Yöntem makalesi

Kendi Kendine Kurulan Mezenkimal Kök Hücre Agregaatlarından Türetilen Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Terapötik Uygulaması

DOI:

10.3791/70534

⸱

24 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3Department of Stomatology, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 4The second Department of Surgery, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 5Military Medical Innovation Center, The Fourth Military Medical University, 6School of Basic Medicine, Shaanxi University of Chinese Medicine, 7Department of Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of The Fourth Military Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, büyük ekstraselülük veziküllerin (LEV) kendi kendine kurulan kök hücre agregalarından verimli izolasyonunu ve mandibular kemik yenilenmesi için terapötik kullanımını detaylandırır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekstraselüler veziküller (EV'ler), hücrelerarası iletişimin hayati aracıları ve rejeneratif tıp için umut vadeden hücresiz ajanlardır. EV alt popülasyonları arasında, büyük ekstrasellüler veziküller (LEV'ler), zenginleştirilmiş pro-rejeneratif yükleri nedeniyle doku onarımı için özellikle uygundur. Ancak, fonksiyonel diş kök hücresinden türetilen LEV'ler üretmesinin standart ve tekrarlanabilir yöntemleri, sonraki karakterizasyon ve terapötik değerlendirme için sınırlı kalmaktadır. Apikal papilladan (SCAP'lar) elde edilen kök hücrelerin olağanüstü osteojenik potansiyelini kullanarak, düşük yapışma koşullarında kendi kendine oluşan SCAP agregalarını indükleyen bir 3D kültür modeli geliştirdik. Bu model, fizyolojik mezenkimal yoğuşmayı taklit ederek hücre-hücre etkileşimlerini önemli ölçüde artırır ve LEV salgısını artırır. Toplam tutarlılığı artırmak ve LEV çıktısını maksimize etmek için hücre yaşamını korumak için temel kültür parametreleri ve işlem notları sağlanır. Burada, fonksiyonel SCAP kaynaklı LEV'lerin verimli üretimi için standartlaştırılmış bir protokol sunuyoruz; bu protokol 3D agregasyon üretimi, diferansiyel santrifüjle izolasyon, nanopartikül takip analizi (NTA) tabanlı parçacık boyutu dağılımı ve konsantrasyon analizi ile mandibular kemik defekt onarımı için termal çapraz bağlanmış hidrojel kullanarak terapötik teslimatı kapsıyor. Bu yaklaşım, kraniofasiyal rejenerasyonda aşağı akım mekanistik çalışmalar ve preklinik değerlendirme için LEV üretimini kolaylaştırmaktadır. Bu optimize edilmiş iş akışı, tutarlı verimler ve zenginleştirilmiş pro-osteojenik yükle biyoaktif LEV'lerin tekrarlanabilir hazırlanmasını sağlar, temel araştırmaları kolaylaştırır ve EV aracılı kraniofasiyal rekonstrüksiyonun klinik translasyonunu hızlandırır. Temsilci uygulamalarda, hidrojel yüklü LEV'ler kusur noktalarında yerel bir depo sağlar ve implantasyon sırasında rahat bir kullanım sağlar. Toplu olarak, bu yöntem SCAP kaynaklı LEV'ler hazırlamak için ölçeklenebilir bir platform sağlar ve standartlaştırılmış raporlama ile çeviri çalışma tasarımı için temel hususları vurgular. Bu yaklaşım, kraniofasiyal EV laboratuvarlarında daha geniş bir benimseme desteğini sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekstraselüler veziküller (EV'ler), hücreler tarafından salınan ve proteinler, miRNA'lar velipidler 1,2,3 gibi biyoaktif kargoların transferi yoluyla hücreler arası iletişimi aracılık eden zara bağlı nanopartiküllerdir. EV alt popülasyonları arasında, büyük ekstrasellüler veziküller (LEV'ler), hücre zarından doğrudan salınımları ve pro-rejeneratif moleküllerin doğal zenginlenmesi ile ayırt edilir; bu da onları doku onarımı ve yenilenme gereksinimleri için oldukça uygundur 4,5. Rejeneratif tıpta, mezenkimal kök hücrelerden (MSC) türetilen EV'ler, tüm hücre tedavisine karşı uygulanabilir bir hücresiz alternatif olarak giderek daha fazla kabuledilmektedir 6,7,8. Ebeveyn MSC'lerinin parakrin rejeneratif etkilerini özetlerken, düşük enjeksiyon verimliliği, immünojenlik ve parti değişkenliği gibi doğrudan hücre naklinin sınırlamalarındankaçınırlar 7,8,9,10. MSC kaynakları arasında, apikal papilladan (SCAP'lar) elde edilen kök hücreler üstün osteojenik ve odontojenik farklılaşmapotansiyeline sahiptir 11,12,13, bu da SCAP kaynaklı EV'leri özellikle orofasiyal kemik ve diş dokusu onarımı için cazipkılar 8.

Özellikle, EV'lerin biyogenezi ve işlevselliği hücresel mikroçevre tarafından derindenetkilenmektedir 14,15. Geleneksel iki boyutlu (2D) tek katmanlı kültürler, doğal doku bağlamından önemli ölçüdesapır 16,17 ve sıklıkla rejeneratif kapasite zayıf olanEV'ler üretir 18. Buna karşılık, üç boyutlu (3D) kendi kendine oluşturulmuş MSC agregajları, yüksek hücre yoğunluğu, yoğun hücre-hücre teması ve zenginleştirilmiş hücre dışı matriks (ECM) ile karakterize edilen gelişim aşaması fizyolojik mezenkimal yoğunlaşmanın temel yönlerini çoğaltmaktadır; bu aşama, yapısal destek sağlar ve hücre yapışması, göçü ve kader kararlarını düzenleyen biyokimyasal ve mekanik ipuçları verir 19,20,21. Bu biyomimetik 3D mikro ortam, hücreler arası iletişimi ve parakrin sinyalleri (22,23) artırmakla kalmaz, aynı zamanda daha yüksek verimli ve geliştirilmiş biyoaktif kargo profillerine sahip EV'lerin salgılanmasınıda teşvik eder 24,25,26. 3D kendi kendine montaj edilen MSC agregalarının kullanılması, rejeneratif uygulamalar için işlevsel olarak güçlü elektrikli araçlar elde etmek için son derece umut verici bir strateji olarak ortayaçıkar 18.

Toplu türeden türetilen EV'lerin açık avantajlarına rağmen, 3D sistemlerden izolasyon ve karakterizasyonu için standartlaştırılmış protokoller hâlâ yeterince geliştirilmemiştir. Mevcut EV izolasyon metodolojileri, örneğin diferansiyel santrifüj, iyi kurulmuş ve EVüretimi 27 için ölçeklenebilir bir çerçeve sunmaktadır. Benzer şekilde, MSC agregaları üretmek için yöntemler rapor edilmiştir; genellikle 2D kültürlü hücrelerden C vitamini kaynaklı hücresel kıvrım ve agregasyonadayanmaktadır 28. Ancak, bu vitamin C kaynaklı agregalar içindeki ECM yapısı, yerli mezenkimal dokuların mekansal olarak düzenlenmiş, yoğuşmaya benzer mikro ortamından yine de farklı olabilir. Buna karşılık, düşük yapışma koşullarında iskelesiz kendiliğinden montaj, mezenkimal yoğunlaşmanın temel özelliklerini yaklaşık olarak yansıtan kompakt, küresel agregatların oluşmasınıkolaylaştırır 19,29. Şu anda, bu düşük yapışma kaynaklı 3B SCAP agregalarından EV'leri izole etmek ve uygulamak için sistematik ve tekrarlanabilir bir iş akışı eksik durumdadır. Pratikte bakıldığında, geleneksel 2D SCAP kültürlerinden LEV üretimi genellikle nanoparçacık takip analiziyle (NTA) ~1011 parçacık/mL aralığında yer alır ve 3D düşük yapışma toplaması LEV üretimini birkaç kat artırırken sonraki uygulamalar için tekrarlanabilirliği koruması beklenmektedir. Bu boşluğu gidermek için, SCAP'ların doğasında bulunan osteojenik/odontojenik işlevselliğinden yararlanan ve MSC mikro ortamını 3D düşük yapışma toplama yoluyla optimize eden kapsamlı bir protokolü detaylandırıyoruz. Bu protokol, yüksek kaliteli LEV'lerin güvenilir şekilde üretilmesini sağlar ve kraniofasiyal tıbbda hücresiz rejeneratif tedavileri ilerletmek için standartlaştırılmış bir araç sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri, Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve ARRIVE yönergelerine uygun şekilde gerçekleştirilmiştir. İnsan örneklerinin toplanması ve kullanımı, Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylandı (onay no. IRB-REV-2022187). Örnek toplamadan önce tüm bağışçılardan yazılı bilgilendirilmiş onay alındı; Reşit olmayan veya başka şekilde rıza veremeyen bağışçılar için, yasal vasilerinden yazılı bilgilendirilmiş onay alınırdı. Tüm reaktifler steril filtrelenmişti ve hücre kültürü işlemleri sterilliği korumak için biyogüvenlik dolabında gerçekleştirildi (bkz. Malzeme Tablosu). İnsan kaynaklı tüm malzemeleri (dişler, dokular, primer hücreler, koşullandırılmış ortamlar ve EV preparatları) potansiyel olarak bulaşıcı olarak kabul edin. İnsan örnekleriyle ilgili tüm işlemleri, uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) kullanarak, laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması dahil olmak üzere sertifikalı bir biyogüvenlik dolabında gerçekleştirin. Biyogüvenlik ve atık bertarafı için kurumsal BSL-2 yönergelerine uyun: Tüm insan kaynaklı malzemeleri ve kirlenmiş tek kullanımlık maddeleri BSL-2 biyotehlike atığı olarak ele almak; Kullanımdan sonra yüzeyleri/ekipmanları kurum tarafından onaylanmış dezenfektan ile dezenfekte edin. Sıvı biyotehlike atıklarını etiketlenmiş kaplara toplayın ve bertaraf edilmeden önce onaylı yöntemlerle etkisiz hale getirin. Keskin fileri hemen onaylı keskin kaplara atın (kap değiştirmek yok). Hayvan dokularını/leşlerini ve anestezik/kimyasal kalıntıları düzenlenen biyolojik tehlike/kimyasal atık olarak ele alıp bunları ilgili düzenlemelere göre kurumsal hizmetler aracılığıyla bertaraf etmelidir.

1. İnsan SCAP'larının izolasyonu ve kültürü

NOT: P/S, biyoaktif bir antibiyotik karışımıdır ve cilt/göz tahrişi veya alerjik reaksiyonlara neden olabilir. Açarken BSL-2 biyogüvenlik kabininde tutun; eldiven ve göz koruyucu takmak; aerosol oluşumundan kaçınmak; ve atıkları kurumsal kimyasal atık yönergelerine uygun olarak bertaraf etmek. Kollagenaz tip I (çözelti) biyoaktif bir enzimdir ve cilt/göz tahrişine veya alerjik reaksiyonlara neden olabilir. Sapı BSL-2 biyogüvenlik kabininde kullanılır; eldiven ve göz koruyucu takmak; pipetleme sırasında sıçrama ve aerosol oluşumundan kaçınmak; ve kurumsal prosedürlere uygun olarak sızıntıları derhal temizlemek. Depolama ve kullanım sırasında kollagenaz tip I'i ışıktan koruyun (bkz. Malzemeler Tablosu).

  1. Sağlıklı bağışçılardan (16–21 yaş) olgunlaşmamış uçlu üçüncü azı dişleri toplayın ve %1 penisilin/streptomisin (P/S) içeren fosfatla tamponlu tuzlu su (PBS) ile iyice durulayın (bkz. Malzeme Tablosu).
  2. Apikal papilla dokusunu kök ucundan steril göz cımbız ve makasla kesin, ardından küçük parçalara (<1 mm3) doğrayın.
  3. Tüm doku parçalarını 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Parçaları 2 mg/mL kollagenaz tip I ile 37 °C'de 1 saat boyunca sindirin, her 15 dakikada bir hafifçe çalkalayarak.
  4. Sindirimi durdurmak için eşit hacimde tam α-minimum temel ortam (α-MEM) eklenebilir ( bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: Kollagenaz tip I'in sindirim süresi sabit değildir ve doku sindirim durumuna bağlıdır. Yakından izleyin, dokular yarı eroziyaya uğradığında sindirimi sonlandırın; bu ekleyerek ortam ekleyin. Aşırı sindirim hücre canlılığını bozabilir.
  5. Hücre süspansiyonunu 100 × g ile 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin, üst süspansiyonu atın ve peleti 2 mL tam α-MEM ile yeniden süzülür.
  6. Sindirilmiş doku süspansiyonunu 10 cm Petri kabına tohumlayın ve her tabak başına 10 mL nihai hacme 8 mL tam α-MEM ekleyin.
  7. Kültür SCAP'ları 37 °C'de %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş kuluçka içinde.
    NOT: Kültürleri sürekli izlediğinizde, hücreler genellikle doku parçalarından dışarı göç eder ve 3–7 gün içinde radyal bir desenle çanak üzerine bağlanır. Eğer doku canlılığı zayıfsa veya 5 gün içinde hücre göçü gözlemlenmezse, %20 serum takviyeli tam α-MEM'e geçin.
  8. Hücre geçişi için, hücreler %80–90 birleşimine ulaştıklarında kalıntı ortamı çıkarmak amacıyla 5 mL PBS ile yıkanmıştır. Daha sonra, 37 °C'de 2 dakika boyunca %0,25 tripsin-1 mM EDTA ile 2 mL kuluçka altına alındılar ( bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: Tripsin–EDTA tahriş edici bir yapıdır ve cildi/gözleri zarar verebilir. Eldiven ve göz koruyucu ile tutun, sıçramalardan ve aerosol oluşumundan kaçının, temas olursa hemen bol suyla durulayın. Tripsin içeren sıvı atıkları kurumsal yönergelere uygun olarak bertaraf etmelidir.
  9. Hücreler mikroskop altında yuvarlatıldığında ve hücrelerarası bağlantılar bozulduğunda, hücreleri aşırı yapısal hasar olmadan nazikçe çanaktan ayırın. Tripsini 4 mL tam α-MEM ekleyerek nötralize edin.
  10. Hücreleri nazik, tekrarlayan pipetlemelerle yeni 15 mL santrifüj tüpüne toplayın. 100 × g 5 dakika boyunca santrifüjden sonra süpernatantı atın ve hücre pelletini tam α-MEM ile yeniden süsküyerin. Yeniden askılanan hücreleri taze kültür kaplarına veya kuyu tabaklarına tohumlayın. Ortamı her iki günde bir değiştirin.
    NOT: Agrega kültür için kullanılan SCAP'ların 5. pasaj içinde olduğundan emin olun. Sap ve toplama kapasitesi, geçişsayısı 30,31 ile azalır; bu da toplam oluşum verimliliğini ve işlevsel performansı azaltabilir.

2. SCAP agregalarının kendi kendine birleştirilmesi

  1. 3–5 SCAP tripsizasyon ile alın, 100 × g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve %10 EV-eksik fetal sığır serumu (FBS) ve %1 P/S ile takviye edilmiş α-MEM'e yeniden süzülün (bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: EV'ler ve diğer safsızlıkları temizlemek için gece boyunca 4 °C'de 150.000 × g sıcaklıkta santrifüjle yaparak EV'den mahrum edilmiş FBShazırlayın 32.
  2. Hücreleri hemositometre kullanarak sayın ve ultra düşük tutucu, 24 delikli plakalarda her kuyu başına 1 ×10-105 hücre tohumu ekin. Süspansiyon durumunu korumak için orta hacmi kuyu başına 500 μL olarak ayarlayın.
  3. Plakaları %5 CO₂ ile 37 °C'de 72 saat boyunca kuluçka yapın ve kültür ortamını her 48 saatte bir değiştirin.
  4. Agrega oluşumunu her gün ters optik mikroskop altında izleyin. Agregalar çapı 200–400 μm olduğunda ve kompakt, düzgün kenarlı bir yapı sergilediğinde EV'leri toplayın.
    NOT: Bir üretim "partisini" aynı gün aynı hücre geçişinden tohumlanan SCAP agregalarından toplanan ve aynı kültür koşullarında tek bir toplama penceresi (72 saat) içinde tutulan koşullu ortamdan izole edilen LEV'ler olarak tanımlayın. Her partiyi bağımsız olarak santrifüjleme yoluyla işleyin. Tohumlamadan sonra 48 saat içinde kültür ortamını değiştirin ve aynı hacimde taze ortamla yenileyin. LEV üretimi için, tohumlamadan sonra 48 saat ve 72 saat sonra koşullu ortam toplayın ve hasat edilen ortamı (0–48 saat ve 48–72 saat fraksiyonları) tek bir parti olarak birleştirin. Havuzlanmış kondisyonlu ortamı 4 °C'de tutun ve LEV'ler izolasyonu için işleyin.

3. EV'lerin SCAP agregalarından izolasyonu ve karakterizasyonu

  1. Büyük LEV'lerin izolasyonu için diferansiyel santrifüjleme
    1. SCAP agregaları içeren kültür ortamını 15 mL'lik santrifüj tüplerine toplayın.
    2. 800 × g sıcaklıkta 10 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın, sağlam agregaları ve büyük hücre kalıntılarını çıkarmak.
    3. Süpernatantı yeni 15 mL tüplere aktarın ve 2.500 × g sıcaklığında 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın; böylece kalıntı trombositler ve küçük hücre parçaları ortadan kaldırılır.
    4. Süpernatantı dikkatlice steril 1,5 mL konik tüplere aktarın ve 16.800 × g sıcaklıkta 30 dakika boyunca 4 °C'de pellet LEV'lere santrifüj yapın.
      NOT: LEV verimini artırmak için 1,5 mL konik tüpler kullanın.
    5. Süpernatantı at, pelleti 1 mL steril PBS ile yeniden askıya alın ve 16.800 × g'de 30 dakika boyunca 4 °C'de sabit açılı bir rotor (standart tezgah üstü santrifüjle uyumlu) tekrar santrifüj yapın.
    6. Yavaşlama/freni "yavaş" veya "düşük" ayarına (genellikle fren seviyesi 1 veya 2) ayarlayın, böylece LEV peletinin son yavaşlama aşamasında yeniden süspansiyonu önlenir.
    7. Süpernatantı atın ve son LEV pelletini 50 μL steril PBS ile yeniden askıya alın. Süspansiyonu hemen (24 saat içinde) kullanın veya 4 °C'de saklayın. Biyoaktivite kaybını en aza indirmek için dondurmaktan kaçının.
      NOT: Tipik aşağı akış deneyleri için yeterli LEV elde etmek amacıyla yaklaşık 80 agrega kuyusu hazırlayın. LEV örnekleri uzun vadeli depolama yerine hemen karakterizasyon veya terapötik uygulama için önerilir. Daha uzun depolama gerekiyorsa, LEV süspansiyonunu (örneğin, tüp başına 5–10 μL) tekrar eden sıcaklık dalgalanmaları ve donma-erime döngülerini önlemek için aliquot kullanın. Aliquotları kuru buzda snap-freeze ile kısa süreli uzun süreli depolama için −80 °C'de saklayabilir (örneğin 1–3 aya kadar). Buzda bir kez eritin ve hemen kullanın. Dondurmanın biyoaktiviteyi azaltabileceği ve parçacık geri kazanım/boyut dağılımını değiştirebileceği dikkat edin; bu nedenle, mümkün olduğunda, taze hazırlanmış LEV'lerle fonksiyonel çalışmalar yapın. Depolama sonrası kalite kontrolü için, partikül konsantrasyonu ve boyut dağılımı NTA kullanılarak yeniden ölçülür ve yalnızca değerler önceden tanımlanmış kabul aralığı içinde kalırsa devam edilir. Ayrıca, bu protokolde, protein bazlı BCA testleriyle ilişkili veziküllerin kaybını önlemek ve böylece sonraki uygulamalarda verimi maksimize etmek için NTA parçacık konsantrasyonu birincil nicelendirme yöntemi olarak kullanılır.
  2. Parçacık boyutu ve konsantrasyonu için NTA
    NOT: NTA, boyut dağılımı ve parçacık konsantrasyonunu değerlendirmek için ticari olarak mevcut bir nanopartikül takip analizörü ( bkz. Malzeme Tablosu) kullanılarak gerçekleştirilir.
    1. LEVs süspansiyonunun 1 μL'sini (Bölüm 3.1, Adım 6'dan) steril 1.5 mL konik bir tüpte 1.499 μL steril PBS ile seyreldin ve iyice karıştırın.
    2. Uyumlu yazılımı başlatın ve örnek hücresini 10 mL ultra saf su ile doldurun. Sistemin temiz olduğundan emin olmak için arka plan parçacık sayısının her kare için 10 < olduğunu doğrulayın ( bkz. Malzeme Tablosu).
    3. Enstrümanı hazırlanmış standart bir çözeltiyle kalibre edin. Yazılım parametrelerini şu şekilde ayarlayın: Hassasiyet 70, Deklanşör 70, Minimum Alan 5 ve Minimum Parlaklık 20. Lazerin odaklandığından emin olmak için "Otomatik Hizalama" gerçekleştirin. Standart seyreltmeyi yazılımda gösterilen parçacık sayısı 50–400 (tercihen ~200) olana kadar ayarlayın ve ardından kalibrasyon programını çalıştırın.
      NOT: Standart çözeltiyi 1 mL damıtılmış suda 1 μL kalibrasyon boncukları yeniden oluşturarak birincil çözelti oluşturun. Birincil çözeltinin 100 μL'sini 25 mL damıtılmış suda (1:250.000 seyreltme) seyreldin ve 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
    4. Analiz öncesi örnek hücresini 5 mL damıtılmış su ile durulayın.
    5. Kanalı 1 mL damıtılmış su ile yıkayın ve tespit arayüzündeki parçacık sayısının <10 olduğunu doğrulayın.
    6. Sulandırılmış LEV'lerden 1 mL numunesini steril 1 mL şırınga ile sabit 0,5 mL/s hızda enjekte edin.
      DIKKAT: Enjeksiyon hızını sabit tutmak için şırıngayı manuel olarak kontrol edin.
    7. Parçacık analizi yapın ve raporlar oluşturun. Yazılımda yeni bir ölçüm oluşturun ve Boyut/Konsantrasyon modunu seçin. Yakalama süresini, 3. Adımdaki algılama parametreleriyle (Hassasiyet 70, Enstantör 70, Minimum Alan 5, Minimum Parlaklık 20) kullanarak 25 °C'de 3 kayıt olarak ayarlayın.
    8. Toplamaya başlayın ve ekrandaki parçacık sayısının 50–400 parçacık/kare (tercihen ~200) arasında kaldığını doğrulayın; bu aralığın dışındaysa, dur ve örnek seyreltmesini ayarlayın, ardından 6. Adımı tekrarlayın. Alımdan sonra, ortalama boyut, mod boyutu, D10/D50/D90 ve parçacık konsantrasyonu (parçacık/mL) elde etmek için analiz yapılabilir. Sonra sonuçları ve boyut dağılımı grafiklerini .csv ve .pdf (veya eşdeğer rapor formatları) olarak dışa aktarın ve ölçüm dosyasını kayıt tutmak üzere kaydedersiniz.

4. LEV'lerin mandibular kemik yenilenmesinde terapötik uygulaması

  1. LEV yüklü hidrojelin hazırlanması
    1. Pluronic F-127 stokunu (%20 v/k/vs) hazırlayın. Steril PBS'ye Pluronik F-127 tozunu %20 (w/v) nihai konsantrasyona kadar ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de karıştırın, tamamen çözünüp homojen hale gelene kadar ( bkz. Malzemeler Tablosu). Hazırlık boyunca çözeltiyi 4 °C'de tutarak erken jelleşmeyi önleyin.
      NOT: %20 (k/v) Pluronik F-127 4 °C'de sıvıdır ve ~20–25 °C'de (tüp/oda bağımlısı) termojelasyona uğrar; 37 °C'de stabil bir jel haline gelir.
    2. LEV'leri soğuk koşullarda yükleyin. Tüpleri, pipet uçlarını ve hidrojeli 4 °C'ye kadar önceden soğut. 50 μg LEV'leri (iki 24 kuyuyla agrega plakasından alınan LEV'lere eşdeğer) 1 mL %20 Pluronik F 127 ile nazik pipetleme ve kısa süreli düşük hızlı vorteksleme ile karıştırarak eşit dağılımın sağlanmasını sağlar. Karışımı buz üzerinde veya 4 °C sıcaklıkta tutun, implantasyona kadar yapın.
    3. Tekrarlanabilirlik için kullanım ve kullanım rehberliği. Buz üzerinde hızlı bir şekilde yükleme ve şırınga/uç yüklemesini gerçekleştirin. Karışım ~20–25 °C'nin üzerinde ısınırsa, viskozite artar ve jelleşme başlayabilir; bu durumda, malzeme tekrar tamamen akışabilir hale gelene kadar 4 °C'ye geri döndürülür. Kusura yerleştirildikten sonra, vücut sıcaklığında (37 °C) jelleşmenin yerinde gerçekleşmesine izin verin.
  2. Sare mandibular kemik defekti modelinin oluşturulması
    1. 8 haftalık C57Bl/6 farelerini (erkek veya dişi) intraperitoneal pentobarbital sodyum (50 mg/kg) enjeksiyonu ile anestezi edin ( bkz. Malzeme Tablosu).
      DIKKAT: Pentobarbital sodyum güçlü bir sedatif/anestezidir ve yanlışlıkla enjekte edilir, yutulursa veya solulursa insanlar için toksiktir. Güvenli keskin iğneler uygulamalarını hazırlayın ve uygulayın (iğneleri tekrar kapatmayın; hemen keskin bir kaba atın), eldiven ve göz koruyucu takın, cilt temasından kaçının ve kullanımı kurumsal kontrollü ilaç politikalarına göre depolayın/kaydedin. Farelerde uygun anestezi doğrulamak, korneal refleksin yokluğunu ve ayak pedini sıkıştırdığında uzuv çekilmediğini kontrol edin. Korneanın kurumasını önlemek için koruyucu bir göz merhemi uygulayın.
    2. Sol mandibular bölgesindeki tüyleri tıraş edin ve dönüşümlü olarak %10 povidon-iyot ve %75 etanol ile dezenfekte edin.
      DIKKAT: %75 etanol oldukça yanıcıdır; Alov kaynaklarından uzak tutun ve iyi havalandırma sağla. Povidon-iyot cilt/göz tahrişine veya alerjik reaksiyonlara neden olabilir; Eldiveni takın, gözler/mukoza ile temas kurmayın ve dökülmeleri derhal temizleyin.
    3. Mandibular kenarı boyunca 1 cm boyuna bir kesi yapın ve mandibular açısını ortaya çıkarmak için yumuşak dokuları küt bir şekilde kesin.
    4. Termal hasarı önlemek için sürekli tuzlu sulama ile diş matkapı kullanarak 2 mm çapında dairesel kemik kusuru oluşturun (bkz. Malzeme Tablosu).
      DIKKAT: Ameliyat içi kanamayı yakından izleyin, küçük pamuk toplarıyla kanamayı kontrol ederek cerrahi alan net kalmasını sağlayacak ve enfeksiyon riskini azaltın. Dolanmayı önlemek için matkap ile çevredeki yumuşak dokulara temas etmekten kaçının.
  3. LEV yüklü hidrojelin implantasyonu
    1. LEV-hidrojel karışımını steril bir şırıngaya yükleyip kemik defektine enjekte ederek tam dolgu sağlanır.
      NOT: Fare başına ~10 μg LEV uygulayın. n = 5 fareyle yapılan bir deney için yeterli LEV elde etmek için iki 24 kuyruklu SCAP agregatı levhası gereklidir.
    2. Kontrol grubu için, LEV'ler olmadan eşit hacimde Pluronik F-127 hidrojel enjekte edilir.
    3. Kesiyi 4-0 emilebilir dikiş ile dikin ve ameliyat sonrası ağrıyı hafifletmek için deri altı analjezi (Karprofen, 5 mg/kg) uygulanın (bkz. Malzeme Tablosu).
      DIKKAT: Karprofen, farmakolojik olarak aktif bir NSAID'dir ve yanlışlıkla enjekte edilirse veya cilt/gözlerle temas ederse zararlı olabilir. Eldiven takın, keskin yaralanmalardan kaçının, iğneleri/şırıngaları keskin bir kapta atın ve kullanılmayan ilaçlar ile kirli malzemeleri kurumsal ilaç atık prosedürlerine uygun olarak atabilirsiniz.
    4. Anesteziden iyileşene kadar fareleri ısıtıcı bir battaniyeye yerleştirin, ardından serbest yiyecek ve suya erişimi olan bireysel kafeslere aktarın.
      NOT: Fareler, sternum yatağını koruyacak kadar bilinç kazanana kadar onları gözetimsiz bırakmayın. Fareleri ancak tam iyileşmeden sonra grup konusuna geri gönderin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deneysel iş akışına göre, SCAP izolasyonu, agregat oluşumu, LEV çıkarımı ve terapötik implantasyon gibi temel adımlar başarıyla gerçekleştirilmiştir (Şekil 1). Donörlerden alınan klinik çarpma üçüncü azı dişlerde, açık kök kanal deliklerinin etrafına sağlam apikal papilla dokusu ile olgunlaşmamış apisler gösterdi ve bu da SCAP'ın uygun kaynağını doğruladı (Şekil 2A). In vitro kültür yapıldığında, bol hücresel süreçlere ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücresiz rejeneratif tedavilere artan ilgi, mezenkimal kök hücre türevli LEV'leri, hücre tabanlı yaklaşımlarla ilişkili riskler olmadan biyoaktif moleküller sunabilme yetenekleri sayesinde tüm hücre nakli için umut vadeden alternatifler olarak konumlandırmıştır. Ancak, LEV tabanlı tedavilerin klinik çevirisi, LEV'lerin işlevselliğini tam olarak koruyup geliştirebilen fizyolojik olarak ilgili kültür sistemlerinin eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Geleneksel 2B monolayer kültürleri, meze...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Ana Araştırma ve Geliştirme Programı (2021YFA1100600), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82471011, 82401201), Oral ve Çene Reskonstrüksiyonu ve Rejenerasyonu Devlet Ana Laboratuvarı Projesi (2024MS04), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (BX20230485) ve Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi'nin Ortak Laboratuvar İşbirliği ve Değişim Programı Projesi (2024HB014) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL İğneli ŞırıngaBD300841Anestezileme
10 cm Hücre Kültürü ÇanakıCorning353003Hücre kültürü
15 mL polistiren santrifüj tüpüCorning352095Hücre kültürü
%75 etanol dezenfektanHai Shi Hai NuoHS-750İş Buluşması
Emilebilir Dikiş 4-0Jinhuan TıpR413İş Buluşması
Tezgah üstü santrifüjWIGGENSCE187EV izolasyonu
CO2 kuluçka makinesi, 150 L, evrensel tipThermoFisher51032874Hücre kültürü
Kollagenaz Tip IThermoFisher17100017Hücre kültürü
Pamuk ToplarıDeroyal30-033İş Buluşması
Eğimli Çalışma MakasıJZ Cerrahi EnstrümanJ21040İş Buluşması
Dental Mobil Türbin ÜnitesiKaVoS609Cİş Buluşması
Elektronik DengeZhi KeZK-DSTHücre kültürü
Eppendorf TüpüEppendorf3810XEV izolasyonu
Kılıfı, tamamJZ Cerrahi EnstrümanJD1020İş Buluşması
Tüy Alma KremiVeet1.00097E+11İş Buluşması
Yüksek hızlı top buruDentsply SironaE0123İş Buluşması
Yüksek hızlı el parçasıKaVoKV-1-008-1644İş Buluşması
Ters MikroskopMshotMF53-NHücre kültürü
MEM α (Minimum Gerekli Ortam α)ThermoFisher12561056Hücre kültürü
Nanopartikül İzleme Video Mikroskobu PMX-120Parçacık MetrixiZetaView PMX120Nanopartikül takip analizi
Penisillin-Streptomisin (P/S)ThermoFisher15140122Hücre kültürü
Pentobarbital sodyumSigma-Aldrich57-33-0Anestezileme
Fosfat-tamponlu tuzlu (PBS)ThermoFisher10010023Hücre kültürü
Plüronik F-127Sigma-AldrichP2443EV implantasyonu
Povidon iyot çözeltisiBaxter PROSL500İş Buluşması
Özel Fetal Sığır Serumu (FBS)ThermoFisher12664025Hücre kültürü
Steril gazlı bez bloğuKazanmak10-000-681İş Buluşması
Masaüstü Yüksek Hızlı Mikro SantrifüjHitachiCT15EEV izolasyonu
Trephine MatkapBiomet Mikrofiksasyonu01-9182İş Buluşması
Tripsin-EDTAThermoFisher25200072Hücre kültürü
Ultra-Düşük Bağlantı 24 Kuyu PlakasıCorning3473Hücre kültürü
Vortex Mikser CiniBilimsel EndüstrilerSI0425EV implantasyonu

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qiu, G., et al. Functional proteins of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Stem Cell Res. Ther. 10, 359-372 (2019).
  2. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Res. Ther. 9, 50-63 (2019).
  3. van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 19, 213-228 (2018).
  4. Rai, A., et al. Proteomic dissection of large extracellular vesicle surfaceome unravels interactive surface platform. J. Extracell. Vesicles. 10, 1-20 (2021).
  5. Ye, T., et al. Large extracellular vesicles secreted by human iPSC-derived MSCs ameliorate tendinopathy via regulating macrophage heterogeneity. Bioact. Mater. 21, 194-208 (2023).
  6. Liang, Z., Luo, Y., Lv, Y. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles mediate BMP2 gene delivery and enhance bone regeneration. J Mater Chem B. 8, 6378-6389 (2020).
  7. Olaechea, A., et al. Preclinical Evidence for the use of oral mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in bone regenerative therapy: a systematic review. Stem Cells Transl Med. 12, 791-800 (2023).
  8. Zhang, T., et al. Extracellular vesicles derived from human dental mesenchymal stem cells stimulated with low-intensity pulsed ultrasound alleviate inflammation-induced bone loss in a mouse model of periodontitis. Genes Dis. 10, 161-1625 (2023).
  9. Cai, X. Y., et al. Inflammation-triggered Gli1(+) stem cells engage with extracellular vesicles to prime aberrant neutrophils to exacerbate periodontal immunopathology. Cell Mol Immunol. 22, 371-389 (2025).
  10. Wang, Y., et al. Reciprocal regulation of mesenchymal stem cells and immune responses. Cell Stem Cell. 29, 1515-1530 (2025).
  11. Chalisserry, E. P., Nam, S. Y., Park, S. H., Anil, S. Therapeutic potential of dental stem cells. J Tissue Eng. 29, 1-17 (2017).
  12. Yang, H., et al. Secreted frizzled-related protein 2 promotes the osteo/odontogenic differentiation and paracrine potentials of stem cells from apical papilla under inflammation and hypoxia conditions. Cell Prolif. 53, 1-11 (2020).
  13. Huang, M., Dissanayaka, W. L., Yiu, C. K. Exploring the potential of stem cells from the apical papilla (SCAPs) in regenerative medicine: advantages, applications, challenges, and opportunities. Stem Cell Res Ther. 16, 1-20 (2025).
  14. Jaukovic, A., et al. Specificity of 3D MSC Spheroids Microenvironment: Impact on MSC Behavior and Properties. Stem Cell Rev Rep. 16, 853-875 (2020).
  15. Wang, X., et al. Hypoxia promotes EV secretion by impairing lysosomal homeostasis in HNSCC through negative regulation of ATP6V1A by HIF-1 alpha. J Extracell Vesicles. 12, 1-20 (2023).
  16. Yuste, I., et al. Mimicking bone microenvironment: 2D and 3D in vitro models of human osteoblasts. Pharmacol Res. 169, 1-57 (2021).
  17. Fontana, F., et al. In Vitro 3D cultures to model the tumor microenvironment. Cancers (Basel). 13, 1-16 (2021).
  18. Cook, K., Li, H. Advancing extracellular vesicle production: improving physiological relevance and yield with 3D cell culture. Nanoscale. 17, 15110-15131 (2025).
  19. Sui, B. D., et al. Mesenchymal condensation in tooth development and regeneration: a focus on translational aspects of organogenesis. Physiol Rev. 103, 1899-1964 (2023).
  20. Kobayashi, T., Kronenberg, H. M. Overview of skeletal development. Methods Mol Biol. 2230, 3-16 (2021).
  21. Naba, A. Mechanisms of assembly and remodelling of the extracellular matrix. Nat Rev Mol Cell Biol. 25, 865-885 (2024).
  22. Guo, H., et al. Odontogenesis-related developmental microenvironment facilitates deciduous dental pulp stem cell aggregates to revitalize an avulsed tooth. Biomaterials. 279, 1-16 (2021).
  23. Zhang, J., et al. Functional tissue-engineered microtissue formed by self-aggregation of cells for peripheral nerve regeneration. Stem Cell Res Ther. 13, 1-20 (2022).
  24. Yu, W., et al. Higher yield and enhanced therapeutic effects of exosomes derived from MSCs in hydrogel-assisted 3D culture system for bone regeneration. Biomater Adv. 133, 1-17 (2022).
  25. Kim, M., et al. Three-dimensional spheroid culture increases exosome secretion from mesenchymal stem cells. Tissue Eng Regen Med. 15, 427-436 (2018).
  26. Millan, C., et al. Extracellular vesicles from 3d engineered microtissues harbor disease-related cargo absent in EVs from 2D cultures. Adv Healthc Mater. 11, 1-17 (2022).
  27. Petit, I., Levy, A., Aberdam, D. Purification of extracellular microvesicles secreted by dermal fibroblasts. Methods Mol Biol. 2154, 63-72 (2020).
  28. Li, S., et al. Construction, characterization, and regenerative application of self-assembled human mesenchymal stem cell aggregates. J Vis Exp. (15), e64697(2023).
  29. Sui, B. D., et al. Reconstruction of regenerative stem cell niche by cell aggregate engineering. Methods Mol Biol. 2002, 87-99 (2019).
  30. Mobasseri, R., et al. Peptide-modified nanofibrous scaffold promotes human mesenchymal stem cell proliferation and long-term passaging. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 84, 80-91 (2018).
  31. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10, 637-644 (2011).
  32. Cao, Y., et al. Isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues. J Vis Exp. 20, e63990(2022).
  33. Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell Tissue Res. 347, 701-711 (2012).
  34. Li, Y., et al. Lysosome-Featured Cell Aggregate-Released Extracellular Vesicles Regulate Iron Homeostasis and Alleviate Post-Irradiation Endothelial Ferroptosis for Mandibular Regeneration. Adv Sci (Weinh). 12, 1-22 (2025).
  35. Longjohn, M. N., Christian, S. L. Characterizing Extracellular Vesicles Using Nanoparticle-Tracking Analysis. Methods Mol Biol. 2508, 353373(2022).
  36. Cantore, S., et al. Characterization of human apical papilla-derived stem cells. J Biol Regul Homeost Agents. 31, 901-910 (2017).
  37. Wang, Z., et al. Fibroblast growth factor 2 promotes osteo/odontogenic differentiation in stem cells from the apical papilla by inhibiting PI3K/AKT pathway. Sci Rep. 14, 19-35 (2024).
  38. Li, J., et al. TGF-beta2 and TGF-beta1 differentially regulate the odontogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Arch Oral Biol. 135, 1-15 (2022).
  39. Zhang, W., et al. Foxc2 and BMP2 Induce Osteogenic/Odontogenic Differentiation and Mineralization of Human Stem Cells from Apical Papilla. Stem Cells Int. 18, 23-36 (2018).
  40. Man, K., et al. An ECM-mimetic hydrogel to promote the therapeutic efficacy of osteoblast-derived extracellular vesicles for bone regeneration. Front Bioeng Biotechnol. 10, 82-99 (2022).
  41. Ming, L., et al. Small extracellular vesicles laden oxygen-releasing thermosensitive hydrogel for enhanced antibacterial therapy against anaerobe-induced periodontitis alveolar bone defect. ACS Biomater Sci Eng. 10, 932-945 (2024).
  42. Clayton, D. A., Shadel, G. S. Purification of mitochondria by sucrose step density gradient centrifugation. Cold Spring Harb Protoc. 14, 8-28 (2014).
  43. Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 2016, 299-310 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Extracellular VesiclesMesenchymal Stem CellsStem Cell AggregatesLarge Extracellular VesiclesSCAP Derived LEVs3D Cell CultureDifferential CentrifugationNanoparticle Tracking AnalysisHydrogel DeliveryCraniofacial Regeneration

İlgili makaleler