Yöntem makalesi

Osteoartrit Hastalarının Infrapatellar Yağ Pedlerinden Küçük Ekstraselüllü Veziküllerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/70518

⸱

3 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, the First Hospital of Hebei Medical University, 2Department of Orthopedic Surgery, Hebei Medical University Third Hospital

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ÖZET Bu protokol, osteoartrit hastalarının infrapatellar yağ pedleri dokularından küçük ekstraselüler veziküllerin (sEV) izole edilmesi ve karakterizasyonu için standartlaştırılmış bir iş akışı sunmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekstraselüler veziküller (EV'ler), özellikle 200 nm'den küçük veziküller olarak tanımlanan küçük hücre dışı veziküller (sEV'ler), hücrelerarası iletişimin temel aracıları olarak görev yapar ve neredeyse tüm hücre tipleri tarafından çeşitli biyolojik sıvılara salınır. Infrapatellar yağ pedi (IPFP), diz osteoartritinin (OA) gelişimi ve ilerlemesiyle yakından ilişkilidir. Ancak, sEV'leri doğrudan IPFP explantlarından izole etmek için standart yöntemler sınırlı kalmaktadır. OA hastalarından elde edilen IPFP dokularından türetilen sEV'lerin izolasyonu ve karakterizasyonu için tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. IPFP doku kültürlerinden toplanan koşullu ortam, düşük hızlı santrifüjleme ile hücreler ve kalıntılardan sıralı olarak temizlenir, ardından ultrasantrifüjleme yapılır ve sEV boyut aralığındaki veziküller zenginleştirilir. Ortaya çıkan veziküller, ekstraselüler veziküller (MISEV2023) çalışmaları için minimum bilgiye göre karakterize edilir; farklı fonksiyonel kategorilerde temsil edici protein belirteçleri seti kullanılarak öneriler kullanılır: CD63 zarla ilişkili tetraspanin olarak, ALIX ve TSG101 biyogenezde yer alan sitozolik proteinler olarak Endozomal Sorting Complex for Transport (ESCRT) mekanizması aracılığıyla ve Calnexin ise potansiyel izlemek için endoplazmik retikulum yerleşik protein olarak veziküler olmayan kontaminasyon. Bu iş akışı, osteoartrit araştırmalarında fonksiyonel testler veya proteomik profilleme gibi sonraki uygulamalar için uygun iyi tanımlanmış sEV hazırlıkları sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük ekstrasellüler veziküller (sEV'ler), Uluslararası Ekstrasellüler Vezikülleri Derneği (ISEV) tarafından önerilen operasyonel sınıflandırmaya göre, ekstraselülük veziküller (MISEV2023) yönergelerinde önerilen operasyonel sınıflandırmaya göre, genellikle çapı 200 nm'den küçük veziküller olarak tanımlanan heterojen bir hücredışı vezikülalt tipidir 1. sEV'ler neredeyse tüm hücre tipleri tarafından biyolojik sıvılara salınır ve hem fizyolojik hem de patolojik bağlamlarda hücrelerarası iletişimin aracıları olarak hayati rolleri nedeniyle giderek artan ilgi çekmiştir 2,3.

SEV'lerin zarı, birden fazla fonksiyonel proteinle zenginleştirilir. Bunlar arasında, CD63 gibi tetraspaninler vezikül zarı organizasyonu vefüzyon 4 ile ilişkilidir. Ayrıca, taşınım için gerekli endozomal sıralama kompleksi (ESCRT) ile ilişkili sitozolik proteinler, örneğin ALIX ve TSG101, sEV biyogenezi ve salgılanma için ayrılmaz bir yerdir. Sonuç olarak, izoleveziküllerin endozomal kökenini doğrulamak için güvenilir işaretleyiciler olarak hizmet ederler 5,6.

Infrapatellar yağ pedi (IPFP), osteoartritin (OA) başlangıcını ve ilerlemesiyle yakından bağlantılı aktif eklemle ilişkili bir doku olarak tanınmıştır7,8. İltihap ve dejeneratif koşullarda, IPFP'den elde edilen sEV'lerin inflamatuar aracılar ve patojenik sinyaller taşıyarak sinovial iltihaba ve kıkırdak bozulmasına katkıda bulunduğuvarsayılmaktadır9. OA hastalarından IPFP dokuları tarafından salınan sEV'lerin karakterize edilmesi, hastalıkla ilişkili hücreler arası iletişim ağları hakkında kritik bilgiler sağlayabilir.

Moleküler aracılar ve potansiyel terapötik ajanlar olarak sEV'lere artan ilgi göz önüne alındığında, yüksek verimli, yüksek saflıkta ve tekrarlanabilir bir izolasyon yaklaşımının oluşturulması şarttır. Diferansiyel ultrasantrifüjasyon en yaygın kullanılan arıtma stratejilerinden biri olmaya devametmesine rağmen, hücre kültürü süpernatantları veya biyosıvılar için optimize edilmiş protokoller, IPFP gibi katı yağ kaynaklı dokulara doğrudan uygulanmayabilir. Yüksek lipid içeriği, yoğun hücredışı matriks ve değişken enzimatik sindirim koşulları, vezikülün iyileşmesini ve saflığını etkileyebilir.

Doku ekzplant kültürü, doğal hücresel mimariyi ve hücre-hücre etkileşimlerini koruyarak aşırı enzimatik bozulmayı en aza indiren fizyolojik olarak ilgili bir yaklaşım sunar; böylece neredeyse doğal koşullarda salınan sEV'lerin toplanmasını mümkün kılar. Ancak, IPFP explant kültürlerinden sEV'lerin izole edilmesi için özel olarak tasarlanmış standart bir iş akışı şu anda eksik durumda.

Burada, osteoartrit hastalarının infrapatellar yağ pediyle ekzekt kültürlerinden küçük ekstrasellüler veziküllerin ayırt edici ultrasantrifüjasyon kullanılarak izole edilmesi ve karakterizasyonu için adım adım bir protokolü tanımlıyoruz; bu protokol, aşağı akım fonksiyonel ve translasyonel çalışmalar için tekrarlanabilir bir metodolojik çerçeve sağlıyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada osteoartrit hastalarından alınan IPFP dokularının kullanımı, Hebei Tıp Üniversitesi Birinci Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylandı (Onay No. [2024] 018). Örnek toplama onaylanan süre içinde gerçekleştirildi ve doku alımından önce tüm katılımcılardan yazılı bilgilendirilmiş onay alındı.

1. Ortam ve çözelti hazırlama

  1. 445 mL bazal DMEM/F12 ortamı, 50 mL ekzozom içermeyen fetal sığır serumu (%10) ve 5 mL Penisillin/Streptomisin/Amfoterisin B (sırasıyla 100 U/mL, 100 μg/mL ve 0.25 μg/mL) karıştırarak 500 mL ekzosom yoksulmuş tam DMEM/F12 ortamı hazırlayın. 0.22 μm filtre ile filtre sterilizasyonu.
  2. Western blot koşma tamponu hazırlayın; 950 mL damıtılmış su (dH 2O) ile 50 mL 20x koşma tamponu (Tris/MOPS/SDS) karıştırın.
  3. Western blot transfer tamponu hazırlayın; 800 mL dH2O ile 100 mL 10x transfer tamponu ve 100 mL mutlak etanol karıştırın.
    NOT: Bu hızlı transfer tamponu, oda sıcaklığında yüksek akımlı ıslak transfer (400 mA) için özel olarak optimize edilmiştir. Düşük ısı üretimi nedeniyle, 45 dakikadan kısa transfer süreleri için buz banyosu gerekmez; bu da 10–250 kDa aralığındaki proteinler için yüksek transfer verimliliğini sağladığı gösterilmiştir.
    DIKKAT: Mutlak etanol yanıcıdır. İyi havalandırılan bir alanda tutun ve ısı kaynaklarından uzak durun.
  4. Yıkama tamponunu 50 mL 20 x TBS (pH 7.5–7.6 aralığında 200 mM Tris ve 3 M NaCl) ve 2 mL Tween-20 ile 950 mL dH2O karıştırarak hazırlayın.
  5. Kemimilüminesans çalışma çözeltisi, eşit hacimde luminol/güçlendirici çözeltisi ve peroksit tamponu karıştırarak hazırlanın (yaklaşık 0,1 mL çalışma çözeltisi membran kare santimetre başına gereklidir).
    DIKKAT: Kemilyünesan substratlar tahriş edici olabilir. Eldiven ve göz koruyucu takın. Kimyasal atıkları yerel kurumsal düzenlemelere göre bertaraf etmelidir.

2. IPFP dokusunun hazırlanması ve koşullandırılmış ortamın toplanması

  1. Taze alınan IPFP dokusunu (yaklaşık 10 g) her yıkamada 50 mL önceden soğutmuş PBS ile üç kez, santrifüj tüpünde nazik manuel karıştırma ile yıkayarak kalan kan kalıntısını iyice çıkarın.
  2. IPFP dokusunu steril makas veya bistüri kullanarak yaklaşık 2mm x 2mm x 2mm civarında parçalara indirin.
  3. IPFP doku parçalarını T175 şişelerine aktarın. 50 mL ekzozom tükenmiş DMEM/F12 tam ortamı ekleyin. 37 °C'de, %5 CO₂ ile 48 saat boyunca hafif çalkalama ile kuluçka yapın.
  4. DMEM/F12 tam ortamını (yani koşullandırılmış ortamı) buz üzerinde 50 mL tüplerde toplayın. 70 μm'lik bir süzgeçten geçirerek doku kalıntılarını çıkarın.

3. Diferansiyel ultrasantrifüjleme ile sEV'lerin izolasyonu

NOT: Aşağıdaki adımların hepsini 4 °C sıcaklıkta veya buz üzerinde gerçekleştirin.

  1. İlk düşük hızlı santrifüj, doku kalıntılarını çıkarmak için
    1. Kondisyonlu ortamı 300 x g sıcaklığında 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice topla ve yeni 50 mL santrifüj tüplerine aktar.
    2. Süpernatantı 3.000 x g sıcaklığında 10 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın. Süpernatantı topla ve yeni tüplere aktar, böylece pelletin rahatsız edilmediğinden emin ol.
  2. Ara santrifüj ve filtreleme.
    1. Süpernatantı 10.000 x g hassasiyetinde 30 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
    2. Süpernatantı toplayın ve 0,22 μm vakum filtresinden geçirerek daha büyük vezikülleri ve kirleticileri temizleyin.
  3. İlk ultrasantrifüj: sEV pelletleme.
    1. Filtrelenmiş süpernatantı 40 mL polikarbonat santrifüj tüplerine aktarın.
    2. Örnekleri 110.000 x g hassasiyetinde, sabit açılı rotor (k-faktörü = 70) kullanarak 70 dakika boyunca 4 °C'de ultrasantrifüj yapın. Süpernatantı pipet kullanarak dikkatlice çıkarın.
    3. Pelleti 10 mL önceden soğutulan, steril PBS ile yeniden süskü tutun. Yeniden askılanmış çözeltiyi 0,22 μm bir şırınga filtresinden geçirerek kalan agregaların çıkarılmasını sağlayın.
  4. İkinci ultrasantrifüjleme: sEV arıtma
    1. Süspansiyonu tekrar 110.000 x g ile 70 dakika boyunca 4 °C'de sabit açılı rotor kullanarak ultrasantrifüj yapın (k-faktörü = 70).
    2. Süpernatantı dikkatlice atın, sEV pelletini tüpün dibinde bırakın. Son sEV pelletini 200 μL steril PBS ile yeniden askıya alın.
    3. Tekrarlayan donma-erime döngülerinden zarar görmesini önlemek için sEV süspansiyonunu 20 μL aliquot'a ayırın. Aliquotları uzun süreli kullanım için -80 °C'de sakla.

4. Western Blot analiziyle sEV'lerin karakterizasyonu

  1. SEV protein örneklerini hazırlayın.
    1. SEV pelletini (3.5.2. adımdan itibaren) 80–120 μL RIPA lizin tamponu ve proteaz inhibitörleriyle takviye edilmiş şekilde karıştırın.
      NOT: Tahmini proteinin 0,5–1,0 μg başına yaklaşık 1 μL RIPA tamponu oranı hedefleyin. Western blot analizi sırasında verimli elektroforetik ayrım ve yüksek kaliteli sinyal algılaması için en az 1,0 μg/μL nihai protein konsantrasyonu önerilir.
      DIKKAT: RIPA tamponu deterjanlar ve tahriş edici maddeler içerir. Kişisel koruyucu ekipman kullanın.
    2. Karışımı kısa bir süre vortex ile alıp örnekleri 15–30 dakika boyunca hafif sallayarak buz üzerinde kuluçka geçirin.
      NOT: Bu aşamada kapsamlı karıştırma, tam zar bozulması ve optimal protein salınımı için kritiktir. Yetersiz girdap oluşması, eksik lizize ve replikatlar arasında tutarsız protein konsantrasyonlarına yol açabilir.
    3. Lizat 12.000–14.000 x g arasında 10–15 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice topla.
    4. Yüksek duyarlılıklı bisinkonik asit (BCA) protein testi kullanarak sEV lizatının toplam protein konsantrasyonunu belirleyin.
      NOT: Daha düşük tespit aralığı (0,5–20 μg/mL) nedeniyle, ekstraselülük vezikül örnekleri için standart BCA testine göre yüksek duyarlılıklı bir BCA testi önerilir; bu test, saflaştırılmış sEV preparatlarından elde edilen tipik düşük protein konsantrasyonlarının doğru nicelenmesini sağlar. Testi kit protokolüne göre yapın.
  2. Western Blot Analizi.
    1. Protein örneklerini 5 x SDS-PAGE örnek yükleme tamponu ile karıştırın.
      NOT: CD63 tespiti için, örnekleri indirgemeyen 5x yükleme tamponu (β-merkaptoetanol olmadan) kullanarak hazırlayın ve 70 °C'de 10 dakika kuluçka yapın. Bu koşullar konformasyonel epitopları korur ve bu tetraspanin proteininin ısı kaynaklı toplanması önler. ALIX (ALG-2 ile etkileşimli protein X), TSG101 (tümör hassasiyet geni 101) ve Calnexin gibi diğer belirteçler için, %10 β-merkaptoetanol içeren indirgeme 5x yükleme tamponu kullanılarak örnekler hazırlayın ve 95 °C'de 5 dakika ısıtarak tam protein denatürasyonu sağlanır.
    2. Hazırlanan örnekleri (genellikle toplam 20–40 μg) precast gradyan jele (%4–%12) yükleyin.
    3. Protein moleküler ağırlık belirtecisini üreticinin önerilerine göre atanan kuyuya yükleyin.
    4. Jeli sabit 100 V voltajda çalıştırma tamponunda çalıştırın.
    5. Bu koşu 1–1,5 saat veya yükleme boyası jelin altına ulaşana kadar devam edin.
      NOT: Çalışma süresi, elektroforez sistemine ve jelin yüzdesine bağlı olarak değişebilir.
    6. Jelden proteinleri PVDF membranlarına 400 mA'da ıslak transfer sistemi kullanarak 30 dakika boyunca aktarın.
      NOT: Transfer süresi, kullanılan transfer tamponunun markasına bağlı olarak değişebilir.
    7. Zarları, %0,2 Tween-20 (TBS-T) içeren tris tamponlu tuzlu bir suyla hazırlanmış proteinsiz bloklayıcı tamponda oda sıcaklığında nazik bir çaltlama ile 30 dakika boyunca blokleyin. Bloklayıcı tampon, spesifik olmayan bağlanma ve arka plan girişimini en aza indirmek için serum proteinleri, biotin veya fosforile proteinler olmadan formüle edilir.
    8. Zarı, protein bazlı stabilizatörler ve antikor koruyucu katkı maddeleri içeren serumsuz antikor sulandırma tamponu içinde seyreltilmiş spesifik birincil antikorlarla gece boyunca (12–16 saat) hafif bir çaltlama ile inkübe yapın.
    9. Zarları yıkama tamponu (TBST %0,2 Tween-20 içeren) ile nazik bir çalkalama altında bir shaker üzerinde yıkayın.
    10. Zarları uygun ikincil antikorlarla oda sıcaklığında 1 saat boyunca hafif bir çaltlama ile kuluçka edin.
    11. Zarları tekrar yıkama tamponu içinde nazikçe çalkalayıcı üzerinde yıkayın.
    12. Protein bantlarını kemimilüminesans substrat kullanarak görselleştirin.
      DIKKAT: Kemilyünesan substratlar cilt ve gözleri tahriş edebilir. Uygun eldiven ve koruyucu gözlük takın. Substratı kurumsal tehlikeli atık yönergelerine göre bertaraf et.

5. Nanopartikül İzleme Analizi (NTA) ile sEV'lerin karakterizasyonu

  1. Üreticinin talimatlarına göre nanopartikül takip analizörünü ve şırınga pompası modülünü açın ve ölçüm öncesi sistemin en az 30 dakika dengelenmesine izin verin.
  2. EV örneklerini buz üzerinde nazikçe eritin ve örnekleri steril, partikülsüz fosfat-tamponlu tuzlu sulunda (PBS) seyreltirin; böylece önerilen ölçüm aralığında (yaklaşık 1 x 108 ila 1 x 109 parçacık/mL) optimal partikül konsantrasyonu elde edilir.
  3. Sulandırılmış numuneden 1 mL steril bir şırıngaya yükleyin ve numuneyi yavaşça ölçüm odasına enjekte edin, böylece hava kabarcıkları oluşmadığından emin olun.
  4. Kamera seviyesini ayarlayın ve odaklanın, bireysel parçacıkların Brownian hareketini net görselleştirin.
  5. Her örnek için sürekli akış koşullarında şırınga pompası kullanarak 60 saniyelik üç video kaydederek tutarlı partikül dağılımını sağlayın.
  6. Algılama eşiği 12, bulanıklık boyutu Otomatik ve maksimum zıplama mesafesi Otomatik olarak ayarlanmış NTA yazılımı ile kaydedilen videoları analiz edin.
  7. Yazılımın otomatik analiz fonksiyonunu kullanarak parçacık boyutu dağılımı ve konsantrasyon profilleri oluşturun.
  8. Ham verileri, parçacık boyutu dağılımı grafiklerini ve konsantrasyon ölçümlerini daha fazla istatistiksel analiz için dışa aktarın.
  9. Ölçüm odasını steril, partikülsüz su ile iyice temizleyin, ardından %70 etanol ekleyin ve numuneler arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için tekrar steril partikülsüz suyla yıkayın.

6. SEV'lerin İletim Elektron Mikroskopisi (TEM) ile karakterizasyonu

  1. Karbon kaplamalı 200 mesh bakır ızgaralar kullanın. Eğer mümkünse, bir parıltı deşarj sistemi kullanarak ızgaralarda 30 saniye boyunca parlayan deşarj işlemi yapın.
  2. 10 μL sEV süspansiyonunu (steril, filtrelenmiş PBS'de yeniden süspansiyon) ızgaraya uygulayın ve oda sıcaklığında 2–5 dakika kuluçka yapın.
  3. Fazla sıvıyı filtre kağıdıyla ızgaranın kenarına hafifçe dokunarak çıkarın.
  4. Izgarayı, örnek dolu yüzeyi üç ayrı ultra saf su damlasına sırayla yerleştirerek yıkayın.
  5. Izgaradan 10 μL %2 fosfortungstik asit çözeltisi (pH 7.0) uygulayın ve oda sıcaklığında 1–2 dakika kuluçka yapın.
    DIKKAT: Fosfotungstik asit, cilt, göz ve solunum yollarında tahriş yaratabilecek aşındırıcı asidik bir reaktiftir. Eldiven ve göz koruma gibi uygun kişisel koruyucu ekipmanlar takarak kurumsal güvenlik kurallarına uygun şekilde müdahale edin. Lekelenen atıkları ve kirlenmiş malzemeleri onaylanmış tehlikeli kimyasal atık prosedürlerine uygun olarak bertaraf et.
  6. Fazla lekeyi filtre kağıdı ile temizleyin ve ızgaranın oda sıcaklığında en az 10 dakika boyunca tamamen hava kurumasına izin verin.
  7. Şebekeleri, 80 kV hızlandırma voltajında çalışan bir iletim elektron mikroskobu kullanarak inceleyin.
  8. Vezikül morfolojisini değerlendirmek için uygun büyütmelerde temsilci görüntüler alın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan infrapatellar yağ pedleri (IPFP) dokularından küçük ekstrasellüler veziküllerin (sEV) başarılı izolasyonu multimodal karakterizasyon yoluyla doğrulandı.

Geçirim elektron mikroskopisi (TEM), izole edilen veziküllerin karakteristik fincan şekilli morfolojiye sahip olduğunu ve açıkça tanımlanmış lipid çift katmanlı zarlara sahip olduğunu ortaya koymuştur; bu durum sEV'lerin yapısal özellikleriyle uyumlu (Şekil 1)11.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, insan infrapatellar yağ pedleri (IPFP) dokularından küçük ekstraselüler vezikülleri (sEV) explant kültürü ve ardından diferansiyel ultrasantrifüjleme ile izole etmek için tekrarlanabilir ve pratik bir iş akışı sağlar. İzole veziküller, transmisyon elektron mikroskopisi (TEM), nanopartikül takip analizi (NTA) ve yerleşik EV belirteçlerinin Western blot tespiti gibi tamamlayıcı karakterizasyonyöntemleriyle doğrulandı 1. TEM, karakteristik morfolojiye sa...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların hiçbirinin ilan edecek çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Ulusal Ana Araştırma ve Geliştirme Programı (hibe numarası 2023YFC3604905), Hebei Maliye Bakanlığı (hibe numarası: ZF2024132 ve ZF2024143), Hengrui-Hebei-Nehrei Yenilik ve Kalkınma Tıbbi İşbirliği Programı tarafından finanse edilmiştir HR2002048

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
40 mL PET Santrifüj Tüplerihimac (Eppendorf Himac Technologies)5720411148Polietilen tereftalat, 26 x 90 mm
70 µ m Hücre SüzcüPekin Lanjieke Teknolojisi560049Doku kalıntılarının uzaklaştırılması için
Anti Alix antikorŞanghay Açıkları BiyoteknolojisiCY7215sEV pozitif işaretleyici
Anti Kalneksin antikoruŞanghay Açıkları BiyoteknolojisiCY5839Negatif işaretleyici (ER kontaminasyonu)
Anti CD63 antikorAffinity BiosciencesDF2305Tetraspanin işaretleyicisi
Anti TSG101 antikorŞanghay Açıkları BiyoteknolojisiCY5985sEV pozitif işaretleyici
BCA Protein Test KitiŞanghay YaMei BiyoteknolojisiZJ102Protein nicelendirmesi için
Hücre kültürü şişesi (T175)NEST Biyoteknolojisi560229IPFP ekplant kültürü için
Santrifüj tüpü (50 mL)BIOFIL560041Başlangıçta düşük hızlı adımlar için
Ekzosom tükenmiş fetal sığır serumuCyagen BiosciencesFBSNE-01061Doku kültürü için
HRP Keçi Tavşan Karşıtı IgGŞanghay Açıkları BiyoteknolojisiAB0101WB için ikincil antikor
Anında Protein Yükleme Tamponu (Denatürleme, Azaltma, 5 Kez;)Şanghay YaMei BiyoteknolojisiLT101Protein denatürasyonu için
Mikro BCA Protein Analiz KitiTermo Bilimsel23235Protein nicelendirmesi için
Millex-GP Filtre Ünitesi (0.22 ve mikro; m)Pekin Lanjieke Teknolojisi560360Steril, vezikül filtrasyonu için
Nanopartikül İzleme AnalizörüMalvern PanalyticalNanoSight NS300Boyut ve konsantrasyon analizi için
Omni-Flash Buzsuz Hızlı Transfer TamponuŞanghay YaMei BiyoteknolojisiPS201SWestern blot protein transferi için
Fosfotungstik asit (%2)Sigma-AldrichP4006TEM negatif boyama için
Protein Yükleme Tamponu (Denatürleyici, İndükleyici, 5& kez;)Şanghay YaMei BiyoteknolojisiLT103Protein denatürasyonu için
Proteinsiz Hızlı Bloklama Tamponu (5&Times;)Şanghay YaMei BiyoteknolojisiPS108Zarları bloklamak için
RIPA liz tamponuPekin Solarbio Bilim & Teknoloji Co.,LtdR0010SEV protein ekstraksiyonu için
TBS(20×)Pekin Solarbio Bilim & Teknoloji Co.,LtdT1080Yıkama tamponu hazırlamak için
İletim Elektron MikroskobuHitachiHT7800Morfolojik karakterizasyon için
Tris/MOPS/SDS Elektroforez TamponuŞanghay YaMei BiyoteknolojisiPS120Protein ayrımı için
Tween-20Pekin Solarbio Bilim & Teknoloji Co.,LtdT8220Yıkama tamponu hazırlamak için
Ultrasantrifüjhimac (Eppendorf Himac Technologies)CP100NXYüksek hızlı izolasyon sistemi
Ultra hassas kemilyünestan tespit kitiŞanghay YaMei BiyoteknolojisiSQ201Protein bandı görselleştirmesi için
Evrensel Antikor Sulandırma TamponuŞanghay YaMei BiyoteknolojisiPS119LPrimer/ikincil antikorlar için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): from basic to advanced approaches. Journal of Extracellular Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  2. van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  3. Zhao, R., et al. Adipose tissue-derived exosome maintains metabolic balance of extracellular matrix in rat nucleus pulposus cells. International Journal of Nanomedicine. 20, 2411-2425 (2025).
  4. Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nature Communications. 12 (1), 4389(2021).
  5. Larios, J., Mercier, V., Roux, A., Gruenberg, J. ALIX- and ESCRT-III-dependent sorting of tetraspanins to exosomes. Journal of Cell Biology. 219 (3), e201904113(2020).
  6. Ferreira, J. V., et al. LAMP2A regulates the loading of proteins into exosomes. Science Advances. 8 (12), eabm1140(2022).
  7. Tang, S., et al. Single-cell atlas of human infrapatellar fat pad and synovium implicates APOE signaling in osteoarthritis pathology. Science Translational Medicine. 16 (731), eadf4590(2024).
  8. Peters, H., et al. Cell and transcriptomic diversity of infrapatellar fat pad during knee osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 84 (2), 351-367 (2025).
  9. Cao, Y., et al. Extracellular vesicles in infrapatellar fat pad from osteoarthritis patients impair cartilage metabolism and induce senescence. Advanced Science. 11 (3), e2303614(2024).
  10. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031(2015).
  11. Pascucci, L., Scattini, G. Imaging extracellular vesicles by transmission electron microscopy: coping with technical hurdles and morphological interpretation. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1865 (4), 129648(2021).
  12. Kowal, E. J. K., Ter-Ovanesyan, D., Regev, A., Church, G. M. Extracellular vesicle isolation and analysis by western blotting. Methods in Molecular Biology. 1660, 143-152 (2017).
  13. Han, Y., Ye, M., Ye, S., Liu, B. Comparison of lung tissue-derived extracellular vesicles using multiple dissociation methods for profiling protein biomarkers. Biotechnology Journal. 19 (9), e202400329(2024).
  14. Xue, J., Huang, D., Zhou, H., Qin, T., Liu, Y., Chen, J. Tissue-derived extracellular vesicles: comparing Ts-EVs and Te-EVs in extraction, characteristics and research trends. Cancer Cell International. 26 (1), 82(2026).
  15. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Scientific Reports. 10 (1), 1039(2020).
  16. Görgens, A., et al. Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), e12238(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Infrapatellar Fat PadVesicle IsolationVesicle CharacterizationUltracentrifugationProtein MarkersCD63 MarkerFunctional AssaysProteomic Profiling
Video yakında

İlgili makaleler