 dakika boyunca eosin ile karşı boyandı. Son olarak, boyalı bölümler kurutuldu, temizlendi ve mikroskobik gözlem için kapak örtüleriyle monte edildi. Bu yaklaşım, villilerin ve kriptlerin yapısı, epitel hücrelerinin durumu ve lamina propria içindeki inflamatuar infiltratların varlığı dahil olmak üzere bağırsak mukoza morfolojisinin ayrıntılı bir şekilde değerlendirilmesini mümkün kıldı.

KEGG yolu ve GO zenginleştirme analizi
SDPF'nin önceden belirlenmiş kimyasal profilinden yararlanarak, her bileşen için protein hedeflerinin siliko tahminleri SwissTargetPrediction platformu kullanılarak gerçekleştirildi. Kabızlıkla ilgili olası hedefler, DAVID 6.8 veritabanı kullanılarak filtrelenip fonksiyonel açıklamaya tabi tutuldu ve P < 0.05 anlamlılık sınırı olarak belirlendi. Ortaya çıkan gen seti daha sonra biyolojik süreçler, moleküler fonksiyonlar ve hücresel bileşenlerdeki rollerini açıklamak için GO sınıflandırmasına tabi tutuldu. Hastalık patogenezindeki rollerini daha da aydınlatmak için, bu hedefler KEGG yollarına haritalandı ve kabızlığın başlangıcı ve gelişiminde önemli ölçüde zenginleşmiş ve potansiyel olarak rol oynayan birkaç sinyal zinciri ortaya çıkarıldı.

"Bileşen-Hedef-Yol" ağının İnşası
Cytoscape'te (sürüm 3.6.1) SDPF'nin kimyasal bileşenleri, kabızlık için karşılık gelen terapötik hedefler ve ilgili zenginleştirilmiş yollar sistematik olarak entegre edilerek "Bileşen-Hedef-Yolu" ağı oluşturuldu. Bu grafiksel model içinde, üç veri tipini temsil etmek için farklı düğüm geometrileri kullanılmıştır: bileşikler için daireler, hedefler için üçgenler ve yollar için dikdörtgenler. Bu düğümler arasındaki bağlantıların gücü, kenar ağırlıklandırma ile nicelendirildi ve karmaşık, çok katmanlı farmakolojik etkileşimlerin bütüncül bir görünümünü sağladı.

Moleküler kenetleme
Moleküler kenetlenme analizi için, dört biyoaktif bileşik — Cyclocurcumin, Albiflorin, Klorojenik asit ve Quercetin — ligand molekülleri olarak seçildi ve yapıları ilgili CAS kayıt numaraları kullanılarak PubChem veritabanından indirildi. Protein reseptörlerini hazırlamak için, hedef proteinler PI3K ve AKT doğrulanmak üzere UniProt bilgi tabanına danışıldı ve onların üç boyutlu yapıları daha sonra RCSB Protein Veri Bankası'ndan alındı. Bu protein ve bileşik yapıları daha sonra Discovery Studio 2019'da işlendi; burada hidrojen atomları eklendi, yükler atandı ve atom tipleri tanımlandı; Ayrıca, reseptörler üzerindeki potansiyel bağlanma cepleri de tespit edildi. Hazırlanan ligandlar ve reseptörler daha sonra kenetlenme simülasyonları için PDBQT formatında saklandı. Kenetlenme prosedürü şu konfigürasyonla gerçekleştirildi: 0.5 pozisyon kümesi yarıçapı, 10 rastgele ligand konformasyonu oluşturulması ve 10 iyileştirme yönelimi. Kenetlenme çalışmaları tamamlandıktan sonra, aday kompleksler tahmin edilen bağlanma serbest enerjilerine göre değerlendirildi ve sıralandı. En enerjik olarak uygun bağlanma pozları, nihai olarak seçildi ve PyMOL kullanılarak temel moleküller arası etkileşimleri göstermek için görselleştirildi.

İmmünohistokimya
Parafinle gömülü rektal örnekler, 4 μm kalınlıkta kesilerek Kontrol, Model ve SDPF-M tedavi kohortlarından alındı; önce parafin temizlendi ve kademeli olarak hidratlandırıldı. Antijenik siteler, slaytların pH 6.0'a ayarlanmış sitrat tamponunda ısıtılması ile ortaya çıkarıldı. Endojen peroksidazları söndürmek için dokular %3 hidrojen peroksit çözeltisi ile işlendi, ardından normal keçi serumuyla inkubasyon yapılarak spesifik olmayan antikor bağlanmasını azalttı. Bölümler daha sonra 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya geçirildi; birincil antikorlar fosforile PI3K ve AKT'yi hedefledi; PBS ile kuluçka yapılan paralel kesitler negatif kontrol olarak hizmet verdi. Kapsamlı yıkamadan sonra, yadağ peroksidaz ile konjuge ikincil antikorlar uygulandı ve reaksiyon süresini kontrol etmek için mikroskobik gözlem altında DAB kromojeniyle immünboyama geliştirildi. Son olarak, dokular hafifçe hematoksilin ile boyandı, derecelendirilmiş alkollerle kurutuldu, temizlendi ve monte edildi. p-PI3K ve p-AKT ifade seviyeleri, deneysel gruplara kör olan iki bağımsız araştırmacı tarafından niteliksel olarak değerlendirildi ve gruplar arasındaki farklılıkları göstermek için temsilci görüntüler seçildi.

Western blotting
Sıçanlardan alınan rektal doku örnekleri, buzda uygun bir RIPA lizis tamponu hacminde 10 dakika boyunca homojenleştirildikten sonra soğuttulan fosfat-tamponlu tuzlu suyla iki kez durulandı. Homojenizasyonun ardından karışım 15.000 × g değerinde santrifüjlendi ve üst kısım analiz için tutuldu. Protein miktarı bisinkoninik asit yöntemiyle gerçekleştirildi. Daha sonra, örnekler SDS yükleme tamponu ile birleştirildi ve 95 °C'de 5 dakika boyunca kuluçka yoluyla denatüre edildi. Eşdeğer protein miktarları daha sonra SDS-poliakrilamid jel elektroforezi ile çözülür ve 0,45 μm gözenek boyutuna sahip poliviniliden diflorür membranlarına elektrotransfere yapılır. Transferden sonra, zarlar hava kurumasına izin verildi ve ardından TBST'de 1 saat boyunca ortam sıcaklığında %5 yağsız kuru sütle bloklandı. Bu adımın ardından, zarlar TBST ile durulandırıldı ve ardından 4 °C'de gece boyunca kuluçka edildi; birincil antikorlar AQP3 (RRID: AB_2837708) ve AQP8 (RRID: AB_605941) hedeflendi. Ertesi gün, TBST ile ek yıkamalardan sonra, zarlar uygun adıran turpu peroksidaz ile konjuge ikincil antikorla oda sıcaklığında 1 saat kuluçka edildi. İmmünoreaktif bantlar nihayetinde bir görüntüleme sistemi kullanılarak tespit edilip yakalanmıştır.

İmmünoflüoresans
İmmünoflüoresans boyama işlemi, Control, Model ve SDPF-M ile tedavi edilen sıçanların rektal doku kesitlerinde şu şekilde gerçekleştirildi: kriyoseksiyondan sonra dokular %4 paraformaldehit ile sabitlendi, %0,1 Triton X-100 ile permeabilize edildi ve spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için uygun bir bloklama tamponu ile bloklandı. Bölümler daha sonra gece boyunca 4 °C'de AQP3 ve AQP8'e karşı primer antikor karışımıyla inkübe edildi; ardından bağlanmamış antikorlar yıkanarak dokular oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edildi ve özellikle keçi anti-tavşan IgG'si Alexa Fluor 594 (kırmızı) ile AQP3 etiketi için ve keçi anti-fare IgG'si Alexa Fluor 488 (yeşil) ile konjuge edildi. İkincil antikor kuluçka ve ardından yapılan yıkamaların ardından, hücre çekirdekleri DAPI ile karşı boyanmış ve slaytlar, görselleştirme ve görüntü alınmadan önce floresans veya konfokal mikroskop kullanılarak sulu bir montaj ortamıyla örtülmüştür.

16S fekal mikrobiyotanın rRNA dizilemesi
Her deneysel grup (n = 8) için, bakteriyel genomik DNA, ticari bir Toprak DNA Çıkarma Kiti kullanılarak fare dışkısından izole edildi ve tüm prosedürler tedarikçinin protokolüne sıkı sıkıya uyuldu. PCR amplifikasyonu, 16S rRNA geninin V3–V4 hiperdeğişken bölgelerini hedefleyen bir termal döngücü üzerinde 338F/806R primer çifti kullanılarak gerçekleştirildi. Amplikon dizileme işlemi Illumina MiSeq platformunda üretici yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi; böylece seyrekleşme eğrisi doygunluğu sağlanacak kadar yeterli dizileme derinliği sağlandı ve güvenilir mikrobiyal çeşitlilik analizini sağladı. Dizileme tamamlandıktan sonra, ham okumalar kalite filtreleniyor, adaptör tarafından çıkarılıyor ve Trimmomatic ile FLASH kullanılarak birleştiriliyordu. Yüksek kaliteli diziler daha sonra UPARSE kullanılarak %97 benzerlik eşiğinde operasyonel taksonomik birimlere (OTU) kümelendi ve potansiyel kimerik diziler UCHIME kullanılarak belirlenip çıkarıldı. Temsilci dizilerin taksonomik ataması, RDP sınıflayıcısı kullanılarak SILVA referans veritabanına karşı gerçekleştirildi ve güven eşiği %70 oldu. Mikrobiyal topluluklar içindeki alfa çeşitliliğini değerlendirmek için, Chao1 zenginlik tahmincisi ve Shannon çeşitlilik indeksi Mothur yazılım paketi kullanılarak hesaplandı (v.1.30.2). Beta-çeşitlilik analizi için, gruplar arasındaki bileşimsel farklılıkları görselleştirmek amacıyla ana koordinat analizi yapıldı. Farklı deneysel koşullarda benzersiz ve paylaşılan OTU'ların dağılımını göstermek için bir Venn diyagramı oluşturuldu. Kohortlar arasında farklı bol taksonların tanımlanması, lineer ayrımcı analiz etkisi boyutu kullanılarak gerçekleştirildi. Son olarak, KEGG ortholoji açıklamalarından fonksiyonel potansiyel çıkarılan PICRUSt2 kullanılarak mikrobiyal topluluk fonksiyonlarının öngörülebilir profillenmesi gerçekleştirilmiştir.

İstatistikler
Tüm istatistiksel analizler SPSS 23.0 ve GraphPad Prism 8.0 kullanılarak gerçekleştirildi. Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulur. Veri dağılımının normalliği Shapiro–Wilk testi kullanılarak değerlendirildi. İki grup arasındaki karşılaştırmalar için, bağımsız örneklemli Student's t-testi normal dağıtılmış veriler için kullanıldı, normal dağılım olmayan veriler için ise Mann–Whitney U testi kullanıldı. Üç veya daha fazla grubu içeren karşılaştırmalar için, normal dağıtılmış veriler için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey'nin post-hoc testi uygulanırken, normal dağılımsız veriler için Kruskal–Wallis testi ve ardından Dunn'un post-hoc testi kullanıldı. Mikrobiyom analizleri için, varsayılan eşik (LDA sonu 2.0) ile (LDA sonu 2.0> ile doğrusal ayırt edici analiz etkisi boyutu (LEfSe) kullanılarak farklı bol taksonlar tanımlandı ve Benjamini–Hochberg yanlış keşf oranı (FDR) yöntemiyle çoklu test düzeltmesi uygulandı. Mikrobiyom istatistiksel analizleri Mothur (v.1.30.2), LEfSe (çevrimiçi araç, Huttenhower laboratuvarı) ve PICRUSt2 (v.2.5.0) kullanılarak gerçekleştirildi. 0,05'in altında olan p-değeri istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

Sonuçlar

SDPF ekstraksiyonu ve liyofilizasyonu
SDPF, beş şifalı bitkiden oluşan çok bitkisel bir formülasyondur: Radix Paeoniae Alba (Baishao), Curcuma longa (Jianghuang), Rhizoma cibotii (Tanggouji), Siegesbeckia orientalis L. (Xixiancao) ve Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian) (Şekil 1A). Karışım, saflaştırılmış su ile ekstraksiyona alındı ve daha fazla analiz için bir toz haline getirildi (

Tartışma

Kronik kabızlık, bağırsak mikrobiyotası disbiyozu, nöromüsküler fonksiyonun bozulması ve bağırsak salgısının değişmesi arasında karmaşık etkileşimleri içeren çok faktörlü bir bozukluktur. Bu belirtiler altı aydan fazla sürer ve hastaların yaşam kalitesini önemli ölçüde^{düşürür 19}. Kabızlık, yavaş transit, normal-transit, dışkı bozukluğu ve karışık^{tipler 20} olmak üzere birkaç alt tipe ayrılabilir. Kronik kabızlığın kesin patogenezi tam olarak...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Otomatik öğütücü	Numune öğütmek için yüksek verimli doku homojenizatörü	JXFSTPRP-48
LC-MS sistemi	Thermo Fisher Scientific	Q Exactive HF LC-MS sistemi	Ultra yüksek performanslı sıvı kromatografi ve ndash; Kütle Spektrometrisi Sistemi
Kütle spektrometresi	Thermo Fisher Scientific	Q Exactive HF	Yüksek çözünürlüklü Orbitrap kütle spektrometresi
C18 kolonu	Agilent Teknolojileri	Zorbax Eclipse Plus C18 (2.1 & zaman; 100 mm, 1.8 μ m)	Bileşik ayrımı için ters faz sütunu
Görüntüleme tarama sistemi	GE Healthcare	ImageQuant LAS 4000	Jel ve leke görüntüleme sistemi
Termosikler	Uygulamalı Biyosistemler (Thermo Fisher Scientific)	GeneAmp PCR Sistemi 9700	PCR amplifikasyon cihazı
Toprak DNA Çıkarma Kiti	Omega Bio-Tek	D5625	Dışkı/toprak örneklerinden mikrobiyal DNA çıkarımı için kit