Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Akut Solunum Sıkıntısı Sendromu Modelinde Akciğer Dokusunun Tek Hücreli RNA Dizilimi

435 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70491

⸱

7 Nisan 2026

 ,  , 
1Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

Bu makalede

Özet

Bu makale, Akut Solunum Sıkıntısı Sendromu (ARDS) bir fare modelinde akciğer dokusunun tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq) analizi için standartlaştırılmış bir protokolü sunmaktadır. LPS kaynaklı model oluşturulmasından biyoinformatik analize kadar adımları detaylandırır, 21 hücre kümesi ve 6 makrofaj alt popülasyonu tanımlanır ve ARDS patogenezinde rol alan temel inflamatuar yolları vurgular.

Özet

Akut Respirator Sıkıntı Sendromu (ARDS), yüksek ölüm oranı olan şiddetli bir akciğer hastalığıdır; düzensiz bağışıklık yanıtları ve alveolar hasarla karakterize edilir, ancak hücresel heterojenliği hâlâ tam olarak anlaşılmamıştır. Tek hücreli RNA dizileme (scRNA-dizi), hücre tipine özgü mekanizmaları disseksite etmek için eşi benzeri görülmemiş çözünürlük sunar, ancak ARDS'deki uygulaması teknik değişkenlik nedeniyle zekâ çekmektedir. Burada, lipopolisakkarit (LPS) indüklenmiş bir fare ARDS modelinde akciğer dokusunun scRNA-seq analizi için standartlaştırılmış bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, optimize edilmiş doku ayrıştırma, titiz kalite kontrolü, çift parça çıkarma, toplu etki düzeltmesi ve kümeleme, notlama ve diferansiyel ifade analizi için kapsamlı biyoinformatik boru hatlarını içerir. Yaklaşımımız 21 farklı hücre popülasyonunu güvenilir şekilde tanımlıyor ve ARDS'de benzersiz transkripsiyonel imzalara sahip altı makrofaj/monosit alt popülasyonunu ortaya koymaktadır. Alt küme özgül diferansiyel gen ekspresyonu ve fonksiyonel zenginleştirme analizi, ARDS patogenezinin altında yatan anahtar genleri ve yolları daha da belirlemiştir. Bu tekrarlanabilir iş akışı, hücresel çeşitliliğin, inflamatuar yolların ve aday terapötik hedeflerin derinlemesine karakterizasyonunu sağlar ve ARDS'de mekanistik ve translasyonel çalışmalar için sağlam bir temel sağlar.

Giriş

Akut Solunum Sıkıntısı Sendromu (ARDS), yaygın akciğer iltihabı ve kardiyojenik olmayan pulmoner ödemle karakterize edilen akut bir solunum hastalığıdır ve öncelikle ilerleyici hipoksemi ve solunum yetmezliği olarak kendini gösterir 1,2. ARDS'nin patolojik mekanizmaları, düzensiz inflamatuar kaskadlar, alveolar-kapiler bariyer bozulma ve birden fazla bağışıklık hücre tipinin anormal aktivasyon ve etkileşimleriniiçerir 3,4. ARDS ilerlemesi sırasında, akciğer dokusındaki bağışıklık hücreleri, inflamatuar aracıların salgılanması ve bağışıklık yanıtlarının modülasyonu yoluyla inflamatuar zincirleme zincirleri sürer; böylece pulmoner endotelyumu bozar, dışsal pıhtılaşma kaskadının aktivasyonunu tetikler ve akciğer hasarını kötüleştirir 5,6,7. Ancak, ARDS'deki hücresel düzeyde patolojik mekanizmaların mevcut anlayışı sınırlı kalmaktadır; bu da belirli farmakolojik tedavilerin geliştirilmesini küçümsüyor; mevcut yönetim stratejileri ise esas olarak oksijen desteği ve mekanik ventilasyon yöntemlerindenoluşmaktadır. ARDS patogenezi sırasında hücresel heterojenliğin ve dinamik değişikliklerin derinlemesine karakterizasyonu, yeni terapötik hedeflerin belirlenmesi ve yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için son derece önemlidir 8,9,10.

Tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq) teknolojisinin ortaya çıkışı, RNA dizileme araştırmalarında devrim niteliğinde atılımlar getirdi ve hastalık patogenezinde hücresel heterojenlik ve fonksiyonel dinamikleri incelememizisağladı. 11,12. Geleneksel toplu RNA dizileme ile karşılaştırıldığında, scRNA-dizili teknolojisi nadir ancak kritik hücre alt popülasyonlarını tanımlayabilir, hücre-durum geçişlerinin dinamik süreçlerini ortaya çıkarabilir ve karmaşık hücrelerarası etkileşim ağlarını keşfedebilir; bu bilgiler genellikle popülasyon düzeyindeki analizlerde gizlenir 13,14,15. ARDS'de yapılan son scRNA-seq çalışmaları, spesifik monosit gen ekspresyon imzalarının tanımlanması, anormal makrofaj polarizasyon desenlerinin keşfi ve profibrotik hücreler arası iletişim ağlarının aydınlanması gibi önemli ilerlemeler eldeetmiştir 16,17,18,19 . Bu bulgular, ARDS'nin patofizyolojik mekanizmalarını anlamamızın kalmasının yanı sıra, biyobelirteç gelişimi, hastalık tabakalaşması ve hassas tedavi (20,21) hakkında yeni bilgiler de sunmaktadır.

Ancak, mevcut ARDS scRNA-seq araştırmaları, yetersiz metodolojik standartlaştırma, örnek işleme protokollerinde önemli farklılıklar ve tutarsız veri analiz boru hatları gibi zorluklarla karşı karşıyadır; bu da araştırma sonuçlarının tekrarlanabilirliğini ve klinik translasyonel uygulamalarınısınırlamaktadır 22,23. Bu protokol, ARDS akciğer dokusunun scRNA-seq analiziyle ilgili teknik zorlukları ele alır; doku işleme, kalite kontrol ve veri analizi prosedürlerini optimize eder ve böylece mekanik çalışmalar ve terapötik geliştirme için bir temel sağlar. Standartlaştırılmış yaklaşım, farklı laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirliği sağlar ve ARDS araştırmalarında hücresel heterojenlik karşılaştırmalı çalışmaları kolaylaştırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

6–7 haftalık ve 220 g ± 10 g ağırlığında, on iki özel patojensiz (SPF) erkek Sprague-Dawley (SD) faresi, Pekin Vital River Laboratuvarı Hayvan Teknolojisi Co., Ltd.'den satın alınmıştır (Hayvan Lisans Numarası: SCXK (Jing) 2025-0008). Fareler, Çin Ulusal Laboratuvar Hayvan Standartlaştırma Teknik Komitesi tarafından verilen "Laboratuvar Hayvanları-Çevre ve Konut Tesisleri Gereksinimleri" (GB 14925-2010) ulusal standardına uygun olarak Pekin Çin Tıp Üniversitesi Dongzhimen Hastanesi Laboratuvar Hayvan Merkezi'nde barındırıldı. Deneysel prosedürler, Pekin Çin Tıp Üniversitesi Dongzhimen Hastanesi Hayvan Refahı ve Etik Komitesi tarafından onaylandı (Onay Numarası: 24-54). Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Model oluşturma ve örnek toplama

NOT: Deneyden önce, tüm fareleri stres kaynaklı etkileri en aza indirmek için 1 haftalık bir uyum sürecine tabi bırakın.

  1. Escherichia coli lipopolisakkaridi (LPS) %0,9 tuzlu bir şekilde çözerek 0,4 mg/mL LPS çözeltisi elde edilir.
  2. 12 SPF erkek Sprague-Dawley (SD) faresini rastgele iki gruba ayırın: bir kontrol grubu (n = 6) ve bir ARDS model grubu (n = 6).
  3. Kontrol grubuna 0,5 mL/100g vücut ağırlığı dozda intratrakeal enjeksiyon yoluyla %0,9 salin verin.
  4. 0,4 mg/mL LPS çözeltisini aynı hacimde (0,5 mL/100g) intratrakeal enjeksiyonla ARDS model grubuna verilin ve 16 saat sonra sıçanları izofluran ile anestezi edin (kurumsal onaylı protokollere doğru).
  5. Karın aortası üzerinden kan toplayın, ardından serum elde etmek için santrifüj yapın (4 °C, 1000 × g, 30 dakika).
  6. Toraks boşluğunu açın ve akciğer dokusunu çıkarın.
  7. Bronkoalveolar lavaj işlemi için bir şırınga kullanarak bronkoalveolar lavaj işlemi yapın ve Bronkoalveolar Lavaj Sıvısı (BALF)24,25 alın.
  8. Sağ akciğer lobunu alıp PBS ile durulayın, ardından patolojik muayene için kullanın.
  9. Sol akciğer lobunu hasat edip PBS ile durulayarak sonraki tek hücreli dizileme ve moleküler biyolojideneyleri için 26,27.

2. Akciğer dokusunun histopatolojik değerlendirmesi

  1. Farelerin toplanan sağ akciğer dokusunu 12 saat boyunca fiksasyon için %4 paraformaldehite batırın.
  2. Fiksasyondan sonra, dokuyu dereceli etanol serisi (70%, 80%, 90%, 95%, %100 ve %100) ile kurutarak her konsantrasyonda 2 saat bekleniyor.
  3. Dehidratlanmış dokuyu ksilen ile işlem yapın, şeffaf hale gelene kadar.
  4. Şeffaf dokuyu erimiş parafinle 60 °C fırında 2 saat boyunca sızdırın.
  5. İnfiltrasyon yapmış doku bloğunu gömülü kalıba yerleştirin, taze parafin dökün ve soğuyup sertleşip parafin bloğuna dönüşmesini sağlayın.
  6. Parafin bloğunu mikrotom kullanarak 4 μm kalınlığında dilimlere ayırın, bölümleri 45 °C su banyosu üzerinde yaymak için yüzdürün ve ardından poli-L-lizin kaplamalı slaytlarla alın.
  7. Slaytları 60 °C fırında pişirin, böylece bölümlerin sürgülere sıkı yapışmasını sağlayın.
  8. Bölümleri ksilene daldırarak deparaffize edin ve etanol gradyanıyla (%100%, %95, %90, %80 ve %70) yeniden nemlendirin.
  9. Bölümleri PBS ile durulayın, hematoksilin ve eozin (HE) boyama işlemi yapın ve kapak kapaklarını nötr reçine ile monte edin.
  10. Nötrofil infiltrasyonu, interstisiel iltihaplanma, ödem ve tıkanıklığa dayalı standart bir puanlama sistemi kullanarak tam kaydırma taramalı kesitlerde akciğer hasarını değerlendirin.
    NOT: Her parametre patolojik katılım derecesine göre 0'dan 4'e kadar puanlandırıldı: 0 (hiçbiri); 1 (%25 ≤); 2 (26-50%); 3 (51-75%); 4 (>%75)28,29.

3. Enzimle bağlantılı immünosorbent test

NOT: Numuneler, alımdan hemen sonra analiz yapılamazsa -80 °C'de tutulabilir.

  1. Standartları çözüp 15 dakika oda sıcaklığında beklet, ardından üreticinin talimatlarına göre seri seyreltme uygulanır.
  2. Kılavuzda belirtildiği gibi biyotinile edilmiş antikor çalışma çözeltisi, enzim konjuge çalışma çözeltisi ve yıkama tamponu hazırlanır.
  3. Her örnekten 100 μL veya seri seyreltilmiş standart 100 μL antikor kaplı kuyulara ekleyin ve 37 °C'de 90 dakika kuluçka yapın.
  4. Plakayı bir plaka makinesiyle 4 kez yıkayın, 100 μL biyotinile edilmiş antikor çalışma çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
  5. Plakayı 4 kez yıkayın, 100 μL enzim konjugat çalışma çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
  6. Her kuyu başına 100 μL substrat çözeltisi ekleyin, 37 °C'de ışıktan korunan inkübe yapın ve 10 dakika boyunca inkübe yapın.
  7. Her kuyu başına 100 μL stop çözeltisi ekleyin, nazikçe karıştırın ve mikroplaka okuyucu ile 450 nm optik yoğunluğu (OD) ölçün.
  8. Tasarlanmış yazılım kullanarak OD değerlerini standart konsantrasyonlara karşı çizerek standart bir eğri oluşturun.
  9. Ölçülen OD değerleri ve standart eğri temelinde örnek konsantrasyonlarını belirleyin.

4. Dizileme için tek hücreli süspansiyonların hazırlanması

NOT: Akciğer dokusu alındıktan sonra, hücre canlılığını korumak için buz üzerine konmalı ve hızlıca işlenmesi gerekir.

  1. Akciğer dokusunu PBS ile 4 °C'ye kadar önceden soğutmuş şekilde 3 kez yıkayın.
  2. 2 mL önceden soğutulmuş PBS ekleyin ve steril makasla yaklaşık 0,5mm 3 boyutunda daha küçük parçalara doğrayın.
  3. Kıyma dokusunu PBS ile birlikte 15 mL'lik santrifüj tüpüne aktarmak için Pasteur pipeti kullanın.
  4. Kültür kabına 4 °C'ye kadar önceden soğutulmuş ek 1 mL PBS ekleyin, kalan doku parçalarını durulayın ve tekrar süspansiyon aynı tüpe aktarın.
  5. Hacmi 6,5 mL'ye ayarlayın, PBS önceden 4 °C'ye soğutultulmuş halde, doku parçalarını kollagenaz I (100 U/mL) ve Dispase II (1 U/mL) içeren enzim çözeltisinde sindirin ve oda sıcaklığında nazikçe çalkalayarak 30 dakika kuluçka yapın.
  6. Doku parçaları saydam hale geldiğinde ve belirgin katı parçalar kalmadığında, sindirilen dokuyu 70 μm ve 40 μm hücre süzgeçlerinden filtreleyin, ardından santrifüj (4°C, 500 × g, 5 dakika) ve üst süzücüyü atırlar.
  7. Pelleti hemen 3 mL kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponu içinde yeniden askıya alın, pipetle nazikçe karıştırın ve 10 dakika boyunca buzda lize yapın.
  8. Süpernatant soluk sarı veya neredeyse renksiz göründüğünde, reaksiyonu sonlandırmak için 7 mL PBS ekleyin, santrifüj yapın (4 °C, 500 × g, 5 dakika) ve süpernatantı atın.
  9. Hücreleri yeniden süspan yapmak ve tripan mavisi boyama ile hücre konsantrasyonu ile canlılığı belirlemek için 3 mL PBS ekleyin.
    NOT: Hücre canlılığı %70'in altındaysa, ölü hücre çıkarma işlemi uygulanır.
  10. Hücreleri, DPBS'de hazırlanmış %0,04 sığır serum albümini (BSA) içeren yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.
  11. Hücreleri saymak için yeniden askıya alın ve sonraki yükleme ve tespit için konsantrasyonu 1.000 hücre/μL'ye ayarlayın.

5. Tek hücreli dizileme verileri için kalite kontrolü

NOT: Tek hücreli RNA kütüphaneleri, hücre askımalarından damla tabanlı tek hücre kütüphanesi oluşturma yöntemiyle hazırlanmıştır. Kütüphaneler, DNA nanoball tabanlı dizileme kimyası kullanılarak yüksek verimli bir platformda dizilenmiştir. Kütüphane başına yaklaşık 21.000 hücre yüklendi ve hücre iyileşme oranı ~%60 olarak hedeflendi. Dizileme her kütüphane için toplamda 5,0 ×10 8 okuma üretiyor ve hücre başına ortalama derinlik 30.000-40.000 arasında değişiyordu. Ham dizileme verileri, ilgili tek hücreli RNA analiz hattı kullanılarak işlenerek her örnek için gen ifade matrisi üretildi.

  1. Oligo kütüphanesini PCR ve barkod etiketleme ile oluşturarak, konsantrasyon >10 ng/μL ve tepe boyutu 180 bp ±10 bp sağlanır.
  2. cDNA kütüphanesini parçalanma, uç onarım, adaptör ligasyonu ve PCR ile oluşturarak konsantrasyon >10 ng/μL ve tepe boyutu 350–550 bp sağlanır.
  3. R yazılımındaki (v4.2.0) Seurat paketindeki Read10X fonksiyonunu kullanarak gen ifade matriksinden her örnek için bir Seurat nesnesi oluşturun.
  4. Düşük kaliteli hücreleri, mitokondriyal gen oranı >%10 veya hemoglobin gen oranı %%>5 filtreleyerek filtreleyerek çıkarır.
  5. Verileri "LogNormalize" yöntemiyle 10.000 ölçek faktörü ile normalleştirin.
  6. "VST" yöntemiyle yüksek değişkenlikli özellikleri belirleyin ve en iyi 2.000 geni sonraki analizler için korunuyorsunuz.
  7. Seurat'ın yerleşik hücre döngüsü işaretleyici genlerini kullanarak hücre döngüsü puanlamasını gerçekleştirin ve hücre döngüsü etkilerini gerileyin (G2M. Skor ve S.Score) veri ölçeklendirme sırasında kullanılır.
  8. DoubletFinder (v2.0.3) ile potansiyel çiftleri tespit edip çıkarın; pN = 0.25, pK = 0.09 ve beklenen çift hızı 0.06 ile bu çiftleri daha fazla işlemeye dahil edin.
  9. Harmony paketi (v0.1.1) kullanılarak örnekler arasında doğru toplu etkiler theta = 2 ve max.iter.harmony = 20 ile sağlanır.
  10. Seurat nesnesindeki meta verilere bireysel örnek isimleri ve ARDS model grubu ile kontrol grubunun gruplama detayları için bilgi sütunları ekleyin.

6. Boyut küçültme, kümeleme ve hücre tipi açıklaması

  1. Seurat'taki RunPCA fonksiyonunu kullanarak yüksek değişkenlikli genler üzerinde ana bileşen analizi (PCA) gerçekleştirin.
  2. ElbowPlot görselleştirmesi ile ana bileşenin optimal sayısını belirleyin.
  3. Leiden algoritmasını Seurat'ın FindClusters fonksiyonu ve FindNeighbors fonksiyonu üzerinden 0.1 çözünürlüğe sahip Leiden algoritması uygulayarak ana hücre kümelerini belirlemek.
  4. Seçilen ana bileşenleri kullanarak UMAP boyut küçültmesi yapılacaktır.
  5. FindAllMarkers fonksiyonuyla belirteç genlerini tanımlayarak hücre tiplerini annotasyon yapın.
  6. DotPlot fonksiyonunu kullanarak hücre tipleri arasında belirteç gen ifadesini görselleştirin.
  7. Meta veriye hücre açıklama sonuçlarının yeni bir bilgi sütunu ekleyin ve Umap ile hücre tipi açıklamasını görselleştirin.
  8. Tanımlanan her hücre tipindeki her deneysel grubun oranını, hücreleri saymak ve yüzdeleri hesaplamak için dplyr fonksiyonlarıyla hesaplayın.
  9. Ggplot2 ile grup bileşimini göstermek için ggplot2 ile üst üste yığılmış çubuk grafikler oluşturun; bu da grup etiketleri ve gruplar arasındaki istatistiksel karşılaştırmalar dahil olmak üzere.

7. Alt popülasyon analizi

  1. Alt küme fonksiyonunu kullanarak hedef hücre alt popülasyonunu çıkarın ve aşağı akış alt popülasyon düzeyinde analiz için karşılık gelen bir Seurat nesnesi oluşturun.
  2. Alt popülasyon verilerini yeniden normalize edin ve mitokondriyal genler, hemoglobin genleri, UMI sayıları ve hücre döngüsü puanlarını geriye götürürken.
  3. İkincil PCA analizi yapın ve alt popülasyon için özel olarak Harmony toplu düzeltme uygulanın.
  4. FindNeighbors ve FindClusters fonksiyonlarını kullanarak hedef hücre alt popülasyonlarında farklı alt tipleri belirlemek için yeniden kümeleme gerçekleştirin.
  5. Daha önce tanımlanan aynı yaklaşımı izleyerek yeni UMAP gömütmeleri oluşturun ve alt popülasyon kümelerini hücre tipi açıklamalarla görselleştirin.

8. Diferansiyel gen ifade analizi

  1. MAST istatistiksel yöntemiyle her alt küme için ARDS model grubu ve kontrol grubu arasında farklı olarak ifade edilen genleri (DEG) belirleyin.
  2. Diferansiyel ifade testi sırasında dizileme derinlik etkilerini kontrol etmek için gizli değişken regresyonunu dahil etmek.
  3. Önceden tanımlanmış log katlama eşiklerine dayalı filtre DEG'leri ve FindMarkers fonksiyonuyla ayarlanmış p-değerleri ile filtreler.
  4. Her alt küme için ggplot fonksiyonuyla volkan grafikleri oluşturularak anlamlılık etiketlemeli farklı gen ifade desenlerini görselleştirin.
  5. DEG sonuçlarını dışa aktarın ve fonksiyonel zenginleştirme ile diğer sonraki analizleri kolaylaştırmak için kapsamlı özet tablolar oluşturun.

9. Zenginleştirme analizi

  1. Gen sembollerini organizasyon kullanarak ENTREZ ID'lerine eşleyin. Rn.eg.db yol analizi uyumluluğu için annotasyon veritabanı.
  2. Tüm alt kümelerden DEG'leri birleştirin ve log katlama değişim eşikleri ile ayarlanmış p-değerler (Wilcoxon rank-sum testi, logfc.threshold = 0.25, p_val < 0.05) temelinde önemli genleri filtreleyin.
  3. Biyolojik Süreç, Moleküler Fonksiyon, Hücresel Bileşen ontoloji kategorileri ve Benjamini-Hochberg düzeltme yöntemiyle zenginleştirme fonksiyonunu kullanarak Gen Ontolojisi (GO) zenginleştirme analizi yap.
  4. Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) yol zenginleştirme analizini kare organizma veritabanı ile zenginleştirme fonksiyonunu kullanarak ve istatistiksel anlamlılık eşiklerini uygulayın.
  5. GO ve KEGG zenginleştirme sonuçları için nokta grafikleri oluşturun; nokta grafik fonksiyonu kullanılarak, en önemli 15 zenginleştirilmiş terimi gen oranları ve ayarlanmış p-değerlerle gösterilir.
  6. Zenginleştirme sonuçlarını CSV dosyaları olarak dışa aktarın ve kapsamlı yol analizi yorumu için görselleştirme grafiklerini kaydedin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Fare akciğer dokusunun HE boyamasında kontrollerde minimum iltihaplanma ile net alveolar yapılar gösterilirken, ARDS model grubu ilgili akciğer hasar puanlarında gösterildiği gibi alveolar boşlukların çarpıklığı, duvarların kalınlaşması ve belirgin infiltrasyon gösterdiği görüldü (Şekil 1A–E). BALF ve serumda IL-6, TNF-α ve IL-1β seviyelerinin yükselmesi, başarılı modellemenin ve sistemik bir enflamatuar yanıtın olduğunu doğruladı (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS) bir fare modelinde akciğer dokusunun tek hücreli RNA dizileme analizi için standartlaştırılmış bir yaklaşım sunmaktadır. Bu sonuçlar, histopatolojik muayene, yükselen akciğer hasarı puanları ve BALF ile serumda artan inflamatuar sitokinler seviyeleriyle doğrulanan LPS kaynaklı ARDS modelinin başarılı şekilde kurulduğunu göstermektedir. Tek hücreli transkriptomik analiz, ARDS dokularında makrofajlar/monositler, nötrofiller ve dendritik h...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar, Pekin Çin Tıp Üniversitesi Dongzhimen Hastanesi Yatay Projesi'nden (HX-DZM-202114) destek almak ister.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%0,4 Trypan mavi çözeltisiGibco, ABD15250061
%4 paraformaldehitServicebio, ÇinG1101
Sığır serum albümini (BSA)Sangon Biotech, ÇinA600332-0005
Kollagenaz IYEASEN, Çin40507ES60
CurveExpertHyams Gelişimiv1.4
Dispase IIYEASEN, Çin40104ES60
Escherichia coli lipopolisakkarid (LPS) & nbsp;Sigma, ABDL6511
hematoksilin ve eozin (HE) boyamaSolarbio, ÇinG1120
Yüksek verimli gen dikenleyicisi MGI Tech Co., LtdMGISEQ-2000RS
Fosfataz inhibitörüBeyotime Biotechnology, ÇinP1081
Fosfat tamponlu çözeltiSolarbio, ÇinP1020
PMSFSolarbio, ÇinR0010
R software Lucent Technologies, ABDv4.2.0
rat IL-1β ELISA kiti4abio, ÇinCRE0006
rat IL-6 ELISA kiti4abio, ÇinCRE0005
sıçan TNF-α ELISA kiti4abio, ÇinCRE0003
Kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponuSolarbio, ÇinR1010
Kırmızı kan hücresi lizis tamponuTiangen Biotech, ÇinRT122-1
RNase-içermeyen suAmbion, ABDAM9937
TE tamponu, pH 8.0Ambion, ABDAM9858
Tris-Glisin Transfer TamponuServicebio, ÇinG2017

Kaynaklar

  1. Meyer, N. J., Gattinoni, L., Calfee, C. S. Acute respiratory distress syndrome. Lancet. 398 (10300), 622-637 (2021).
  2. Gragossian, A., Siuba, M. T. Acute respiratory distress syndrome. Emerg Med Clin North Am. 40 (3), 459-472 (2022).
  3. Bos, L. D. J., Ware, L. B. Acute respiratory distress syndrome: causes, pathophysiology, and phenotypes. Lancet. 400 (10358), 1145-1156 (2022).
  4. Huang, Q., Le, Y., Li, S., Bian, Y. Signaling pathways and potential therapeutic targets in acute respiratory distress syndrome (ARDS). Respir Res. 25 (1), 30(2024).
  5. Cutolo, M., Campitiello, R., Gotelli, E., Soldano, S. The role of M1/M2 macrophage polarization in rheumatoid arthritis synovitis. Front Immunol. 13, 867260(2022).
  6. Scozzi, D., Liao, F., Krupnick, A. S., Kreisel, D., Gelman, A. E. The role of neutrophil extracellular traps in acute lung injury. Front Immunol. 13, 953195(2022).
  7. Zheng, J., Li, Y., Kong, X., Guo, J. Exploring immune-related pathogenesis in lung injury: providing new insights into ALI/ARDS. Biomed Pharmacother. 175, 116773(2024).
  8. Qiao, Q., Liu, X., Yang, T., Cui, K., Kong, L., Yang, C., Zhang, Z. Nanomedicine for acute respiratory distress syndrome: The latest application, targeting strategy, and rational design. Acta Pharm Sin B. 11 (10), 3060-3091 (2021).
  9. Bonaventura, A., et al. Endothelial dysfunction and immunothrombosis as key pathogenic mechanisms in COVID-19. Nat Rev Immunol. 21 (5), 319-329 (2021).
  10. Yıldırım, F., Karaman, İ, Kaya, A. Current situation in ARDS in the light of recent studies: classification, epidemiology and pharmacotherapeutics. Tuberk Toraks. 69 (4), 535-546 (2021).
  11. Huminiecki, Ł Bulk and single-cell RNA sequencing elucidate the etiology of severe COVID-19. Int J Mol Sci. 25 (6), 3280(2024).
  12. Riemondy, K. A., et al. Single cell RNA sequencing identifies TGF-β as a key regenerative cue following LPS-induced lung injury. JCI Insight. 5 (8), e123637(2019).
  13. Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: a brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).
  14. Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. Int J Oral Sci. 13 (1), 36(2021).
  15. Cheng, C., Chen, W., Jin, H., Chen, X. A review of single-cell RNA-seq annotation, integration, and cell-cell communication. Cells. 12 (15), 1970(2023).
  16. Zhang, F., Wei, K., Slowikowski, K. Defining inflammatory cell states in rheumatoid arthritis joint synovial tissues by integrating single-cell transcriptomics and mass cytometry. Nat Immunol. 20 (7), 928-942 (2019).
  17. Mulder, K., Patel, A. A., Kong, W. T. Cross-tissue single-cell landscape of human monocytes and macrophages in health and disease. Immunity. 54 (8), 1883-1900.e5 (2021).
  18. Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), eaau0964(2019).
  19. Kang, Z. Y., et al. Heterogeneity of immune cells and their communications unveiled by transcriptome profiling in acute inflammatory lung injury. Front Immunol. 15, 1382449(2024).
  20. Wang, H. P., et al. Single-cell transcriptome analysis of the mouse lungs during the injury and recovery periods after lipopolysaccharide administration. Inflamm Res. 73 (12), 2087-2107 (2024).
  21. Yao, C., et al. Cell-type-specific immune dysregulation in severely ill COVID-19 patients. Cell Rep. 34 (1), 108590(2021).
  22. Cheng, C., Chen, W., Jin, H., Chen, X. A review of single-cell RNA-seq annotation, integration, and cell-cell communication. Cells. 12 (15), 1970(2023).
  23. Su, M., et al. Data analysis guidelines for single-cell RNA-seq in biomedical studies and clinical applications. Mil Med Res. 9 (1), 68(2022).
  24. Yang, Q., et al. The interaction of macrophages and CD8 T cells in bronchoalveolar lavage fluid is associated with latent tuberculosis infection. Emerg Microbes Infect. 12 (2), 2239940(2023).
  25. Zheng, L., et al. Single-cell transcriptome sequencing reveals the immune microenvironment in bronchoalveolar lavage fluid of checkpoint inhibitor-related pneumonitis. Cancer Immunol Immunother. 74 (4), 128-145 (2025).
  26. Shi, X. Y. Single-cell transcriptomic analysis of radiation-induced lung injury in rat. Biomol Biomed. 24 (5), 1331-1349 (2024).
  27. Huang, H., et al. Single-cell RNA sequencing uncovered the involvement of an endothelial subset in neutrophil recruitment in chemically induced rat pulmonary inflammation. Int J Med Sci. 19 (4), 669-680 (2022).
  28. Kosaka, J., et al. Effects of biliverdin administration on acute lung injury induced by hemorrhagic shock and resuscitation in rats. PLoS One. 8 (5), e63606(2013).
  29. Hassan, N. H., El-Wafaey, D. I. Histopathological scoring system role in evaluation of electronic cigarette's impact on respiratory pathway in albino rat: Biochemical, histo-morphometric and ultrastructural study. Tissue Cell. 79, 101945(2022).
  30. Wang, P., et al. Single-cell suspension preparation from Nile Tilapia intestine for single-cell sequencing. J Vis Exp. (192), e64321(2023).
  31. Wang, F., et al. Integrating bulk and single-cell sequencing reveals the phenotype-associated cell subpopulations in sepsis-induced acute lung injury. Front Immunol. 13, 981784(2022).
  32. Zi, S. F., et al. Endothelial cell-derived extracellular vesicles promote aberrant neutrophil trafficking and subsequent remote lung injury. Adv Sci Weinh. 11 (38), e2400647(2024).
  33. Zi, S. F., Wu, X. J., Tang, Y., Liang, Y. P. Endothelial cell-derived extracellular vesicles promote aberrant neutrophil trafficking and subsequent remote lung injury. Adv Sci Weinh. 11 (38), e2400647(2024).
  34. Hurskainen, M., et al. Single cell transcriptomic analysis of murine lung development on hyperoxia-induced damage. Nat Commun. 12 (1), 1565(2021).
  35. Zhou, X., Zhang, C., Yang, S. Macrophage-derived MMP12 promotes fibrosis through sustained damage to endothelial cells. J Hazard Mater. 461, 132733(2024).
  36. Zhao, C. Q., et al. Heterogeneity of T cells and macrophages in chlorine-induced acute lung injury in mice using single-cell RNA sequencing. Inhal Toxicol. 34 (13-14), 399-411 (2022).
  37. Liu, D., Zhang, Y., Bai, B., Xiong, X. Integration of single-cell RNA sequencing and network pharmacology to elucidate the effect of Yantiao Formula on alleviating ALI by regulating the polarization of alveolar macrophages. J Ethnopharmacol. 343, 119436(2025).
  38. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of Cibotium barometz in treating osteoarthritis. Evid Based Complement Alternat Med. 2022, 1826299(2022).
  39. Chen, G. Y., et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong Recipe in the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022, 7858925(2022).
  40. Dun, Y., et al. PTTG1 promotes CD34+CD45+ cells to repair the pulmonary vascular barrier via activating the VEGF-bFGF/PI3K/AKT/eNOS signaling pathway in rats with phosgene-induced acute lung injury. Biomed Pharmacother. 162, 114654(2023).
  41. Liu, Z., Wei, J., Sun, H., Xu, L. Plumbagin ameliorates LPS-induced acute lung injury by regulating PI3K/AKT/mTOR and Keap1-Nrf2/HO-1 signalling pathways. J Cell Mol Med. 28 (13), e18386(2024).
  42. Guo, Y., Zhang, H., Lv, Z., Du, Y. Up-regulated CD38 by daphnetin alleviates lipopolysaccharide-induced lung injury via inhibiting MAPK/NF-κB/NLRP3 pathway. Cell Commun Signal. 21 (1), 66(2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

S an ARDS ModeliDoku DisosiyasyonuKalite KontrolParti Etkisi D zeltmesiH cre K melemeDiferansiyel Gen Ekspresyonunflamatuar Yollar
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.