Method Article

Osteoartrit Hastalarının Infrapatellar Yağ Pedlerinden Küçük Ekstraselüllü Veziküllerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/70518

⸱

April 3rd, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, the First Hospital of Hebei Medical University, 2Department of Orthopedic Surgery, Hebei Medical University Third Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ÖZET Bu protokol, osteoartrit hastalarının infrapatellar yağ pedleri dokularından küçük ekstraselüler veziküllerin (sEV) izole edilmesi ve karakterizasyonu için standartlaştırılmış bir iş akışı sunmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekstraselüler veziküller (EV'ler), özellikle 200 nm'den küçük veziküller olarak tanımlanan küçük hücre dışı veziküller (sEV'ler), hücrelerarası iletişimin temel aracıları olarak görev yapar ve neredeyse tüm hücre tipleri tarafından çeşitli biyolojik sıvılara salınır. Infrapatellar yağ pedi (IPFP), diz osteoartritinin (OA) gelişimi ve ilerlemesiyle yakından ilişkilidir. Ancak, sEV'leri doğrudan IPFP explantlarından izole etmek için standart yöntemler sınırlı kalmaktadır. OA hastalarından elde edilen IPFP dokularından türetilen sEV'lerin izolasyonu ve karakterizasyonu için tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. IPFP doku kültürlerinden toplanan koşullu ortam, düşük hızlı santrifüjleme ile hücreler ve kalıntılardan sıralı olarak temizlenir, ardından ultrasantrifüjleme yapılır ve sEV boyut aralığındaki veziküller zenginleştirilir. Ortaya çıkan veziküller, ekstraselüler veziküller (MISEV2023) çalışmaları için minimum bilgiye göre karakterize edilir; farklı fonksiyonel kategorilerde temsil edici protein belirteçleri seti kullanılarak öneriler kullanılır: CD63 zarla ilişkili tetraspanin olarak, ALIX ve TSG101 biyogenezde yer alan sitozolik proteinler olarak Endozomal Sorting Complex for Transport (ESCRT) mekanizması aracılığıyla ve Calnexin ise potansiyel izlemek için endoplazmik retikulum yerleşik protein olarak veziküler olmayan kontaminasyon. Bu iş akışı, osteoartrit araştırmalarında fonksiyonel testler veya proteomik profilleme gibi sonraki uygulamalar için uygun iyi tanımlanmış sEV hazırlıkları sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük ekstrasellüler veziküller (sEV'ler), Uluslararası Ekstrasellüler Vezikülleri Derneği (ISEV) tarafından önerilen operasyonel sınıflandırmaya göre, ekstraselülük veziküller (MISEV2023) yönergelerinde önerilen operasyonel sınıflandırmaya göre, genellikle çapı 200 nm'den küçük veziküller olarak tanımlanan heterojen bir hücredışı vezikülalt tipidir 1. sEV'ler neredeyse tüm hücre tipleri tarafından biyolojik sıvılara salınır ve hem fizyolojik hem de patolojik bağlamlarda hücrelerarası iletişimin aracıları olarak hayati rolleri nedeniyle giderek artan ilgi çekmiştir 2,3

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada osteoartrit hastalarından alınan IPFP dokularının kullanımı, Hebei Tıp Üniversitesi Birinci Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylandı (Onay No. [2024] 018). Örnek toplama onaylanan süre içinde gerçekleştirildi ve doku alımından önce tüm katılımcılardan yazılı bilgilendirilmiş onay alındı.

1. Ortam ve çözelti hazırlama

  1. 445 mL bazal DMEM/F12 ortamı, 50 mL ekzozom içermeyen fetal sığır serumu (%10) ve 5 mL Penisillin/Streptomisin/Amfoterisin B (sırasıyla 100 U/mL, 100 μg/mL ve 0.25 μg/mL) karıştırarak 500 mL ekzosom yoksulmuş tam DMEM/F12 ortamı hazırlayın. 0.22 μm ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan infrapatellar yağ pedleri (IPFP) dokularından küçük ekstrasellüler veziküllerin (sEV) başarılı izolasyonu multimodal karakterizasyon yoluyla doğrulandı.

Geçirim elektron mikroskopisi (TEM), izole edilen veziküllerin karakteristik fincan şekilli morfolojiye sahip olduğunu ve açıkça tanımlanmış lipid çift katmanlı zarlara sahip olduğunu ortaya koymuştur; bu durum sEV'lerin yapısal özellikleriyle uyumlu (Şekil 1)11.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, insan infrapatellar yağ pedleri (IPFP) dokularından küçük ekstraselüler vezikülleri (sEV) explant kültürü ve ardından diferansiyel ultrasantrifüjleme ile izole etmek için tekrarlanabilir ve pratik bir iş akışı sağlar. İzole veziküller, transmisyon elektron mikroskopisi (TEM), nanopartikül takip analizi (NTA) ve yerleşik EV belirteçlerinin Western blot tespiti gibi tamamlayıcı karakterizasyonyöntemleriyle doğrulandı 1. TEM, karakteristik morfolojiye sa.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların hiçbirinin ilan edecek çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Ulusal Ana Araştırma ve Geliştirme Programı (hibe numarası 2023YFC3604905), Hebei Maliye Bakanlığı (hibe numarası: ZF2024132 ve ZF2024143), Hengrui-Hebei-Nehrei Yenilik ve Kalkınma Tıbbi İşbirliği Programı tarafından finanse edilmiştir HR2002048

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
40 mL PET Santrifüj Tüplerihimac (Eppendorf Himac Technologies)5720411148Polietilen tereftalat, 26 x 90 mm
70 µ m Hücre SüzcüPekin Lanjieke Teknolojisi560049Doku kalıntılarının uzaklaştırılması için
Anti Alix antikorŞanghay Açıkları BiyoteknolojisiCY7215sEV pozitif işaretleyici
Anti Kalneksin antikoruŞanghay Açıkları BiyoteknolojisiCY5839Negatif işaretleyici (ER kontaminasyonu)
Anti CD63 antikorAffinity BiosciencesDF2305Tetraspanin işaretleyicisi
Anti TSG101 antikorŞanghay Açıkları BiyoteknolojisiCY5985sEV pozitif işaretleyici
BCA Protein Test KitiŞanghay YaMei BiyoteknolojisiZJ102Protein nicelendirmesi için
Hücre kültürü şişesi (T175)NEST Biyoteknolojisi560229IPFP ekplant kültürü için
Santrifüj tüpü (50 mL)BIOFIL560041Başlangıçta düşük hızlı adımlar için
Ekzosom tükenmiş fetal sığır serumuCyagen BiosciencesFBSNE-01061Doku kültürü için
HRP Keçi Tavşan Karşıtı IgGŞanghay Açıkları BiyoteknolojisiAB0101WB için ikincil antikor
Anında Protein Yükleme Tamponu (Denatürleme, Azaltma, 5 Kez;)Şanghay YaMei BiyoteknolojisiLT101Protein denatürasyonu için
Mikro BCA Protein Analiz KitiTermo Bilimsel23235Protein nicelendirmesi için
Millex-GP Filtre Ünitesi (0.22 ve mikro; m)Pekin Lanjieke Teknolojisi560360Steril, vezikül filtrasyonu için
Nanopartikül İzleme AnalizörüMalvern PanalyticalNanoSight NS300Boyut ve konsantrasyon analizi için
Omni-Flash Buzsuz Hızlı Transfer TamponuŞanghay YaMei BiyoteknolojisiPS201SWestern blot protein transferi için
Fosfotungstik asit (%2)Sigma-AldrichP4006TEM negatif boyama için
Protein Yükleme Tamponu (Denatürleyici, İndükleyici, 5& kez;)Şanghay YaMei BiyoteknolojisiLT103Protein denatürasyonu için
Proteinsiz Hızlı Bloklama Tamponu (5&Times;)Şanghay YaMei BiyoteknolojisiPS108Zarları bloklamak için
RIPA liz tamponuPekin Solarbio Bilim & Teknoloji Co.,LtdR0010SEV protein ekstraksiyonu için
TBS(20×)Pekin Solarbio Bilim & Teknoloji Co.,LtdT1080Yıkama tamponu hazırlamak için
İletim Elektron MikroskobuHitachiHT7800Morfolojik karakterizasyon için
Tris/MOPS/SDS Elektroforez TamponuŞanghay YaMei BiyoteknolojisiPS120Protein ayrımı için
Tween-20Pekin Solarbio Bilim & Teknoloji Co.,LtdT8220Yıkama tamponu hazırlamak için
Ultrasantrifüjhimac (Eppendorf Himac Technologies)CP100NXYüksek hızlı izolasyon sistemi
Ultra hassas kemilyünestan tespit kitiŞanghay YaMei BiyoteknolojisiSQ201Protein bandı görselleştirmesi için
Evrensel Antikor Sulandırma TamponuŞanghay YaMei BiyoteknolojisiPS119LPrimer/ikincil antikorlar için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): from basic to advanced approaches. Journal of Extracellular Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  2. van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Small Extracellular VesiclesInfrapatellar Fat PadOsteoarthritis PatientsVesicle IsolationVesicle CharacterizationUltracentrifugationProtein MarkersCD63 MarkerFunctional AssaysProteomic Profiling
Video Coming Soon

Related Articles