Toprak Bazal Solunumu Toprak Yönetimi ve Mikrobiyal Aktivitenin Etkisini Belirleme Yöntemi Olarak

Özet

Burada, toprak bazal solunumunu kızılötesi gaz analizörü (IRGA) kullanarak değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz; bu protokol toprak CO₂ dinamiklerinin kontrollü ve sürekli izlenmesine olanak sağlamaktadır; mikrobiyal aktivitenin tekrarlanabilir değerlendirilmesine olanak tanır.

Özet

Toprak solunumu, topraktan atmosfere CO₂ transferini temsil eder ve brüt birincil üretimden sonra en büyük karasal karbon akışlarından biridir. Büyük ölçüde toprak organizmalarının metabolik aktivitesinden kaynaklandığı için, toprak biyolojik aktivitesi, karbon dönüşümü ve çevresel veya yönetimle ilgili bozulmaların etkilerinin hassas bir göstergesi olarak yaygın olarak kabul edilir. Toprak solunum, bitki köklerinden ve rizosfer mikroorganizmalarından ototrofik solunum ve organik maddenin mikrobiyal ayrışmasıyla ilişkili heterotrofik solunum dahil olmak üzere birden fazla CO₂ kaynağını entegre eder. Dış substratlar veya yeni besin girdileri olmadan ölçüldüğünde, mikrobiyal solunum toprak bazal solunumu (SBR) olarak adlandırılır.

Bu makale, SBR'yi kontrollü laboratuvar koşullarında nicelendirmek için kızılötesi gaz analizörü (IRGA) tabanlı bir protokol sunmaktadır. Sadece mikrobiyal metabolizmaya atfedilen heterotrofik bileşeni izole etmek için, bitkiden kaynaklı CO₂ akışları, standart nem ve sıcaklık koşullarında kuluçka edilen önceden koşullandırılmış, elenmiş ve homojenleştirilmiş toprak örnekleri kullanılarak dışlanır; bu da C-CO₂ evriminin zaman içinde kümülatif olarak nicelleştirilmesine olanak tanır ve mikrobiyal biyokütle, aktivite ve toprak sağlığı için sağlam bir örnek sağlar. Protokol, toprak hazırlığı, nem ayarlaması, mühürlü şişe kuluçkası, IRGA tabanlı CO₂ ölçümü ve kümülatif solunumun hesaplanmasını içerir.

Bu çalışmada, SBR'yi kontrol edilen koşullarda toprak CO₂ dinamiklerinin izlenmesini sağlayan kızılötesi gaz analizörü (IRGA) kullanarak değerlendirdik. Temsil eden sonuçlar, kompost eklemenin Tabernas Çölü'nden kurak topraklarda mikrobiyal solunumu artırdığını ve bunun organik değişim sonrası mikrobiyal süreçlerin güçlü bir şekilde uyarıldığını gösterdiğini gösterdi. Bu bulgular, özellikle bozulmuş kurak ortamlarda toprak yönetiminin mikrobiyal aktivite üzerindeki etkilerinin bir göstergesi olarak SBR'nin faydasını vurgulamaktadır. Metodolojik olarak, IRGA tabanlı protokol, toprak karbon dinamiğiyle ilgili araştırma ve öğretim uygulamaları için pratik bir araç sunar.

Giriş

Toprak solunumu, toprak yüzeyinden atmosfere karbondioksit (CO₂) akışını kapsayan merkezi bir biyojeokimyasal süreçtir. Brüt birincil üretimden sonra ikinci en büyük karasal karbon^{akışı olarak tahmin edilmektedir 1} ve küresel karbon^{döngüsüne önemli katkı sağlar 2}. Bu süreç, karasal ekosistemlerde karbon dönüşümünün anahtarıdır ve toprak biyolojik aktivitesi ile toprak karbon tutumu dinamiklerinin hassas bir^{göstergesi olarak giderek} daha fazla kullanılmaktadır ^3,4.

Toprak solunumu birden fazla kaynaktan türegelir ve genellikle iki ana biyolojik bileşene ayrılır: bitki kökü metabolizmasından ve rizosferle ilişkili mikroorganizmalardan kaynaklanan ototrofik solun ve toprak organik maddesinin mikrobiyal ayrışmasıyla ilişkili heterotrofik^{solunum 5,6}. Karbonat aşınması⁷ ve fotodegradasyon⁸ gibi biyolojik olmayan kaynaklar da belirli koşullarda katkıda bulunabilir. Sadece mikrobiyal metabolizmaya atfedilen heterotrofik bileşeni izole etmek için, bitki kaynaklı CO₂ akışları hariç tutulmalıdır.

Bu bağlamda, mikrobiyal solunum, aerobik veya anaerobik metabolik süreçler sonucu bakteriler, mantarlar, protozoalar ve algler dahil mikroorganizmalar tarafından CO₂ üretimi veya O₂ alımı olarak^{tanımlanır9}. Harici substratlar veya yeni besin girdileri olmadan ölçüldüğünde, mikrobiyal solunum bazal^{solunum 10} olarak adlandırılır. Bazal solunum, yerli mikrobiyal topluluğun endojen metabolik aktivitesini yansıtır ve genellikle mikrobiyal biyokütle, aktivite ve çevresel ya da antropojenik bozulmalara karşı duyarlılık için bir vekil olarak^{kullanılır 11,12}.

Bazal solunumu doğru şekilde değerlendirmek için, önceden koşullandırılmış, elek ve homojenleştirilmiş toprak örneklerinde laboratuvar tabanlı ölçümler yapılır. Bu ön tedavi, kökleri ve makrofaunayı etkili bir şekilde ortadan kaldırır, böylece ototrofik solunum ortadan kaldırılır ve heterotrofik mikrobiyal aktiviteye odaklanma sağlanmasını sağlar. Eleme orijinal toprak yapısını değiştirse de, örnek homojenliğini ve tekrarlanabilirliğini artırır ve mikrobiyal süreçlerin izole olarak incelenmesini^{kolaylaştırır 9}. Kuluçka genellikle 25 °C ve toprak alanı kapasitesinin %60'ı gibi kontrollü çevresel koşullarda yapılır; böylece mikrobiyal aktivite belirli fonksiyonel grupları kayırmadan optimize^{edilir 13,14}. Bu bağlamda, toprak nemi ve alan kapasitesi kritik parametrelerdir çünkü mikrobiyal solunum su bulunabilirliğine karşı son derece hassastır; bu da substrat difüzyonunu, oksijen tedarikini ve mikrobiyal metabolizmayı düzenler. Bu nedenle, bazal solunum ölçümleri genellikle saha kapasitesinin oranı olarak ifade edilen standart nem koşullarında yapılır. Bir kuluçka dönemi boyunca evrimleşen C-CO₂, bazal solunum ölçüsü^{olarak nicelendirilir 15}.

Bu protokol, özellikle önceden koşullandırılmış topraklarda bazal solunum yoluyla mikrobiyal aktiviteyi değerlendirmeye yönelik kontrollü laboratuvar kuluçka çalışmaları için uygundur. Özellikle organik düzenleme veya diğer bozulmalar gibi farklı yönetim uygulamalarına maruz kalan toprakların homojenleştirilmiş örneklerle standart sıcaklık ve nem koşullarında karşılaştırılması için faydalıdır. Bitki kaynaklı CO₂ girdileri hariç tutulduğundan, yöntem en uygunu, toprak solunumunun heterotrofik bileşenini değerlendirmek için toplam toprak solmasına değil.

Toprak solunumunu nicelendirmek için çeşitli analitik teknikler geliştirilmiştir; her biri hassasiyet, verimlilik ve operasyonel karmaşıklık^{açısından farklılık gösterir 9,16}. Klasik yaklaşımlar arasında alkali emilim, ardından titrasyon, iletken sistemler, gaz kromatografisi ve kızılötesi gaz analizi bulunur. Alkali bazlı yöntemler sağlam ve nispeten ucuzdur, ancak sınırlı zaman çözünürlüğü sağlar ve eksik CO₂ emilimi veya sızıntısından etkilenebilir. İletkenlik yöntemler, sıcaklık ve iyon gücünden etkilense de, sürekli ölçümlere olanak tanır. Gaz kromatografisi, hassas kafa aralığı CO₂ nicelendirmesi sağlar ve diğer gazların eşzamanlı olarak belirlenmesini sağlar, ancak özel enstrümantasyon ve eğitimli personel gerektirir ve veri verimliliği sınırlı olabilir. Buna karşılık, kızılötesi gaz analizörleri (IRGA), kontrollü kuluçka koşullarında CO₂ konsantrasyonunun hızlı ve tekrarlanan izlenmesini sağlar; bu da onları mikrobiyal solunumun zamanla ölçülmesi için özellikle faydalı kılar. Ancak, IRGA ölçümleri tekrarlanabilirliği sağlamak için uygun kalibrasyon ve kuluçka koşullarının dikkatli kontrolünü gerektirir ve sinyal kayması, su buharı paraziti ve yüksek CO₂ konsantrasyonlarında azalan güvenilirlikten etkilenebilir. Son gelişmeler, laboratuvar ve saha uygulamaları için daha düşük maliyetli odalı ve sensör tabanlı platformlar dahil olmak üzere kızılötesi ve NDIR tabanlı toprak solunum sistemlerinin kullanılabilirliğini ^{artırmıştır 24,25}. Kapalı şişe kuluçkalarında, kuluçka sırasında aşırı CO₂ birikimini önlemek için headspace-toprak oranı ve ölçümler arasındaki aralık beklenen solunum hızına göre ayarlanmalıdır. Son zamanlarda IRGA tabanlı protokoller de yayımlanmıştır; kontrollü kuluçka koşullarında toprak solunumunun standartlaştırılmış laboratuvar ölçümlerini^{desteklemek için 26,27} ve toprak solunum ölçümleri için standartlaştırılmış metodolojik rehberlik de yakın zamanda FAO^{protokolünde 28 önerilmiştir.} Bu daha geniş bağlamda, bazal solunum uzun vadeli tarımsal deneylerde toprak sağlığı değerlendirmesinin bir bileşeni olarak da kabul edilebilir. Mikrobiyal metabolik aktivite ve C mineralizasyonunu yansıtırken, CO₂ yıkama, permanganat ile oksitlenebilir karbon ve toprak organik karbon yakalama gibi göstergeler toprak işleyişinin tamamlayıcı^{yönleri 29}. Bu çalışmada, kuluçka yoluyla toprak örneklerinden bazal solunum oranlarını nicelendirmek için IRGA tkullandık. Bu yöntem, kuluçka dönemi boyunca CO₂ afısının tekrar tekrar izlenmesini sağlar ve tanımlanmış nem ve termal koşullar altında mikrobiyal metabolik aktivitenin değerlendirilmesini kolaylaştırır. Aşağıdaki protokol, farklı yönetim koşullarına maruz kalan topraklarda bazal toprak solunumunu ölçmek için kullanılan laboratuvar prosedürünü tanımlar.

Protokol

1. Hazırlıklar

1. Örnek koleksiyonu:
   1. Yüzeysel çalışmalar durumunda her toprak horizonu veya 0-10 cm arasında örnekler toplayın.
      NOT: Mikrobiyal kontaminasyonları önlemek için dezenfekte edilmiş aletler ve eldivenler kullanın.
   2. Örnekleri izotermal torbalara yerleştirip soğutmalı bir kutuda laboratuvara taşıyabilirsiniz.
   3. Toprak ön işlemesi hemen yapılamazsa, örnekleri 4ºC'de tutun (tercihen 48 saatten fazla olmamalıdır).
   4. İşleme ve kuluçkadan önce örneklerin en az 2 saat oda sıcaklığında dengelenmesine izin verin.
2. Malzeme hazırlığı ve toprak ön işleme:
   1. Laboratuvar malzemelerini %10 çamaşır suyu veya %70 etanol içinde 30 dakika boyunca dezenfekte edin, ardından damıtılmış suyla iyice durulayın ve kullanmadan önce hava kurumasına izin verin.
      DIKKAT: Bu kimyasallarla çalışırken eldiven, laboratuvar önlüğü ve gözlük kullanın.
   2. Numuneleri stabilizasyon için 2 saat oda sıcaklığında bırakın.
   3. Örnekleri 2 mm'ye kadar elek yapın. Kökleri ve kaba kalıntıları cımbızla atın.
   4. Her örnekten sonra eleği dezenfeksiyon çözeltileriyle temizleyin ve kağıt havluyla kurutun.
3. Toprak nemini (mevcut su miktarı) ve tarla kapasitesini (toprağı tutabilen su) ^belirleyin17.
   1. Toprak nem hesaplaması: Toprak nemini, 20 g numuneyi seramik kapsülde 24 saat boyunca fırında kurutarak (105ºC)^{belirleyin [} Eq 1].
      [Eq 1]
   2. "Richards" basınç-zar cihazı¹⁹ kullanarak alan kapasitesini belirleyin.
      1. Toprak örnekleri, plastik halkalarla sınırlanmış cihazın seramik plakalarının üzerine yerleştirin.
      2. Damıtılmış suyu doygunluğa kadar ekleyin ve en az 24 saat bırakın. Daha sonra, diğer 24 saat için −0.33 bar (−33 kPa) basınç uygulanır. Sonra Denklem 1'e göre toprak nemini tekrar belirleyin.
4. Toprak yoğunluğunu (g·^mL-1) belirleyin. Fırında kurutulmuş toprak örneğiyle kamarlı ve bilinen hacimli bir kavanozu doldurun ve toprağın ağırlığını kaydedin. Toprak yoğunluğu, kavanozun ağırlık/hacim oranıdır.
5. İnkubasyon için örnek hazırlığı:
   1. İnkuluçka makinesinin sıcaklığını 25 °C'ye ayarlayın. UNE-EN ISO 16072:2002 standardı (Toprak kalitesi: Mikrobiyal solunumun belirlenmesi için laboratuvar yöntemleri, https://www.iso.org/standard/32096.html), çalışmalar arasında karşılaştırılabilirlik için sıcaklığı önerir).
   2. Nem koşullarını tahmin edin: Her örnek için başlangıç toprak nem^içeriği 20,21'den saha kapasitesinin %60'ına ulaşması için gereken damıtılmış hacmi hesaplayın. Bu, deneyin başındaki nem seviyesi olacak ve kuluçka döneminde su ayarlamasına gerek yok.
   3. Toprak miktarının seçimi: Kullanılan toprak miktarı, organik madde içeriğine göre değişebilir (organik madde içeriği ne kadar yüksekse, deney için o kadar az toprak gerekir)²¹. Ancak, referans miktarı olarak 20 g önerilmektedir.
   4. Örnekleri 100 mL'lik cam şişelere yerleştirin ve %60 saha kapasitesi nem yüzdesine kadar damıtılmış su ekleyin. Şişeleri septaumla kapatın ve kuluçka makinesine yerleştirin.

2._CO2 konsantrasyon ölçümleri

1. Ölçüm aralığı:
   1. Şişe başlığında aşırı CO₂ birikmesini önlemek için toprağın beklenen solunum hızına göre seçilmiş aralıklarda_CO2 ölçümleri yapılmalıdır.
   2. Mikrobiyal aktivitenin inhibisyonunu önlemek için %10'un (100.000 ppm) üzerindeki konsantrasyonlardan kaçının. Konsantrasyonlar bu eşiği aşarsa ölçüm aralıklarını kısaltın. İlk hafta boyunca günlük ve sonrasında her 3 veya 4 günde bir ölçümler yapın, daha sonra gösterilen örnekte gösterilir.
2. Kızılöte-Kızılötesi Headspace Gaz Analizörü (IRGA) ile CO2 konsantrasyonlarının (%) ölçülmesi
   1. Her ölçüm seansından önce üretici talimatlarına göre veya sıfır standart (CO₂ içermeyen hava veya azot) ve ölçüm aralığında bilinen CO₂ konsantrasyonuna sahip en az bir aralık standardı kullanarak IRGA'yı kalibre edin. Cihaz stabilitesini doğrulayın ve üreticinin talimatlarına göre temel kaymayı düzeltin. Numune ölçümlerinden önce kalibrasyon parametrelerini kaydedin.
   2. Malzeme listesinde tanımlanan IRGA cihazında, bir kapiller olan bir iğneyi enstrumana bağlayın..
   3. Neddle'ı septumdan şişeye sokarak bir aliquot gaz çıkarır ve CO₂ konsantrasyonunu (%) kaydedersin.
   4. Sinyal stabil olana kadar örnek başına tekrar tekrar ölçümler yapın.
3. Örnek yeniden yapılandırma
   1. Şişeleri, her ölçümden sonra toz ve hava akışından korunan temiz bir alanda (tercihen laminar akış odasında) yarım saat boyunca açık bırakarak havayı yenileyin ve anaerobik koşulları önleyin. Bu havalandırma aşamasında toprağı karıştırmayın veya karıştırmayın.
   2. Şişeleri septum kullanarak yeniden kapatın ve kuluçka odasına geri götürün.
4. _CO2 düzeltmesi
   1. Boş bir şişe için topraksız ama aynı çalışma koşullarına sahip bir şişe ekleyin.
   2. Çevresel CO₂ koşullarını çıkarmak için boşluğun değerlerini örneklere çıkarın.
      NOT: Açık şişelere yakın nefes vermeye dikkat edin. Bu da sonuçları olumsuz etkileyebilir.

3. Toprak bazal solunumunun (SBR) hesaplanması

1. Şişedeki başlık hacmini (Vhs) toprak (hacim yoğunluğu) ve eklenen suyun toplam şişe hacminden çıkararak belirleyin [Eq 2].
2. Toplu yoğunluk ölçümleriyle toprak hacmini tahmin edin ve eklenen nemden su hacmini hesaplayın. Bu düzeltilmiş baş aralığı hacmini sonraki tüm hesaplamalarda kullanın.
3. Şişedeki headspace hacminin belirlenmesi (Vhs): Şişenin hacmi en düşük toprak ve su içeriği hacmi [Eq 2] anlamına gelir.
   [Eq 2]
4. Şişedeki CO₂ hacminin tahmini
   1. Şişenin CO₂ hacmini, CO₂ konsantrasyonunun (%) IRGA okumalarından elde edin [Eq 3].
      
      [Eq 3]
5. Toprak örneklerinden salınan CO₂ mol tahmini:
   1. Toprak örneklerinden solunan CO₂ mollarını, ideal gaz yasası denkleminde (P ∙ V = n ∙ R ∙ T) [Eq 4] çözülerek elde edin; daha önce hesaplanan V'yi [Eq 3]'te değiştirdikten sonra.
      [Eq 4]
6. CO₂ akısı tahmini (mg C-CO₂ ^kg-1 kuru toprak ¹. gün)
   1. %_{CO 2'nin} bireysel ölçümleri eklenmeli ve nihai_CO2 akısı [Eq 5] kullanılarak aşağıdaki hususlarla tahmin edilmelidir: i) toprak nemi dikkate alınarak doğru örnek ağırlığı; ii) bir mol CO_2'nin 12 g C (12000 mg C) anlamına geldiğini düşünün.
      
      [Eq 5]
      burada:
      P = şişenin içindeki gaz basıncı. Bu, atmosferik (atm) ile eşdeğer olmalıdır. Konum değerleri doğru.
      Vhs = şişedeki gaz baş boşluğu hacmi (L)
      [% CO₂ ]= IRGA ile ölçülen CO₂ konsantrasyonu
      R = gaz sabitisi = 0.082 L·atm· K⁻¹·mol⁻¹
      T = Kelvin cinsinden kuluçka sıcaklığı
      kuru toprak = kg cinsinden kuru toprak kütlesi
      t = kuluçka süresi günler cinsinden
      Protokolün özet iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir.

Şekil 1: IRGA tabanlı toprak bazal solunum protokolünün iş akışı, toprak örnekleme ve ön koşullandırmadan kuluçkalamaya, IRGA ölçümü ve hesaplamalara kadar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Bu makalede gösterilen sonuçlar, düşük verimli toprakların verimlilik parametrelerini ve mikrobiyolojik aktiviteyi artırmak için kompostla değiştirildiği bir deneye karşılık gelmektedir. Orijinal topraklar, yarı kurak iklime ve zayıf gelişmiş topraklara sahip "Tabernas çölü"nde (Güneydoğu İspanya) ölçülmüştür^. Yaklaşık olarak, bir tarım tarlasının üst 30 cm'sinin 40 kg'sı örneklendi, laboratuvara götürüldü ve ince toprak fraksiyonu elde etmek için 2 mm elek alındı...

Tartışma

Toprak solunumu, mikrobiyal aktivite ve organik madde ayrışmasının hassas bir göstergesidir ve toprak yönetiminin etkileri hakkında dikkate değer bilgiler ^{sağlar 23,24}. Bu makalede açıklanan deneysel yaklaşım, kontrollü laboratuvar koşullarında CO₂ emisyon ölçümleriyle toprak mikrobiyal aktivitesini nicelendirmek için basit ve güçlü bir çerçeve^{sağlar ve} García ve ark. (2003)²¹ temel...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2 mm elek
Hava geçirmez şişeler veya septumlu şişeler (100 mL)
Analitik Terazi
Bar basınçlı plaka ekstraktör	Soil Moisture Equipment Corp, Goleta, CA, USA	1600F1	Tarlanın kapasitesini hesaplamak için
Deionize su veya sterilize edilmiş damıtma suyu
İnkübasyon ekipmanları	VWR Inc. Radnor, PA, USA	IL 250R PREMIUM
Silinmez kalem
IRGA CO2 konsantrasyon ölçer	Ametek Inc. Berwin, PA, USA	CheckMate 4	https://www.ametekmocon.com/products/headspacemapgasanalyzers/checkmate-4
İzotermal torbalar ve kutu			Toprağı laboratuvara taşımak için
Laboratuvar Fırını			105ºC'yi izin vermeli
Laminer akış odası	CRUMA	HZ-1	2.3 adımında isteğe bağlı
Septum tıkacı, şişeleri sıkıca kapatmak için
Toprak numuneleri			Araştırılacak alandan temsili bir şekilde toplanmıştır.
Sterilize edici reaktifler			%10 çamaşır suyu veya %70 etanol kullanılabilir