Yöntem makalesi

AAV Transdüksiyon Çalışmaları için 3B Sferoidlerin Değerlendirilmesi

81 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70517

⸱

14 Ağustos 2026

 , 
1Office of Gene Therapy, Office of Therapeutic Products, Center for Biologics Evaluation and Research

Bu makalede

Özet

Üç boyutlu sferoid kültür sistemleri, AAV gen terapisi geliştirmeleri için geleneksel 2D modellerine göre iyileştirmeler sunar. Bu metodoloji, düşük dozlarda AAV transdüksiyonunun hassas tespitini, artırılmış fizyolojik ilgiyi ve güçlü uzun süreli izlemeyi mümkün kılar. Platform; farklı hücre hatları ve AAV serotipleri genelinde etkinlik değerlendirmesini, yüksek kapasiteli taramayı ve vektör optimizasyonunu destekler.

Özet

Adeno-associated virüsler (AAV'ler), gen tedavisi ürünlerinde gen aktarımı için kullanılan güçlü vektörlerdir. Bunların geliştirilmesi; vektör tasarımı, serotip performansı, düzenleyici element gücü ve ekspresyon kinetiğindeki farklılıkları güvenilir bir şekilde tespit edebilen in vitro  sistemler gerektirir. Bu sistemler aynı zamanda potens değerlendirmesi ve vektör optimizasyonu gibi uygulamaları da desteklemelidir. Burada, çeşitli hücre hatlarında AAV potensini, transgen ekspresyon kinetiğini ve serotipe özgü transduksiyon etkinliğini değerlendirmek için optimize edilmiş, yalınlaştırılmış üç boyutlu bir sferoid platformunu tanımlıyoruz. Ultra düşük yapışmalı plakalar kullanılarak tekdüze sferoidler oluşturulmakta ve stabil mimari ile uzun süreli görüntülemeyi destekleyen koşullar altında tutulmaktadır. AAV transduksiyonunun ardından, floresan veya lüminesans okumalar canlı hücre görüntüleme sistemleri kullanılarak gerçek zamanlı olarak izlenir. Bu, sürekli kinetik görüntüleme yoluyla reporter sinyalinin, doz yanıtının, düzenleyici element aktivitesinin ve başlangıç süresinin kantitatif değerlendirmesine olanak tanır. Platform, güçlü ve zayıf vektör genom tasarımları ile birden fazla AAV serotipi arasında etkili bir ayrım yapar. Bu yöntem, hem yavaş hem de hızlı bölünen hücre hatlarında güçlü bir performans sergilemektedir. Bu sonuçlar, sistemin preklinik gen tedavisi değerlendirmesi ve geliştirilmesi için ölçeklenebilir ve fizyolojik olarak ilgili bir sistem olarak faydasını ortaya koymaktadır.

Giriş

AAV vektörleri, güvenlik profilleri ve kalıcı gen ekspresyonu sağlama yetenekleri nedeniyle in vivo uygulamalar için tercih edilen gen iletim sistemlerinden biri haline gelmiştir1. AAV gen tedavisi, geliştirme aşamasındaki yüzlerce ürünle birlikte, birçok nadir hastalık endikasyonunun tedavisinde başarı göstermektedir2. Ayrıca, gelişmekte olan uygulamalar arasında, tedavisi zor endikasyonların iyileştirilmesine yardımcı olma potansiyeli yüksek olan Cas9 gibi genom düzenleme bileşenlerinin in vivo iletimi yer almaktadır3. Temel geliştirme zorlukları arasında yüksek üretim maliyetleri ve mevcut in vitro analizlerin ürün kalitesini ve klinik etkinliği belirlemedeki sınırlı öngörü kapasitesi bulunmaktadır4.

AAV terapötiklerinin ilerlemesi, klinik performansı doğru bir şekilde öngörebilen prediktif ve standartlaştırılmış aktivite analizlerinin eksikliği nedeniyle temel olarak sınırlanmıştır4,5. Bu analizler; mühendislik ürünü vektör kütüphanelerinin taranması, hedeflemeyi artırmak için kapsid modifikasyonlarının optimize edilmesi ve dokuya özgü tropizmin değerlendirilmesi dahil olmak üzere birçok amaçla kullanıldıkları için geliştirme sürecinin kritik bir bileşenidir. Ayrıca, regülatör sekansların transgen ekspresyonu üzerindeki etkisini karakterize etmeye de hizmet ederler6. Aday seçimi dışında, AAV transduksiyon analizleri; lot salımı, lot karşılaştırma çalışmaları ve stabilite değerlendirmeleri için kullanılan potens analizleri aracılığıyla kritik üretim kalite kontrolünü de destekler6,7.

Bilimsel zorluk, rutin kullanım için pratik uygulanabilirliği korurken vektör-konak etkileşimlerinin karmaşıklığını yakalayan analizler geliştirmektir7,8. Mevcut yaklaşımlar, geleneksel 2D monokatman kültürlerinde hedef organı temsil eden ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarının kullanımını içermektedir. Bu kültür koşulları fizyolojik uygunluktan yoksundur ve yüksek ilaç dozları gerektirir. Bu durum, laboratuvar tahminleri ile klinik çevrilebilirlik arasında önemli bir boşluk yaratmaktadır. AAVR aşırı eksprese eden veya CRISPR ile aktive edilen sistemler gibi yeni mühendislik ürünü hücre hatları önemli ilerlemeleri temsil etse de, doğal dokulara özgü üç boyutlu mimariyi ve hücre dışı matriks etkileşimlerini yeniden oluşturmakta yetersiz kalmaktadır9,10,11. in vivo mikroortamları daha iyi simüle eden yeni nesil modeller, bu translasyonel kopukluğu giderebilir12,13,14.

AAV transduksiyon deneylerinin translasyonel değerini artırmak amacıyla, yakın zamanda AAV transduksiyonu için optimize edilmiş 3D bir sferoid sistem geliştirdik. Bu sistem, altın standart olan 2D deneylerle karşılaştırıldığında, birden fazla hücre hattında ve AAV serotiplerinde AAV transduksiyon verimliliğini önemli ölçüde artırmaktadır. Artan hassasiyetin ve deneyde kullanılan ürünün korunmasının yanı sıra bu modeller, sferoid içindeki hücresel konuma göre değişen gerçekçi hücre-hücre etkileşimleri sağlayarak 2D monokatmanlara göre iyileştirme sunar. Ayrıca, gerçek organ koşullarını simüle eden ilaç penetrasyonunun anlamlı bir şekilde incelenmesine olanak tanır11,15,16. Dahası, bu sferoid yaklaşımı, standart laboratuvar ekipmanları kullanması ve özel besiyeri veya iskele gereksinimlerini ortadan kaldırması nedeniyle, daha karmaşık organoid veya ko-kültür sistemlerine göre pratik avantajlar sağlar. Bu basitlik, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği garanti ederek sistemi rutin gen tedavisi testleri ve vektör geliştirme iş akışları için uygun hale getirir17.

Bu 3D sferoid platformu, özellikle düşük dozlarda AAV transduksiyonunun hassas tespitini ve vektör genom tasarımlarının karşılaştırmalı değerlendirmesini gerektiren uygulamalar için oldukça uygundur. Ayrıca serotipe bağlı tropizmin değerlendirilmesini de destekler. Geleneksel 2D kültürlerde yüksek AAV dozları gerektiren, nispeten düşük transduksiyon verimliliğine sahip hücre hatları için özellikle avantajlıdır. Bu bağlamlarda, 3D platformunun artırılmış hassasiyeti ve gelişmiş fizyolojik uygunluğu kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, bu sistem; immün bileşenler, vasküler iletim veya tam doku kompleksliği gerektiren çalışmalar için daha az uygun olabilir. Bunun nedeni, sferoidlerin in vivo ortamı tamamen yeniden oluşturamamasıdır.

Böylece, iki kritik ve tamamlayıcı okuma parametresine sahip, AAV transduksiyon analizleri için optimize edilmiş basit bir 3B sferoid protokolü sunuyoruz: transduksiyon verimliliği (burada sferoid başına toplam raporlayıcı sinyal olarak tanımlanmıştır) ve transduksiyon kinetiği. Bu yöntem; AAV potens değerlendirmesi, vektör tasarımı ve nötralizasyon analizleri için maliyet etkin, fizyolojik olarak ilgili ve bilgilendirici bir platform sağlamaktadır.

Protokol

Bu çalışmada, ticari kaynaklardan veya daha önce yayınlanmış kaynaklardan temin edilen yerleşik insan hücre hatları (HEK293T, HeLa, Huh7, HEP3B, HEPG2 ve A375) kullanılmıştır. Herhangi bir primer insan veya hayvan örneği kullanılmadığı için etik onay gerekmemiştir.

1. Steril deneysel kurulum ve başlangıç lama kabini hazırlığı

  1. Biyogüvenlik kabinini aktif hale getirin.
  2. Hava akışının stabilize olması için yeterli sürenin geçmesi amacıyla, Sınıf II laminer akışlı mikrobiyolojik güvenlik kabinini çalışmaya başlamadan 15 dk önce açın.
  3. Kabin içindeki tüm yüzeyleri %70 (v/v) etanol ile püskürterek temizleyin.
  4. Hücre süpernatantı ve hücresel kalıntıların imhası için 500 mL'lik bir cam beherde %5 (v/v) çamaşır suyu dezenfektan solüsyonu hazırlayın.
  5. Tüm mikropipetleri ve uç kutularını %70 (v/v) etanol kullanarak iyice dezenfekte ederek ekipmanı temizleyin.

2. Hücre kültürü besiyeri hazırlama

  1. 500 mL Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) yüksek glikoz baz besiyeri hazırlayın.
  2. Baz besiyerini 10 mL ısı ile inaktive edilmiş fetal bovine serum (FBS), 1 mL penisilin/streptomisin solüsyonu (100 units/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin) ve 5 mL 2 mM L-glutamin ile takviye edin.
    NOT: Tüm prosedürler boyunca aseptik teknikler uygulanmalıdır. Her deney için taze besiyeri hazırlanması gerekir. Belirli ekipman özellikleri için lütfen Materyaller Tablosu'na bakın.

3. Sferoid hazırlama

  1. Yukarıda açıklandığı şekilde komple DMEM besiyerini hazırlayın.
  2. Kültür besiyerini 37 °C'lik su banyosunda 10–15 dk ısıtın.
  3. İlgili hücre hatlarını sıvı nitrojen tankından çıkarın.
  4. Kriyoprezerve edilmiş HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 ve HeLa hücrelerini 37 °C'lik su banyosuna yerleştirerek hızla çözdürün.
  5. Son buz kristali çözünür çözünmez hücreleri hemen su banyosundan çıkarın.
  6. Çözdürülen 1 mL hücreyi 9 mL komple DMEM besiyeri ile seyreltin.
    NOT: Bu protokolde kullanılan tüm hücre hatları aynı DMEM besiyerinde ve kültür koşullarında tutulmaktadır.
  7. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dk boyunca 350 × g. hızında santrifüjleyin.
  8. Süpernatantı uzaklaştırın.
  9. Pelleti 5 mL komple DMEM besiyeri içerisinde yeniden süspande edin.
  10. Hücreleri T75 hücre kültür flaskına ekin.
  11. Ekilen flaskları 37 °C, %5 CO2 ve %95 nem oranında tutulan bir hücre kültür inkübatörüne yerleştirin.

4. Hücre büyümesinin izlenmesi

  1. Her 3 günde bir 15 mL kültür ortamı ekleyin.
  2. HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 ve HeLa hücreleri %70 konfluens düzeyine ulaştığında pasajlayın; T75 flasklardaki komple DMEM ortamını aspire edin. 
  3. Hücreleri içeren T75 flasklara 5 mL PBS ekleyerek hücreleri yıkayın. 
  4. T75 flasklara eklendikten 30 s sonra 5 mL PBS'yi aspire edin.  
  5. Bu yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.  
  6. Hücreleri 5 mL %0,05 trypsin-EDTA ile 5 dk boyunca tripsinizleyin. 
  7. Hücrelerin tamamen ayrışmasını sağlamak için flaskları 37 °C'lik inkübatörde 5 dk inkübe edin.  
  8. Tripsini nötralize etmek için 5 mL komple DMEM ortamı ekleyin.  
  9. Tripsini uzaklaştırmak için hücreleri 350 × g hızında 5 dk santrifüjleyin. 
  10. Hücre peletini 5 mL DMEM içinde resüspande edin. 
  11. Rutin hücre pasajlaması için hücreleri 1:10 dilüsyonda bölün. 
    NOT: Hücrelerin log fazına ulaşması ve metabolik olarak aktif hale gelmesi için deneyleri gerçekleştirmeden önce hücrelerin 2 kez pasajlanması önerilir. 
  12. Hücreler %70 konfluens düzeyine ulaşana kadar bu kontrollü koşullar altında inkübasyona devam edin, ardından sonraki deneysel prosedürlere geçin.
    NOT: Hücre morfolojisi ve büyüme paternleri düzenli olarak izlenmelidir. Optimal gaz değişimi için flaskların uygun şekilde konumlandırıldığından emin olun. İnkübasyon süresi boyunca steril koşullar esastır.

5. Hücrelerin hasadı ve ilk hücre hazırlığı

  1. T75 flasklardaki mevcut kültür ortamını aspire ederek ortamı uzaklaştırın.
  2. Kalıntı ortamı ve döküntüleri temizlemek için HEK293T, Huh7, HEP3B, A375, HEPG2 ve HeLa hücrelerini PBS ile 3 kez yıkayın.
  3. Adheran hücreleri flask yüzeyinden ayırmak için bu hücrelere 5 mL önceden ısıtılmış 1× tripsin çözeltisi ekleyin.
    NOT: Optimal enzimatik aktiviteyi korumak için tripsinin önceden ısıtıldığından emin olun. Hücrelerin tamamen ayrılmasına izin vermek için flaskları 37 °C'lik bir inkübatörde 5 dk bekletin. Aşırı sindirimi önlemek için tripsinizasyon süresini dikkatle takip edin.
  4. Tripsin enzimini inaktive etmek için 5 mL komple kültür ortamı ekleyin.
  5. Çözeltiyi homojenize etmek için karışımı pipetle yukarı aşağı çekin.
  6. Hücre süspansiyonunun tamamını ayrı ayrı etiketlenmiş santrifüj tüplerine aktararak her bir hücre süspansiyonunu toplayın.
    NOT: Canlılığı korumak için resüspansiyon sırasında hücrelere nazik davranılmalıdır.
  7. Hücreleri peletlemek için oda sıcaklığında, 350 × g. hızda 5 dk boyunca santrifüjleyin.
  8. Süpernatanı atın ve hücre peletini 5 mL taze kültür ortamında nazikçe resüspande edin.

6. Hücre sayacı kullanarak hücre sayımı ve canlılık değerlendirmesi

  1. Santrifüj tüpü boyunca hücrelerin homojen dağılımını sağlamak için süspansiyonu pipetle nazikçe aşağı yukarı çekerek homojenleştirin.
  2. HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 ve HeLa hücreleri için sayım tüplerini hazırlayın.
  3. Tam DMEM kültür ortamında numunenin 1:10'luk bir dilüsyonunu hazırlayın. Örneğin, 360 µL tam DMEM ortamına 40 µL hücre süspansiyonu ekleyin.
  4. Homojen bir dilüsyon sağlamak için karışımı pipetle nazikçe dört kez aşağı yukarı çekin.
  5. Numuneyi giriş kaydına işleyin; kullanılan hücre tipini, dilüsyonu ve numune adını atayın.
  6. Numuneyi hücre sayıcıya yükleyin ve dilüe edilmiş hücre süspansiyonunu içeren tüpü atanan numaralı konuma yerleştirin.
    NOT: Hücre sayıcı, hücre numunelerini aspire eden ve bunları trypan blue ile karıştıran, böylece operatörler arası değişkenliği azaltan otomatik bir hücre sayıcıdır.
  7. Numuneyi saymadan önce hücre süspansiyonunun 1 dk boyunca çökelmesini bekleyin.
  8. Doğru sonuçlar elde etmek için sayım öncesinde hücreleri eşit şekilde yeniden süspanse edin.
  9. Toplam hücre sayısını hesaplayın.
  10. Deneyler için hücre ekim miktarını belirlemek amacıyla toplam canlı hücre konsantrasyonunu kullanın.
  11. Canlılığı > %90 olan canlı hücreleri kullanın.
  12. Canlı (boyanmamış) ve canlı olmayan (mavi boyanmış) hücreleri birbirinden ayırt edin.
    NOT: Tüm numuneler boyunca tutarlı sayım kriterleri sürdürülmelidir.

7. Sferoid ekimi ve boyut optimizasyonu

  1. Çözeltiyi homojenize etmek için hücre süspansiyonunu pipetle yukarı ve aşağı çekin.
  2. HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2 veya HeLa hücrelerinden farklı hücre yoğunlukları ekleyin.
  3. Ultra düşük yapışmalı (ULA) 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakada 200 µL hacimde 1 x 104 hücre ekleyerek başlayın.
  4. Deneyler için istenen hücre yoğunluğuna ulaşana kadar 1 x 104 hücre/kuyucuk oranını 2 katlı seri dilüsyonlarla seyreltin.
  5. En üst satır hariç tüm satırlara (1B-1H) 1 hacim tam besiyeri ekleyin.
  6. 1A satırına (en üst satır) 2 hacim 1 x 104 hücre/kuyucuk ekleyin.
  7. 1A satırından 1 hacmi 1B'ye ekleyerek ve bu şekilde devam ederek 1A satırını seri olarak seyreltin. Deneysel yerleşim örneği için aşağıdaki Ek Şekil 1'e bakın.
    NOT- Plaka kenarlarına hafifçe vurarak homojen süspansiyon sağladığınızdan emin olun.
  8. Hücreleri merkeze toplamak ve hücre-hücre temasını artırmak için ULA plakayı santrifüjde 350 × g . hızda 5 dk boyunca döndürün.
    NOT: Burada bildirilenler dışındaki hücre hatları kullanılıyorsa, farklı hücre hatlarının farklı büyüme ve sferoid oluşum hızları sergilemesi nedeniyle parametre optimizasyonu gerekebilir.
  9. İlk sferoid oluşumuna izin vermek için ilk 24–48 saat boyunca plakalara müdahale etmekten kaçının. Sferoidlerin ~400 µm çapına ulaşması için 3 gün boyunca olgunlaşmasını bekleyin.
  10. Sferoid boyutlarının tekdüzeliğini kontrol edin. Hücrelerin homojen şekilde süspanse edildiğinden ve plakaların eğilmediğinden emin olun.
    Not: Tutarsız boyutlardaki sferoidlerin bulunduğu plakaları kullanmayın. Her kuyucuk içindeki sferoidlerin çaplarının nispeten tekdüze olduğundan emin olun.
  11. Sferoid morfolojisini izleyin.
    Not: İyi oluşmuş sferoidler, belirgin kenarları olan yuvarlak yapılar şeklinde görünür.
  12. Gevşek hücre agregatları değil, sıkı hücre-hücre adezyonu sergileyen olgun sferoidler oluşturun.
  13. Ekim yoğunluğunu artırın veya oluşum süresini uzatın. Sferoidler kompakt değilse, ekim yoğunluğunu artırın veya oluşum süresini uzatın.
  14. Ekim yoğunluğunu azaltarak veya santrifüj adımını uzatarak çok sayıda küçük agregat oluşumunu en aza indirin.

8. Canlı hücre gerçek zamanlı sferoid izleme

  1. Hücre süspansiyonları çöktürüldükten sonra, plakayı otomatik canlı hücre görüntüleme için canlı hücre görüntüleme cihazının bulunduğu 37 °C'lik bir inkübatöre (%5 CO2, %95 nem) aktarın.
  2. Sferoid canlı hücre görüntüleme parametrelerini deney için gerektiği şekilde ayarlayın:
    NOT: Test edilen tüm hücre hatları için aşağıdaki parametreler kullanılmıştır.
  3. Görüntüleme yazılımına giriş yapın.
  4. Şu komutları seçin:|Schedule To Acquire | Launch Add Vessel | Scan On Schedule | Create Vessel: New.
  5. |Select Scan Type|: Spheroid. |İlgilenilen kanalları seçin|: Faz + Aydınlık Alan (sferoid büyümesini izlemek için), Yeşil/Kırmızı (AAV transduksiyonunu izlemek için, görüntüleme süreleri sırasıyla 300 ms veya 400 ms).
  6. İstenen büyütmeyi seçin: 10x.
  7. Plaka modelini ve çekmecedeki konumunu belirleyin.
  8. Görüntülenecek kuyucukların konumunu ve kuyucuk başına kaç görüntü istendiğini seçin.
  9. Deneyin açıklamasını girin: isim, hücre tipi, hücre sayısı.
  10. Analiz kurulumu için  Defer Analysis Until Later seçeneğini belirleyin.
  11. Zaman çizelgesine sağ tıklayın ve  Set Selected Scan Group Interval seçeneğini seçin.
  12.  Her 6 h'de bir tarama ekleyin ve  süresiz tarama yapın. İstenen başlangıç zamanını ayarlayın (otomatik görüntüleme cihazındaki inkübasyondan en az 1 h sonra).
  13. Görüntüleme yazılımına giriş yaparak sferoid büyümesini günlük olarak kontrol edin.
  14.  View Recent Scans seçeneğini belirleyin ve istenen deneye çift tıklayın. |Görüntü kanalları panelinden  Brightfield seçeneğini belirleyin| ve ardından sferoidlerin çapını ölçmek için  |Measure image| özellikleri aracını kullanın.
    NOT: İlgilenilen hücrelerden kompakt sferoidler üretmek için optimal olgunlaşma süresi gerekebilir.
  15. Optimize edilmiş sferoid oluşumunun gerçekleştiği günde plakayı çıkarın ve AAV transduksiyonu için kullanın.

9. AAV Transdüksiyonu

  1. AAV serotipleri3 ve ilgili transgenleri satın alın veya üretin.
  2. 490 mL DMEM besiyerine 10 mL FBS ekleyerek, AAV transduksiyonları için %2 FBS destekli DMEM besiyeri hazırlayın.
    NOT: Temsili sonuçlar bölümünde gösterildiği üzere, kapsidlerin veya genomik düzenleyici elementlerin taranması için bir GFP transgeni oldukça etkilidir. İlgili AAV'yi, antibiyotik içermeyen %2 FBS destekli DMEM besiyerinde seyreltin.
  3. Seri seyreltmeler için belirlenmiş bir 96 kuyucuklu yuvarlak plakta seyreltme yapın.
  4. AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 ve AAV9'u titre etmek için başlangıç MOI değerinden itibaren 1:10'luk seyreltmeler yapın.
  5. Örnek deneysel düzeneği aşağıdaki Ek Şekil 2'de görün. Tartışma bölümünde gösterildiği gibi, AAV transduksiyonu için gereken MOI değerini hesaplayın.
  6. Toplamda 330 µL 1 × 106 MOI elde etmek için 297 µL besiyerine 33 µL AAV stoğu ekleyin.
  7. 297 µL %2 FBS destekli DMEM besiyerine 33 µL ekleyerek, 1 × 106 MOI ile başlayan 10 katlık seri seyreltmeler gerçekleştirin.
    NOT: Hücre canlılığındaki azalmayı önlemek için yüksek MOI değerlerinden kaçınılması önerilir. Optimal MOI'yi önemli ölçüde etkileyebilecekleri için her hücre tipi ve AAV serotipi için deneysel koşulların optimizasyonu gerekebilir. Tüm viral genomlar enfeksiyöz değildir; fonksiyonel titreler vg/mL değerinden farklılık gösterebilir.

10. AAV dozlaması

  1. Çok kanallı bir pipet kullanarak önceden hazırlanmış sferoid plağındaki tüm besiyerini aspire edin.
  2. Çok kanallı bir pipet kullanarak, dilüsyon plağından tedavi plağına 100 µL hacminde istenen MOI ekleyin.
  3. Plakları görüntüleme cihazına geri yerleştirin ve 72 sa boyunca yeşil floresan yoğunluğunu takip ederek transdüksiyonu izlemeye başlayın.
  4. İzleme süresi 3 günü aşarsa, besinleri yenilemek için her 3 günde bir kuyu başına 100 µL complete DMEM besiyeri ekleyin.

11. Canlı hücre görüntüleme, transdüksiyon izleme ve veri analizi

  1. Tedavi grubuna istenen AAV ve MOI eklendikten sonra plakayı cihaza geri yerleştirin.
  2. Her 6 h'de bir transdüksiyon verimliliğini kaydetmeye başlayın.
    NOT: Optimal GFP ekspresyonuna ulaşmak genellikle 3 ile 5 gün arasında sürer. Bu süre, kullanılan promotöre ve genom konfigürasyonuna bağlıdır.
  3. İlgilenilen hücrelere ve reporter genlere özgü bir analiz tanımı oluşturarak verileri analiz edin.
    NOT: Alternatif olarak, plakayı standart bir 37 °C inkübatörde tutun ve transdüksiyon verimliliğini qPCR, western blotting veya ELISA ile değerlendirin.
  4. Primer sferoid tespiti için Brightfield Analizi gerçekleştirerek Analiz Parametrelerini tanımlayın.
  5. Segmentasyon Parametrelerini şu şekilde optimize edin:
    1. Analiz Tipi: "Spheroid Brightfield."
    2. Segmentasyon Yöntemi: "Adaptive Threshold."
    3. Eşik Aralığı: 0.3–0.8 (başlangıçta otomatik ayarlama önerilir)
    4. Top-hat Filtresi: 200–500 µm (düzensiz aydınlatmayı giderir)
  6. Brightfield parametrelerini şu şekilde optimize edin:
    1. Farklı zaman noktalarından temsili görüntüler yükleyin .
    2. Optimal tespiti bulmak için eşik aralığını (0.2–0.9) test edin.
    3. Beklenen sferoid boyut aralığına göre boyut filtrelerini ayarlayın.
    4. Görsel üst üste bindirme incelemesi ile segmentasyonu doğrulayın.
  7. AAV transdüksiyon değerlendirmesi için Yeşil Kanalı şu şekilde optimize edin:
    1. İşlem görmemiş kuyucukların (MOI=0) arka plan seviyelerini belirleyin.
    2. Eşiği arka plan gürültüsünün 2–3× üzerine ayarlayın.
    3. En yüksek MOI ile işlem görmüş örnek ile test edin.
  8. Sinyali korurken doygunluğu önlemek için pozlama süresini optimize edin
    NOT: AAV transdüksiyonları için, transdüksiyon verimliliğinin bir ölçüsü olarak sferoid başına toplam floresan sinyalini raporlayın.

12. Veri Analizi

  1. Görüntüdeki hücreleri seçmek ve arka plan gürültüsünü dışlamak için filtreleri ve maskeleri ayarlayarak doğru parametreleri belirleyin.
  2. Yazılımı eğitmek için temsili bir görüntü seçin.
  3. Optimize edilmiş parametreleri çalışmadaki tüm görüntülere uygulayın.
  4. Verileri bireysel değerler veya gruplandırılmış şekilde dışa aktarın ve daha ileri veri sunumu için bir istatistiksel analiz sistemine aktarın.

13. Başlangıç zamanı hesaplaması

  1. Her MOI başına ilk GFP sinyalinin tespit edilmesi için gereken süreyi hesaplayın.
  2. İşlem görmemiş kuyucukların ortalaması (MOI = 0) + 3 Standart Sapma (SD) üzerinden interpolasyon yapın.
  3. Her bir zaman noktasındaki her bir sferoidin yeşil floresan yoğunluğunu, canlı hücre görüntüleme yazılımından bir istatistik yazılımına kopyalayın.
  4. Tekrarların ortalamasını alın.
  5. İşlem görmemiş sferoidlerin bulunduğu tüm kuyucukların (MOI = 0) ortalama ve SD sinyallerini hesaplayın.
  6. Her MOI için başlangıç süresini belirlemek amacıyla Asimetrik Sigmoidal, 5PL eğri uydurma yöntemini kullanarak interpolasyon yapın.
  7. Örneğin, Tablo 1'de aşağıdaki interpolasyon değerleri kullanılmıştır:
    1. scGFP için: 254,955 (ortalama) + 3 × 288,055 (SD) = 1,412,120 (interpolasyon sinyali)
    2. ssGFP için: 2,417,941(ortalama) + 3 × 26,093  (SD) =  3,200,746 (interpolasyon sinyali)

14. Floresans yeteneklerine sahip bir plaka okuyucu ile floresansı ölçün.

  1. Plaka okuyucuya bağlı bilgisayarda floresan plaka okuyucu yazılımını başlatın.
  2. Gezin girmek için / -e/a Dosya > Aç Protokolü belirleyin, plaka tipini (örneğin, 96 kuyucuklu, 384 kuyucuklu) seçin ve doğru kuyucuk düzeninin seçildiğinden emin olun. 
  3. Okuyucunun her bir kuyucuktan ne kadar süre boyunca floresans toplayacağını belirleyen floresan tespit entegrasyon süresini ayarlayın.
  4. Ayarlayın Herhangi biri kazanç veya duyarlılık ayarlar
    eğer belirtili tanımlık (the) analiz gerektirir daha yüksek veya düşük sinyal tespit
  5. GFP için floresan parametrelerini şu şekilde ayarlayın: eksitasyon: 485 nm ve emisyon: 528 nm.
  6. Ölçümü başlatmak için yazılımda Run butonuna tıklayın.
  7. Ölçün floresans den her biri kuyu
    NOT - Çalışma tamamlandıktan sonra yazılım, ortalamalar hesaplanıp arka plan çıkarılarak grafiklerin oluşturulmasında kullanılabilecek ham floresans değerlerini görüntüler.
  8. Dışa Aktar sonuçlar içinde belirtili tanımlık (the) tercih edilen format için dahası analiz veya raporlama.
    NOT: Örnek protokol modifiye edildiyse, Dosya'yı kullanın > Orijinali gelecekteki kullanımlar için korumak amacıyla, benzersiz bir sürüm oluşturmak için Farklı Kaydet'i kullanın.

15. Lüminesan transgen transdüksiyonu

  1. Yukarıda ayrıntıları verilen ekim ve AAV dozaj protokolünün aynısını izleyin.
  2. Farklı MOI'larda (0–10 arası), nano luciferase transgeni taşıyan 100µL AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 ve AAV9 ekleyin6 ULA plaklarında önceden büyütülmüş 100 µL HeLa sferoidlerine.
  3. Plakaları standart bir 37 °C inkübatörde inkübe edin ve transdüksiyonun 3 gün ardından transdüksiyon verimliliğini değerlendirin.

16. Canlı hücre deneyi tespiti için hücre dışı lüminesans inhibitörü ve lüminesans substratı hazırlayın

  1. 3. günde (bitiş noktası) analiz plakalarını inkübatörden çıkarın.
  2. Hücrelerin üzerine doğrudan hücre dışı lüminesans inhibitörü ve substrat ekleyin.
    NOT: Besiyerinin uzaklaştırılmasına gerek yoktur.
  3. Hücre dışı inhibitörü −20 °C depolama alanından çıkarın ve oda sıcaklığında çözülmesini bekleyin.
  4. Tüpün kapağında ve kenarlarında kalan sıvıyı toplamak için kısa süreli santrifüj yapın.
  5. 1  hacim hücre dışı inhibitörü ile 14  hacim komple DMEM besiyerini birleştirerek istenen miktarda rekonstitüe 15X hücre dışı lüminesans inhibitörü hazırlayın.
    1. Örneğin, deney için 1,0 mL reaktif gerekiyorsa, 933 µL  DMEM'e 67 µL inhibitör ekleyin. 1 plaka için 1 mL DMEM hazırlayın ve 67 µL inhibitör ekleyin.
  6. Adım 16.5'te hazırlanan inhibitörü steril bir reaktif rezervuarına aktarın.
  7. AAV ile transduksiyon yapılmış kuyucuklara 10 µL inhibitör dağıtmak için çok kanallı pipet kullanın.
  8. Canlı Hücre Substratını −20°C depolama alanından çıkarın ve karıştırın.
  9. Tüpün kapağında ve kenarlarında kalan sıvıyı toplamak için kısa süreli santrifüj yapın.
  10. İstenen miktarda rekonstitüe 3,6X Canlı Hücre Reaktifi hazırlayın.
  11. 1 plaka için 4 mL DMEM hazırlayın ve 144 µL substrat ekleyin.
  12. Adım 16.11'de hazırlanan substratı steril bir reaktif rezervuarına aktarın.
  13. AAV ile transduksiyon yapılmış aynı kuyucuklara 50 µL substrat dağıtmak için çok kanallı pipet kullanın.
    NOT: Birden fazla analiz plakası aynı anda çalıştırılıyorsa, reaktif hacimlerinin ayarlanması gerekebilir.
  14. Plakayı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 rpm'de sallayın.
  15. Lüminesans tespit reaktifleri eklendikten sonraki 2 saat içinde plakayı bir in vivo görüntüleme sistemi cihazı ile okuyun.
    NOT: Lüminesans yoğunluğu 2 saat boyunca kademeli olarak azalacaktır.

17. Biyolüminesans görüntüleme

  1. CCD kameranın soğuması (−90 °C) için biyolüminesans görüntüleme sistemini görüntülemeden en az 30 dk önce açın.
  2. Plakaların görüntüleme için hazır olduğundan emin olun (örneğin, biyolüminesans okuması için canlı hücre görüntüleme substratı eklenmiş olmalıdır).
  3. Işık yansımasını ve saçılmasını önlemek için plaka kapağını çıkarın.
  4. Alttan görüntüleme yapılacaksa plağın alt kısmını temizleyin.
  5. Plakayı görüntüleme haznesindeki tablaya yerleştirin.
  6. Plakayı kameranın altına ortalayacak şekilde konumlandırın.
  7. Lüminesans için görüntüleme parametrelerini ayarlayın: Otomatik pozlama veya pozlama süresini ayarlayın (tipik olarak 1–60 s), binning (orta seviye önerilir), f/stop (maksimum hassasiyet için 1).
  8. Anatomik referans için bir fotoğraf çekin.
  9. Lüminesans görüntüsünü yakalayın.

18. Biyolüminesans Görüntüleme Veri Analizi

  1. Kuyu veya ilgi alanlarını daire içine almak için ROI araçlarını kullanın.
  2. Karşılaştırma yapabilmek için örnekler arasında tutarlı ROI boyutları sağlayın.
  3. Biyolüminesans için toplam akıyı (foton/saniye) ölçün.
  4. Radyan verimliliğini ölçün.
  5. İstatistiksel analiz için verileri bir hesap çizelgesine aktarın.
  6. Görüntü dosyalarını ve analiz sonuçlarını kaydedin.
  7. Sunumlar için görüntüleri TIFF veya JPEG olarak dışa aktarın.

Sonuçlar

Burada, 3D sferoitlerin AAV transdüksiyonunu değerlendirmek, kendini tamamlayıcı (sc) ve tek zincirli (ss) gibi vektör genom tasarımlarını ayırt etmek ve transdüksiyon kinetiğini değerlendirmek için bir araç olarak kullanılabileceğini gösteriyoruz. Sürecin genel görünümü Şekil 1'de gösterilmektedir. . Kısaca, hücreler önce 2D kültürlerde genişletilir ve kompakt sferoitler oluşturmak için ultra düşük yapışma (ULA) plakalarına ekilir (Şekil 1A). Ardından, agregasyonu teşvik etmek için plaklar santrifüj edilir (Şekil 1B) ve sferoit oluşumunun gerçek zamanlı izlenmesi için canlı hücre görüntüleme sistemine aktarılır (Şekil 1C). 3. günde, sferoitler farklı MOI'larda AAV ile transdükse edilir (Şekil 1D). Transdüksiyon kinetiği, canlı hücre görüntüleme kullanılarak boylamsal olarak takip edilir (Şekil 1E) ve uç nokta analizi, plaka tabanlı floresan veya lüminesans okumaları kullanılarak gerçekleştirilir (Şekil 1F).

Şekil 2, 6 farklı hücre hattından elde edilen sferoidlerin morfolojisini göstermekte olup; çeşitli yoğunluk, yuvarlaklık ve şekilleri ortaya koymaktadır. Tüm hücre hatları, herhangi bir deneyde kullanılmadan önce birkaç pasaj boyunca tamamlanmış DMEM ortamında büyütülmüştür. Hücreler log fazına ulaştığında; HEP3B, HEK293T, A375, HeLa, HEPG2 ve Huh7 hücreleri hasat edilmiş ve kuyuk başına 10.00 hücre yoğunluğundan başlanarak, ULA-yuvarlak tabanlı plaklarda 2 katlı seri dilüsyonlar şeklinde ekilmiştir (Plaka düzeni Ek Şekil 1'de verilmiş olup temsilci sonuçlar Ek Şekil 2'de gösterilmiştir). Sferoid boyutu, sferoid yapısını ve mükemmel transdüksiyon duyarlılığını koruyarak 50 µm kadar küçük olabilir. Hücre ekiminden sonra, hücrelerin kuyuk merkezinde toplanmasını ve sferoidler şeklinde kendi kendine düzenlenmesini sağlamak için ULA yuvarlak tabanlı plaka 350 × g hızda 5 dk boyunca santrifüj edilmiştir. Bu adım, doğal olarak agregasyon göstermeyen hücreler için özellikle faydalıdır. Lenfositler gibi oldukça dirençli hücreler için santrifüj süresi 5 dakikadan 15 dakikaya kadar uzatılabilir. İyi oluşmuş sferoidler, HEK293T ve Huh7 hücrelerinde gözlemlendiği gibi yuvarlak ve kompakt bir fenotip sergilerken; kötü oluşmuş sferoidler gevşek şekilde agregasyon göstermiş olup ortam değişimleri sırasında dağılmaya meyillidir.

Ardından, plaka canlı hücre izleme cihazıyla donatılmış 37 °C'lik bir inkübatöre aktarılır. Burada bildirilen her bir hücre hattı için sferoid oluşumunu değerlendirmek amacıyla plakalar 6 saatlik aralıklarla günlük olarak izlenir. Hücre hatlarının çoğu, bir sferoid oluşturacak şekilde kendi kendine birleşmek için 3 güne ihtiyaç duyar. Şekil 2'de gösterildiği gibi, her bir hücre hattı ekimden 3 gün sonra belirgin morfolojik özellikler ve farklı sıkışma seviyeleri sergilemiştir. Hepatik hücre hatları (Huh7, HEPG2 ve HEP3B), diğer hücre hatlarına göre daha kompakt ve yoğun sferoidler oluşturmuştur. HEK293T, belirgin bir nekrotik çekirdeğe sahip çok yuvarlak küresel bir görünüm oluştururken, A375 düzensiz şekilli bir hücre agregatı (daha önce deforme olmuş sferoid olarak tanımlanmıştır)18,19 oluşturmuştur. Morfolojideki bu farklılıkların, hastalığın patofizyolojik durumlarının göstergeleri olduğu düşünülmektedir; bu durum, 3D modellerin 2D kültür sistemlerine kıyasla faydasını daha da desteklemektedir18,19. Sferoid birleştirme protokolü, test edilen altı hücre hattı genelinde oldukça tekrarlanabilirdir ve burada gösterilen tüm transdüksiyonlara uygulanmıştır.

Hücre konsantrasyonu, sferoid oluşum süresi ve yeşil/kırmızı otofloresans durumu optimize edildikten sonra (Ek Şekil 3'te gösterilmiştir), canlı hücre görüntüleme sistemi ve bir plaka okuyucu kullanarak sferoidlerde AAV transdüksiyonunu test etmeye geçtik (AAV titrasyonu için plaka düzeni örneği Ek Şekil 4'te gösterilmiştir). Şekil 3 , dört farklı hücre hattında (HEK293T, Huh7, HEP3B ve HEPG2) uygulanan optimize edilmiş sferoid protokolünü göstermektedir. Sferoid oluşumunun 3. gününde, sferoidler GFP ile işaretlenmiş ve farklı vektör genom tasarımlarına sahip iki AAV2 vektörü ile çeşitli enfeksiyon çokluklarında (MOI'lar) transdükte edildi. Bu iki AAV transgen tasarımı, yüksek potansiyelli (scGFP) ve düşük potansiyelli (ssGFP) GFP varyantlarını temsil etmektedir. Hücreler transdükte edildikten sonra, AAV transdüksiyonunun gerçek zamanlı izlemesi için plakalar bir canlı hücre görüntüleme sistemine yerleştirildi. 72 saatlik zaman noktasında, canlı hücre görüntüleme yazılımı kullanılarak yeşil floresan yoğunluğu tespit edildi. Şekil 3'te, mavi çizgiler sc-GFP genomlarını, kırmızı çizgiler ise ss-GFP genomlarını temsil etmektedir. Sferoidler AAV transdüksiyonuna karşı oldukça duyarlıydı; scGFP için çok düşük AAV titrelerinde ve farklı hücre hatlarında güçlü transdüksiyon tespit edildi. Çeşitli hücre hatları ve MOI'larda gerçek zamanlı olarak kaydedilen AAV transdüksiyonunun temsili videoları Ek Video 1, Ek Video 2, Ek Video 3, Ek Video 4, Ek Video 5 ve Ek Video 6'da gösterilmiştir. Öte yandan, ssGFP AAV'nin sferoid transdüksiyonu daha düşük seviyelerde gözlemlendi; bu durum, bu tip düzenleyici elementlerin beklenen daha zayıf/yavaş transdüksiyonunu yansıtmaktadır20,21. Bu durum, 3D sferoidlerin hem güçlü hem de zayıf AAV transdüksiyonları için, ayrıca sc-GFP gibi güçlü transdükte olan genler ile ss-GFP gibi daha az potansiyelli genler arasındaki ayrımı yapmak için kullanışlı olduğunu göstermektedir. HEK293T hücrelerinde 106 MOI değerinde sc ve ss transgenleri arasında göreceli floresansta 10 kat fark, HEP3B gibi transdüksiyonu daha zor olan hücre hatlarında ise 3 kat fark gözlemledik.

Ardından, çeşitli serotiplerin AAV transdüksiyonunu hem HEK293T sferoidlerinde hem de Huh7 sferoidlerinde doz bağımlı bir şekilde test ettik. Şekil 4'te gösterildiği gibi, 3D sferoidler dört farklı serotipe ait AAV-scGFP transdüksiyonlarına uygundu. 72 saatlik transdüksiyonun ardından scGFP, floresan plaka okuyucu (Şekil 4A,B) ve canlı hücre görüntüleme yazılımı (Şekil 4C,D)) kullanılarak ölçüldü. Dört serotipin tamamı bu iki cihaz kullanılarak başarıyla tespit edildi. Normalize edilmiş sinyal önemli farklılıklar göstermese de, canlı hücre görüntüleme sistemi, floresan plaka okuyucuya göre sinyal-gürültü oranı arasında daha yüksek bir aralık sergiledi. Her iki hücre hattında da AAV2'nin en güçlü transdüksiyon etkinliğine sahip olduğunu, bunu AAV1'in takip ettiğini, AAV5 ve AAV9'un ise önemli ölçüde daha düşük transdüksiyon gösterdiğini bulduk.

Ardından, sferoid protokolünü kullanarak lüminesans transduksiyonunu değerlendirdik. Bunu test etmek için HeLa hücreleri, burada açıklanan optimize edilmiş protokol takip edilerek 3D sferoidler şeklinde büyütüldü. 3. günde, HeLa sferoidleri nano lüsiferaz raporlayıcı genini kodlayan 5 farklı AAV serotipi ile transdukte edildi. AAV transduksiyonundan 72 saat sonra hücreler Live Cell substratı ile işleme tabi tutuldu ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edildi. Daha sonra, bir biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanılarak lüminesans ölçüldü ve görüntülendi(Şekil 5A). Bu sistem kullanılarak tüm AAV serotipleri için etkili transduksiyon gözlemlendi. Farklı AAV serotiplerinin transduksiyon etkinliği arasında hassas bir ayrım gözlemlendi; bu durum, protokolün yalnızca floresan okumalarıyla sınırlı olmadığını göstermektedir. Şekil 5'te gözlemlenen eğilimlerle tutarlı olarak, HeLa hücrelerindeki AAV-nano lüsiferaz transduksiyonu, AAV-GFP vektörlerinde görüldüğü gibi AAV2'nin en etkili serotip olduğunu gösterdi. Benzer şekilde, hem floresan hem de lüminesans vektörleri tarafından gösterildiği üzere, en düşük transduksiyon etkinliği AAV9 serotipi için gözlemlendi (Şekil 4 ve 5). AAV-nano lüsiferaz transduksiyonunun temsili bir görüntüsü Şekil 5B'de gösterilmiştir.

Transdüksiyon yoğunluğuna ek olarak, 3D sferoid protokolleri transdüksiyonun kinetik izlemesine olanak tanır. Şekil 6, farklı MOI'larda (0-106) transdükte edilen AAV2-scGFP ve AAV2-ssGFP'nin 3D HEK293T sferoid transdüksiyon kinetiği için temsili sonuçları göstermektedir (Şekil 6A-G). Canlı hücre görüntüleme sistemi kullanarak, AAV2-scGFP transdüksiyonunun 101 kadar düşük MOI'larda tespit edilebildiğini ve tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla yaklaşık 34 saat sonra GFP sinyalinde bir artışın gözlemlendiğini bulduk. AAV2-ssGFP sinyali, AAV2-scGFP sinyaline göre çok daha zayıf ve yavaştır. Transdüksiyon hızını daha ayrıntılı karşılaştırmak için, GFP sinyalinin tespit edilebilir hale geldiği başlangıç zamanını hesapladık. scGFP'nin hücreleri transdükte etmede ssGFP'den ortalama 4 kat daha hızlı olduğunu gözlemledik. Bireysel başlangıç zamanları Tablo 1'de bildirilmiştir. Bu kinetik ölçümler, analiz optimizasyonu için yararlı olan transdüksiyon etkinliğinin ek bir boyutunu ortaya koymaktadır.

Hücre kültürü iş akışı şeması; IncuCyte kullanılarak sferoid oluşumu, transduksiyon ve analiz.
Şekil 1: 3D kültürler kullanılarak yapılan AAV transduksiyonlarına genel bakış. (AHücreler 2D kültürde genişletilir ve sferoidler oluşturmak için ultra düşük yapışmalı (ULA) plaklara ekilir.B) Plakalar, agregasyonu teşvik etmek için santrifüj edilir ve ( kısmına aktarılırC) Sferoid oluşumunun gerçek zamanlı izlenmesi için IncuCyte S3 sistemi. (D3. günde, sferoitler farklı MOI'larda AAV ile transduse edilir.E) Transdüksiyon kinetiği, canlı hücre görüntüleme kullanılarak boylamsal olarak takip edilir ve (Fson nokta analizi, plaka tabanlı floresan veya lüminesans okumaları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 

Hücre kültürü sferoid karşılaştırması; deney düzeneğindeki altı farklı hücre hattının mikroskopi görüntüsü.
Şekil 2: Çoklu hücre hatlarında sferoidlerin morfolojik karakterizasyonu. HEP3B, HEK293T, A375, HeLa, HEPG2 ve Huh7 hücrelerinden üretilen sferoidlerin temsilci görüntüleri; boyut, morfoloji ve kompaklık açısından değişkenlik gösterirken, tekrarlar arasında yüksek yeniden üretilebilirlik sergilemektedir (ölçek çubuğu, 50 µm). Tüm hücre hatları 1 x 10 yoğunluğunda ekilmiştir4 3 gün boyunca kuyuk başına ... hücre. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

GFP etiketli hücrelerde gen ekspresyon analizi; MOI'ye karşı floresans, çoklu hücre hatları, grafik, görüntüler.
Şekil 3: Hücre hatları genelinde kendini tamamlayan (scGFP) ve tek zincirli (ssGFP) vektörlerin AAV transdüksiyon verimliliğinin karşılaştırılması. ( şeklinde 3B sferoidlerA) HEK293T, (B) Huh7, (C) HEP3B ve (D) HEPG2 hücreleri kendi kendine toplandı ve farklı MOI'larda AAV2-scGFP (mavi) ve AAV2-ssGFP (kırmızı) ile transduksiyonları yapıldı. Toplam yeşil floresans yoğunluğu, transduksiyondan 72 saat sonra kantitasyonla belirlendi. Her bir AAV için en yüksek MOI ile işlem görmüş sferoidlerin, canlı hücre görüntüleme sistemi kullanılarak 72. saatte alınan temsilci görüntüleri. Ölçek çubukları ... değerini temsil etmektedir. 200 µmHata çubukları standart sapmayı (SD) temsil etmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 

HEK293T ve Huh7 hücrelerindeki AAV serotipleri için floresan yoğunluk grafikleri; MOI, zaman değişkeni.
Şekil 4: 3D sferoidlerde AAV transdüksiyonu, farklı AAV serotiplerinin aktivitesini ayırt eder. ( kaynaklı 3D sferoitlerA,C) HEK293T ve (B,DHuh7 hücreleri; AAV1, AAV2, AAV5 ve AAV9 ile çeşitli MOI değerlerinde scGFP transgeni kullanılarak transduksiyon işlemine tabi tutuldu. Floresan yoğunluk birimleri, 72. saatte floresan tabanlı bir plaka okuyucu kullanılarak ölçüldü (A,B) ve canlı hücre görüntüleme sistemi (C,D). Hata çubukları standart sapmayı (SD) temsil etmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

AAV transduksiyon verimliliği grafiği ve ısı haritası; MOI ile toplam akı karşılaştırması; viral vektör analizi.
Şekil 5: Lüminesans raporlayıcılara sahip 3B sferoidlerde AAV transduksiyonu. HeLa sferoidleri; artan MOI'larda nanolüsiferaz raporer transgenini kodlayan AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 ve AAV9 ile transduksiyon işlemine tabi tutulmuştur. Lüminesans, transduksiyondan 72 saat sonra lüminesans görüntüleme sistemi kullanılarak bir Son Nokta (Endpoint) okumasıyla görselleştirilmiş ve ölçülmüştür.A) Toplam Akı değerleri. (BSferoid plakaların lüminesans görüntüleri ile elde edilen temsili son nokta okuması, sinyal dağılımının MOI'ler ve serotipler genelindeki durumunu göstermektedir. Her bir AAV vektörü, iki yatay replikatta çalışılmıştır. Hata çubukları SD'yi temsil etmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Gen ekspresyon analizi; MOI'ye karşı zaman grafikleri; sgGFP floresan yoğunluğu; deneysel sonuçlar.
Şekil 6: 3D Sferoidlerde Transdüksiyon Kinetiği DeğerlendirmesiHEK293T sferoitleri, 7 farklı MOI aralığında AAV2-scGFP (mavi) ve AAV2-ssGFP (kırmızı) ile transduce edildi (A–G). Toplam yeşil yoğunluk, Monitor sferoid oluşum/büyüme sistemi kullanılarak 72 saatlik bir süre boyunca, 6 saatlik zaman aralıklarıyla ölçüldü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

MOI (Multiplisite of Infection / Enfeksiyon Multiplisitesi)scGFP (saat)ssGFP (saat)
1>72 saat>72
1034.2>72
10016.554.2
10005.623.1
100003.313
1000001.98

Tablo 1: GFP tespiti için başlangıç süresi.

Ek Şekil 1: Sferoid titrasyonu için plaka düzeni. (A) 10.00 ile 78 hücre arasında değişen başlangıç ekim yoğunluklarından üretilen HEK293T, Huh7, HEP3B ve HEPG2 sferoidleri için dilüsyon şemasını gösteren temsili plaka düzeni. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Çeşitli ekim yoğunluklarında sferoid oluşumu. 10.00 ile 78 arasındaki başlangıç ekim yoğunluklarından üretilen HEK293T ve Huh7 sferoidlerinin 3. gündeki temsilci mikroskop görüntüleri. Ölçek çubuğu 50 µm'yi temsil etmektedir.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: 3D Sferoid oluşumu için hücre hattı bilgileri.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 4: AAV seri dilüsyonlar için plaka düzeni. (A) AAV1, AAV2, AAV5 ve AAV9 için kullanılan ve 106 MOI ile başlayan AAV seri dilüsyon şemasını gösteren temsili plaka düzeni. H satırında, tedavi edilmemiş sferoidleri temsil eden negatif kontrol gösterilmektedir.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek Video 1: MOI 106 seviyesinde HEK293T sferoidlerinde AAV2-scGFP transdüksiyonunun gerçek zamanlı canlı hücre görüntülemesi.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 2: 106 MOI ile Huh7 sferoidlerinde AAV2-scGFP transdüksiyonunun gerçek zamanlı canlı hücre görüntülemesi.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ek Video 3: MOI 106 değerindeki HEP3B sferoidlerinde AAV2-scGFP transdüksiyonunun gerçek zamanlı canlı hücre görüntülemesi.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 4: Doz bağımlılık çalışmasının bir parçası olarak, 106 MOI'de HEK293T sferoidlerinde AAV2-scGFP transdüksiyonunun gerçek zamanlı canlı hücre görüntülemesi.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Film 5: 104 MOI değerindeki HEK293T sferoidlerinde AAV2-scGFP transduksiyonunun gerçek zamanlı canlı hücre görüntülemesi.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Film 6: MOI 101 değerindeki HEK293T sferoidlerinde AAV2-scGFP transdüksiyonunun gerçek zamanlı canlı hücre görüntülemesi.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: AAV transdüksiyonu için gerekli MOI hesaplaması.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Burada, AAV geliştirme ve potans testi için optimize edilmiş bir in vitro 3B platformu sunuyoruz. Bu platform, insan doku mimarisini daha yakından taklit eden üç boyutlu hücre kültürü kullanarak artırılmış transdüksiyon, yüksek hassasiyet ve daha iyi translasyonel öngörülebilirlik sağlar. Bu sistem; tek zincirli ve kendini tamamlayan vektörler dahil olmak üzere, birden fazla hücre hattında farklı AAV serotipleri ve düzenleyici elementler arasındaki transdüksiyon etkinliğini başarıyla ayırt eder. Transdüksiyon verimliliğinin genellikle transgen-pozitif hücrelerin yüzdesi olarak tanımlandığı geleneksel 2B analizlerin aksine, 3B sferoid sisteminin tek hücre çözünürlüğünde kantifikasyona kolaylıkla izin vermediğini belirtmek isteriz. Bu nedenle, bu çalışmada transdüksiyon verimliliği, transdükte edilen hücrelerin oranı ile hücre başına transgen ekspresyon düzeyinin birleşik katkılarını yansıtan toplu raporlayıcı sinyal yoğunluğu (floresan veya lüminesans) olarak tanımlanmıştır. Sferoidlerin yüksek hassasiyeti, yüksek ürün miktarlarına olan ihtiyacı önemli ölçüde azaltarak sistemi AAV araştırma ve geliştirme çalışmaları için maliyet etkin, çok yönlü ve fizyolojik olarak uygun hale getirmektedir.

Bu yaklaşım, yapay yüzeylere yapışmaya dayanan ve hücresel organizasyondan yoksun olan geleneksel 2D hücre kültürü analizlerindeki temel zorlukları ele almaktadır; bu durum muhtemelen bu durum, klinik ortamlardaki vektör performansının zayıf tahmin edilmesine yol açmaktadır. 3D sferoid sistemi, doku yapısını ve ilaç dağılım modellerini daha iyi taklit ederek gerçek biyolojik koşullarla daha yakından eşleşen vektör davranış verileri sağlamaktadır.22,23Protokol, basit ultra düşük yapışma özellikli plakalar kullandığından, standart laboratuvar ortamlarında kolayca tekrarlanabilmektedir.

Bu uyarlanabilir sistem, AAV nötralizasyon analizleri için, AAV penetrasyonunu incelemek amacıyla ve farklı hücresel ortamların AAV transdüksiyonu üzerindeki etkilerini araştırmak için daha karmaşık ko-kültür deneyleri geliştirmek için kullanılabilir. Ayrıca, yüksek verimli ilaç ve vektör tarama platformları sferoid platformuyla kolayca entegre edilebilir; bu da daha hedefli ürünlerin geliştirilmesine yönelik vektör keşif iş akışlarında otomasyonu ve maliyet düşüşünü sağlar.

Sferoidlerin temel bir pratik avantajı, hücre pasajlaması gerektirmeden haftalarca sürekli büyüyebilmeleri ve böylece AAV aktivitesinin kapsamlı çalışmalarına olanak tanımalarıdır. Bu stabil kültür sistemi, 2D kültürlerde gerekli olan tekrarlayan hücre hasadının neden olduğu kesintileri önleyerek, önemli hücre-hücre etkileşimlerini ve matris bileşenlerini korur24. Korunan hücresel ortam, AAV'nin hücrelere bağlanmasını ve girişini değerlendirmek için temel olan doğal protein organizasyonunu ve membran yapılarını destekler25.

3B sferoidler, AAV transduksiyon değerlendirmeleri için büyük bir potansiyel göstermelerine rağmen, temel olarak yerli dokulara kıyasla basitleştirilmiş yapıları nedeniyle in vivo modellerle karşılaştırıldığında bazı translasyonel eksiklikler de sunarlar. Sferoidler; vektör iletimi için vaskülarizasyon, immünojeniteyi değerlendirmek için immün hücreler ve kan-beyin bariyeri gibi AAV performansını önemli ölçüde etkileyebilecek dokuya özgü bariyerler dahil olmak üzere kritik fizyolojik bileşenlerden yoksundur26. Bu kısıtlamalar, sferoidlerin geleneksel 2B kültürler ile in vivo hayvan modelleri arasında orta düzeyde bir karmaşıklık sunmasına rağmen, kapsamlı AAV değerlendirmesi için gereken fizyolojik mikroçevreyi tam olarak yeniden oluşturmak için yetersiz kaldığını göstermektedir.

Burada sunulan sferoid protokolü, her seferinde tek bir hücre tipini tanımlamaktadır. Bu protokol, temel bir üç boyutlu yapı oluşturacak şekilde kümelenen 2–3 ek hücre tipini içerecek şekilde geliştirilebilir. Organoidler veya mikroakışkanlar gibi daha karmaşık 3D modeller, doku benzeri paternlerde düzenlenmiş 10 veya daha fazla farklı hücre tipi içeren ve belirli organların hücresel çeşitliliğini ve organizasyonunu yeniden oluşturan çok hücreli sistemlerdir. Bu tür gelişmiş 3D organoidler; çoklu hücreleri27, hidrojel gömülü kültürleri, asılı damla tekniklerini ve mikroakışkan platformları11,27,28 içerebilir. Bu yöntemler, AAV biyolojisine dair anlayışımızı geliştirmeye yardımcı olabilecek daha karmaşık doku mimarileri sağlasa da, genellikle daha özel reaktifler, ekipmanlar ve önemli ölçüde teknik uzmanlık gerektirme eğilimindedirler. Öte yandan, ultra düşük yapışmalı plaklarda oluşturulan 3D sferoidler çok daha basittir ve maliyet etkinliği ile tekrarlanabilirliği sayesinde birçok laboratuvar için uygundur.

Bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması için kritik adımlar arasında, hücre canlılığının yüksek tutulması yer alır; çünkü hasarlı hücreler sferoid oluşumunu ve transduksiyon verimliliğini olumsuz etkileyebilir. Sferoid kompaktlığının sağlanması için ultra düşük yapışma özellikli plakaların kullanımı ve santrifüjleme işleminin optimizasyonu da kritiktir. Zayıf sinyallerden veya doygunluktan kaçınmak için her hücre tipi ve AAV serotipi için MOI'nin optimize edilmesi esastır. Uygun tespit yönteminin seçimi, özellikle sürekli canlı hücre görüntüleme sistemleriyle uyumluluğun gerektiği kinetik analizler için kritik önem taşır. 3D sferoidlerde AAV transduksiyonunun doğru yorumlanması için çeşitli teknik hususlar önemlidir.

Yetersiz veya mevcut olmayan bir transdüksiyon sinyali; düşük viral titreden, suboptimal MOI değerinden veya yetersiz inkübasyon süresinden kaynaklanabilir; bu durum, viral titrelerin doğrulanması, MOI'nin optimize edilmesi ve inkübasyon süresinin (genellikle 3–5 gün) uzatılmasıyla giderilebilir. Zayıf floresans veya lüminesans sinyalleri, düşük transgen ekspresyonunu veya 3D yapı içinde sınırlı reaktif penetrasyonunu yansıtabilir; bu durum, pozlama ayarlarının optimize edilmesi veya substrat difüzyonu için ek süre tanınmasıyla iyileştirilebilir. HeLa hücreleri gibi belirli hücre hatlarındaki temel zorluklardan biri, yüksek arka plan sinyaline ve floresans tabanlı analizlerde azalmış hassasiyete yol açabilen otofloresanstır. Bu sınırlamayı gidermek için, daha iyi bir sinyal-gürültü oranı sağlayan ve otofloresan arka planlarda transdüksiyonun daha doğru tespit edilmesine olanak tanıyan lüminesans tabanlı bir nanolüsiferaz raporlayıcı sistem uyguladık. Ek olarak, arka plan sinyali uygun olmayan eşikleme veya medya kaynaklı floresanstan kaynaklanabilir ve temel seviyeleri belirlemek için işlem görmemiş kuyucuklar (MOI = 0) kullanılarak kontrol edilmelidir. Son olarak, yüksek MOI değerlerinde sinyal saturasyonu, aşırı viral girdiye veya detektör sınırlamalarına bağlı olarak meydana gelebilir; bu durum, MOI aralığının düşürülmesi ve ölçümlerin lineer dinamik aralıkta tutulması için detektör pozlama ayarlarının optimize edilmesiyle hafifletilebilir.

Genel olarak, bu 3D sferoid metodolojisi, AAV transdüksiyonunu, potansiyelini ve kinetiğini değerlendirmek için modernize edilmiş, tekrarlanabilir bir sistem sunar. Konvansiyonel 2D analizler ile in vivo çalışmalar arasındaki boşluğu doldurarak, daha bilinçli vektör geliştirilmesine olanak tanır ve klinik olarak ilgili gen tedavisi stratejilerinin ilerlemesini destekler.

Açıklamalar

Yazarların beyan edeceği herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, AAV nanolüsiferaz üretimi için plazmidi ve canlı substrat reaktiflerini sağladıkları için Morten Seirup ve Trish Hoang'a teşekkür ederler. Bu proje, ABD Enerji Bakanlığı ile FDA arasındaki kurumlar arası bir anlaşma kapsamında Oak Ridge Bilim ve Eğitim Enstitüsü tarafından yürütülen, ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) CBER bünyesindeki ORISE Araştırma Katılım Programı'na yapılan bir atama ile desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
37°C inkübatörThermoFisher Scientific#51025983Standart kültür koşulları
A375 hücreleriATCCCRL-1619Hücre hattı
AAV1 plazmidiAddgene112862AAV plazmidi
AAV2 plazmidiAddgene104963AAV plazmidi
AAV5 plazmidiAddgene104964AAV plazmidi
AAV8 plazmidiAddgene112864AAV plazmidi
AAV9 plazmidiAddgene112865AAV plazmidi
BioTek GEN5 plaka okuyucuAgilent TechnologiesNAFloresans veya lüminesans için uç nokta okuması
SantrifüjThermoFisher Scientific#TSO-MX1RSferoid süspansiyonunu korumak için
Corning™ Hücre Kültürü Fosfat Tamponlu Salin (1X)Fisher Scientific#MT21040CMXHücreleri durulamak için PBS
DMEM yüksek glukoz, GlutaMAX takviyesi, piruvatThermoFisher Scientific#10569010Tam büyüme besiyeri
Ekstraselüler NanoLuc İnhibitörü PromegaN235BEkstraselüler ortamdan gelen herhangi bir Nanoluc® sinyalini söndürür  
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-Aldrich#F4135-500mLBüyüme faktörleri sağlamak için
HEK293T HücreleriATCCCRL-3216Hücre hattı
HeLa HücreleriATCCCRM-CCL-2Hücre hattı
HEP3B HücreleriATCCHB-8064Hücre hattı
HEPG2 HücreleriATCCHB-8065Hücre hattı
Huh7 HücreleriABMT8973Hücre hattı
IncuCyte S3 Ters mikroskopSartoriusNASferoid oluşumunu/büyümesini izlemek için
IVIS Spectrum Görüntüleme SistemiSpectralinvivoNALüminesans için uç nokta okuması
Nano-Glo® Canlı Hücre Analizi PromegaN2013Canlı hücre tespiti için lüminesan substrat reaktifi
Penisilin-Streptomisin (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific# 15140122Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için
Havalandırmalı T75 Doku Kültürü flasklarıFisher Scientific#NC0509296 Hücre büyütmek için kullanılan flasklar
Trypsin-EDTA (0.05%)ThermoFisher Scientific#25300120Hücrelerin enzimatik olarak ayrıştırılması
Ultra düşük yapışma plakalarıCorning#7007Sferoid oluşumunu teşvik etmek için hücre yapışmasını önler

Kaynaklar

  1. Mendell JR, et al. Current Clinical Applications of In Vivo Gene Therapy with AAVs. Mol Ther. 2021;29(2):464-88.
  2. Byrne BJ, et al. Current clinical applications of AAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 2025;33(6):2479-516.
  3. Najera SS, et al. AAV2 delivery of the saCas9 gene results in presentation of an HLA-A*02:01-restricted T cell epitope potent to induce T cell cytotoxicity. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(3):101506.
  4. Alhakamy NA, Curiel DT, Berkland CJ. The era of gene therapy: From preclinical development to clinical application. Drug Discov Today. 2021;26(7):1602-19.
  5. Arutyunyan IV, et al. Gene Expression Profile of 3D Spheroids in Comparison with 2D Cell Cultures and Tissue Strains of Diffuse High-Grade Gliomas. Bull Exp Biol Med. 2023;175(4):576-84.
  6. Cashen P, Manser B. Quality by design (QbD) for adeno-associated virus (AAV): A framework for a QbD assessment for AAV products within the chemistry manufacturing and controls (CMC) documentation [Internet]. Port Washington (NY): Pall Corporation; 2021. Available from: https://www.pall.com/
  7. Center for Biologics Evaluation and Research. Potency Assurance for Cellular and Gene Therapy Products: Draft Guidance for Industry [Internet]. Silver Spring (MD): U.S. Food and Drug Administration; 2023. Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/potency-assurance-cellular-and-gene-therapy-products
  8. Fu Q, Polanco A, Lee YS, Yoon S. Critical challenges and advances in recombinant adeno-associated virus (rAAV) biomanufacturing. Biotechnol Bioeng. 2023;120(9):2601-21.
  9. Martinez RA, et al. A versatile cell line for establishing potency of cell type-specific AAV transgenes. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101401.
  10. Zengel J, et al. Development of cell lines with increased susceptibility to diverse adeno-associated viral vectors to enable in vitro potency assays. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101416.
  11. Marconi GD, et al. Three-Dimensional Culture System: A New Frontier in Cancer Research, Drug Discovery, and Stem Cell-Based Therapy. Biology (Basel). 2025;14(7):875.
  12. Bialkowska K, Komorowski P, Bryszewska M, Milowska K. Spheroids as a Type of Three-Dimensional Cell Cultures-Examples of Methods of Preparation and the Most Important Application. Int J Mol Sci. 2020;21(17):6225.
  13. Ducker M, Millar V, Ebner D, Szele FG. A Semi-automated and Scalable 3D Spheroid Assay to Study Neuroblast Migration. Stem Cell Reports. 2020;15(3):789-802.
  14. Hiller T, et al. Generation of a 3D Liver Model Comprising Human Extracellular Matrix in an Alginate/Gelatin-Based Bioink by Extrusion Bioprinting for Infection and Transduction Studies. Int J Mol Sci. 2018;19(10):3129.
  15. Jakeman PG, et al. Improved in vitro human tumor models for cancer gene therapy. Hum Gene Ther. 2015;26(5):249-56.
  16. Kapalczynska M, et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 2018;14(4):910-9.
  17. Gunti S, Hoke ATK, Vu KP, London NR Jr. Organoid and Spheroid Tumor Models: Techniques and Applications. Cancers (Basel). 2021;13(4):874.
  18. McRobb LS, Lee VS, Faqihi F, Stoodley MA. A Simple Model to Study Mosaic Gene Expression in 3D Endothelial Spheroids. J Cardiovasc Dev Dis. 2024;11(10):305.
  19. Ohguro H, et al. 3D Spheroid Configurations Are Possible Indicators for Evaluating the Pathophysiology of Melanoma Cell Lines. Cells. 2023;12(5):759.
  20. Casey G, et al. Self-complementarity in adeno-associated virus enhances transduction and gene expression in mouse cochlear tissues. PLoS One. 2020;15(11):e0242599.
  21. Hutt JA, et al. Scientific and Regulatory Policy Committee Points to Consider: Nonclinical Research and Development of In Vivo Gene Therapy Products, Emphasizing Adeno-Associated Virus Vectors. Toxicol Pathol. 2022;50(1):118-46.
  22. El Harane S, et al. Cancer Spheroids and Organoids as Novel Tools for Research and Therapy: State of the Art and Challenges to Guide Precision Medicine. Cells. 2023;12(7):1001.
  23. Najera SS, et al. Targeting NAD+ Metabolism Vulnerability in FH-Deficient Hereditary Leiomyomatosis and Renal Cell Carcinoma with the Novel NAMPT Inhibitor OT-82. Mol Cancer Ther. 2025;24(2):200-13.
  24. Huang HL, et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 2010;17(1):36.
  25. Ripa I, Andreu S, Lopez-Guerrero JA, Bello-Morales R. Membrane Rafts: Portals for Viral Entry. Front Microbiol. 2021;12:631274.
  26. Habanjar O, Diab-Assaf M, Caldefie-Chezet F, Delort L. 3D Cell Culture Systems: Tumor Application, Advantages, and Disadvantages. Int J Mol Sci. 2021;22(22):12200.
  27. Kaiser VM, Gonzalez-Cordero A. Organoids - the future of pre-clinical development of AAV gene therapy for CNS disorders. Gene Ther. 2025;Mar 27. Epub ahead of print. PMID: 40148593.
  28. Ramamurthy RM, Atala A, Porada CD, Almeida-Porada G. Organoids and microphysiological systems: Promising models for accelerating AAV gene therapy studies. Front Immunol. 2022;13:1011143.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

3B SferoidlerGen letimiSferoid PlatformuTransgen EkspresyonuSerotip PerformansPotans De erlendirmesiCanl H cre G r nt lemeRaporlay c SinyalVekt r Optimizasyonu
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.