Yöntem makalesi

Yüksek Yoğunluklu Mikroelektrot Dizileriyle Pallidal Derin Beyin Uyarısının Ağ Genelindeki Mekanizmalarının İncelenmesi

212 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70507

⸱

16 Haziran 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Oscar Langendorff Institute of Physiology, University Medical Center Rostock, 2Institute of General Electrical Engineering, University of Rostock, 3Institute for Pharmacology, Pharmacy and Toxicology, University of Leipzig, 4Institute of Applied Microelectronics and Computer Engineering, University of Rostock

Bu makalede

Özet

Burada, distonik hamster modelinin akut serebellar beyin dilimlerinden in vivo olarak alınan yüksek yoğunluklu mikroelektrod dizisi kayıtları için bir protokolü açıklıyoruz . 11 gün boyunca sürekli pallidal derin beyin stimülasyonu.

Özet

Distoni, gönüllü hareketleri ve uzun duruşları etkileyen anormal kas kontrolleriyle karakterize edilen nörolojik bir hareket bozukluğudur. Distoni bazal ganglion disfonksiyonuyla ilişkili olsa da, artan kanıtlar beyinciklerin patofizyolojisinde rol oynadığını göstermektedir. Bu protokol, in vivo pallidal derin beyin stimülasyonu (DBS) distonik hamster modelinde (dtsz hamster) ex vivo yüksek yoğunluklu mikroelektrot dizisi (HD-MEA) kayıtlarıyla birleştirilerek serebellar aktiviteyi araştırır. Protokol (1) elektrot ve stimulatör implantasyonu için DBS ameliyatını, (2) akut serebellar dilim hazırlığını, (3) yüksek çözünürlüklü elektrofizyolojik kayıtları ve (4) veri analizini içerir. Temsil eden sonuçlar, 11 gün pallidal DBS'nin moleküler, Purkinje ve granüler katmanlarda spike aktivitesini normal seviyelere geri getirdiğini ve bu da distonide serebellar ağ etkileşimiyle uyumlu olduğunu göstermektedir. Bu protokol, beyincik aktivitesinin ve DBS tarafından modülasyonunun ayrıntılı analizini sağlar ve nöromodülasyon tedavilerinin altında yatan ağ düzeyindeki mekanizmaları incelemek için bir platform sağlar.

Giriş

Distoni, belirgin klinik belirtiler ve belirtilerle karakterize edilen üçüncü en yaygın hareket bozukluğu 1 olup, bazen diğer motor bozukluklarla karıştırılabilir 4,5,6. En belirgin klinik özellikler arasında istemsiz kas kasılmaları, tekrarlayan hareketler ve anormal ve/veya burkulmuş duruşyer alır 7. Bu özellikler, ağrı, motor performansın bozulması ve yorgunluk gibi semptomlarla birlikte olabilir; bu belirtiler stres, anksiyete veya fiziksel yorgunluk dönemlerinde kötüleşebilir 8,9,10,11. Distoninin patofizyolojisi hâlâ tam olarak anlaşılmamıştır12,13. Çalışmalar geleneksel olarak bazal ganglionlar üzerine odaklanmış olsa da, artan kanıtlar bozukluğun ağ düzeyinde bir kavramını desteklemektedir; bu kavram beyin beyin bölgelerini (beyincik 14,15,16,17) kapsamaktadır. Bu protokol, serebellar korteksin farklı katmanlarında hücre dışı ağ aktivitesini incelemeyi, distoninin patofizyolojisindeki rollerini aydınlatmayı ve derin beyin uyarışının (DBS) ağ çapındaki mekanizmalarını anlamayı amaçlamaktadır.

Globus pallidus internus (GPi) veya subthalamik çekirdeği (STN) hedefleyen derin beyin uyarımı (DBS), özellikle ilaçta dirençli olanlar olmak üzere belirli distoni 18,19 türlerini tedavi etmek için sıklıkla kullanılır. Ayrıca, tedavi sonucu heterojen ve öngörülemezdir; benzer klinik belirtilere sahip hastalar aynı terapötik yaklaşıma farklı yanıtverebilir20. Distoninin altında yatan sinir ağının daha kapsamlı bir şekilde anlaşılması, tedavi sonuçlarınıiyileştirebilir 21. Bu nedenle, hayvan modellerinde preklinik çalışmalarla sağlanabilecek büyük ölçekli ve deneysel yaklaşımlar gereklidir. In vivo DBS deneylerinin ex vivo yüksek yoğunluklu mikroelektrod dizisi (HD-MEA) kayıtlarıyla birleştirilmesi, distoninin patofizyolojisini ve DBS mekanizmalarını daha iyi anlamak için (neredeyse) fizyolojik nöron ağı aktivitesinin yüksek çözünürlüklü izlenmesini sağlar.

Bazal ganglionlar ve beyincik, en azından kısmen birincil motor korteks (M1)22 ile bağlantıları aracılığıyla motor kontrolü etkiler. Striatal lezyon ve beyincik cerrahi olarak çıkarılmasıyla yapılan anatomik çalışma bu fikridestekler 23. Çalışmamızda, distonik dtsz hamster 24,25'in hayvan modelini kullanıyoruz; bu model, distoni26 ile ilişkili serebellar anormallikler sergiliyor. Yüksek yoğunluklu mikroelektrot dizileri (HD-MEA'lar) kullanarak, distonik ve sağlıklı hamsterlerde serebellar kortikal ağ aktivitesini araştırdık. Ancak, geleneksel elektrofizyolojik yaklaşımlar katman-spesifik ağ dinamiklerini yakalamak için mekansal çözünürlüğe sahip değildir; oysa bu yöntem bu sınırlamayı ele alır. Öte yandan, globus pallidus internus'taki derin beyin uyarısının serebellar kortikal ağlar üzerindeki etkisini araştırdık.

HD-MEA sistemi, serebellar korteksin katmanları (granül, Purkinje ve moleküler katmanlar) boyunca analiz yapılmasını mümkün kılan ayrıntılı elektrofizyolojik kayıtların paralel avantajını sunar; her katman hareket dizilerinin işlenmesindeönemli bir rol oynar 27. Granül hücrelerle yoğun şekilde doldurulmuş granül tabaka, yosunlu liflerden duyusal ve motor bilgileri alır ve iletir; böylece ilk sinyal entegrasyonu ve ardından daha fazla işlemyapılması sağlanır 27. Purkinje hücrelerini içeren Purkinje tabakası, inhibitör sinyalleri derin serebellar çekirdeklere iletir; burada granüler ve moleküler katmanlar giden sinyali modüle eder. Dendritler ve internöronlarla zengin olan moleküler tabaka, Purkinje hücreleriyle sinaptik etkileşimler yoluyla karmaşık modülasyonu destekler ve motorçıkışını ince ayarlar. HD-MEA, diğer kayıt tekniklerinden farklı olarak, mekânsal çözünürlük veya örnekleme alanıyla sınırlı değildir; bu da her katmanın benzersiz katkılarının,distoni 15'te görülen değişen sinir dinamiklerinde yakalanmaya olanak tanır. Bu yaklaşım, tek elektrotlu veya düşük yoğunluklu kayıt yöntemlerine kıyasla daha yüksek mekansal çözünürlük ve paralel kayıt yetenekleri sağlar. Tamamlayıcı metal-oksit-yarıiletken (CMOS)29,30 teknolojisine dayanan HD-MEA sistemleri ve Aktif Piksel Sensörü (APS) konseptiyle birleşmiş, büyük nöron popülasyonlarının zaman içinde elektriksel aktivitesini görselleştirmek için fonksiyonel görüntüleme sağlayansistemler vardır 31,32. Bu teknikle, serebellar korteksin her katmanının dinamikleri izlenebilir ve çeşitli maddelerle yıkama yoluyla spesifik sinaptik iletim süreçleri incelenebilir. Bu yöntem, özellikle nörolojik hastalık modellerinde karmaşık nöronal ağ aktivitesi ve katman spesifik değişiklikleri inceleyen çalışmalar için uygundur.

Bu çalışma, uyarım sisteminin kapsüllenmesi ile doku hazırlığı, veri toplama ve büyük bir elektrofizyolojik veri setinin analiziyle ilgili teknik zorlukları ele almaktadır. Bu çalışmayla, son derece karmaşık nöron işleminin in vitro araştırması için bir seçenek sunuyoruz; bizim durumumuzda bu, bir yandan distonik nöron ağlarındaki patofizyolojik dinamiklerin daha farklılaşmış bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunurken, diğer yandan DBS'nin terapötik etki mekanizması hakkında bilgi sağlar.

Protokol

Distonik dtsz hamsterları kullanın ve deneyler için Suriyeli altın hamsterları kontroledin 26. Toplamda dört deneysel grup mevcut çalışmada incelendi: (1) distonik olmayan kontrol hamsterları (vahşi tip, WT), (2) yerli tedavi edilmemiş dtsz hamsterları, (3) dtsz-Sham (implantasyon geçirdi ancak aktif uyarım olmadan) ve (4) dtsz-DBS (dilim hazırlığından önce 11 gün boyunca sürekli DBS in vivo ile). Tüm hayvan deneyleri, AB Direktifi 2010/63/EU ve hayvan koruma federal yasalarına uygun olarak, 7221.3-1-029/20 lisansı altında gerçekleştirilmiştir.

1. Hayvanlar

  1. Hayvanları GVSolas 33'ün standart koşullarında, 14 saat ışık/10 saat karanlık döngüde ve serbest su ile yiyeceğe (standart diyet hamsterı, Altromin) erişim sağlanır.
  2. 20 yaşında, 1± 27 yaşında, DTSz mutant hamsterları distonik semptomlar için26 yaşında, 20 yaşında, 1 27 ± 4 gün
    NOT: Bu standart hafif stres prosedürü, hamsterın ev kafesinden çıkarılıp yeni boş bir kafese nakledilmesi, ardından intraperitoneal veya deri altı salin enjeksiyonu ve kısa süreli uyku yoksunluğu uygulanmasını içerir. Bu hafif kaygı tetikleyen uyaranlar dizisi, tekrarlanabilir gecikmeyle distonik atakları güvenilir şekilde tetikler ve bu nedenle deneysel gruplara dahil edilmeden önce fenotipik tarama için kullanılır. Distonik olmayan kontrol hamsterları, gruplar arasında benzer deneysel koşullar sağlamak için aynı prosedürü uygular.
  3. Analjezi için, dtsz-Sham ve dtsz-DBS gruplarındaki hayvanları 100 mg·kg-1 peroral (p.o.) metamizol ile tedavi edin. Her iki grubu aşağıda açıklanan cerrahi prosedüre göre implante edin.

2. STELLA uyarı sisteminin kapsüllenmesi

  1. STELLA stimülasyon sistemleri, kronik implantasyon sırasında sıvı nüfuzundan korumak için biyouyumlu bir yaklaşımla kapsüllenmiştir. Elektronik cihaz, özel olarak 3D baskılı bir PETG kapsülünde saklanıyor.
    1. Kapak ile kapsül arasında silikon ile kapatın.
    2. Ayrıca, kablo çıkışında gövdeyi silikonla mühürleyin.
    3. Kuruduktan sonra silikonda boşluklar görünürse, 1. ve 2. adımları tekrarlayın.
    4. Silikonun tam katılaşmasından sonra, epoksi reçineyi 100:35 karışım oranında (ağırlığı) hazırlayın.
    5. Vakumda reçineden hava kabarcıklarını çıkarın (Vevor RS-1.5).
    6. Kalıp montajından önce, özel silikon kalıbın eşleme yüzeyine ince bir vazelin tabakası uygulayarak epoksi kürlemeden sonra sızdırmazlığı ve demoldasyonu kolaylaştırın. Stimulatör kapsülünü silikon kalıba yerleştirin ve kalıbı yavaşça epoksi reçine ile doldurun, ta ki stimulyatör ve kablo bağlantıları tamamen kapalanana kadar. Dolgu sırasında hava kabarcıklarından kaçının.
    7. Reçine kürleştikten sonra, kapsülü kalıptan çıkarın ve keskin kenarları ortadan kaldırmak için ince bir törpü veya parlatma aracı kullanarak epoksi yüzeyi düzeltin.
    8. Kürlenmiş epoksi kapsülün üzerine kapsülü sıvı silikona batırarak son ince silikon kaplama uygulayın. Kablo etrafına bağlantı bölgesine yakın ek silikon uygulamak için plastik pipet kullanın. Fazla silikon birikimi, kaplama kalınlığını önlemek için kürlenmeden önce bir çubukla çıkarılmalıdır.
    9. Son olarak, implantasyon veya deneysel kullanım öncesinde doğru uyarı çıktısını doğrulamak için kapsülleme sonrası işlevsellik testi yapın. STELLA uyarı sistemini Ringer çözeltisine yerleştirin ve manyetik BIST fonksiyonunu aktive edin. Doğru LED yanıp sönme desenini (2 × 2) doğrulayın; bu da doğru uyarı çıkışını ve kısa devreler, açık devreler veya düşük pil koşullarının olmadığını gösterir34.

3. Bir uyarım sisteminin implantasyonu için cerrahi prosedür

  1. Cerrahi aletleri (Şekil 1) ve STELLA (yazılım tanımlı implante edilebilir modüler platform) uyarımsistemini 34 hazırla.
    1. Şekil 1'deki metal aletleri yaklaşık 5 dakika boyunca 200 °C'de sterilize edin, örneğin FST Sterilizer 250 ile. Aletleri çıkarırken sıcak olduğunu unutmayın.
    2. STELLA stimülasyon sistemini iki DBS elektroduyla %70 etanol ile dezenfekte edin. Kurutulmuş uyarım sistemini gece boyunca Ringer çözeltisiyle doldurulmuş bir Falcon (50 mL konik tüp) içine yerleştirin.
  2. Hayvanı hazırlayın (25–32 günlük yaşlarında)
    1. Anestezi odasını (kendi yapımı olan) hamster kafesine yerleştirin. Hamster kısa bir süre sonra gönüllü olarak tüpe girer (Şekil 2A).
    2. Hamster tüpte olduğunda, tüpü ucundan kapatın ve tüpü uçucu izofluran çıkışına 1-2 dakika bağlayın (%4 isofluran ile anestezi indüksiyonu) (Şekil 2B).
    3. Hayvanı silindirden nazikçe çıkarın. Hayvanı sıcaklık kontrollü cihaza yerleştirin
      yüzey (yaklaşık 38 °C) ve solunum maskesi (GM-4; %3 isofluran ile anestezi sürdürülmesi; anestezi derinliğinin interdigital refleks ile test edilmesi) ile takılır.
    4. Baştaki cerrahi bölgeyi uygun bir saç makası ile tıraş edin (Şekil 2C). Bölgeyi ıslak bir sürüntüyle temizleyin ve periostun ek lokal anestezi için deriye deri altına 500 μL %0,25 bupivakain enjekte edin. Saç derisini açmadan önce en az 5 dakika bekleyin.
    5. Hayvanı dikkatlice stereotaksik çerçeveye aktarın ve kulak barlarıyla sabitleyin, böylece bregma ve lambda aynı yükseklikte olsun (anestezi sürdürmek için izofluranı %1,5–2,5 seviyesine indirin).
    6. Gözyaş ikamesi (TVM Ocry-Gel) ile gözleri koruyun.

4. STELLA stimülasyon sistemini implante edin

  1. Saç derisinde medial olarak 2 cm uzunluğunda bir cilt kesisi yapın. Bir retraktor (Şekil 1, No. 14 ve Şekil 2D) kaplamayı çekip çıkarır. Kafatasını bıçakla yerel olarak çıkararak kaşıyarak hazırlayın. Olası kanamayı sürüntlerle durdurun.
  2. Pürgenlik için pamuk ucu aplikatörü ile %3H 22 uygulayın.
  3. Ringer'ın çözeltisinden alın uyarı sistemini alın ve DBS elektrotlarını parafilm ile koruyun.
  4. Kafada yeni yapılmış deri kesisinden kör bir makas geçirin ve boyun ile yan tarafa doğru deri altı olarak 5 cm deri cepi oluşturun.
  5. Falcon'dan çıkarılıp dermal dezenfeksiyona batırılmış uyarıcıyı yerleştirin.
  6. Cilt cebine pamuk ucu aplikatörüyle yaklaşık 500 μL antibiyotik (10 mg·g-1 fusidik asit) uygulayın.
  7. DBS elektrotları için kafatasında iki adet 7 mm delik (FST#19007-07 ile) AP: −0.6 mm ve ML: 2.2 mm bregma'ya göre ± delik açın.
  8. İki delik daha aç (9 mm; FST#19007-09) her elektrot deliğinde yanal olarak kullanılır. Hazırlanan deliklere dört vida (DIN 84 A2 M1x2) vidalın (Şekil 2D).
  9. İki DBS elektrodu (SNEX-100) ve bregmaya göre DV: 6.0 mm ölçüsünde implantasyon yapın. Lütfen lütfen belirli stereotaktik çerçevenizin elektrot tutucusunun elektrodun hangi tarafa önce yerleştirileceğini belirlediğini unutmayın (elektrotlar arasındaki mesafe 4,4 mm'dir).
  10. Elektrodu UV ışığı kürleyen bağlantı (Heliobond) ile iki vidaya sabitleyin. Her iki elektrot da yerleştirildiğinde, aralarına UV ışığı kürleyen bağ içeren son bir katman uygulanır. Son olarak, elektrotlar Compoglass Flow ile çimentolanır (Şekil 2E).
  11. DBS grubunun uyarıcısı, en az üç günlük iyileşme sonrası manyetik olarak aktive edilsin; DBS sürekli 11 gün süren DBS. Bu çalışmada, kliniklerde kullanılan uyarım parametrelerine benzer (130 Hz, 50 μA ve 60 μs) kullandık.
  12. Uyarıcının ışık desenini her gün bir mıknatısla hamsterın yanından geçirerek kontrol edin (Şekil 2F).

5. Akut serebellar dilimlerin hazırlanması

  1. Her hayvan için 1 L yapay beyinomurilik sıvısı (ACSF) ve 0,5 L sukroz hazırlayın (ayrıntılar için Tablo 1 ve Tablo 2'ye bakınız).
  2. Beyin ekstraksiyonu ve dilimleme sırasında yaklaşık 4 °C sıcaklıkta sukroz çözeltisi kullanın, sürekli karbojenasyon yapılabilir. Ayrıca, hızlı diseksiyon sırasında düşük doku sıcaklığını korumak için buz gibi soğuk sluhy sukroz hazırlayın.
  3. İş yerini diseksiyon aletleri, sukroz çözeltisi, Petri kapları ve vibratom kurulumu ile hazırlayın ( bkz. Şekil 3A).
  4. Hayvanların kurbanı, DBS sonrası yaklaşık 15 dakika içinde gerçekleşmeli ve serebellar ekstraksiyon hemen ardından başlamalıdır. Hayvanın kafasını uçucu izofluran ile derin anestezi ile kesin. Başı, buz gibi soğuk sluhy sukrozla dolu daha yüksek bir Petri kabına koyun.
  5. Beyni, omurga kanalından medial kesiklerden kaçınarak serebellar dokuyu hasardan koruyarak diseksiyona çıkarın.
  6. Beyni buz gibi çamurlu sukrozla dolu yeni bir Petri kabına aktarın, altına bir filtre kağıdı koyarak beyinciklerin kesitleme sırasında kaymasını önleyin.
  7. İlk olarak, ponsu koronal keserek bir bıçakla beyincik çıkarın (Şekil 3B). Sonra, serebellar yarımküreleri parasagital kesiklerle bir bıçakla çıkarın (Şekil 3C).
  8. Vibratom plakasını bir damla süper yapıştırıcı ile hazırlayın. Petri kabındaki serebellar vermisi dikkatlice çıkarın. Parasagital kesit düzlemesini bir filtre kağıdına süpürerek kuruduktan sonra bu tarafı yapıştırın (Şekil 3D).
  9. Vibratom plakasını tepsiye yerleştirin ve vermisi tamamen batıracak kadar sukroz (yarısı sluhy, yarı çözelti) ile doldurun. Karbogen (CB) ile benzin yapmayı unutmayın.
  10. Parasagital serebellar dilimler 200 μm kalınlığında sabit 0,08 mm·s-1 hızda kesin (Şekil 3E). Dilimleri ACSF'de oda sıcaklığında sürekli CB ile gazlanmış bir bedekte saklayın (Şekil 3F).
  11. Dilimlerin karbonatlı ACSF'de oda sıcaklığında yaklaşık 40 dakika geri kazanılmasına izin verin, ardından HD-MEA'ya aktarılır; bu da kayıt öncesi yeniden ısıtma ve stabilizasyon dönemi olarak hizmet eder. Bu süre zarfında, ACSF'yi oda sıcaklığında tutun.

6. BioCAM DupleX MEA sisteminin CorePlateTM Single-Well Kaydı için Hazırlanması

  1. Deneylere başlamadan en az 30 dakika önce BioCAM DupleX kayıt sistemini Brainwave 5 yazılımı (BW5) ile açın.
  2. Doku dilimi kaydı için CorePlateTM Single-Well'e yerleştirmeden önce, tek kuyuyu kayıt sistemine yerleştirerek arka plan gürültü seviyesini değerlendirin. Yüksek kaliteli kayıt için optimal gürültü seviyesi 9-20 μV olmalıdır.
  3. Altın kaplamalı pedleri %100 etanol ile temizleyin (Şekil 4A-1), elektrot dizisi %70 etanol ve yumuşak bir fırça ile temizleyin (Şekil 4A-2). Son olarak, elektrot dizisini MilliQ suyla durulayın.
  4. HD-MEA/CorePlateTM Single-Well cihazını kayıt sistemine bağlayın (Şekil 4D-1).
  5. Yaklaşık 2 mL ACSF pipetini kuyuya koyun. Elektrotlarda veya toprakta hava kabarcıkları olmadığından emin olun (Şekil 4D-2).
  6. Canlı alımı başlatın ve BW5 ile en az 30 saniye kaydedin.

7. Tepeden tepeye genliği analiz edin

  1. Gürültü arayüzünü analiz etmek için, elektrotların ve amplifikatör devrelerinin dirençli bileşenleri tarafından üretilen 30 saniyelik içsel gürültü kaydını içeren kayıtlı *.bxr dosyasını açın.
  2. "Etkinlik Haritası"nı seçin ve "Metrik" altında Zirveden Zirveye Genişliği seçin. Ölçek 500 μV olarak ayarlanmıştır ve elektrot dizisi boyunca sinyal değişkenliğinin görselleştirilmesini sağlar (Şekil 5A).
  3. "Etkinlik Haritası" penceresinde, fare işaretçisini kaydedilen elektrodun üzerine konumlandırarak "Kuyu Geniş Ortalama" genlik değerini gösterin.
  4. Alternatif olarak, "Graph Export" altında bir Excel dosyası (*.xlsx) oluşturarak ortalama genlik değerini belirleyebilirsiniz. Sonra o Excel dosyasını açın ve ortalama genlik değerini hesaplayın [=Ortalama(Sayı1; Number2;...)].

8. Temel gürültüyü analiz edin (sinyal standart sapması)

  1. *.brw-dosyasını oluşturmak için "Playback"a tıklayarak temel gürültüyü analiz edin. Sonra, "Aktivite Haritası"nı seçin ve "Metrik" bölümünden "Standart Sapma"yı seçin. Ölçek otomatik olarak 30 μV'a ayarlanır ve elektrot dizisi boyunca sinyal değişkenliğinin görselleştirilmesini sağlar (Şekil 5B).
  2. "Etkinlik Haritası" penceresinde, fare işaretçisini kaydedilen elektrodun üzerine getirerek "Well Wide Average" standart sapmasını gösterin.
  3. Alternatif olarak, "Chart Export" ile ortalama standart sapmayı belirleyip *.xlsx Excel dosyasını oluşturabilirsiniz. Sonra, Excel dosyasını açın ve ortalama standart sapmayı hesaplayın [=Ortalama(Sayı1; Number2;...)].

9. Sinyal kalitesinin değerlendirilmesi için:

  1. Sinyal-gürültü oranını (SNR) hesaplayın
    figure-protocol-1
    SNR ≥ 5: İyi kalite
    SNR 2 ile 5 arasında: Orta kalite
    SNR < 2: Düşük kalite

10. CorePlate tek kuyusunda veri toplama için dilim konumlandırması

  1. Bir Pasteur pipeti yardımıyla, dilimi elektrot dizisine konumlandırın, böylece ilgi duyulan bölge kayıt elektrotlarıyla kaplanır (Şekil 4 B-1). Çözeltiyi kuyudan çıkarın (Şekil 4 B-2). Dik bir mikroskopla fotoğraf çekin.
  2. Dokuyu dilim çapasıyla sabitleyin (Şekil 4C).
  3. 3 mL Pasteur pipeti kullanarak dilime bir damla ACSF ekleyin.
  4. Sıvıyı daha küçük hacimli bir Pasteur pipeti ile çıkarın. Kalan sıvıyı bükülmüş bir kağıtla çıkarın (bunu 7-10 kez tekrarlayın) (Şekil 4C-2).
  5. Kayıt sırasında perfüzyon için ACSF'yi oda sıcaklığında kullanın ve hızı 2 mL·min-1'e ayarlayın. Giriş pozisyonu doku diliminin üzerindedir ve çıkış kuyu duvarındadır (Şekil 4D).
  6. Perfüzyon kaynaklı gürültüyü en aza indirmek için giriş ve çıkışın ek topraklanması önerilir; bu, kayıt sistemine bir tel aracılığıyla bağlanarak sağlanabilir (Şekil 4D-1).
  7. Rahatsızlıkları azaltmak için mikroskobu ve odanın ışıklarını kapatın.

11. CorePlateTM Single-Well ile ağ faaliyetinin kayıtları

  1. Kayıt parametrelerini 100 Hz'de yüksek geçirimli filtre ile örnekleme frekansı 20.000 Hz'e ayarlayın.
    1. BrainWave 5 Yazılımında Dosya bölümüne gidip yeni bir kayıt oturumu açın.
    2. "Kaynak"a tıklayın.
    3. Aç: çip pilotu ve aşağıdaki ayarlamalar için seçin:
      Örnekleme hızında spontan sinirsel aktivite kaydedilir: 20.000 Hz/elektrot.
      Donanım yüksek geçirimli filtre kesimi: 100 Hz.
      Işık telafisi Oranı: kısa (doğrudan ışık uyarımı).
  2. Çip kalibrasyon kanalını ve ham iz türünü seçmek için.
    1. Aç: Sinyal kontrol et ve seç: Dahili çip kalibrasyonunda, çıkış kanalını seç: 1.1.
    2. "+" ve "Charting" seçeneklerine tıklayın.
    3. Aç: Grafik ayarı.
    4. Ham izleri seçin: ham ve spikes.

12. Mikroskop görüntüsünü etkinlik haritasına yerleştirin ve hizalayın

  1. "+" üzerine tıklayın.
  2. BW5'teki faaliyet haritasına mikroskop resmini eklemek için "Üstleme ve Açıklamalar":
  3. Kuyu katmanlarına geçin:
    1. Katmanları yönet ve serebellar resmi seçin.
    2. Seçilmiş görüntü katmanını hizala: start'a tıklayın.
    3. Sayısal diziyi takip eden resmin dört köşesine tıklayın ve uygulayın.

13. Kayıt öncesi veri sıkıştırma kurulumu

  1. Veriyi sıkıştırmak için RECORDER'ın ilk sayfasına gidin:
    1. Kokpit modu: gelişmiş
    2. Ham sıkıştırılmış: dalgalet sıkıştırması + olaylar: spike'ları kaydet.
    3. Kayda başlamadan önce 10 dakika çal.
  2. Kayıtları bitirdikten sonra altın kaplamalı pedleri %100 etanol ile temizleyin. Sonra kuyunu saf suyla doldurun ve 30 saniye fırçalayın.
  3. Sonrasında kuyuyu %70 etanol ile doldurun ve elektrot diziyi yaklaşık 30 saniye boyunca nazikçe fırçalayın. Son olarak, kuyuyu saf suyla doldurun ve 30 saniye boyunca nazikçe fırçalayın (bu adımı 2-3 kez tekrarlayın).
  4. CorePlateTM Single-Well'i uygun kapta kuru tutun.

14. Kaydedilen verilerin çevrimdışı analizi

  1. İstediğin dosyayı BW5 ile açın.
  2. Serebellar korteksi anatomik katman atamasına göre elektrotlar seçerek üç gruba bölünür (moleküler katman, Purkinje hücre tabakası, granül hücre tabakası).
    NOT: Katman başına ilgi duyulan bölgelerdeki elektrot sayısı (ROI) her katmanda tespit edilen spontan aktiviteye bağlıydı ve bu nedenle kayıtlar arasında değişiklik gösterdi. Genellikle, tek bir dilimden her yatırım getirisi başına 25-250 elektrot analiz edilirdi. İki anatomik katmanı kapsayan bölgelerde bulunan elektrotlar, katman atamasında belirsizlik önlemek için hariç tutuldu. Yalnızca belirli bir serebellar tabakaya açıkça atfedilen elektrotlar daha ileri değerlendirme için dahil edilmiştir.
    1. Seçim ve gruplama: Birim gruplarına geçin.
    2. Birim gruplarını yönet bölümünde, "+" tuşuna tıklayarak bir grup oluşturun ve adını verin.
    3. Gruba daha fazla elektrot eklemek için elektrotları seçin ve "seçilmiş üniteleri ekle veya çıkar" seçeneğine tıklayın.
  3. Hassas zamanlama spike tespiti (PTSD) olarak bilinen spike tespit yöntemiyle ham izleri analiz edin. Bu yöntem, tepeden tepeye genliklerin önceden tanımlanmış eşiği aştığı göreceli maksimumlar ve minimumları tespit etmeye odaklanır; böylece hassas ve doğru bir spike tanımlanmasını sağlar.
    1. Veri işleme: Spike algılama'ya gidin ve modu gelişmiş olarak ayarlayın.
    2. Verileri kullanın: Raw.
    3. Algoritma: PTSD (Hassas zamanlama spike tespiti).
    4. Standart sapma faktörü: 8.0.
    5. En yüksek ömür süresi: 2.0 ms.
    6. Refrakter dönemi: 1.0 ms.
    7. Spike atama: negatif zirve.
    8. Zirve öncesi dalga süresi: 1.0 ms.
    9. Zirve sonrası dalga süresi: 1,5 ms.
  4. Spike sıralamasına git ve modu gelişmiş olarak ayarla. Aşağıdaki parametreyi ayarlayın:
    1. Zirve öncesi dalga süresi: 0.5 ms.
    2. Zirve sonrası dalga alınan süre: 1.0 ms.
    3. Özellik çıkarma algoritması: Legendre anları.
    4. Özellikler sayısı: 3.
    5. Kümeleme algoritması: K-Means & Silhouette.
    6. Küme başına minimum spike sayısı: 20.
    7. Maksimum küme sayısı: 3.
    8. Taslak eşiği: 2.
  5. Verileri Excel'e aktarıyorum.
    1. "Charting" üzerine tıklayın.
    2. Chart Export sayfasına gidin.
    3. Elektronik tabloyu seçin ve dışa aktarın.

Sonuçlar

Pallidal DBS, gruplar arasında kortikal katmanlarda sivri çıkma sayısını normal seviyelere çıkardı.

Serebellar korteksin üç katmanındaki toplam sivri sayısını—moleküler tabaka (ML), Purkinje hücre tabakası (PL) ve granüler hücre tabakası (GL)—dört deneysel grup boyunca analiz ettik: vahşi tip (WT, N = 8), dtsz (N = 8), dtsz-Sham (N = 7) ve dtsz-DBS (N = 7), analizler bu hayvanlardan alınan dilimler üzerinde gerçekleştirildi.

Distonik doku (dtsz) önemli ölçüde daha az spike üretirken, pallidal DBS sırgalanma sayısını sağlıklı kontrol seviyelerine kadar artırdı (Tablo 3). Kruskal-Wallis H testi bunu daha da doğruladı ve dtsz DBS grubunda ML'deki spike sayısında hem dtsz hem de dt sz-Sham gruplarına kıyasla istatistiksel olarak anlamlı bir artış gösterdi (χ2(3) = 20.728, p = 0.001; Şekil 6A). dtsz-DBS grubu da PL'de benzer bir artış gösterdi (χ2(3) = 16.855, p = 0.001; Şekil 6B) ve GL (χ2(3) = 13.164, s. = 0.004; Şekil 6C), WT grubuna benzer değerlere ulaşır (Tablo 3).

figure-results-1
Şekil 1. Cerrahi aletlerin genel bakışı. Görüntü, derin elektrotlar ve uyarıcıların implantasyonu için özel olarak tasarlanmış cerrahi ve mikrocerrahi aletlerin bulunduğu düzenlenmiş bir tepsiyi gösteriyor. Aletler, kullanım sırasına göre düzenlenir ve prosedürel verimliliği artırır. İşlem sırasında temizliği korumak ve kolay erişilebilirlik sağlamak için doku üzerine yerleştirilir. Bu düzenleme, hassas cerrahi iş akışlarına hassasiyet, sterillik ve hazırlık üzerine odaklanır. (1) Makas küt/küt, (2) Dikiş makasi, (3) Makas, keskin/keskin, (4) İğne tutucu, (5) Dikiş bağlama forseps, (6) Splend forseps/kavisli, (7) Dişli forseps, (8) Standart kısa, (9) Standart forseps, (10) Mikro spatula, (11) Tekrar kullanılan elektrot, (12) Vidalar, (13) Matkap aksesuarları, (14) Retraktor ucu/kelepçe, (15) Cam boşluğu bloğu %0,9 NaCl ve ksilokain ile doldurulacaktır. Daha fazla bilgi için materyal listesine göz atın. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2. DBS elektrotlarının ve stimulatörün implantasyonu için stereotaksik cihazda hayvanın anestezi edilmesi ve konumlandırılması için deneysel kurulum. (A) Hayvan, anestezi başlatmak için özel hazırlanmış bir indüksiyon odasına nazikçe yerleştirilir. (B) Indüksiyon odası, düzgün anestezi uygulanmasını sağlamak için solunum maskesine bağlıdır (%4 oranında izofluran ile indüksiyon) ve kullanım sırasında güvenliği korur. (C) Anestezi edildikten sonra, hayvan hipotermiyi önlemek ve tıraş sırasında sürekli anestezi sağlamak için bağlı bir solunum maskesi ile ısıtma plakasına (%3 oranında izofluran ile bakım sağlanır) geçirilir. (D) Hayvan dikkatlice stereotaksik çerçeveye yerleştirilir. Boylamasına bir kesi yapılır ve cildi geri çekmek için kelepçeler kullanılır. Dört nokta vida yerleşimini gösterir. İşaretlenen alanlara vidalar yerleştirilir ve elektrot yerleştirme için iki ek nokta işaretlenir. (E) Elektrot, stereotaksik tutucu çıkarılmadan önce GPi'ye yerleştirilir ve yapıştırıcı ile sabitlenir. Daha iyi fiksasyon için elektrotların etrafına çimento uygulanır. Kesintili uzununa dikişler cerrahi bölgeyi kapatmak için kullanılır ve (F) uyarıcının hayvanın deri altı yan bölgesine yerleştirilir. Hayvan ameliyattan sonra hayatta kalır ve ok uyarıcının yerini gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3. Beyin kesitleme ve dilimleme örneği. (A) diseksiyon prosedürü için cerrahi aletler. (1*) Ev yapımı Agar Petri kabı, (2*) Agar Petri kabı, (3*) Karbogen tüpünü sabitleyen kelepçe, (4*) Kağıt filtre, (5*) Bıçak, (6*) Süper yapıştırıcı, (7*) Vibratom plaka/tutucu, (8*) Kavisli forseps, (9*) Makas, Keskin/Küt. (B) Beyin örneği hazırlama: diseksiyondan sonra beyin kesilir ve kesik çizgiler koronal düzlem kesiminin yönelimini gösterir. (C) Parasagital kesim: beyin belirtilen parasagital düzlem boyunca kesilir. (D) Doku fiksasyonu: Ortaya çıkan beyin dokusu, hassas kesitleme için yapıştırıcı ile bir plaka/tutucuya yapıştırılır. (E) Vibratom kesitleme: Bağlı doku içeren plaka, ultra ince dilimler (200 μm) elde edilen vibratoma aktarılır. (F) Son dilimler: Hassas parasagital serebellar dilimler üretilir ve elektrofizyolojik kayıtiçin hazır hale getirilir 35. Daha fazla bilgi için materyal listesine göz atın. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4. İyi bir hücre aktivitesi elde etmek için adımların örneği. (A) Temizlik: Bu adım, HD-MEA'nın yüzeyini temizleyerek ve bağlantı (Temas paneli, A-1) veya kayıt sürecine (düz alan, A-2) hiçbir kirin engel olmaması için hazırlanmasını içerir. (B) Dilim pozisyonu: Doku dilimi HD-MEA (B-1) üzerinde dikkatlice yerleştirilir, böylece elektrot teması (B-2) için doğru hizalanma sağlanır. Pipetin ince bir ucu (ok) kalan ACSF'yi çıkarmak için kullanılır ve çapa yerleştirilir. (C) Dilimin bağlanması: dilim, çapa kullanılarak HD-MEA üzerinde güvenli şekilde konumlandırılır. Bu adımda, bir damla ACSF koymak ve ardından fazla sıvıyı pipet (C-1; ok) ve bükülmüş hassas bir silme kağıdı (C-2) ile dikkatlice çıkarmak çok önemlidir. Bu, dilimin stabil ve elektrotlara iyi bağlı kalmasını sağlar ve doğru kayıt için kullanılır. (D) Perfüzyon: Son olarak, deney sırasında doku diliminin canlılığını korumak için bir perfüzyon sistemi bağlanır ve başlatılır; burada giriş dilimin üstünde, çıkış ise duvara (D-2) yakın olmalıdır. Ayrıca, kayıt sırasında gürültüyü en aza indirmek için yerden tüm kabarcıkların çıkarılması da gereklidir (ok işaretiyle belirtilir). Hem giriş hem çıkış borusuna (D-1) ek topraklama bağlanır. Kırmızı ölçekli çubuklar 1,5 mm uzunluğundadır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5. Sinyal kalitesini değerlendirmek için Brain Wave 5 yazılımı (BW5) kullanılarak HD-MEA kayıtlarında genlik ve standart sapma metrikleri. (A) Içsel elektrot genlik değerlerini çıkarmak için seçilen Zirveden Zirveye Genlik metriği (ölçek: 500 μV). (B) Elektrotlar arasında temel gürültüyü niceltmek için seçilen Standart Sapma metri (ölçek: 30 μV). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Pallidal DBS'nin serebellar kortikal katmanlar boyunca sivri aktivite üzerindeki etkileri: (A) moleküler tabaka (ML), (B) Purkinje hücre tabakası (PL) ve (C) granül tabaka (GL). Box-Whisker grafikleri, ortalama ve medyanı sırasıyla çapraz ve yatay çizgi ile 25. ve 75. perdeliklerle birlikte gösterir. İlgili gruplar wild type (WT, n = 22 dilim),dt sz ameliyatsız (n = 20 dilim), dtsz DBS inaktif (Sham, n = 20 dilim) ve dt sz-DBS aktif (n = 20 dilim) olur. İstatistiksel anlamlılık Kruskal-Wallis testi kullanılarak belirlendi, ardından Dunn'ın çift karşılaştırmaları (*p .< 0.05). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

İsimMoleküler ağırlık [g/mol]Son konsantrasyon [mol/ l]
NaCl58.440.124
KCl74.550.003
Glikoz180.160.01
CaCl2 (susuz)110.980.0025
NaHCO384,0070.026
NaH2PO4119.980.00125
pH7.35'ten 7.40'a (HCl ile ayarlanabilir)
Osmolalite [mosmol/ kg]290 ile 300

Tablo 1: Yapay beyin-omurilik sıvısı (ACSF) çözümü: Serebellar dilim deneyleri için ACSF hazırlamak için kullanılan bileşenlerin bileşimi ve son azı dişleri konsantrasyonları. pH HCl ile 7.35–7.40 arasında ayarlandı ve osmolalite 290–300 mOsm·kg-1 arasında tutuldu.

İsimMoleküler ağırlık [g/mol]Son konsantrasyon [mol/L]
Saccharose342.300.075
KCl74.550.0025
NaCl58.440.087
CaCl2 (susuz)110.980.0005
MgCl295.210.007
Glikoz180.160.01
NaHCO384.010.025
NaH2PO4119.980.00125
pH7.35'ten 7.40'a (HCl ile ayarlanabilir)
Osmolalite [mosmol/ kg]320'den 330'a

Tablo 2: Sukroz çözeltisi. Serebellar dilim hazırlığı sırasında kullanılan sakaroz çözeltisinin bileşimi ve son azı dişleri konsantrasyonları. pH 7.35–7.40 arasında ayarlandı ve osmolalite 320–330 mOsm·kg-1 arasında tutuldu.

Gruplar:WTdtsz dtsz-Shamdtsz-DBS
n22202020
Varyans katsayısı
ML0.530.550.60.35
PL0.570.570.520.46
GL0.480.660.610.51
Sivri sayı
ML287240±32605163434±19998234209±31284345915±27113
PL413223±50171194277±24786304568±35692412707±42509
GL390817±40139211274±31193325533±44318373208±42220

Tablo 3: Serebellar katmanlar ve deneysel gruplar arasında spike metriklerinin özeti. WT – vahşi tipli, distonik olmayan kontrol hamsterları; DTSz - yerli DTSz hamsterları; dtsz-DBS - dtsz hamsterlar 11 gün boyunca sürekli uyarılmaktadır; dtsz-Sham - aktif DBS olmayan ameliyat yapılan hamsterlardt sz; ML – moleküler katman; PL – Purkinje hücre tabakası; GL. – granül hücre tabakası.

Tartışma

dtsz hamster'daki patofizyolojik distonik nöronal ağda derin beyin uyarısı (DBS) mekanizmalarını incelemek için metodolojik bir yaklaşım tanımladık. Kritik adımlar arasında hassas elektrot implantasyonu, hızlı serebellar dilim hazırlığı ve güvenilir veri toplama için stabil HD-MEA kayıt koşulları yer alır. Ameliyat prosedürü, serebellar dilimlerin hazırlanması, kayıt ve analiz tekniklerini göstererek ex vivo serebellar aktivite ve DBS tarafından modülasyonunu inceledik. HD-MEA kullanılarak yapılan elektrofizyolojik ölçümler, yüksek zamansal ve mekansalçözünürlüklü 36 çözünürlüğe sahip serebellar spontan aktivitenin gerçek zamanlı kayıtlarını sağladı; bu kayıtları, distoninin tedavisinde pallidal derin beyin uyarısının mekanizmalarını araştırmak için gerekli gördüğümüzdür.

Distoni şu anda bazal ganglionlar, serebellar ve kortikal devreler arasındaki işlevsiz etkileşimlerden kaynaklanan anormal motor çıkışla karakterize edilen bir ağbozukluğu olarak bilinir 37,38. Serebellar anormalliklerin hem klinik hem de deneysel çalışmalarla desteklendiği gibi distonide önemli bir rol oynadığıgösterilmiştir 15,22,39. Ayrıca, Cebus maymunlarının serebellar korteksine retrograd kuduz virüsü (RV) enjekte edilmesini içeren bir anatomik çalışma, bazal gangliyonların subtalamik çekirdeğinin serebellarkortekse 40 önemli bir projeksiyona sahip olduğunu göstermektedir. Bu bulgular, DBS40,41,42'nin terapötik mekanizmalarını incelerken, bazal ganglion ağlarıyla birlikte serebellar devrelerin araştırılmasının önemini vurgulamaktadır. Bu yöntem, özellikle hareket bozukluklarında nöronal etkileşimler ve nöromodülasyon etkilerini araştıran çalışmalar için uygundur.

Pallidal DBS'nin ağ genelinde mekanizmalarıyla ilgili olarak, çalışmalar globus pallidus'un (GPi) iç segmentinin DBS'sinin sadece bazal ganglionlar içinde değil, aynı zamanda kortiko-striatal ağ43, talamus44 ve beyincik15 gibi birbirine bağlı bölgelerde de yaygın beyin aktivitesinde değişiklikler yarattığını göstermiştir. Bu gözlemler, pallidal DBS'nin bazal gangliya-serebellar ağ boyunca aktiviteyi modüle edebildiği ve distonide terapötik etkinliğine katkıda bulunduğu hipotezini desteklemektedir. Bu, DBS mekanizmalarını araştırmak için preklinik çalışmalara ihtiyaç olduğunu ve HD-MEA kayıtlarının ağ çapında elektrofizyolojik değişiklikleri yakalamadaki avantajlarını göstermektedir. Ayrıca, Kotyra ve ark. (2025) tarafından yapılan çalışma, distonik motor ağı45 içinde uzun vadeli GPi-DBS tarafından indüklenen uzun süreli nöroplastik yeniden şekillendirmenin varlığını desteklemektedir. In vivo bulgular, pallidal uyarılmanın dtsz hamsterlarında distoninin şiddetini kademeli olarak azalttığını ve uyarılmayı bıraktıktan sonra da faydalı etkinin devam ettiğini gösterdi; bu da DBS kaynaklı etkilerin sadece akut uyarımla sınırlı olmadığınıgösterdi 45. Ayrıca, son elektrofizyolojik çalışmalar, uzun süreli DBS sonrası sinaptik plastisitede ve spike desenlerinde ağ çapında modülasyonu göstermiştir; bunlar arasında serebellar aktivite15'in artması, motor talamik nöronlara artan uyarıcı girdi ve kortikal M146'ya daha kümelenmiş uyarıcı girdi dahildir.

Temsil eden sonuçlar, distonik hamsterlerde serebellar korteksin moleküler, Purkinje hücresi ve granül hücre katmanlarında spike aktivitesinin normalleşmesiyle kanıtlandığı derin beyin stimülasyonunun (DBS) ağ çapında bir etkisini göstermektedir (Şekil 6). dtsz DBS grubunda gözlemlenen artan spike aktivitesi, vahşi tip kontrollerle karşılaştırılabilir seviyelere ulaştı. Bu spike aktivitesinin normalleşmesi, distoninin tedavisinde DBS'nin terapötik potansiyelini destekler. Özellikle, dtsz-Sham grubu, tüm serebellar katmanlarda WT grubuna kıyasla ara spike değerleri göstermiştir; bu da elektrot implantasyonunun tek başına serebellar ağ aktivitesini etkileyebileceğini göstermektedir. Bu yorum, elektrot implantasyonunun kendisinin uyarılma başlamadan önce semptomları geçici olarak iyileştirebileceği distonide klinik olarak tanımlanan mikrolezyon etkisiyleuyumludur. dtsz hamster, paroksismal genelize distoninin temel özelliklerini yeniden üretse de, insan distoni sendromlarında gözlemlenen klinik heterojenliği tam olarak yansıtmaz. Bu nedenle, bu bulgular insan distonisine aktarılırken dikkatli olunmalıdır.

Bu çalışma, stimulatör kapsülasyonu, DBS cerrahisi, dilim hazırlama ve büyük ölçekli elektrofizyolojik veri analiziyle ilgili teknik zorlukları ele almaktadır. CMOS tabanlı HD-MEA teknolojisinin birleşimi, son derece karmaşık nöron etkileşimlerinin in vitro araştırması için sağlam bir platformsağlar 48. Sonuçlarımız, distoninin altında yatan patofizyolojik dinamiklerin daha incelikli bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunmakta ve DBS tedavisinin ağ düzeyindeki mekanizmalarına dair değerli bilgiler sunmaktadır. Belirli beyin bölgelerinin ve etkileşimlerinin ayrıntılı fonksiyonel analizini kolaylaştırmak, distonik nöronal ağlardaki patofizyolojik dinamiklerin daha farklılaşmış bir şekilde anlaşılmasına katkı sağlar ve öte yandan DBS'nin terapötik etki mekanizmasına dair içgörü sağlar.

Bu çalışmada, teknik sorunlar arka plan gürültüsünün artmasına ve HD-MEA kayıtları sırasında kararlı sinyal alımını bozmasına yol açtı. Yaygın sorun giderme adımları arasında gürültü kaynaklarını ele almak, doğru topraklama sağlamak ve sağlam doku-elektrot teması yer alır. Yüksek gürültü seviyeleri veya dengesiz ölçümler durumunda, önce topraklama, kablo bağlantıları ve yakındaki elektrik cihazları kontrol edilmelidir. Elektrot dizisindeki hava kabarcıkları da doku-elektrot temasını ve kayıt kararlılığını bozabilir ve dikkatlice çıkarılmalıdır (Şekil 4). Ayrıca, amplifikatordan bilgisayara yüksek kaliteli bir USB-C-USB-C kablosu aracılığıyla istikrarlı veri iletimi sağlanmalıdır. Sürekli gürültülü elektrotlar daha fazla analizden çıkarılmalıdır. HD-MEA ile hücre dışı sinyallerin kaydedilmesi, ağ aktivitesinin yüksek mekansal çözünürlüğünü sağlar ve mikroskobik görüntüyle birlikte serebellar korteksin bireysel katmanlarına atama, tespit edilen hücre dışı aktivitenin atanan tabakadan başka bir aksondan çapraz aksonlarla üretildiği göz ardı edilemez. Ayrıca, her dilim standart deneysel koşullarda bağımsız bir elektrofizyolojik kaydı temsil ettiği için, bazı dilimler aynı hayvandan gelmiş olsa da, istatistiksel analizler dilim düzeyinde gerçekleştirilmiştir.

DBS sırasında, elektrodların gevşemesi veya uyarıcıda teknik bir arıza nedeniyle ek sorunlar ortaya çıkabilir. Bu sorunları en aza indirmek için, elektrot sabitlemesinin doğru olmasını sağlayın ve işlem boyunca steril kullanım koşullarını koruyun. Bu, mevcut çalışmadaki tüm çalışmaların %5'inde gerçekleşti. Elektrot gevşemesini en aza indirmek için, elektrot yapıştırıcı veya diş çimentosu ile sabitlenmeden önce kafatası yüzeyi kurutulmalıdır; böylece yapışma daha iyi olur ve kaymayı önler. Sterilliği sağlamak ve mekanik kontaminasyonu önlemek için, stimulyatör, elektrot ucu ve monofilament ipliği yalnızca forseps veya hemostaz forsepsiyle ele alınmalıdır. Ayrıca, enfeksiyon riskini en aza indirmek için eldivenler etanol ile dezenfekte edilmeli ve hayvanla ilgilenmeden önce kurutulmalıdır. Serebellar beyin dilimlerinin hızlı hazırlanması, yüksek kaliteli elektrofizyolojik kayıtlar için gereklidir. Ancak bu, implante edilen DBS elektrotlarının konumunun sonradan doğrulanamaması anlamına geliyordu. Farklı uyarı parametrelerinin dt sz-Hamster'da distoni şiddeti üzerindeki etkisini inceleyen başka bir çalışmada, aynı uyarım elektrotları ve cerrahi teknikler kullanıldı. Burada,37 denemenin %94'ünde doğru elektrot konumunu doğrulayabildik.

Sonuç olarak, bu protokol DBS'nin elektrofizyolojik mekanizmalarını incelemek için güçlü bir platform sağlar ve etki mekanizması hakkında değerli bilgiler kazandırır. dtsz hamsterı, distonik fenotip üzerindeki pallidal DBS etkilerinin preklinik çalışmalarını ve nöron ağı aktivitesinin ex vivo yüksek çözünürlüklü kaydını benzersiz şekilde mümkün kılar. Sonuçlarımız serebellar diston kavramını desteklemekte ve nöromodülasyon tedavilerini anlamak ve optimize etmekte ağ düzeyinde analizin önemini vurgulamaktadır.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Alman Araştırma Vakfı (DFG) tarafından İşbirlikçi Araştırma Merkezi (SFB 1270/1,2 ELAINE 299150580) kapsamında desteklenmektedir.

Malzemeler

```html
Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3% H2O2Caelo15301730
50 ml conical tubeGreiner Bio-OneFalcon-type conical tube
Agar Petri dishHandmade 
Anaesthesia UnitBioMedical InstrumentsUniventor 1200
BioCam DupleX3BrainBioCAM DupleXCMOS-HD-MEA platform
Blade (5*)Apollo Herkenrath09-025-056
Brainwave Software 53BrainVersion 5CMOS-HD-MEA platform
Breathing maskNarishigeGM-4
Bulk Fill Flowable: Compula RefillDentsply Sirona267-0195For cement
Capsule Dispenser Gun Dentsply Sirona296-0003For cement
CarbogenAir LiquideAir Liqiuide (House system)
Cavity Block GlassAIMAIM40 mm x 40 mm
Clamp (3*)DIEFFENBACH12-1003-04stainless steel 4cm
ComputerDellPrecission 3431
CorePlateTM 1W 38/603BrainAccura HD-MEACMOS-HD-MEA chip
Drill accessory (13)FST19007-07Tip: 7mm
Drill accessory (13)FST19007-09Tip: 9mm
Eco wipes - wipe dispenserDr Schumacher00-915SE001 (1x1) 
Eco wipes - wipe rollsDr Schumacher00-915SE001 (6x1)
ELASTOSILWackerRT 601 A/B
ElectrodeMicroprobesSNEX-100
EthanolCarl Roth GmbH + Co. KGArt-Nr. T913.3
Excavator (10)HLW Dental-Instruments GermanyS-10.28-6
Forceps (5)FST18025-10Stainless Steel 10cm
Forceps (6)AesculapBD311R9cm
Forceps (7)FST91100-12Stainless Steel 12cm
Forceps (8)FST11231-20Stainless Steel 11cm
Forceps (8*) Karl Hammacher9.160 160Wironit 10,5cm
Forceps (9)FST11200-33Dumoxel 13,5cm
Forceps (9)FST11200-33Dumoxel 13,5cm
Heated surgical table+integrated gas exhaustBioMedical InstrumentsBioMedical Instruments
heliobondIvoclar Vivadent42040
Ice MachineScotsmanAF 80 AS / WS
Inflow and outflow needlesBD Microlance 1,25 x70mm
Isathal 10mg/gDechraZul.-Nr. 400216.00.00Fucidin
IsofluraneSedana medicalN001254
Mili-Q Water FilterElgaPURELAB flex 3
Needle Holder (4)FST12501-13Tungsten Carbide 13cm
OcteniseptSchülke & MayrAntiseptic solution 
Paper Filter (4*)Carl Roth GmbH + Co. KGAP75.1
ParafilmSigma AldrichHS234526C
Platinum anchor3Brain3Brain
Retractor Tip (14)FST18200-102.5mm
Reused Electrode (11)MicroprobesSNEX-100For Coordinates
RingerB. Braun3570030
Scissor (1)FST14078-10Stainless Steel 10cm
Scissor (2)AesculapBC144R
Scissor (3)FST14058-09Stainless Steel 9cm
Scissor (9*)FST91401-12Stainless Steel 12cm
Screw (12)Online-Schrauben.deDIN 84 A2 M 1x2
ShaverExactaGT415
STELLA (software defined implantable modular platform) stimulation systemnon-commercial; developement of the University of Rostockopen source (https://github.com/SFB-ELAINE/STELLA)battery-driven DBS stimulator
Sterelizer 250FST18000-45
StereotaxicNarishigeModel SR-AR
Super glueUHU64212
Tear cream (Panthenol Nose Cream)Jenapharm5541249
Vibratome LaicaVT12005
Xylocain Gel 2%Aspen Pharma1138060
Weigh BoatCarl Roth GmbH + Co. KGHYT9.1
WeigherVoltcraftTS-5000/1
Compounds used for solutions preparation
Calcium chloride (CaCl2)Sigma-Aldrich10043-52-4
D-Glucose(C6H12O6)Sigma-Aldrich50-99-7
Magnesium Chloride (MgCl2)Sigma-Aldrich7786-30-3
Potassium Chloride(KCl)Sigma-Aldrich7447-40-7
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)Sigma-Aldrich144-55-8
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-Aldrich7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)Sigma-Aldrich7558-80-7
SucroseSigma-Aldrich57-50-1
```

Kaynaklar

  1. Beylergil, S. B., et al. Tremor in cervical dystonia. Dystonia. , (2024).
  2. Stephen, C. D., et al. Dystonias: Clinical recognition and the role of additional diagnostic testing. Semin Neurol. , (2023).
  3. Fung, V. S. C., Jinnah, H. A., Bhatia, K., Vidailhet, M. Assessment of the patient with isolated or combined dystonia: An update on dystonia syndromes. Mov Disord. , (2013).
  4. Klepitskaya, O., Neuwelt, A. J., Nguyen, T., Leehey, M. Primary dystonia misinterpreted as Parkinson disease. Neurol Clin Pract. , (2013).
  5. Drivenes, B., et al. A child with myoclonus-dystonia (DYT11) misdiagnosed as atypical opsoclonus myoclonus syndrome. Eur J Paediatr Neurol. , (2015).
  6. Valeriani, D., Simonyan, K. A. Microstructural neural network biomarker for dystonia diagnosis identified by a DystoniaNet deep learning platform. Proc Natl Acad Sci U S A, , (2020).
  7. Albanese, A., et al. Definition and classification of dystonia. Mov Disord. , (2025).
  8. Balint, B., et al. Dystonia. Nat Rev Dis Primers. , (2018).
  9. Bohne, P., et al. Cerebellar α1D-adrenergic receptors mediate stress-induced dystonia in totteringtg/tg mice. Cell Mol Life Sci. , (2025).
  10. Gwinn-Hardy, K. A., et al. Effect of hormone variations and other factors on symptom severity in women with dystonia. Mayo Clin Proc, , (2000).
  11. Kim, J. E., et al. Cerebellar 5HT-2A receptor mediates stress-induced onset of dystonia. Sci Adv. , (2021).
  12. Vitek, J. L. Pathophysiology of dystonia: A neuronal model. Mov Disord. , (2002).
  13. Rissardo, J. P., et al. Neurobiology of dystonia: Review of genetics, animal models, and neuroimaging. Brain Sci. , (2025).
  14. Bologna, M., Berardelli, A. The cerebellum and dystonia. Handb Clin Neurol. , (2018).
  15. Kragelund, F. S., et al. Network-wide effects of pallidal deep brain stimulation normalised abnormal cerebellar cortical activity in the dystonic animal model. Neurobiol Dis. , (2025).
  16. Löscher, W., Hörstermann, D. Abnormalities in amino acid neurotransmitters in discrete brain regions of genetically dystonic hamsters. J Neurochem. , (1992).
  17. Lüttig, A., et al. Short-term stimulations of the entopeduncular nucleus induce cerebellar changes of c-Fos expression in an animal model of paroxysmal dystonia. Brain Res. , (2024).
  18. Yousef, O., et al. Subthalamic nucleus versus globus pallidus internus deep brain stimulation in the treatment of dystonia: A systematic review and meta-analysis of safety and efficacy. J Clin Neurosci. , (2025).
  19. Lin, S., et al. Globus pallidus internus versus subthalamic nucleus deep brain stimulation for isolated dystonia: A 3-year follow-up. Eur J Neurol. , (2023).
  20. Liker, M. A., et al. Stereotactic awake basal ganglia electrophysiological recording and stimulation (SABERS): A novel staged procedure for personalized targeting of deep brain stimulation in pediatric movement and neuropsychiatric disorders. J Child Neurol. , (2024).
  21. Hock, A. N., et al. A randomised double-blind controlled study of deep brain stimulation for dystonia in STN or GPi: A long-term follow-up after up to 15 years. Parkinsonism Relat Disord. , (2022).
  22. Shakkottai, V. G., et al. Current opinions and areas of consensus on the role of the cerebellum in dystonia. Cerebellum. , (2017).
  23. Neychev, V. K., et al. The basal ganglia and cerebellum interact in the expression of dystonic movement. Brain. , (2008).
  24. Fredow, G., Löscher, W. Effects of pharmacological manipulation of GABAergic neurotransmission in a new mutant hamster model of paroxysmal dystonia. Eur J Pharmacol. , (1991).
  25. Löscher, W., et al. The sz mutant hamster: A genetic model of epilepsy or of paroxysmal dystonia? Mov Disord. , (1989).
  26. Richter, A., Löscher, W. Pathophysiology of idiopathic dystonia: Findings from genetic animal models. Prog Neurobiol. , (1998).
  27. Hull, C., Regehr, W. G. The cerebellar cortex. Annu Rev Neurosci. , (2022).
  28. van der Heijden, M. E., Sillitoe, R. V. Interactions between Purkinje cells and granule cells coordinate the development of functional cerebellar circuits. Neuroscience. , (2021).
  29. Emery, B. A., et al. High-resolution CMOS-based biosensor for assessing hippocampal circuit dynamics in experience-dependent plasticity. Biosens Bioelectron. , (2023).
  30. Viswam, V., et al. Impedance spectroscopy and electrophysiological imaging of cells with a high-density CMOS microelectrode array system. IEEE Trans Biomed Circuits Syst. , (2018).
  31. Imfeld, K., et al. Large-scale, high-resolution data acquisition system for extracellular recording of electrophysiological activity. IEEE Trans Biomed Eng. , (2008).
  32. Berdondini, L., et al. Extracellular recordings from locally dense microelectrode arrays coupled to dissociated cortical cultures. J Neurosci Methods. , (2009).
  33. Busch, M., et al. Species-appropriate housing of laboratory rats. , GV-SOLAS Committee for Laboratory Animal Husbandry. (2019).
  34. Plocksties, F., et al. The software defined implantable modular platform (STELLA) for preclinical deep brain stimulation research in rodents. J Neural Eng. , (2021).
  35. Kragelund, F. S. Illustration of brain sectioning and slicing. , BioRender. (2026).
  36. Schröter, M., et al. Advances in large-scale electrophysiology with high-density microelectrode arrays. Lab Chip. , (2025).
  37. Paap, M., et al. Deep brain stimulation by optimized stimulators in a phenotypic model of dystonia: Effects of different frequencies. Neurobiol Dis. , (2021).
  38. Takada, M., et al. Two separate neuronal populations of the rat subthalamic nucleus project to the basal ganglia and pedunculopontine tegmental region. Brain Res. , (1988).
  39. Filip, P., Lungu, O. V., Bareš, M. Dystonia and the cerebellum: A new field of interest in movement disorders? Clin Neurophysiol. , (2013).
  40. Bostan, A. C., Strick, P. L. The basal ganglia and the cerebellum: Nodes in an integrated network. Nat Rev Neurosci. , (2018).
  41. Bostan, A. C., Dum, R. P., Strick, P. L. The basal ganglia communicate with the cerebellum. Proc Natl Acad Sci U S A, , (2010).
  42. Middleton, F. A., Strick, P. L. Basal ganglia and cerebellar loops: Motor and cognitive circuits. Brain Res Rev. , (2000).
  43. Heerdegen, M., et al. Mechanisms of pallidal deep brain stimulation: Alteration of cortico-striatal synaptic communication in a dystonia animal model. Neurobiol Dis. , (2021).
  44. Pralong, E., et al. Effect of deep brain stimulation of GPI on neuronal activity of the thalamic nucleus ventralis oralis in a dystonic patient. Neurophysiol Clin. , (2003).
  45. Kotyra, M., et al. Effects of longer-term pallidal stimulation on the severity of dystonia in a phenotypic animal model. Exp Neurol. , (2026).
  46. Franz, D., et al. Network-wide modulation of synaptic plasticity and spike patterns in motor circuits after pallidal deep brain stimulation in a dystonia model. Neurobiol Dis. , (2025).
  47. Cersosimo, M. G., et al. Micro lesion effect of the globus pallidus internus and outcome with deep brain stimulation in patients with Parkinson disease and dystonia. Mov Disord. , (2009).
  48. Blotter, M. L., et al. High-quality seizure-like activity from acute brain slices using a complementary metal-oxide-semiconductor high-density microelectrode array system. J Vis Exp. (211), e67065(2024).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Distoni ModeliSerebellar AktiviteElektrofizyolojik Kay tlarBazal GanglionlarSerebellar ADBS CerrahisiPurkinje H creleriN romod lasyon Tedavileri
Video yakında

İlgili makaleler