Yöntem makalesi

Konak-bakteri etkileşimlerini incelemek için invazin veya bazal zar ekstraktı üzerine iki boyutlu organoid kültürü

1.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70512

⸱

13 Mart 2026

 ,  ,  ,  , 
1Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research: Hubrecht Institute, 2Oncode Institute, 3Royal Netherlands Academy of Arts and Science (KNAW), 4University Medical Center Utrecht

Bu makalede

Özet

Çalışma, doku kök hücresinden türetilen bağırsak organoidleri kullanılarak bakteriyel enfeksiyonun in vitro incelenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Protokol, organoidlerin iki boyutta nasıl kültürleneceğini ve farklılaştırılacağını, onları yapışkan-invaziv Escherichia coli ile enfekte edeceğini ve epitel bariyer sızıntısı, enfeksiyon görüntüleme ve epitel RNA yanıtı gibi önemli okumaları nasıl değerlendireceğini açıklar.

Özet

Organoid teknolojisi, sağlık ve hastalık alanında insan fizyolojisini incelemek için deneysel bir in vitro platform sağlar. Kanserden kaynaklanan hücre hatları veya explant gibi diğer in vitro sistemlerle karşılaştırıldığında, doku kök hücresinden (TSC) türetilen organoidler önemli avantajlar sunar: genomik kararlılığı korurken sonsuza kadar genişletilebilir ve CRISPR modifikasyonuna uygundurlar. Bu organoidler normal TSC'lerden üretildiği için, köken dokularının hücre tiplerini içerirler. Bu durum, organoidleri bakterilerle farklılaşmış, tümü olmayan insan hücreleri arasındaki etkileşimleri araştırmak için özellikle değerli kılar. Bağırsak organoidleri, hücre kültürü eklerinde iki boyutlu polarize monotabakalar olarak yetiştirilir; bu ekin hayvansız ve maliyetli bir alternatif, Basement Membrane Extract (BME) ile kaplanmış ve patojenik yapışkan-invaziv E. coli enfeksiyonu için ana bağırsak epitel hücre tiplerine ayrılabilir. Önemli enfeksiyon okumaları arasında epitel gen ifadesinin Ters Transkripsiyon (RT-qPCR) ile izlenmesi, konfokal mikroskopiyle bakteri-epitel etkileşimlerinin görselleştirilmesi ve epitel bariyerinin kırılmasının nicelendirilmesi yer alır. Protokol, diğer organları ve bakteri türlerini incelemek için kolayca uyarlanabilir ve organoidlerde konak-mikrop etkileşimlerini incelemek için çok yönlü bir platform sağlar.

Giriş

Bağırsak epiteli, bağırsak lümeninde bulunan patojenik bakterilere karşı ilk savunma hattını oluşturur. Bağırsak epitelinin in vitro modelleri, bakterilerin epitel hücreleriyle nasıl etkileşime girdiğini, bu hücrelerin enfeksiyona nasıl yanıt verdiğini ve bakterilerin epitel bariyerini nasıl aştığını incelemek için yaygın olarakkullanılmıştır 1. Bu modeller, kontrollü ve indirgemeci bir ortamda insan spesifik patojenleri incelemek için özellikle değerlidir. Tarihsel olarak, in vitro enfeksiyon biyolojisi, örneğin Caco-2 hücreleri gibi tümör köklü hücre hatlarına veya hasta kaynaklı explantlara (ex vivo 2,3) dayanmıştır. Daha yakın zamanda, insan dokusu kök hücrelerinden üretilen bağırsak organoidleri, her iki yaklaşımın avantajlarını birleştiren güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır: hücre hatları gibi, organoidler geçiş yapılabilir, genişletilebilir, kriyokorunabilir, çözülebilir ve genetik olarak manipüle edilebilir; ve eksplantlar gibi, tüm ana epitel hücre tiplerine ayrılabilen tümör olmayan kökhücrelerden türemiştir 4,5.

Matrigel veya Basement Membrane Extract (BME) gibi bir matrisin içine gömülü olduğunda, insan bağırsak organoidleri genellikle apikal yüzeyi içe, bazal yüzeyi dışa bakan küresel ve polarize yapılara dönüşür. Çoğu bağırsak patojeni epitel hücrelerine apikal taraftan eriştiği için, bu yüzeyi organoidlerdeki bakterilere maruz bırakmak için çeşitli stratejilergeliştirilmiştir 4. Bir yaklaşım, bakterileri doğrudan organoidlümen'e mikro-enjekte etmektir 6. Bir diğeri ise organoidlerin polaritesini tersine çevirmek, onları ekstrasellüler matriksinden serbest bırakarak askı7'de "apikal çıkış" organoidler üretmektir. Üçüncü bir strateji ise, organoidleri tek hücrelere ayırmak ve onları hücre kültürü insertlerine tohumlayarak polarize, iki boyutlu monokatmanlar (2D organoid tabakalar) oluşturmaktır; apikal taraf üstbölme 8'e bakacaktır. İlk iki yöntemin önemli sınırlamaları vardır: mikroenjeksiyon zaman alıcı ve emek yoğun olup, veri verimliliğini sınırlar; apikal çıkış organoidleri matris desteği olmadan sadece birkaç gün hayatta kalır ve ayırt edilemez1. Buna karşılık, 2D organoid tabakalar yüksek verimli deneyleri destekler (bakteriler üst bölmeye kolayca eklenebilir) ve birkaç hafta boyunca büyük bağırsak epitel hücretiplerine ayrılırken tutulabilir. 9.

Plastik yüzeylere kolayca bağlanan ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarının aksine, organoid türevli hücreler verimli yapışma için plaka kaplamaya ihtiyaç duyar. Kaplama, seyreltilmiş BME10 kullanılarak veya alternatif olarak organoid hücrelerde integrinleri bağlayan bakteriyel protein olan invasin kullanılarakyapılabilir. Invasin, laboratuvarda üretilmesi kolaydır, BME veya Matrigel'den çok daha maliyet etkindir ve tamamen hayvansız değildir.

Bu protokol, bağırsak organoidlerinin, invasin veya Bazal Zar Ekstraktı (BME) ile kaplanmış hücre kültürü insertlerinde iki boyutlu polarize monotabakalar olarak oluşturulmasını ve farklılaşmasını tanımlar. Farklılaşmış organoid tabakalar, daha sonra iltihap bağırsak hastalığı ile ilişkili patojenik bir suş olan Adherent-invaziv Escherichia coli (AIEC) ile enfekteedilir 12. Epitel yanıtları ve bakteriyel translokasyonları değerlendirmek için birden fazla aşağı akım enfeksiyon okuması hazırlanır. AIEC'nin epitel hücrelerini istila edip bağırsak epitelini sızdırdığı düşünüldüğünde — bu mekanizmanın patojenizetine katkıda bulunduğu düşünülür — epitel sızıntısı, bariyer bütünlüğünün transepitel/transendotel elektriksel direnç (TEER) ölçümüyle doğrulandıktan sonra hücre kültürünün bazolateral odasına ulaşan bakterilerin ölçülmesiyle ölçülür.. Ayrıca, enfekte monotabakaların sabitlenmesi ve görüntülemesi ile intra- ve ekstrahücresel AIEC'yi görselleştirmek ve enfeksiyona epitel transkripsiyonel yanıtlarını değerlendirmek için RNA ekstraksiyonu için prosedürler sağlanmaktadır. Tam protokol iki haftadan kısa sürede gerçekleştirilebilir ve yalnızca yaygın olarak kullanılabilir laboratuvar ekipmanları gerektirir; bunlar arasında BSL-2 kabinası, konfokal mikroskop ve nicel PCR cihazı bulunur.

Genel olarak, bu protokol, insan bağırsak epitelinin in vitro farklılaşmış bağırsak epitelinin bakteriyel enfeksiyonunu incelemek için maliyet verimli, çok yönlü ve erişilebilir bir yöntem sunmaktadır. Diğer organoid sistemlere ve diğer mikrobiyal türlere kolayca uyarlanabilir, bu da in vitro enfeksiyon biyolojisi çalışmaları için faydalı bir plan oluşturur.

Protokol

İnsan bağırsak organoidleri, Utrecht Üniversitesi Tıp Merkezi (UMCU)'da kolorektal kanser ameliyatı geçiren hastaların atık maddelerinden üretilmiştir. Hastalar, organoidlerinin üretimi için yerel biyobankacılık etik komitesi tarafından onaylanan UPORT Kanser Biyobankası 21-042 protokolüne uygun olarak bilgilendirilmiş onay sağladı. Şekil 1A , protokolün 8 bölümünü göstermektedir. Reaktif ve ekipman detayları Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Hücre kültürü insertinin kaplaması

  1. İnvazinle kaplama
    1. Tüm işlemleri steril koşullarda doku kültürü kapüşpüsünün içinde yapın.
    2. Steril fosfat-tamponlu salin (PBS) içinde 5 μg/mL invasin çözeltisi hazırlayın.
    3. Bu çözeltinin 100 μL'sini, 24 kuyruklu bir plakaya yerleştirilen her 3 μm gözenekli polyester hücre kültürü insertinin üst bölmesine ekleyin.
    4. Zarın tamamen kaplı olduğundan emin olun.
    5. 4 °C'de gece boyunca kuluçka yapın.
      NOT: Dağıtım sırasında baloncuklar oluşmaktan kaçının, çünkü kabarcıklar eşit kaplamayı engeller.
  2. Bazal Membran Ekstraktı ile kaplama (Alternatif)
    1. Buz üzerinde Eritme Taban Membranı Ekstraktı.
    2. Buz gibi soğuk DMEM'de %10 bir çözelti hazırlayın.
      NOT: Erken polimerleşmeyi önlemek için çözeltiyi soğuk tutun.
    3. Her 3 μm gözenek hücresi kültürü insertinin üst bölmesine 100 μL seyreltilmiş çözelti ekleyin.
    4. Zar yüzeyinin tam kapsamını garanti edin.
    5. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın.

2. Organoid hücrelerin tohumlanması

  1. Organoid hazırlama
    1. Genişleme koşullarında (bölünmeden 3-5 gün sonra) korunan organoid plakalardan kültür ortamı alın.
    2. Organoidleri 1 mL buz gibi soğukDMEM 14'te yeniden süspansiyona alın.
    3. Süspansiyon, 4 mL buz gibi soğuk DMEM içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
      NOT: 12 kuyruklu bir plakadan yaklaşık 1 tam kuyuyu kullanarak 4 hücre kültürü ekini tohumlayın.
  2. Pelletleme organoidleri
    1. 500 × g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika santrifüj yapın.
    2. Üst maddeyi tamamen çıkarın.
  3. Dissosiyasyon organoidler
    1. Pelleti 3 mL rekombinant tripsin ikametiyle yeniden süzülür.
    2. P1000 pipetiyle organoidleri mekanik olarak bozmak için pipetleri yukarı aşağı indirin.
    3. 37 °C'de 15-20 dakika boyunca kuluçka yapın, ta ki tek hücreler veya küçük kümeler (3-4 hücre) elde edilene kadar.
      NOT: 20 dakikalık kuluçka süresini aşmayın. Dissosiyasyonu kolaylaştırmak için her 5 dakikada bir pipet yapın. Daha fazla mekanik güç gerekirse P1000 ucunun içine bir P10 ucu yerleştirin.
  4. Yıkama hücreleri
    1. 5 mL buz gibi soğuk DMEM ekleyin.
    2. 500 × g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika santrifüj yapın.
    3. Üst yüzeyi çıkarın.
  5. Hücre Askıya Hazırlanın
    1. Hücreleri Genişleme ortamında yeniden askıya alın (hücre kültürü inserti başına 100 μL; Genişleme ortamının bileşimi için Tablo 1'e bakınız).
      NOT: Antibiyotik eklemeyin. Anoikisleri önlemek için Rho kinaz inhibitörü ekleyin.
    2. Hücreleri sayaç veya hemositometre kullanarak sayın.
    3. Yaklaşık 2 × 106 hücre/mL'ye ayarlayın.
  6. Hücre kültürü eklerinin tohumlanması
    1. Kaplama çözeltisini eklemelerden çıkarın.
    2. Üst bölmeye 100 μL hücre süspansiyonu (2 × 105 hücre) ekleyin.
    3. Alt bölmeye 500 μL genleşme ortamı ekleyin.

3. Hücre kültürü insert kültürü ve farklılaştırma

  1. 37 °C'de, %5CO2 ile kuluçka yapın, birleşim noktasına ulaşana kadar (yaklaşık 3 gün).
    NOT: Gerekirse her iki bölmede de 4-5 günde bir ortamı yenileyin.
  2. Birleştiğinde, her iki bölmeyi önceden ısıtılmış DMEM ile yıkayın.
  3. Alt bölmeye 500 μL Farklılaştırma ortamı (Tablo 2) ekleyin.
  4. Üst bölmeye 100 μL Advanced DMEM/F12, HEPES ve Glutamax (AdvDMEM++) eklenerek (Tablo 3) ekleyin.
  5. 37 °C'de %5CO2 ile 5 gün kuluçka yapın.
  6. Her iki bölmedeki medyayı her 2 günde bir değiştirin.

4. Transepitelyel/transendotel elektriksel direncin ölçülmesi (TEER)

  1. TEER elektrotlarını %70 etanolde 15 dakika sterilize edin.
  2. Elektrotları steril PBS ile durulayın.
  3. Kısa elektrodu üst bölmeye, uzun elektrotu ise alt bölmeye yerleştirin.
    NOT: Elektrot ucu ile monokatmana dokunmayın.
  4. Direnç değerlerini kaydedin.
  5. Boş direnci PBS içeren hücresiz bir insert ile ölçün (100 μL üst, 500 μL aşağı).
  6. TEER hesaplayın: TEER = (R_cell kültür eklemesi − R_blank) × yüzey alanı (cm²)
    NOT: 24 kuyu girişleri için yüzey alanı = 0,33 cm².

5. AIEC enfeksiyonu

  1. Bakteriyel Kültür Hazırlayın
    1. 3 mL LB ortamda floresan AIECaşılayın 15.
    2. Gece boyunca 37 °C'de sallanma ile kuluçka yapın.
      DIKKAT: Tüm bakteriyel işlemleri BSL-2 kapüşonunda yapın.
  2. Aşı Hazırlayın
    1. 500 μL kültüründe 5 dakika boyunca 1500 × g ile kültürlenin.
    2. 1 mL AdvDMEM++ ile yeniden askıya alın.
    3. Optik yoğunluğu (OD) ölçün.
    4. AdvDMEM++'da yaklaşık 1 × 10⁸ CFU/mL olarak seyreltilin.
      NOT: OD = 1, yaklaşık 1 × 10⁹ CFU/mL ile karşılık gelir.
  3. Monolayerların enfekte edilmesi
    1. Her iki bölmedeki medyayı değiştirin.
    2. Alt bölmeye 500 μL Farklılaştırma ortamı ekleyin.
    3. Enfekte durum için üst bölmeye 100 μL bakteriyel süspansiyon eklenin.
    4. Enfekte olmayan durum için üst bölmeye 100 μL AdvDMEM++ ekleyin.
    5. 37 °C, %5 CO₂ sıcaklıkta kuluçka yapın.

6. Epitel sızmasının değerlendirilmesi

  1. Enfeksiyondan 2,5 saat sonra alt bölmeden 100 μL toplayın.
  2. PBS'de seyreldin ve LB agar'da plak yapın.
  3. Alt bölmeye 100 μL taze Farklılaştırma ortamı ekleyin.
  4. Plakaları gece boyunca 37 °C'de kuluçka edin.
  5. Enfeksiyondan 5 saat sonra tekrar örnekleme alın.
  6. Ertesi gün Kont Koloni Oluşturma Birimi (CFU) ile görev aldı.
  7. Hücre kültürü inserti başına CFU'ları hesaplayın: CFUs/hücre kültürü inserti = koloni × 5 × seyreltme faktörü

7. İmaj Enfeksiyonu

  1. Enfeksiyondan 5 saat sonra maddeyi çıkarın ve %4 paraformaldehit ile sabitleyin.
    DIKKAT: Paraformaldehit toksik ve uçucudur. Eldiven takarak bir duman başlığının içinde tutun.
  2. 30 dakika için düzeltin.
  3. PBS ile üç kez yıkayın.
  4. Zar sektini çıkarın ve hücreleri yukarıya bakarak bir kuyu plakasına yerleştirin.
  5. 1-2 saat floresan falloidin ile boya.
  6. PBS ile üç kez yıkayın.
  7. Çekirdekleri DAPI ile 10 dakika boyayım.
  8. PBS ile üç kez yıkayın.
  9. Cam bir sürgüye montaj malzemesi ile monte edin ve bir örtü kaydırın.
  10. Oje ile mühürle.
  11. DAPI, aktin ve bakteri kanallarının konfokal görüntülerini alın.
  12. 1 μm aralıklarla bazaldan apikal yüzeylere uzanan bir z-yığını elde edin.
  13. Fiji'de açık görüntüler.
  14. Ortalama yoğunluk → Z projesi → Görüntü seçin.
  15. Kesitleri görselleştirmek için Görsel → Yığınları → Ortogonal Görünümleri seçin.

8. Epitel yanıtını analiz etmek

  1. Enfeksiyondan 5 saat sonra medya maddesini çıkarın.
  2. Üst bölmeye 350 μL lizin tamponu ekleyin.
  3. Hücreleri lizlemek için pipet yapın ve buz üzerindeki RNase-içermeyen bir tüpe aktarın.
  4. Kit talimatlarına göre RNA çıkarımı yapın.
  5. RNA konsantrasyonunu ölçün ve örnekleri normalize edin.
  6. Ters transkripsiyon yapın.
  7. Üreticinin talimatlarına uygun olarak nicel PCR yapılabilir ( TNFα için primer dizileri ve referans gen β-aktin Tablo 4'te sağlanmıştır).

Sonuçlar

Birleşmeye ulaştıktan sonra, hücre kültüründeki bağırsak hücreleri, tek katmanda görünür boşluklar olmadan mozaik benzeri bir desen (Şekil 1B) göstermiştir. Farklılaşmadan sonra, epitel sıkılığı transepitel elektrik direnci (TEER) ölçülerek değerlendirildi (Şekil 1C). TEER değerleri 500 Ω·cm²'nin üzerinde, sıkı bir epitel monotabakasının oluşumuyla tutarlıydı¹⁶.

Bazolateral bölmede tespit edilen AIEC miktarı zamanla arttı ve bu da epitel bariyerinin bakteriyel aşmasını yansıtıyor (Şekil 2A,B). Alt bölmede AIEC olmaması, bakteriyel translokasyonun başarısız olduğunu gösterir.

Enfeksiyonun görselleştirilmesi iş akışı Şekil 3A'da özetlenmiştir. Konfokal görüntüleme, çekirdeklerin bazal olarak lokalize olduğu ve aktin ağının apikal zenginleşmesinin olduğu polarize bir monotabakanın oluştuğunu göstermiştir (Şekil 3B). Daha yüksek büyütme, hem hücre içi AIEC'yi hem de apikal zara bağlı ekstrahücre bakterileri ortaya çıkardı (Şekil 3C).

RT-qPCR analizi, AIEC enfeksiyonuna yanıt olarak TNFα ekspresyonunun yukarı regulasyonunu gösterdi (Şekil 4A,B), epitelyal inflamatuar yanıtın aktivasyonunu doğruladı.

figure-results-1
Şekil 1: Protokolün genel görünümü. (A) Protokolün şemaları. (B) İnvazin kaplı hücre kültürü insertinde kültürlenmiş ve farklılaştırılmış bağırsak organoid hücrelerinin parlak alan görüntüsü. Ölçek çubuğu: 50 μm. (C) İnvazin kaplı hücre kültürü insertlerinde yetiştirilen ve farklılaşan bağırsak organoidlerinin transepitelyal/transendotel elektrik direnci (TEER). Her nokta bağımsız bir deneyi gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Epitel ihlali değerlendirmesi (A) Protokolün şemaları. (B) Hücre kültürü insertinin alt bölümünde AIEC'nin koloni oluşturan birimlerinin (CFU) zamanla nicelendirilmesi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Görüntüleme enfeksiyonu. (A) Protokolün şemaları. (B) Floresan AIEC ile enfekte olan bağırsak organoidlerinin 5 saat konfokal görüntülemesi. Gri: DAPI. Magenta: falloidin. Cyan: AIEC. Ölçek çubuğu: 50 μm. Birleşik görselin ortogonal görünümleri üstte ve sağda gösterilir. (C) B. Grey'de beyaz karenin yüksek büyütülmesi. Gri: DAPI. Magenta: falloidin. Cyan: AIEC. Ölçek çubuğu: 10 μm. Sağda ortogonal görünümler gösterilir. Epitel hücrelerinin apikal zarına ($) bağlı hücre içi AIEC (*) ve ekstrasellüler AIEC vurgulanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Epitel yanıtının analizi. (A) Protokolün şemaları. (B) AIEC ile enfeksiyondan 5 saat sonra bağırsak organoidleri tarafından TNFα ekspresyonu (yeşil) ile enfekte olmayan kontrol (gri) ile karşılaştırıldığında. TNFα ifadesi, 2-(Cq(TNFα)-Cq(β-aktin)) formülü kullanılarak B-aktin ifadesine normalleştirildi. n=4 çoğalıyor. İstatistiksel analiz, eşleşmemiş bir öğrencinin t-testi kullanılarak gerçekleştirildi. P < 0.001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

BileşenYoğunlaşma 
Adv DMEM1X final
HEPES%1 v/v
Glutamax%1 v/v
Wnt vekili0.5 nM
R-spo1 UPE%2 v/v
Noggin UPE%1 v/v
A vitamini içermeyen B27%2 v/v
N-asetil sistein1.25 mM
Nikotinamid10 μM
hEGF50 ng/mL
A83-01 (TGF-β inhibitörü)0.5 μM
SB202190 (p38 inhibitörü)3 μM
Prostaglandin E21 μM
Rho kinaz inhibitörü10 μM

Tablo 1: İnsan bağırsak organoidleri için genleşme ortamı. İnsan bağırsak organoidlerinin bakımı ve çoğaltımı için kullanılan Genişleme ortamının bileşimi.

BileşenYoğunlaşma
Adv DMEM1X final
HEPES%1 v/v
Glutamax%1 v/v
R-spo1 UPE%2 v/v
Noggin UPE%1 v/v
A vitamini içermeyen B27%2 v/v
NAC1.25 mM
hEGF50 ng/mL

Tablo 2: İnsan bağırsak organoidleri için farklılaşma ortamı. İnsan bağırsak organoid monokatmanlarının epitel olgunlaşmasını teşvik etmek için kullanılan Differensiasyon ortamının bileşimi.

BileşenYoğunlaşma
Adv DMEM1X final
HEPES%1 v/v
Glutamax%1 v/v

Tablo 3: Enfeksiyon için ADV DMEM++. Bakteriyel enfeksiyon testleri sırasında kullanılan HEPES ve Glutamax (Adv DMEM++) ile takviye edilmiş İleri DMEM/F12 ortamının bileşimi.

İsimDizi
TNFα FCTCTTCTGCCTGCTGCACTTTG
TNFα RATGGGCTACAGGCTTGTCACTC
β-aktin FTGACGTTGACATCCGTAAAG
β-aktin RGAGGAGCAATGATCTTGATCT

Tablo 4: TNFα qPCR için primerler. TNFα'nın nicel PCR analizinde referans gen olarak β-aktin kullanılarak kullanılan primer dizilerini gösterir.

Tartışma

Bu çalışma, hücre kültürü insertlerinde kültürlenen TSC kökeni organoidler kullanılarak insan bağırsak epitel hücrelerinin bakteriyel enfeksiyonunu incelemek için bir protokol oluşturdu. 3 μm gözenekli insertler verimli hücre bağlanmasını ve bakteri translokasyonunu sağlarken, 0,4 μm gözenekler AIEC geçişine izin vermez; bu da E. coli'nin yaklaşık 1 μm boyutuyla uyumludur. Organoid hücrelerin 3 μm gözeneklerden geçişi gözlemlenmedi; muhtemelen epitelyal ve invaziv olmayan fenotiplerinden dolayı.

Tekrarlanabilirlik için birkaç deneysel değişken kritik öneme sahipti; bunlar arasında verimli hücre tutuşması, uygun tohumlama yoğunluğu ve enfeksiyondan önce tam birleşme vardı. Organoid kaynaklı epitel hücreleri, kaplamasız plastiğe yapışmaz, bu yüzden kaplama vazgeçilmezdir. BME, sürekli yüksek bağlantı verimliliği sağladı. Invasin kaplama benzer sonuçlar verdi ve maliyet etkin bir alternatif11 temsil ediyor, ancak bunun kendi içinde üretilmesi gerekiyor. Kolajen kaplama da alternatif olarakönerilmiştir 17.

Bakteriyel büyüme koşulları enfeksiyon verimliliğini güçlü şekilde etkiler. E. coli suşları DMEM'de iyi büyür; ancak kalıntı antibiyotikler proliferasyonu engelleyebilir. Optimal koşullarda, enfekte kültürler genellikle kontrol organlarına göre daha fazla bulanıklık gösterir ve bakteri büyümesi apikal bölme içeriklerinin örtülmesiyle doğrulanabilir.

Görüntüleme stratejisi, AIEC'yi hedefleyerek hem hücre içi hem de ekstrasüklü bakterilerin görselleştirilmesini sağladı; bir florofor ifade eden AIEC (örneğin, plazmid pMB1-spect-PthrC-eGFP kullanılarak). Alternatif yöntemler, hücre içi bakterilerin seçici olarak tespit edilmesini sağlar; bunlar arasında farklı immünoflüoresans boyama18 veya invazonun belirli aşamalarında ekspreslenen raporlayıcılarbulunur. Gentamisin koruma testleri ek bir nicel yaklaşımsağlar 20.

Bu model kasıtlı olarak indirgemeci olup, bakteriler ile bağırsak epitelyumu arasındaki doğrudan etkileşimlere odaklanır. Enfeksiyonun ayrışmış epitel monokatmanında ek in vivo hücre tipleri olmadan incelenmesini sağlar. Farklılaşma ortamı ağırlıklı olarak enterosit ve kadeh hücresi farklılaşmasını21 indüklemiştir ancak epitelbileşimini değiştirecek şekilde değiştirilebilir 22,23. Sistem karmaşıklığı, bazalkompartman 24'te bağışıklık veya stromal hücrelerin birlikte kültürlenmesiyle artırılabilir.

Sistem, bağırsak mukozasının üç boyutlu mimarisini yeniden yansıtmaz. Organ-on-chip platformları bazı yapısalsınırlamaları aşar 25 ancak daha fazla teknik karmaşıklık ve kaynak gerektirir. Ayrıca, model akut enfeksiyonlar için en uygundur, çünkü bakteriyel aşırı büyüme deneyleri yaklaşık 8 saat ile sınırlar. Kronik enfeksiyonları invitro 26 incelemek için mikrofluidik platformlar gibi sürekli ortam değişimini sağlayan daha karmaşık sistemler gereklidir.

Benzer hücre kültürü tabanlı organoid enfeksiyon sistemleri, Helicobacter pylori27,28 ile enfekte olan mide organoidleri, Shigella29 ile enfekte olan bağırsak organoidleri, Pseudomonas aeruginosa10 ile enfekte olan hava yolu organoidleri ve Enterococcus faecalis30 ile enfekte olan urotelyal organoidler dahil olmak üzere birçok doku ve patojene uygulanmıştır. Bu nedenle, bu protokol, organ sistemleri arasında epitelyal-bakteriyel etkileşimlerin incelenmesi için çok yönlü bir çerçeve sağlar; ancak patojene özgü büyüme gereksinimleri dikkate alınırsa.

Organoid teknolojisi, dönüşüm yapılmamış epitel hücrelerinde konak-patojen etkileşimlerini araştırmak için fizyolojik olarak ilgili insan modellerisağlar 4,5. Antibiyotik dirençli enfeksiyonların artan yükü ve kronik inflamatuar hastalıklar ile kanserle ilişkisi göz önüne alındığında, bu tür in vitro sistemler mekanik ve translasyonel araştırmalar için değerli araçlar sunmaktadır.

Açıklamalar

H.C., organoid teknolojisiyle ilgili birçok patentin mucitidir. H.C.'nin tam açıklaması https://www.uu.nl/staff/JCClevers/.

Teşekkürler

Yazarlar, özellikle Anneta Brousali, Jorieke Salij ve Arnold Binda'ya Organoid Teknolojisi için Utrecht Portal'ına (UPORT) ve ayrıca kolon dokuları sağladıkları için Utrecht Üniversitesi Tıp Merkezi hasta ve cerrahlarına teşekkür ediyorlar. Yazarlar ayrıca AIEC LF82 suşunu paylaştığı için Nicolas Barnich'e teşekkür etmektedir. Bu çalışma, CRUK hibesi OPTIMISTIC (C10674/A27140) ile desteklendi. TG, Marie Sklodowska-Curie hibe anlaşması kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programı tarafından finanse edildi 101107988. Şematikler BioRender (https://www.biorender.com/) kullanılarak oluşturulmuştur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
A83-01 (TGF-β inhibitör)Tocris2939
Adherent-invaziv Escherichia coli LF82Nicolas Barnich'in nazik hediyesi
İleri DMEM/F12Invitrogen12634-010
A vitamini içermeyen B27Invitrogen12587010
cDNA kitiUygulamalı Biyosistemler4387406Kılavuz burada mevcuttur: https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN
0017977_highcap_cDNA_RT_UG.pdf
Hücre sayacıDeNovixH2796
Hücre sayacıLeicaStellaris
Kapak kaymaları 24 mm x 50 mmMenzel-Glä zerBB024050S1
Cultrex Bazsal Membran Ekstraktı (BME)R& D Sistemleri, Bio-Techne3533-001-02
DAPISigma-Aldrich10236276001
Tek Kullanımlık Skalpel Steril N&Grad; 10Swann Morton3033838
DMEMGibco11965092
FijiFijiFiji açık erişimlidir ve buradan indirilebilir: https://imagej.net/software/fiji/downloads
GlutamaxGibco35050-061
hEGFPeprotechAF-100-15
HEPESGibco15630-080
İstilaWijnakker ve ark. PNAS 2024'e göre özel olarak üretilmiştir
LBTermobalıkçıCM0996
LB AgarTermobalıkçıCM1116
Malassez odasıKOVA87144E
Mikroskop slaytlarıSkycraft18901
Milli hücre voltohmmetresi (TEER ölçümü)MerckMERS00002
montaj ortamıVektörler LaboratuvarlarıVectashield H-1000-10
N-Asetil SisteinSigma-AldrichA9165
NikotinamidSigma-AldrichN0636
Noggin UPEIPA TherapeuticsN002
Paraformaldehit çözeltisi %4Sigma-Aldrich1.00496
Phalloidin 647Sigma-Aldrich65906-10NMOL
plazmid pMB1-spect-PthrC-eGFPAddgene107408
Prostaglandin E2Tocris2296
qPCR makinesiBioradC1000-Touch
Rho kinaz inhibitörüAbMoleM1817
RNA çıkarma kitiQiagen74534Kılavuz buradan erişilebilir: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=bf60203
F-291D-48AE-8206-86B0696B28C0&
lang=en
R-spo3 UPEIPA TherapeuticsR001
SB202190 (p38 inhibitörü)Sigma-AldrichS7076
SpectinomycinSigma-AldrichS9007
Organoid kültürü için askı plakaGreiner665102
SYBR yeşiliBiorad170-8887Kılavuz buradan erişilebilir: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4106212.pdf
TermosiklerBioradT100
Hücre kültürü girişiTranswells 24w 3 & mikro; Gözenekler, Greiner662631
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
TrypLEGibco, Thermo Fisher Scientific12605-010
Wnt vekiliU-Protein EkspresiÖzel sipariş  https://www.life-sciences-europe.com/organisation/protein-express-immunoprecise-group-utrecht-netherlands-west-europe-2001-30404.html

Kaynaklar

  1. McCoy, R., et al. In vitro Models for Investigating Intestinal Host-Pathogen Interactions. Adv Sci. 11 (8), 2306727(2023).
  2. Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21 (1), 1-26 (2005).
  3. Gustafsson, J. K., Ermund, A., Johansson, M. E. V., Schütte, A., Hansson, G. C., Sjövall, H. An ex vivo method for studying mucus formation, properties, and thickness in human colonic biopsies and mouse small and large intestinal explants. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (4), G430-G438 (2012).
  4. Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
  5. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  6. Kim, M., Fèvre, C., Lavina, M., Disson, O., Lecuit, M. Protocol for live imaging of bacteria-cell interactions in genetically modified mouse small intestinal organoids. STAR Protoc. 5 (1), 102773(2024).
  7. Co, J. Y., Margalef-Català, M., Monack, D. M., Amieva, M. R. Controlling the polarity of human gastrointestinal organoids to investigate epithelial biology and infectious diseases. Nat Protoc. 16 (11), 5171-5192 (2021).
  8. Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunol. 7 (4), 818-828 (2014).
  9. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  10. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Dual RNA sequencing of a co-culture model of Pseudomonas aeruginosa and human 2D upper airway organoids. Sci Rep. 15 (1), 2222(2025).
  11. Wijnakker, J. J. A. P. M., et al. Integrin-activating Yersinia protein Invasin sustains long-term expansion of primary epithelial cells as 2D organoid sheets. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (1), e2420595121(2025).
  12. Darfeuille-Michaud, A., et al. Presence of adherent Escherichia coli strains in ileal mucosa of patients with Crohn's disease. Gastroenterology. 115 (6), 1405-1413 (1998).
  13. Darfeuille-Michaud, A., et al. High prevalence of adherent-invasive Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn's disease. Gastroenterology. 127 (2), 412-421 (2004).
  14. Pleguezuelos-Manzano, C., Puschhof, J., van den Brink, S., Geurts, V., Beumer, J., Clevers, H. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).
  15. Anilionyte, O., Liang, H., Ma, X., Yang, L., Zhou, K. Short, auto-inducible promoters for well-controlled protein expression in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 102 (16), 7007-7015 (2018).
  16. Chen, S., Einspanier, R., Schoen, J. Transepithelial electrical resistance (TEER): a functional parameter to monitor the quality of oviduct epithelial cells cultured on filter supports. Histochem Cell Biol. 144 (5), 509-515 (2015).
  17. In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. J Vis Exp. (146), e59357(2019).
  18. Quereda, J. J., et al. A dual microscopy-based assay to assess Listeria monocytogenes cellular entry and vacuolar escape. Appl Environ Microbiol. 82 (1), 211-217 (2016).
  19. Schulte, M., Grotheer, L., Hensel, M. Bright individuals: Applications of fluorescent protein-based reporter systems in single-cell cellular microbiology. Mol Microbiol. 121 (3), 605-617 (2024).
  20. Sharma, A., Puhar, A. Gentamicin protection assay to determine the number of intracellular bacteria during infection of human TC7 intestinal epithelial cells by Shigella flexneri. Bio-protocol. 9 (13), e3292(2019).
  21. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  22. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture conditions. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
  23. He, G. -W., et al. Optimized human intestinal organoid model reveals interleukin-22-dependency of paneth cell formation. Cell Stem Cell. 29 (9), 1333-1345 (2022).
  24. Ding, L., et al. Toll-like receptor 9 pathway mediates Schlafen⁺-MDSC polarization during Helicobacter-induced gastric metaplasias. Gastroenterology. 163 (2), 411-425 (2022).
  25. Alonso-Roman, R., et al. Organ-on-chip models for infectious disease research. Nature Microbiol. 9 (4), 891-904 (2024).
  26. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomed Eng. 3 (7), 520-531 (2019).
  27. Vllahu, M., et al. Inflammation promotes stomach epithelial defense by stimulating the secretion of antimicrobial peptides in the mucus. Gut Microbes. 16 (1), 2390680(2024).
  28. Aguilar, C., et al. et al.Helicobacter pylori shows tropism to gastric differentiated pit cells dependent on urea chemotaxis. Nature Commun. 13 (1), 1-14 (2022).
  29. Llanos-Chea, A., et al. Bacteriophage therapy testing against Shigella flexneri in a novel human intestinal organoid-derived infection model. J Ped Gastroenterol Nutr. 68 (4), 509-516 (2019).
  30. Horsley, H., Dharmasena, D., Malone-Lee, J., Rohn, J. L. A urine-dependent human urothelial organoid offers a potential alternative to rodent models of infection. Sci Rep. 8 (1), 1238(2018).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Bağırsak Organoidleriİnvazin KaplamaPolarize MonotabakaEpitel BariyeriKonfokal MikroskopiRT-qPCRTransepitelyal Elektriksel Direnç
Konak-bakteri etkileşimlerini incelemek için invazin veya bazal zar ekstraktı üzerine iki boyutlu organoid kültürü
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.