Yöntem makalesi

Donmuş Buffy Tüy Örneklerinden İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre Hatlarının Yeniden Programlanması

DOI:

10.3791/70522

⸱

10 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Interdisciplinary Neuroscience, University of Georgia, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 4Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia, 5Division of Pediatric Endocrinology, Emory University School of Medicine, 6Dysautonomia Center, New York University Langone Health, 7Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Emory University School of Medicine, 8Stem Cell Core, Columbia Stem Cell Initiative, Columbia University, 9Department of Cellular Biology, University of Georgia

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, üreticinin talimatlarına uygun olarak yeniden programlanması zor olan hasta örneklerinin periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC) indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevinin sorun giderilmesi adımlarını detaylandırıyor. Bu protokol donmuş buffy tüy örneklerine özgüdür ancak saflaştırılmış PBMC'lerin yeniden programlanmasına da uygulanabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler), hastalık modellemesi için değerli bir araçtır. Daha fazla kök hücreler, indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC) olarak adlandırılan yetişkin somatik hücrelerden yeniden programlanabilir. iPSC teknolojisi, belirli çalışma katılımcılarının ve popülasyonların değerlendirilmesine olanak tanır ve kişiselleştirilmiş tıp girişimlerine girişimler yapar. Kan rutin olarak araştırma amaçlı alınır ve kriyokonserve edilir. Bu örnekler ya beyaz kan hücreleri ve trombositler içeren buffy coats olarak işleniyor; ya da eozinofil, bazofil, trombosit veya kırmızı kan hücresi içermeyen daha saf bir beyaz kan hücresi popülasyonunu temsil eden periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) olarak işlenir. Her ikisi de yeniden programlanabilir somatik hücreler için kolayca erişilebilir ve nispeten invaziv olmayan bir kaynaktır. Birkaç rapor PBMC'lerden yeniden programlama detaylı olarak gösterirken, sadece biri donmuş buffy paltolardan bu süreci anlatır. Son deneyimler, literatürde ve üreticilerden gelen PBMC yeniden programlama protokollerinin donmuş buffy tüy örneklerine uygulandığında başarılı olmadığını ortaya koymuştur; bu da burada açıklanan uyarlama ve sorun giderme stratejilerinin gerekmesini gerektirmiştir. iPSC teknolojileri kullanan birçok araştırmacı için, özellikle hasta örneklerinin sadece az hücre içerebileceği, uzun zaman aralıklarında alındığı, sınırlı katılımcı havuzundan olduğu veya başka şekilde çok değerli olduğu durumlarda, yüksek başarı oranına sahip kapsamlı protokollere sahip olmak şarttır. Burada, insan donmuş buffy ceketleri veya saflaştırılmış PBMC'lerin yeniden programlanma şansını artırmak için kontrol noktaları ve sorun giderme stratejileri belirlenmiştir. Sonuç olarak, bu protokol araştırmacıların yeniden programlama başarısının öngörücülerini belirlemelerine ve başarılı iPSC türetimi şansını artırmak için alternatif yaklaşımlar strateji geliştirmelerine olanak sağlayacaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan pluripotent kök hücresi (hPSC) teknolojisi, vücuttaki herhangi bir hücre tipine farklılaşabilen, kolayca ölçeklenebilir ve yenilenebilir bir insan hücre kaynağıdır; bu da araştırmacıların hastalarda elde edilmesi zor veya erişemeyen hücre ve doku tiplerini incelemelerine olanak tanır. Ayrıca, indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) doğrudan hasta somatik hücrelerindentüretilebilir 1. Bu, hastaya özgü hücre türlerinin farklılaşmasına olanak tanır ve hastalık modellemesi ile ilaç keşfi için paha biçilmez bir araçtır. Bu nedenle, somatik hücreleri iPSC'lere yeniden programlamak için titiz, tekrarlanabilir ve başarılı yöntemler kritik öneme sahiptir.

Fibroblastlar, idrar hücreleri ve kanhücreleri 2,3, her biri kendi sınırlamalarına sahip olup, iPSC türetimi için en sık kullanılan somatik hücre kaynaklarındandır. Tarihsel olarak yenidenprogramlama için en popüler tercih olan fibroblastlar, çok kolay elde edilemiyor ve biraz istilacı bir cilt biyopsisi gerektiriyor. Yeniden programlanabilir hücreler, kolayca elde edilen ve invaziv olmayan idrar örneklerinden türetilebilir, ancak yeniden programlama süreci, 4. toplamadan 4 saat sonra taze örneklerle başlamalıdır. Kan, yeniden programlanabilir hücreler için harika bir kaynak sunar; çünkü elde edilmesi minimal invazivdir, kolayca bulunabilir. Periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler), lenfositler, monositler ve doğal katil hücreler dahil tek çekirdekli kan hücrelerinden birçok yeniden programlamaprotokolü mevcuttur 5. PBMC'ler diğer kan hücrelerine göre daha az yoğun olduğundan, taze izole edilmiş tam kan örneklerinden yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile izole edilebilir/arındırılabilirler 5. Alternatif olarak, santrifüjleme sırasında tüm kan üç farklı tabakaya ayrılır: plazma, buffy cokat ve kırmızı kanhücreleri 6. Buffy tüyleri PBMC'ler, trombositler ve bazı eritrositler içerir. Ancak, PBMC'ler çoğu biyobankada daha az bulunabilirken, tam kan veya buffy tüyler bol ve erişilebilir7. Biyobankalarda buffy coat'ların bulunmasına ve bu örneklerde yeniden programlanabilir PBMC'lerin bulunmasına rağmen, çok az protokol donmuş buffycoats 8'den yeniden programlama detaylı olarak tanımlıyor ve bu da bu kaynakları keşfedilmemiş bir kaynak haline getiriyor.

Şu anda, yeniden programlamayı kolaylaştırmak için birçok yayımlanmışprotokol 1,8,9 ve ticariolarak erişilebilen kit 10 bulunmaktadır; Ancak, yeniden programlanması zor olan hasta donör hücrelerinin başarısını en üst düzeye çıkarmanın yollarını derinlemesine çözmezler. Bazı hücrelerin yeniden programlanmadığı yaygın olarak kabul edilir ve bu olduğunda, birçok araştırmacı farklı bir donör hücre tipi veya farklı bir hasta ile denemek zorunda kalır. Ancak, bu birçok araştırmacı veya hasta popülasyonu için uygulanabilir bir seçenek olmayabilir. Daha önce yayımlananprotokoller 8,9'un aksine, bu protokol yeniden programlama başarısını tahmin etmek için kontrol noktaları ve kriterler içeren bir rehber içerir ve donmuş buffy paltolarını eritildiğinde yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile arındırarak benzersiz bir yaklaşım benimser.

Süreç, seçilmiş bireylerden kan alınması ve ya PBMC'lerin ya da buffy tüylerin izole edilmesiyle başlar. Yeni deneyler için, muhtemelen IRB onayı ve uygun bir onay formuyla taze kan alacak yeni bağışçıların işe alınması da göz önünde bulundurulacaktır. Sonraki adım, donmuş kan hücrelerinin eritip hematopoietik kök hücrelerin ve eritroid öncülerin çoğalmasını teşvik eden koşullarda kültürlendiği somatik hücre genişlemesidir; bu kan hücreleri yeniden programlanma için en iyiadaylardır 11. 10–14 gün sonra, hücreler yeniden programlanmaya hazır olmalıdır; bu, önceki protokollerde tartışılmayan belirgin bir morfolojiyle kanıtlanıyor ve ardından Yamanaka faktörleri Oct4, Sox2, c-Myc ve Klf41 taşıyan Sendai virüsüyle aşılanarak transdüksiyon yapılmalıdır. Transdüksiyondan sonra hücreler Yamanaka transkripsiyon faktörlerini ifade etmeye başlar ve tekrar çok güçlü bir duruma döner; bu durum yine belirgin bir morfolojik değişim ve kök hücre kolonilerine yayılmasıyla belirtilir. Ortaya çıkan koloniler daha sonra bireysel olarak seçilir, genişletilir ve kriyopresler edilir. On pasajdan sonra, kök belirteçleri ve üç tohum tabakasına farklılaşma potansiyelinin ifadesinin doğrulanmasıyla karakterizasyon yapılarak başarılı bir şekilde yeniden programlanmış iPSC hattı doğrulanır.

Bu protokol, < 1 ay saklanan kriyokonsertif buffy tüyleri veya eridikten sonra en az 1 milyon canlı hücre bulunan 2 yıla kadar saklanan kriyokonsertli PBMC'ler için en iyi şekilde çalışır. Ancak, tanımlanan kontrol noktaları, herhangi bir kaliteli kan örneğinden sorun giderme yeniden programlamada rehberlik edebilir. Ayrıca, yeniden programlanmış iPSC'lerin besleyici olmayan koşullara uyarlanmasıyla ilgili detaylar, başlangıç somatik hücre tipine bakılmaksızın herhangi bir iPSC yeniden programlama iş akışına uygulanabilir.

Bu protokol, uygulamalı sorun giderme yoluyla oluşturulmuştur; donmuş buffy montlardan iPSC'leri yeniden programlamayı detaylandırır ve yeniden programlama başarısının morfolojik göstergelerini belirler; böylece zor örnekleri yeniden programlamak için uygulanabilir bir rehber sunar. Sonuç olarak, bu stratejilerin uygulanması zaman, para, reaktifler ve örneklerin korunmasına yol açar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Georgia Üniversitesi insan araştırmaları etik komitesinin yönergelerini takip etmektedir. Tüm insan denek çalışmaları, Dünya Tıp Birliği'nin Helsinki Bildirgesi'nin yönergelerine göre gerçekleştirilmiştir. Kendi raporlarına dayanarak, gönüllüler şu hastalıklardan muzdarip olmadılar: kistik fibroz, kronik obstruktif akciğer hastalığı, tüberküloz, astım, diyabet veya akut hava yolu enfeksiyonları. 18–50 yaş arası ve her iki cinsiyetten gönüllüler de alındı. Hamile kadınlar çalışmadan hariç tutuldu.

1. Buffy tüy veya PBMC ekstraksiyonu ve kriyokonserasyonu

Karar kriterleri: Örnekler uzun süre saklanacaksa, en iyisi 2. seçeneği seçmektir. PBMC arıtması için reaktifler mevcut değilse veya örnekler kısa bir süre saklanacaksa, seçenek 1 uygundur.

  1. Seçenek 1: Buffy Tüylü Çıkarımı
    1. WHO en iyiuygulamalarına göre flebotomi (kan almak için damar ponksiyonu) yapın ve antikoagülant kaplı kan toplama tüplerine 7–10 mL tam kan alın. Örnekleri buzda tutun.
    2. 7–10 mL tam kan 15 mL'lik konik bir tüpe aktarılır. Frenler kapalı halde 200 x g g'de sallanan kova santrifüjle 15 dakika boyunca 4 °C sıcaklıkta kanı aşağı döndürün. Bu, üstte sarı plazma, ortada beyaz buffy tüy tabakası ve altta kırmızı eritrositler içeren 3 katman oluşturmalıdır.
    3. Plazmayı, buffy tüy tabakasını bozmadan steril serolojik pipet kullanarak toplayın. Plazmayı at. Beyaz buffy tüy tabakasını taze 15 mL'lik konik bir tüpe (yaklaşık 1–2 mL) aktarın.
      DIKKAT: Plazmayı uygun biyotehlike atık kutusuna atın.
      NOT: Buffy tüyünün plazma kontaminasyonu sorun değil çünkü çözüldükten sonra iyileşmeye yardımcı oluyor.
    4. Buffy kaplamaya DMSO ekleyin, böylece nihai bileşim %10 DMSO v/v olur ve hemen -80 °C'de kriyovialde (1 mL/şişe) dondurun. Ertesi gün, şişeleri uzun süreli depolama için sıvı azota dönüştürün.
      NOT: Örneğin, 2 ml buffy coat için 200 μl DMSO ekleyin, iyi karıştırın, ardından aliquot ile 2 şişeye karıştırın. Bu genellikle her örnek başına 1–3 donmuş şişe ile sonuçlanır.
  2. Seçenek 2: PBMC Arındırması
    1. WHO en iyiuygulamalarına göre flebotomi (kan almak için damar ponksiyonu) yapın ve antikoagülant kaplı kan toplama tüplerine 7–10 mL tam kan alın. Örnekleri buzda tutun.
    2. 4 mL yoğunluk gradyanı çözeltisi 1'i yeni 15 mL'lik konik bir tüpe ekleyin. Yoğunluk gradyan çözeltisi 1'in üzerine dikkatlice 4 mL kan katmanlayın.
    3. Santrifüj ile 400 x g RT hızında 30 dakika boyunca salınan kovalı santrifüj ile frenleri kapatın. Bu, üst tabakada plazma, orta katmanda PBMC ve kalan kanın alt tabakada oluşmasına yol açar.
    4. PBMC fraksiyonunu yeni 15 mL'lik konik bir tüpe içine toplayın, ardından fren açık iken 350 x g hassasiyette sallanan kovalı santrifüjde 5 dakika boyunca 1x PBS ile 2–3 kez yıkayın. Üst yüzeyi at. Kriyokorumayı atlayıp hemen yeniden programlamaya başlamak için 2.3.4 adımına geçin.
      DIKKAT: Süpernatantı uygun biyotehlike atık kutusuna atın.
    5. Pelleti kriyo-koruma ortamında (%90 serum ve %10 DMSO) tekrar süsle ve hemen -80 °C'de kriyovialde (1 mL/şişe) dondurun. Ertesi gün, şişeleri uzun süreli depolama için sıvı azota dönüştürün.
      NOT: PBMC taze kandan arındırma için yoğunluk gradyanı santrifüjü yerine PBMC izole kan toplama tüpleri kullanılabilir. Ticari olarak mevcut alternatif dondurma ortamlarıyla kriyopreserve da mümkündür. Tipik verim, örnek başına 1–4 dondurulmuş şişedir.

2. Somatik hücre genişlemesi için örnekler hazırlamak

  1. Medya hazırlığı
    1. 45 mL EM taban alikotla Genişleme Ortamı (EM)9'u hazırla. 127,8 μL L-askorbin asit (100 mM stoktan 50 μg/mL) ve 450 μL penisillin-streptomisin (100x stok) ekleyin.
    2. EM + sitokinler 13 ila 4 ml EM hazırlanır, 2 μL kök hücre faktörü (SCF) (100 μg/ml stoktan 50 ng/mL), 2 μL interleukin-3 (IL-3) (20 μg/mL stoktan 10 ng/mL), 16 μL eritropoietin (EPO) (500 U/mL stoktan 2 U/mL), 4 μL insülin benzeri büyüme faktörü 1 (IGF1) (40 μg/ml stoktan 40 ng/mL), ve 4 μL deksametazon (1 mM stoktan 1 μM). EM + sitokinleri hazırlandığı gün kullanın.
      NOT: Alternatif ticari genleşme ortamı sistemleri kullanılabilir.
  2. Seçenek 1: Donmuş Buffy Ceketten PBMC Arındırması
    Karar kriterleri: Eğer birinci adımda 1. seçenek seçilmişse (yani buffy coat ekstraksiyonu), o zaman 2. adımda 1. seçeneği seçin (yani donmuş buffy coat'tan PBMC arıtma).
    1. Yoğunluk gradyanı çözeltisi 2'yi alın ve oda sıcaklığına gelmesine izin verin. Şişeyi ters çevirerek iyice karıştırın. 3 mL yoğunluk gradyanı çözeltisi 2'yi 15 mL'lik konik bir tüpe aseptik olarak aktarır.
    2. 12 mL Dulbecco'nun fosfat tampon tuzlu sonu (DPBS) ile başka bir 15 mL konik tüp hazırlayın.
    3. Donmuş buffy tüylü şişesini sıvı azottan çıkarın. Çözülmeye hazır olana kadar buzda kalın. Numuneyi 37 °C su banyosunda dönerek nazikçe eritin. Sadece küçük bir buz kristali kaldığında çıkarın.
    4. Şişenin içeriğini dikkatlice (damla) DPBS içeren konik tüpe aktarın. Şişeyi 1 mL DPBS ile durulayın ve alınan hücreleri içeren konik tüpe ekleyin.
    5. 200 x g hassasiyette 10 dakika boyunca sallanan kovalı santrifüj ile santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücre pelletini %1 fetal sığır serumu (FBS) ile 4 mL DPBS'de yeniden süspansiyona alın.
    6. Buffy kat karışımını yoğunluk gradyan çözeltinin üzerine nazikçe katmanlayın, karıştırmaya izin vermemeye dikkat edin. 800 x g hızda sallanan kova santrifüjde 20 dakika boyunca reflekte 20 dakika boyunca santrifüj yapın.
    7. Pipet ile, üst plazma tabakasını plazma:gradyan arayüzü bozmadan çıkarıp atabilirsiniz. Pipetle, arayüzdeki PBMC katmanını (Şekil 1A) çıkarıp temiz bir 15 mL tüpe aktarın.
      DIKKAT: Diğer katmanları uygun biyotehlike atık kutusuna atın.
    8. PBMC'leri 3 mL EM ile 200 x g sıcaklığında 10 dakika boyunca RT ile santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve pelleti 2 mL EM + sitokinlerle tekrar askıya alın. 12 kuyruklu bir plakanın 1 kuyusunda plaka.
    9. Plakayı kuluçka makinesine 37 °C, %5CO2 ve %20 O2 ile yerleştirin.
  3. Seçenek 2: Dondurulmuş PBMC'lerin eritilmesi
    Karar kriterleri: Eğer birinci adımda 2. seçenek seçildiyse (yani PBMC arıtma), ya da donmuş buffy tüylerinin düşük canlılığa sahip olacağı endişesi varsa (yani 1 aydan fazla depoda kalacak) (Şekil 1B), o zaman 2. adımda 2. seçeneği seçin (yani dondurulmuş PBMC'lerin eritilmesi).
    1. 12 mL DPBS ile 15 mL'lik konik bir tüp hazırlayın.
    2. Dondurulmuş PBMC şişesini sıvı azottan alın. Buz üzerinde dondurun, erimeye hazır olana kadar. Numuneyi 37 °C su banyosunda döndürerek nazikçe çözebilirsiniz. Sadece küçük bir kristal kaldığında çıkarın.
    3. Şişenin içeriğini dikkatlice (damla) konik tüpe aktarın. Şişedeki tüm hücreleri 1 mL DPBS ile durulayarak aldığınızdan emin olun.
    4. 200 x g RT'de sallanan kova santrifüjde 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve peleti (Şekil 1C) 2 mL EM içinde yeniden askıya alın, ardından hücre canlılığı için 10 μL alın ve hücresayısı 14'ü elde etmek için tripan mavisi dışlama testi yapılsın.
      DIKKAT: Süpernatantı uygun biyotehlike atık kutusuna atın.
    5. Plaka 1.0 x 106–2.0 x 10 6 hücre/mL 2 mL EM + sitokinler, 12 kuyululu bir plakanın bir kuyusunda. Plakayı kuluçka makinesine 37 °C, %5CO2 ve %20 O2 ile yerleştirin.

3. Somatik hücre genişlemesi (eridikten 1 gün sonra)

  1. Her kuyidan dikkatlice 1 mL harcanmış ortamı çıkarın. Kullanılan ortam başka bir kuyuya veya santrifüj tüpüne toplanabilir ve hiçbir hücrenin kaybedilmediğinden emin olmak için kontrol edilebilir.
  2. Kullanılan ortamı 1 mL taze EM + sitokin ile değiştirin.
  3. 3.1 ve 3.2 adımlarını tekrarlayın ve PBMC'lerin fotoğraflarını her iki günde bir alın, morfolojide önemli bir değişiklik gözlemlenene kadar; büyük ve küçük boyutlu parlak ve yuvarlak hücreler (Şekil 2A, turuncu ve mavi ok), bunlar eritroblastlar, yani yeniden programlanacak hücre tipidir. Bu yaklaşık 10–14 gün sürer.
    NOT: Bu morfolojileri göstermeyen hücreler, genellikle daha büyük yuvarlak hücrelere sahip olmayan hücreler (Şekil 2B), başarılı bir şekilde yeniden programlanma olasılığı düşüktür ve ölü olabilirler (Şekil 2C).

4. Transdüksiyon (Eridikten 10–14 gün sonra)

  1. Sendai Virüsü'nü Hazırlayın
    1. Lota özgü titer değerini kullanarak, üreticinin önerdiği gibi 5:5:3 enfeksiyon katlılığı (MOI) ile 2.0 ×10.5 hücrenin transdüksiyonu için gereken her virüsün hacmini hesaplayın. Bu hesaplamanın denklemi üretici tarafından sağlanan ürün belgelerinde bulunabilir.
    2. Virüsleri dondurucudan alıp dondurucudan buzda tutun, çözülene kadar buzun üzerinde tutulun. Virüsleri tek teker, 37 °C'lik bir su banyosunda nazikçe çözebilirsiniz.
    3. Üç virüsün tamamının, 2.0 ×10.5 hücrenin MOI 5:5:3 oranında transdüksiyonu için uygun hacimde karıştırdığı aliquotlar hazırlayın. Alikotları -80 °C'de dondurun, kullanıma hazır olana kadar.
      DIKKAT: Sendai Virüsü'ne temas eden tüm atıkları iyice ağarttığınızdan emin olun.
      NOT: Üretici talimatları, eklenen virüs hacmini belirlemek için MOI hesaplamasıyla hücre sayısının gerçek bir şekilde yapılmasını önerir, ancak bu protokol için yaklaşık 2.0 × 105 yaklaşımı başarılı olmuştur. Aliquote yapmak daha ekonomik olabilir ve virüslerin donma/çözülme döngülerini azaltır.
  2. Transdüksiyon Günü (d0)
    1. PBMC'ler bir gün önce beslenmemişse, 1 mL harcanmış ortamı çıkarın ve yerine 1 mL taze EM + sitokin verin. Virüs alikotunu buzda erit, sonra doğrudan kuyuya ekleyip medyayı karıştır.
    2. Plakayı parafilmle sarın ve plakayı RT hızında 350 x g hassasiyette sallanan bir kova santrifüjde 90 dakika boyunca santrifüj yapın. Tabağı gece boyunca 37 °C, %5CO2 ve %20 O2 sıcaklıklarında kuluçka makinesine yerleştirin.
      DIKKAT: Sendai Virüsü'ne temas eden tüm atıkları iyice ağarttığınızdan emin olun.
  3. Transdüksiyondan 1 gün sonra (d1)
    1. Hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın. 2 mL EM ile iyice durulayın ve tüm hücrelerin toplandığından emin olmak için mikroskop altında kontrol edin. Santrifüj hücrelerini RT hızında 300 x g ile 10 dakika boyunca koyun.
    2. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve 2 mL EM + sitokinlerle yeniden süzülün. 12 kuyuyulmuş yeni bir tabakaya yerleştirin ve tabağı 37 °C, %5CO2 ve %20 O2 sıcaklıklarda kuluçka makinesine geri gönderin.
      DIKKAT: Sendai Virüsü ile temas eden tüm atıkları iyice ağarttığınızdan emin olun.

5. Transdüksiyon Edilen Hücreleri Besleyici Hücrelere Yeniden Plaka Yapın

  1. Besleyici Hücreyi Hazırlayın
    1. 43,5 mL'ye Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamına (DMEM) 5 mL FBS (nihai konsantrasyon 10%), 0,5 mL minimum temel ortam temel olmayan amino asit çözeltisi (MEM-NEAA) (100x stoktan), 50 μL 2-merkaptoetanol (55 mM stoktan 55 μM) ve 0,5 mL antibiyotik-antimikotik (100x stoktan) eklenin.
    2. Jelatin kaplı 6 kuyu plakalarını 12 mL DPBS'ye 600 μL jelatin (%2 stoktan %0,1) ekleyerek ve her kuyu başına 2 mL dağıtarak hazırlayın. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın.
    3. Radasyonlu fare embriyonik fibroblastlarının (MEF) donmuş şişesini alın ve 37 °C su banyosunda nazikçe çözülerek alın.
    4. 15 mL konik tüpte 10 mL DPBS ve şişede ek 1 mL DPBS ile durulayın. RT'de 200 x g ile 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    5. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücre pelletini 1 mL fibroblast ortamında yeniden askıya alın. 10 μL alınarak hücre canlılığı için trypan blue dışlama testi yapılarak hücresayısı 14 elde edilir.
    6. 6 kuyu plakalarından jelatin çözeltisini çıkarın ve 2.5 ×10 4 hücre/cm2 oranında plaka ışınlı MEF'leri alın. İnkübatörde 37 °C, %5CO2 ve %20 O2 sıcaklıklarında 6–48 saat boyunca kuluçka yapın.
      NOT: Dönüştürülmüş hücrelerin yeniden kaplamasından önce besleyici hücre plakaları hazırlanmalıdır. En iyi sonuçlar, radyasyonlu MEF'lerin yeniden kaplamadan önce yaklaşık 2 gün kuluçka halinde yaşandığında görülmüştür, ancak en az 6 saat kuluçka yeterli olabilir.
  2. Transdüksiyon Hücreleri Yeniden Plaka
    1. 10 mL FBS (%10 son konsantrasyon) ile 90 mL DMEM/F12, 100x stoktan 1 mL MEM-NEAA ile 1 mL MEM-NEAA malzemesi, 1 mL L-glutamin (200 mM stoktan 2 mM), 100x stoktan 100 mL penisillin-streptomisin, 100 μL 2-merkaptoetanol (55 mM stoktan 55 μM) ve 100 μL fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2) (10 μg/mL stoktan 10 ng/mL) hazırla. Her beslemede taze L-askorbin asit (50 μg/mL) ekleyin.
    2. Transdüksiyondan sonraki 3. günde, transdüze edilen tüm ortam ve hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpe içine toplayın. En az 1 ml ekstra EM ile iyice durulayın ve 300 x g RT hızında sallanan bir kovalı santrifüjde 10 dakika boyunca durulayın.
    3. Pelleti 6 mL iPSC ortamda yeniden süskü altına alın. Plakanın 3 kuyusundan medyayı ışınlanmış MEF'lerle aspire edin.
    4. Hücreleri bu 3 radyasyonlu MEF (2ml/kuyyu) üzerine plaka transdüksiyonu yapar. 37 °C, %5CO2 ve %20 O2 sıcaklıklarında kuluçka içinde.

6. Koloni ortaya çıkana kadar bakım

  1. Transdüksiyondan sonraki 4., 5. ve 6. günlerde, her gün her kuyuya 1 mL taze iPSC madde ekleyin. Bu, yeni programlanmış hücrelerin besleyicilere yerleşirken gereksiz rahatsızlığını sınırlar ve aynı zamanda onlara taze besinler sağlar.
  2. Transdüksiyondan sonraki 7. günde, tüm eski ortamı çıkarın ve yerine her kuyuya 2 ml yeni iPSC ortam verin. Koloniler ortaya çıkmaya başlayana kadar her iki günde bir iPSC medyası ile beslenmeye devam edin.
  3. 78 mL DMEM/F12 hES medyası ile 20 mL FBS serbest takviyesi (20%), 1 mL MEM-NEAA (100x), 1 mL L-glutamin (200 mM stoktan 2 mM), 1 mL penisillin-streptomisin (100 kat), 100 μL 2-merkaptoetanol (55 mM stoktan 55 μM) ve 100 μL FGF2 (10 μg/ml stoktan 10 ng/mL) hazırlanın. Her beslemede taze L-askorbin asit (50 μg/mL) ekleyin.
  4. Küçük koloniler ortaya çıkmaya başladığında, transdüs hücreleri her iki günde bir hES medyası ile besleyerek korumaya devam edin (Şekil 3A).
    NOT: Koloniler, transdüksiyondan en erken 7 gün sonra ortaya çıkmaya başlar. Transdüksiyondan üç hafta sonra hiç koloni çıkmamışsa, koloninin ortaya çıkması pek olası değildir.

7. Koloniler büyüdükten sonra seçin (Şekil 3B)

NOT: Bazen transdüksiyon edilen hücreler, kök hücre benzeri bir koloni oluşturmayan morfolojik bir değişim geçirir (Şekil 3C). Bu, başarılı bir iPSC hattına yol açabilecek bir koloni olarak kabul edilmez.

NOT: Koloni oluşumundan itibaren, iPSC hatlarının laboratuvarın tercih edilen hPSC kültür koşullarına uyarlanması gerekecektir. Bu protokol, iPSC hatlarının besleyicisiz koşullara nasıl uyarlandığını, vitronectin (VTN) kaplı plakalarda kültürlendiğini, kimyasal olarak tanımlanmış ve ticari olarak mevcut hPSC ortamlarıyla beslendiğini gösterecektir. Koloniler yeni koşullara iyi uyum sağlamıyorsa, hES ortamıyla besleyici hücrelere seçilmek gibi daha yumuşak bir geçişe ihtiyaç duyabilirler.

  1. VTN kaplı plakaları eriterek ve iyice karıştırarak hazırlayın. 24 kuyu plakası için, 120 μL VTN ile 12 mL DPBS hazırlayın (500 μg/mL stoktan 5 μg/mL) ve 0,5 mL VTN çözeltisi/kuyuyu dağıtın. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın.
  2. HPSC ortamını 4°C'de bir şişe hPSC takviyesini gece boyunca eriterek hazırlayın. Çözüldükten sonra, bir 500 mL'lik hPSC bazal ortam şişesine 10 mL hPSC takviyesi ekleyin.
  3. Plakaları 24 kuyu plakasının kuyularından VTN çözeltisi çıkararak ve her kuyuya 0,5 mL hPSC ortam ile 0,5 μL Y-27632 (10 mM stoktan 10 μM) ekleyerek toplamaya hazırlayın.
  4. Yeni plakayı, transdüksiyon edilen hücreleri/kolonileri içeren 6-kuyuyu, steril şırınga iğnelerini ve bir p200 pipeti ile uçları steril koşullarda disseksiya mikroskobuna götürün.
  5. Transdüksiyon edilen hücreleri ve ortaya çıkan kolonileri içeren plakayı disseksiya mikroskobune yerleştirin ve mikroskopla seçilecek bir koloniyi bulun. Tabağın kapağını kaldırıp kuyunu ortaya çıkarın.
  6. Şırıngayı aseptik açıp iğneyi açığa çıkar. Mikroskop tarafından yönlendirilerek, iğne ucu ile koloninin çevresindeki besleyici hücrelerden koloniyi ayırarak koloninin konturunu iğneyle takip edin.
  7. İğne ucunu kullanarak koloniyi birkaç eşit boyutta parçaya böl. Koloni parçaları henüz plakadan ayrılmamışsa, iğnenin yanını kullanarak onları tabaktan alıp ya da kazıyarak yüzerler.
    DIKKAT: İğneyi uygun keskin kaba atın.
  8. P200 ile mikroskopla seçilmiş koloniyi yeniden konumlandırın. Yüzen koloniyi pipetle aspire edin ve hazırlanan 24 delikli plakanın bir kuyusuna aktarın. Tüm koloniyi başka koloni veya besleyici hücre olmadan kuyuya koymaya çalışın.
  9. Plakayı kuluçka makinesine 37 °C, %5CO2 ve %20 O2 ile yerleştirin.
  10. Toplanan kolonilere her gün 1 mL hPSC ortamı ile beslenin, ta ki birleşene kadar.
    NOT: Koloniler genetik olarak birbirinden farklı olma potansiyeline sahiptir. 24 kuyu plakasının her kuyusu, yalnızca bir seçilmiş koloni içermelidir. Her seçilen koloniye ayrı bir tanımlayıcı verilir ve bundan sonra diğer seçilmiş kolonilerden farklı bir hücre hattı olarak kabul edilir. Zorlu bir yeniden programlama turu için en az 24 koloni seçin ve en az 3'ünü genişletip karakterize edin.

8. Genişlet

  1. hPSC bakımı
    1. Seçilmiş koloniler, büyük ve yuvarlak olduklarında ve parlayan kenarları olduğunda bölünmeye hazırdır (Şekil 4A). Koloniler seçildiğinde birden fazla parçaya ayrılır. Bir kuyuda birden fazla koloni varsa, birbirleriyle temas edecek kadar büyüyüp ayrılmaya başlamadan önce onları ayırın.
    2. VTN kaplı 6 kuyu plakası hazırlayın: 6 kuyu plakası için, 12 mL DPBS ile 120 μL VTN (500 μg/mL stoktan 5 μg/mL) hazırlayın ve 1 mL VTN çözeltisi/kuyuyu dağıtın. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın. VTN çözeltisi DPBS ile değiştirilebilir ve bir ay boyunca 37 °C, %5CO2 sıcaklığında saklanabilir. Bölünecek kuyulardan DPBS aspirasyonu yapın ve yerine 1 mL hPSC ortamı verin.
    3. Kuyunun içindeki ortamı amoriye ile ayırın, sonra bir kez 1 mL DPBS ile durulayın. DPBS aspirasyonu ve 500 μL 0.5 mM EDTA dissosiyasyon tamponu eklen (500 mL DPBS ile 0.9 g NaCl ile hazırlanmış ve filtre sterilize edilmiş)15. 37 °C, %5CO2 sıcaklığında 2 dakika kuluçka yapın, ta ki koloniler gevşemeye başlayana ve her koloni içindeki hücreler yuvarlanıp ayrılana kadar.
    4. Plakayı kuluçka makinesinden çıkarın, EDTA dissosiyasyon tamponunu aspire edin. P1000 pipeti kullanarak, hücreleri 1 mL hPSC ortamı ile toplayın; kolonileri tamamen kopup hafifçe parçalanana kadar nazikçe yukarı aşağı pipet yapın. 1 mL ortam ve hücreleri, 1 mL taze hPSC ortamı içeren yeni 6-kuyu ortamına aktarın. Bu ilk bölünme 1:1 bölünme oranında yapılır, orijinal plakadan tüm hücreler yeni plakaya taşınır.
    5. Hücreleri kuluçka makinesine 37 °C, %5CO2 ve %20 O2 olarak yerleştirin. Kuyu birleşip bölünmeye hazır olana kadar iPSC'leri her gün besleyin.
      NOT: Kötü kök hücre morfolojisi (Şekil 4B), bölünme protokolünün daha erken ayarlanması, daha kısa EDTA kuluçka süresi veya bölünme oranının ayarlanması gibi yöntemlerle hafifletilebilir.
    6. 10 cm genişleme kabına çevirin.
      1. Hücreler 6 kuyruklu plakaların her birbirine birleştiğinde, 10 cm'lik bir çanağı VTN ile (7 mL DPBS ile 70 μL VTN (500 μg/mL stoktan 5 μg/mL) ile kaplayın, RT'de 1 saat kuluçka içinde).
      2. Bölünme protokolünü tekrarlayın, bu sefer 6 delikten 10 cm doku kültür kabına genişleyerek (bölünme oranı 1:1). Her 10 cm tabak için 7–10 mL hPSC ortamı kullanın.
      3. 10 cm içindeki hücreler birleştiğinde, bu bölünme süreci (geçiş) tekrarlanın. Her pasajda pasaj numarasını not edin. Bölünme oranı hücre morfolojisi ve yoğunluğuna bağlıdır. Tipik bir oran 1:10'dur; burada orijinal plakadan hücrelerin onda biri yeni plakaya taşınır.
  2. Dondurma ve stok hazırlıkları
    1. Yaklaşık 3 geçişten sonra, erken geçiş stokları için dört adet 10 cm'lik doku kültürü tabakasına genişletin. 10 cm kaplardaki hücreler birleştiğinde, dondurulmaya hazır olurlar.
    2. Kryovialleri hazırlayın ve soğuması için dondurucuya koyun. Etikette hücre hattı, klon, geçiş numarası ve donma tarihi olduğundan emin olun.
    3. Dondurma malzemesi hazırlayın: %90 hPSC orta ve %10 DMSO, 1 mL/şişe (10 cm tabak başına 3 donmuş şişe) gerekir.
    4. Her 10 cm çanağı için 4 mL 0.5 mM EDTA dissosiyasyon tamponu kullanarak bölünme protokolünü normal şekilde gerçekleştirin.
    5. EDTA kuluçkasından sonra aspirasyon EDTA'yı yapın. Yemeğe nazikçe 10 mL hPSC ortamı ekleyin.
    6. Hücreleri tabaktan nazikçe yuyla pipetle yapın. Hücreler çanak zemininden kolayca çıkar ve ortamla karışır. Kolonileri nazikçe parçalamak için sadece 2–5 kez pipet yapın, ancak tek hücrelere ayrılmayı önlersiniz.
    7. RT'de 200 x g g'de 5 dakika santrifüj yapın. Süpernatantı aspire edin ve hücre pelletini dondurucu ortamda yeniden süzülün.
    8. Hemen -80 °C'de izole edip dondurun. Donmuş şişeleri uzun süreli depolama için sıvı azot tankına aktarın.
    9. Karakterizasyon tamamlandıktan sonra aynı şekilde daha fazla hisse senedi dondurun.

9. iPSC'lerin karakterizasyonu:

  1. Kök işaretleyicilerinin ifadesi. En az 10 geçiş boyunca genişledikten sonra, 24 kuyudaki koloniler bölünmeye hazır olduğunda, %4 paraformaldehit ile sabitlenin ve kök belirteci NANOG için immünohistokimya ile boyanın. Kolonilerin Sendai Virüsü (SeV) negatif olması için en az 10 geçiş gerekir ve bu immünoflüoresans ile doğrulanabilir (Şekil 4C).
  2. Çoklu Potensiye Yeteneğini Test: Üç Tohum Katmanı Farklılaşması. iPSC pluripotensisi, üç mikrop tabakasının her birine başarılı bir şekilde farklılaşarak doğrulanır. Her farklılaşma, iyi hPSC morfolojisi sergileyen 10 cm'lik bir birleşim çanaktan başlar (Şekil 4A).
    1. Ektoderm16
      1. Farklılaşma başlamadan bir gün önce (1. gün): Tohum iPSC'leri, matris kaplı 24 kuyu plakalarda hPSC ortamında 2,6 × 105 hücre/cm2 yoğunlukta Y-27632 (10 μM nihai konsantrasyon) ve XAV-939 (2 μM nihai konsantrasyon) ile yapılır.
      2. 0. Gün – 1. Gün: 1 mL/kuyu diferensiasyon tabanıyla LDN (100 nM nihai konsantrasyon), SB (10 μM nihai konsantrasyon) ve XAV (2 μM nihai konsantrasyon) ile beslenin.
      3. 2. Gün – 7. gün: 1 mL/well diferensiasyon tabanı ile LDN (100 nM nihai konsantrasyon) ve SB (10 μM nihai konsantrasyon) ile beslenin. d3'ten itibaren her iki günde bir besle.
      4. 8. Gün: %4 paraformaldehit ile düzeltin ve ektoderm belirteciPAX6 17 için immünohistokimya ile boyanma ile boyantı ve pluripotensi belirteci NANOG kaybının doğrulanmasını sağlayın (Şekil 4D).
    2. Mezoderm18:
      1. Farklılaşma başlamadan bir gün önce (gün -1): Tohum iPSC'leri, matris kaplı 24 kuyu plakalarında hPSC ortamında 2,5 × 105 hücre/cm2 yoğunlukta Y-27632 (10 μM nihai konsantrasyon) ile yapılır.
      2. 0. Gün: DMEM/F12 ile L-Askorbik Asit (64 μg/mL nihai konsantrasyon), Sodyum Selenit (13,6 ng/mL nihai konsantrasyon), Holotransferrin (10 μg/mL nihai konsantrasyon), kimyasal olarak tanımlanmış lipid konsantre (100x) ve CHIR (5 μM nihai konsantrasyon) ile beslenin.
      3. 1. Gün: DMEM/F12 ile L-Askorbik Asit (64 μg/mL nihai konsantrasyon), Sodyum Selenit (13,6 ng/mL nihai konsantrasyon), Holotransferrin (10 μg/mL nihai konsantrasyon), kimyasal olarak tanımlanmış lipid konsantre (100x) ve heparin (0,6 U/mL nihai konsantrasyon) ile beslenin.
      4. 2. Gün: %4 paraformaldehit ile BRACHYURY-T19 için immünohistokimya ile boyama ve pluripotensi belirteci NANOG kaybını doğrulayın (Şekil 4E).
    3. Endoderm20
      1. Farklılaşma başlamadan bir gün önce (gün -1): Tohum iPSC'leri, matris kaplı 24 kuyu plakalarında 1.0 × 105 hücre/cm2 yoğunlukta hPSC ortamında, Y-27632 (10 μM nihai konsantrasyon) ile yapılır.
      2. 0. Gün – 4. Gün: d0 ile DPBS ile yıkayın ve RPMI ile L-glutamin ikamesi (100x), FBS (%0,5 nihai konsantrasyon) ve Activin A (100 ng/mL nihai konsantrasyon) ile besleyin. D0'dan itibaren her gün aynı medyayla beslen.
      3. 5. Gün: %4 paraformaldehit ile düzeltin ve endoderm belirteci SOX1721 için immünohistokimya ile boyama ile ve pluripotensi belirteci NANOG kaybını doğrulayın (Şekil 4F).
        NOT: Farklılaştırmalar daha önce yayımlanmış protokollere göre yapıldı. Deneyimimize göre, matris kaplamalar birbirinin yerine kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün başarısı çeşitli aşamalarda takip edilebilir. Tablo 1, bu protokolün uygulandığı örneklerin özetini sunar. Başlangıç örnekleri, ya bir hafta boyunca saklanan kriyokonsertif buffy kaplamalar ya da kriyokonsertlenen PBMC'lerdir; bu örnekler eridiğinde iyi örnek kalitesine sahip ve hücre genişlemesinden sonra 6/7 kez başarıyla yeniden programlandıktan sonra belirgin morfolojik görünüme sahiptir (Tablo 1, kategori 1). Benzer koşullarda toplanan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

iPSC teknolojisi, hastalık mekanizmalarının keşfi, kişiselleştirilmiş tıp ve "bir tabak içinde klinik denemeler" açısından biyomedikal alanda büyük potansiyele sahiptir22,23. Kan örneklerinden iPSC yeniden programlama için verimli ve uyarlanabilir protokoller, iPSC teknolojisinin büyük potansiyelini ortaya çıkarmak için anahtardır; çünkü bu protokoller kolayca toplanabilir ve genellikle biyobankalarda kolayca bulunabilir. Temizle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Araştırmanın ticari veya finansal ilişkiler olmadan yapıldığını, bu da potansiyel bir çıkar çatışması olarak değerlendirilebileceğini bildiriyoruz.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan denekler, IRB protokolü UGA# 2012-10769-06, NYU# s21-01701, Emory# 2024P008659 ve Emory# 000002114 protokollerine göre kan bağışı için bilgilendirilmiş onay alındı ve alındı. Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüsü'nün Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından 5T32GM142623 numaralı ödül ile J. Art'a, R01MH115174 V. Michopoulos'a ve R01NS114567 N. Zeltner'e desteklenmiştir. İçerik tamamen yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini mutlaka yansıtmaz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 cm standart doku kültürü çanaklarıFalcon353003
12 kuyulu plakaFalcon353043
15 mL konik borularFisher7200886
24 kuyulu plakaCorning7200740
%4 paraformaldehit çözeltisiTermo BilimselJ19943-K2
6 kuyulu plakaFisher ScientificFB012927
accuSpin1RFisher Scientific75003449
Aktivin ABio-techne338-AC
AF488-eşek ve alfa; keçiinvitrogenA11055
AF555-eşek ve alfa; rbtinvitrogenA31572
AF647-eşek & alfa; minvitrogenA31571
AF647-eşek & alfa; rbtinvitrogenA31573
Antibiyotik-Antimikotik (100X)Fisher15 240 096 
Basix Polistiren Serolojik PipotlarFisher14955233
14955234
14955235
14955236
BD Tüberkülin ŞırıngalarıFisher14-826-87
BD Vacutaine Cam Mononükleer Hücre Hazırlama (CPT) TüpleriFisher Scientific02-685-125PBMC kan toplama tüplerini izole ediyor
BD  K2EDTA özellikli Vakutainer Plastik Kan Toplama Tüpleri: Hemogard KapatmaFisher Scientific02-657-32Antikoagülent kaplamalı kan toplama tüpleri
B-MerkaptoetanolFisher21 985 023 
Sığır JelatiniSigmaG1393
Brachyury-T antikor poliklonal keçi IgGR& DAF2085
CellDrop BFDenovixCellDrop BF
Santrifüj 5702EppendorfEP022628102-1EA
kimyasal olarak tanımlanmış lipid konsantreFisherNC9022744
Chir 99021 R& D4423
CO2 kuluçka makinesiSanyoMCO-20AIC
Kriyokoruma Depolama SistemiÖzel Biyojenik SistemlerV-1500AB
CryoStor CS10Kök Hücre Teknolojileri100-1061Alternatif Dondurma Ortamı
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming KitFisherA16517
DeksametazonSigmaD2915
DMEMFisher11965118
DMEM/F12Fisher11330057
DMSOFisherBP231-1
DPBS 1X CA MG  olmadanFisherMT21031CM
EDTAFisherAM9262
Eritropoeitin (EPO)Bio-Techne287-TC-500
Essential 6 Medium (E6)FisherA1516401Farklılaşma Tabanı&NBSP;
Essential 8 orta (E8)FisherA1517001hPSC bazal ortam
EVOS FL mikroskobuTermoAMF4300
Fetal Sığır SerumuVWR45000-734
FGF temel (FGF2)Bio-techne233-FB/CF 
GeltrexFisherA1413202Matris kaplama
Gibco MEM Temel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100X)Fisher11140050
GlutamaxFisher35050061L-glutamin ikameci 
HeparinKök Hücre Teknolojileri7980
Histopaque 1077Sigma10771yoğunluk gradyanı çözümü 1 
HolotransferrinSigmaT0665
İnsan Kök Hücre Faktörü (SCF)Peprotech300-07-100UG
İnsülin benzeri Büyüme Faktörü 1 (IGF1)Peprotech100-11-100UG
Interleukin-3 (IL-3)Peprotech200-03-2UG
İzotemp 210 su banyosuFisher Scientific210
Nakavt-Serum Değişimi (KSR)Fisher10828028FBS ücretsiz takviye ve nbsp;
L-Askorbin AsitSigmaA4544-100G
LDN193189Stemgent04-0074
L-GlutaminFisher25030081
LenforepKök Hücre Teknolojileri7801Yoğunluk gradyanı çözümü 2
MatrigelCorningCB-40234Matris kaplama
Fare Embriyonik FibroblastlarıFisherA34964 
Nanog poliklonal keçi IgGR& DAF1997-SP
Nunc Biyobankacılık ve Hücre Kültürü Kriyojenik TüpleriFisher Scientific12-565-163N
Penisilin/StreptomisinFisher15140122
Arındırılmış anti-Pax-6 Antikor tavşan poliklonal IgGBiolegend901301
QBSF-60 Serumsuz OrtamKaliteli Biyolojik160-204-101EM tabanı
Geri Dönüşüm Hücre Kültürü Dondurma OrtamıThermo Fisher Scientific12648010Alternatif Dondurma Ortamı
rhVitronektin (VTN)FisherA31804
RPMI 1640 OrtaFisher11875093
SB431542R& D1614
Sendai virüsü HN Monoklonal Antikor Fare IgG2aInvitrogen14649482
Sodyum SelenitSigmaS5261
Sox17 Antikor Poliklonal keçi IgGR& Daf1924
StemSpan Eritroid Genişletme TakviyesiKök Hücre Teknolojileri2692Alternatif ticari genleşme ortamı takviyesi
StemSpan SFEM II ortamıKök Hücre Teknolojileri9605Alternatif ticari genleşme ortamı
Ultra Düşük Sıcaklık DondurucuThermo Fisher ScientificTSX60086A
Evrensel Pipet Uçları - FiltrelenmişVWR76322-132
76322-134
76322-150
76322-156
XAV939Bio-techne3748/10
Y-27632 DihidroklorürBioGems1293823

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Ray, A., et al. An overview on promising somatic cell sources utilized for the efficient generation of induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev Rep. 17 (6), 1954-1974 (2021).
  3. Raab, S., Klingenstein, M., Liebau, S., Linta, L. A comparative view on human somatic cell sources for ipsc generation. Stem Cells Int. 2014, 768391(2014).
  4. Sauer, V., et al. Human urinary epithelial cells as a source of engraftable hepatocyte-like cells using stem cell technology. Cell Transplant. 25 (12), 2221-2243 (2016).
  5. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , 161-167 (2015).
  6. Quirynen, M., Siawasch, S. aM., Yu, J., Miron, R. J. Essential principles for blood centrifugation. Periodontol 2000. 97 (1), 43-51 (2025).
  7. Perry, J. N., Jasim, A., Hojat, A., Yong, W. H. Procurement, storage, and use of blood in biobanks. Methods Mol Biol. 1897, 89-97 (2019).
  8. Meraviglia, V., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from frozen buffy coats using non-integrating episomal plasmids. J Vis Exp. (100), e52885(2015).
  9. Yang, W., et al. iPSC reprogramming from human peripheral blood using Sendai Virus mediated gene transfer. , Stembook. Cambridge (MA). (2008).
  10. Cerneckis, J., Cai, H., Shi, Y. Induced pluripotent stem cells (ipscs): Molecular mechanisms of induction and applications. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 112(2024).
  11. Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
  12. guidelines on drawing blood: best practices in phlebotomy. , World Health Organization. Geneva. (2010).
  13. Robb, L. Cytokine receptors and hematopoietic differentiation. Oncogene. 26 (47), 6715-6723 (2007).
  14. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3 B 1-A3 B 3 (2015).
  15. Chen, G. Splitting hESC/hiPSC lines with EDTA in feeder free conditions. , Stembook. Cambridge (MA). (2008).
  16. Zeltner, N., Lafaille, F. G., Fattahi, F., Studer, L. Feeder-free derivation of neural crest progenitor cells from human pluripotent stem cells. J Vis Exp. (87), e51609(2014).
  17. Zhang, X., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7 (1), 90-100 (2010).
  18. Lin, Y., Zou, J. Differentiation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in fully chemically defined conditions. STAR Protoc. 1 (1), (2020).
  19. Technau, U. Brachyury, the blastopore and the evolution of the mesoderm. Bioessays. 23 (9), 788-794 (2001).
  20. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a psc-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22 (12), 1421-1427 (2016).
  21. Kanai-Azuma, M., et al. Depletion of definitive gut endoderm in sox17-null mutant mice. Development. 129 (10), 2367-2379 (2002).
  22. Kirkeby, A., Main, H., Carpenter, M. Pluripotent stem-cell-derived therapies in clinical trial: A 2025 update. Cell Stem Cell. 32 (1), 10-37 (2025).
  23. Verma, I., Seshagiri, P. B. Current applications of human pluripotent stem cells in neuroscience research and cell transplantation therapy for neurological disorders. Stem Cell Rev Rep. 21 (4), 964-987 (2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

nd klenmi Pluripotent K k H crelerBuffy Coat Yeniden ProgramlamaPBMC Yeniden ProgramlamaK k H cre MorfolojisiSendai Vir s Transd ksiyonuK k H cre zelli i Belirteci NANOGEritroblast Diferansiyasyonumm nofloresan BoyamaYo unluk Gradyan ile Ay rmansan Pluripotent K k H creleri

İlgili makaleler