Yöntem makalesi

UHPLC-Q-Orbitrap HRMS'nin ağ farmakolojisi ile entegre edilmesiyle IgA nefropatiye karşı Yiqi Qingjie formülünün maddi temelinin açıklanması

320 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70541

⸱

19 Mayıs 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences., 2Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences., 3Department of New Drug Research and Development, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences.

Bu makalede

Özet

Bu protokol, ultra yüksek performanslı sıvı kromatografinin hibrit quadrupole-Orbitrap yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS) ile birleşmesini, ağ farmakolojisi ve moleküler kenetlenme ile birleştirilerek IgA nefropatisinin (IgAN) tedavisinde Yiqi Qingjie formülünün (YQQJ) maddi temelini tahmin edip doğrulamayı açıklar.

Özet

Bu çalışma, YQQJ'nin su ekstraksiyonu ve kan emiri bileşenlerini karakterize etmek için UHPLC-Q-Orbitrap HRMS kullanmaktadır. Ağ farmakolojisi ve moleküler kenetlenme, YQQJ'nin IgAN'a karşı terapötik etkilerinin maddi temelini tahmin etmek ve doğrulamak için daha fazla uygulanır. YQQJ'nin sulu ekstraktı ve serum örnekleri, kimyasal bileşenleri karakterize etmek ve kan emilen bileşikleri tanımlamak için UHPLC-Q-Orbitrap HRMS kullanılarak analiz edildi. Bileşik tanımlaması, referans veritabanları, yayımlanmış literatür ve tutma süresi, ön iyon kütle doğruluğu, MS/MS parçalanma desenleri ve izotop dağılımı üzerine kapsamlı bir değerlendirmeye dayanarak gerçekleştirildi. Prototip kan emilen bileşiklerin potansiyel hedefleri hedef tahmin veritabanları kullanılarak tahmin edilirken, IgAN ile ilgili hedefler entegre biyoinformatik platformlardan toplandı. Temel hedefler PPI ağ analiziyle tarandı. Temel bileşenleri belirlemek için "bileşik–hedef–yol–hastalık" ağı oluşturuldu ve çekirdek bileşikler ile hedefler arasındaki etkileşimleri değerlendirmek için moleküler kenetlenme gerçekleştirildi. YQQJ'nin su ekstraktında toplam 185 bileşik tespit edilmiştir. Bunlar arasında, 28 bileşik prototip formlarında kan dolaşımına girdi. PPI, YQQJ'nin IgAN'daki terapötik etkileriyle ilişkili 42 temel hedef tespit etmiştir. KEGG ve GO zenginleştirme analizleri, hücre çoğalması, iltihaplanma ve apoptozda rol oynadığını ve PI3K-Akt, MAPK ve JAK-STAT gibi birkaç önemli yolda zenginleşme olduğunu gösterdi. Moleküler kenetlenme analizi, altı kritik hedef (CASP3, IGF1R, JUN, STAT3, PRKCB ve PIK3CA) ile üç ana kan emilen bileşik — Deasetilasperulosid asit, Geniposidik asit ve Dioscin — arasında tutarlı düşük bağlanma enerjilerine sahip olumlu bağlanma etkileşimleri öngördü; bu da potansiyel etkileşimleri önermektedir. Bu entegre analiz, YQQJ'nin IgAN'a karşı birden fazla bileşen ve çoklu hedef aracılığıyla terapötik etkiler uyguladığını ortaya koymaktadır. Deasetilasperulosidik asit, Geniposidik asit ve Dioscin, bu etkilere katkıda bulunan temel aktif bileşenler olarak önerilmektedir.

Giriş

IgA nefropatisi (IgAN), dünya genelinde en yaygın primer glomerulonefritlerden biridir. Klinik belirtileri oldukça heterojendir, genellikle mikroskobik veya kaba hematöriye olarak ortaya çıkar; genellikle farklı derecelerde proteinuriya, hipertansiyon ve böbrek yetmezliği ile birlikte görülür. Önceki çalışmalar, hastaların %40'ına kadar tanıdan sonraki 20 yıl içinde böbrek yetmezliğine geçtiğinigösteriyordu 1; Ancak, daha yeni kanıtlar belirgin şekilde daha kötü bir prognoz olduğunu göstermektedir; çoğu hasta 10–15 yıl içinde böbrek yetmezliği geliştirir ve sadece küçük bir kısmı ilerlemesiz ömür boyu böbrek fonksiyonunu sürdürmektedir 2,3,4. Hedefli tedaviler yakın zamanda IgAN yönetiminde klinik ilerlemeler elde etmiş olsa da, yüksek maliyeti ve nispeten yavaş etkinlik başlangıcı büyük zorluklar olmaya devam ediyor ve klinik fayda-risk dengesi tartışma aşamasında 5,6.

Geleneksel Çin tıbbı (TCM), karmaşık hastalıkların tedavisinde belirgin avantajlar sergiler. Stabil terapötik etkinlik, nispeten düşük yan reaksiyon insidansı ve çok hedefli sinerjistik etkilerlekarakterize edilir 7. Tek hedefli farmakolojik ajanların aksine, TCM formülleri genellikle çeşitli biyolojik yolları aynı anda modüle edebilen birden fazla biyoaktif bileşen içerir. Bu çok bileşenli ve çok hedefli etki modu, IgAN8 gibi karmaşık hastalıkların tedavisinde potansiyel bir terapötik avantaj sağlar. TCM teorisinde, IgAN'ın belirli bir hastalık adı yoktur ancak genellikle "hematuri", "ödem", "sırt ağrısı", "böbrek rüzgarı" ve "tüketici hastalık" olarak sınıflandırılır. Çoğu akademisyon temel patogenezinin Akciğer-Dalak Qi Eksikliği ile ilgili olduğunu düşünür; bu da savunma Qi'si üzerindeki kontrolün kaybına ve bunun da rüzgar, nem, ısı ve toksinlerin istilasına yol açar, bu da nihayetinde böbreklere zarar verir. Böbrek ana organ olmasına rağmen, kalp, karaciğer, dalak ve akciğerler deetkilenebilir. 9. Bu anlayışa dayanarak, IgAN 10,11'in klinik tedavisi için Qi-tonlaştırıcı, dış konsolidasyon, ısı temizleyici, detoksifiye ve nem çözücü özelliklere sahip bitkisel ilaçlar ve formüllerin belirlenmesine odaklanmıştır.

Yiqi Qingjie Formülü (YQQJ), hastanemizin Nefroloji Bölümü'nde IgAN tedavisinde kullanılan etkili bir ampirik reçetedir. Formül, Astragalus membranaceus (Huangqi), Lonicera japonica Thunb. (Jinyinhua), Rheum palmatum L. (Dahuang), Hedyotis diffusa Willd. (Baihuasheshecao), Dioscorea nipponica Makino (Chuanshanlong), Spatholobus suberectus Dunn (Jixueteng) ve Plantago asiatica L dahil olmak üzere yedi bitkiden oluşmaktadır. (Cheqiancao). YQQJ, Qi'yi tonlaştırma, dış yüzeyi konsolide etme, ısıyı temizleme, detoksifikasyon, kan dolaşımını aktive etme ve diurezisi teşvik etme gibi terapötik işlevleruygular. Klinik çalışmalar, YQQJ'nin IgAN hastalarında proteinuri ve hematöriyi anlamlı şekilde azalttığını, böbrek fonksiyonunu iyileştirdiğini ve mukoza bağışık semptomları hafiflettiğini, ayrıca olumlu bir güvenlik profiligösterdiğini göstermiştir 12,13.

Bu formül olumlu klinik etkinlik göstermiş olsa da, farmakolojik olarak aktif malzeme temelini açıklamak zordur çünkü TCM formülleri çok sayıda kimyasal bileşen içerir. Yalnızca kromatografik veya kütle spektrometrik analizine dayalı kimyasal profilleme, bir formülün genel kimyasal bileşimini ortaya çıkarabilir; Ancak, hangi bileşiklerin sistemik dolaşıma emildiğini ve doğrudan terapötik etkilere katkıda bulunduğunu belirleyemez. Ayrıca, geleneksel ağ farmakolojisi çalışmaları büyük ölçüde veritabanı tabanlı tahminlere dayanır ve genellikle oral biyoyararlanış ve ilaç benzerliği gibi parametrelerle aday bileşikleri tarar. Bu yaklaşım, in vivo15 gerçekten farmakolojik etkinlik gösteren bileşikleri göz ardı edebilir.

Bu sınırlamaları ele almak için, son çalışmalar giderek daha fazla ultra-yüksek performanslı sıvı kromatografi ile hibrit quadrupole-Orbitrap yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS) serum farmakokimyası ve sistem farmakolojisini birleştiren entegre analitik stratejileri benimsemektedir16,17. Serum farmakokimyası, uygulamadan sonra sistemik dolaşıma giren bileşikleri belirler ve böylece potansiyel biyoaktif bileşenlerin taraması için farmakokinetik olarak ilgili kanıtlar sağlar18. Bu arada, UHPLC-Q-Orbitrap HRMS, karmaşık bitkisel matrisler içindeki kimyasal bileşenlerin yüksek hassasiyetle tespit edilmesini ve yapısal karakterizasyonunusağlar 19.

Yalnızca kimyasal profilleme veya teorik hedef tahminine dayanan yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, bu çalışmada uygulanan bütünleşik iş akışı—UHPLC-Q-Orbitrap HRMS tabanlı bileşen tanımlama, serum farmakokimyası taraması, ağ farmakoloji analizi ve moleküler kenetlenme doğrulaması—birkaç metodolojik avantaj sunmaktadır. UHPLC-Q-Orbitrap HRMS, karmaşık kimyasal bileşenlerin kapsamlı ve hassas tanımlanmasını sağlar. Serum farmakokimyası, aday bileşikleri sistemik dolaşıma gerçekten emilenler ile sınırlar; böylece sonraki ağ analizlerinin biyolojik olasılığını artırır. Deneysel olarak doğrulanmış emilmiş bileşiklere dayalı ağ farmakoloji analizi, çoklu hedef mekanizmalarının sistem düzeyinde keşfedilmesine olanak tanır ve TCM formüllerinin bütünsel farmakolojik özelliklerini daha iyi yansıtır. Moleküler kenetlenme ayrıca tahmin edilen bileşik-hedef etkileşimlerinin ön hesaplamalı doğrulamasını sağlar ve sonraki deneysel doğrulama için aday moleküllerin rasyonel önceliklendirilmesini destekler. Bu bütünleyici iş akışı, YQQJ gibi karmaşık bitkisel formüllerin maddi temelini ve mekanizmalarını açıklamak için güvenilir, verimli ve fizyolojik olarak ilgili bir strateji sunar.

Bu iş akışı, hayvan veya insan farmakokinetik çalışmalarından in vivo emilim verileri elde edilebildiğinde, karmaşık bitkisel formüllerin farmakolojik olarak aktif malzeme temelini ve mekanizmalarını incelemek için özellikle uygundur. Özellikle klinik etkinliği kanıtlanmış ancak aktif bileşenleri belirsiz olan formüller için geçerlidir. Buna rağmen, birkaç sınırlama kabul edilmelidir. Birincisi, hedef tahmininin doğruluğu, kamuya açık veritabanlarının kalitesi ve tamlığına bağlıdır. İkinci olarak, iş akışı dolaşımda tespit edilen prototip bileşiklere odaklanır ve in vivo üretilen biyoaktif metabolitleri hesaba katmaz. Üçüncü olarak, ağ farmakoloji analizlerinden elde edilen tahminler daha fazla deneysel doğrulama gerektirir. Bu sınırlamalara rağmen, iş akışı TCM formüllerinin mekanik çalışmalarında hipotez oluşturma ve hedef önceliklendirme için verimli ve güvenilir bir yaklaşım sunar.

Bu nedenle, bu çalışma UHPLC-Q-Orbitrap HRMS'yi kullanarak YQQJ'nin hem sulu ekstrakt bileşenlerini hem de dolaşımdaki bileşikleri sistematik olarak karakterize etmiş ve böylece potansiyel aktif bileşenlerin nispeten kapsamlı bir veritabanı oluşturmuştur. Bu veri setine dayanarak, ağ farmakoloji analizi ve moleküler kenetlenme doğrulaması ile birleşerek, YQQJ'nin IgAN tedavisi için potansiyel farmakolojik olarak aktif bileşenlerini öngörür ve sonraki mekanik araştırmalar için temel sağlar.

Protokol

Hayvanlarla ilgili tüm deneysel prosedürler, Çin Hayvan Refahı Komitesi tarafından yayımlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Yönergelerine uygundu. Bu çalışmadaki tüm prosedürler, Guang'anmen Hastanesi Hayvan Deney Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Hayvanlar ve ilaç yönetimi

  1. 200–230 g ağırlığında on iki 6 haftalık erkek Sprague–Dawley (SD) faresi kullanın.
  2. Tüm hayvanları Deneysel Hayvan Merkezi'nde barındırır.
    NOT: Konut sıcaklığını 20–26 °C ve göreli nemi %40–70 olarak tutun. Doğal sirkadiyen ritimleri simüle etmek için 12 saat/12 saat ışık/karanlık döngü kullanın.
  3. Deneyden önce hayvanları standart koşullarda 7 gün boyunca ücretsiz yiyecek ve suya erişimle aklimatize edin. Fareleri rastgele iki gruba ayırın (her grup başına n = 6): bir kontrol grubu ve bir ilaç tedavisiyle tedavi edilen bir grup.
  4. İnsanlar ve hayvanlar arasında vücut yüzey alanına göre dönüştürülen eşdeğer dozabakalım 20. İlaçla tedavi edilen gruba ağızdan 24,68 mL/(kg·gün) dozda ağız yoluyla YQQJ konsantre ekstraktı verilmelidir. Kontrol grubuna eşzamanlı işlem sağlamak için aynı anda eşit miktarda damıtılmış su verilmelidir.
  5. Uygulamaya 1 gün devam et. Toplam günlük dozu üç eşit uygulamaya bölerek (örneğin, 08:00, 13:00 ve 18:00) böylece 1 gün içinde tam doz alın.
    NOT: Son taşıma işlemi öncesi 12 saat boyunca hayvanları hızlı tutun, suya ücretsiz erişim.
  6. Son uygulamadan 2 saat ve 8 saat sonra kan örnekleri alın. Fareleri %1 sodyum pentobarbital (50 mg/kg) intraperitoneal enjeksiyonla anestezi edin. Karın aortasından kan toplayın.
  7. Kan örneklerini oda sıcaklığında 1 saat dik tutun, ardından 450 × g. sıcaklığında 4 °C'de 5 dakika santrifüj yapın. Süpernatantın (serumun) temiz ve hemolizsiz olduğundan emin olun. Süpernatant serumu transfer edin ve daha fazla analiz için –80 °C'de depolayın.

2. Çözümlerin hazırlanması

  1. Test çözeltilerinin hazırlanması
    1. YQQJ'nin tüm ham otlarını formüle göre toplayın. Kaynatma tenceresine 4 hacim saf su ekleyin ve 20 dakika bekletin.
      NOT: Otlara 4:1 (v/k) oranında arıtılmış su eklendi.
    2. Karışımı kaynatın, sonra düşük ateşte 30 dakika boyunca kaynatmaya devam edin. Gazlı bezi filtreleyin ve filtratı toplayın. Kalıntıların karışımını 4 hacim suyla 30 dakika daha tekrarlayın ve tekrar filtreleyin.
    3. İki filtratı birleştirin. Kombine çözeltiyi 60 °C su banyosu sıcaklığında ayarlanmış döner evaporatör kullanarak 3 g/mL (w/v, ham tıbbi maddelere eşdeğer) konsantrasyona ulaşana kadar konsantre edin.
    4. Konsantre ekstraktın görünür bir çökelti olmayan koyu, viskoz bir sıvı olduğundan emin olun. Daha sonra kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.
  2. Referans çözümlerin hazırlanması
    1. Aşağıdaki referans bileşikleri doğru şekilde tartın: Deasetilasosperulosid asit, Geniposidik asit, Loganik asit, Morronisid, Klorojenik asit, Sweroside, Plantagoguanidinic asit, Rhein-8-O-β-D-glukopiranozid, Genistin, Apigenin-7-glikosid, Diosmetin-7-O-β-D-glukopiranosid, Kalikosin, Protodioscin, Genistein, Diosmetin, Pseudoprotodioscin, Formononetin, 3-Hidroksi-9,10-dimetoksipterkarpan, Aloeemodin, Rhein, Dioscin.
    2. Her bileşiği metanolde çözüp, karışımı 1 dakika girdabla soyuyor, ardından oda sıcaklığında 10 dakika sonikasyon yaparak tam çözünmeyi garanti ediyor.
    3. Her çözeltiyi metanol ile seyrelterek her standart için nihai konsantrasyon 10 μg/mL elde edin.

3. Numune hazırlama

  1. YQQJ ekstrakt örneklerinin hazırlanması
    1. YQQJ sulu ekstraktından 100 μL pipetini 1,5 mL santrifüj tüpüne koyun. 300 μL metanol ve vortex ekle, 1 dakika boyunca. 1800 × g, 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Ortaya çıkan süpernatantın berrak ve asılı parçacıklardan arınmış olduğundan emin olun.
    2. 100 μL süpernatant alın ve 100 μL ultrasaf suyla karıştırarak 1:1 seyreltme elde edilir. Girdabı nazikçe ve analiz için otomatik numune alıcı şişesine aktarın.
  2. İlaç içeren serum örneklerinin hazırlanması
    1. 100 μL serumu 1.5 mL santrifüj tüpüne pipet edin. 300 μL metanol ekleyin ve protein çökelmesini sağlamak için 10 dakika vortex yapın. 1800 × g., 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
    2. 270 μL süpernatant toplayın ve temiz bir tüpe aktarın. Üst yüzeyi 120 × g., 37 °C sıcaklıkta 4 saat boyunca ayarlanmış Vakumlu Santrifüj Konsantratör ile buharlaştırarak kuruya bırakın, ta ki görünür katı kalıntı oluşana kadar.
    3. Kalıntıyı %50 metanol sulu çözeltisi ile 90 μL yeniden oluşturuyor. Kalıntıyı tamamen çözmek için 1 dakika girdabda bekle, sonra 1800 × g., 4 °C'de 10 dakika tekrar santrifüj yapın.
    4. Son şeffaf süpernattan 80 μL topla ve analiz için bir otosampler şişesine aktar.

4. Analitik koşullar

  1. Kromatografik koşullar
    1. Kromatografik kolonlu bir UHPLC sistemi kullanarak kromatografik ayrım gerçekleştirin.
    2. İkili mobil faz kullanın (Faz A: %0,1 formik asit içeren su; Faz B: asetonitril). Tablo 1'de gösterildiği gibi, 0,3 mL/dakika akış hızında bir gradyan elusasyon programı uygulanır. Kolon sıcaklığını 40 °C'ye ve enjeksiyon hacmini 6.0 μL olarak ayarlayın.
      NOT: Kolon özellikleri 2.1 mm × 100 mm, parçacık boyutu 1.8 μm'dir.
  2. MS koşulları
    1. Isıtılmış elektrosprey iyonizasyon (HESI) sprey probu ile donatılmış bir quadrupole-orbitrap kütle spektrometresi kullanılarak örnekleri analiz edin.
    2. Parametreleri şu şekilde ayarlayın: İyonlaşma voltajı: 3,7 kV (pozitif mod) / 3,5 kV (negatif mod); kapiller sıcaklığı: 320 °C; kılıf gaz basıncı: 30 psi; yardımcı gaz basıncı: 10 psi; çözünme sıcaklığı: 300 °C; kılıf gazı ve yardımcı gaz: azot; çarpışma gazı: azot, 1.5 mTorr.
    3. Tam tarama/dd-MS2 modunda veri edinin. Tam tarama parametreleri şu şekilde ayarlanır: çözünürlük 70000, otomatik kazanç kontrol hedefi 1×106, maksimum izolasyon süresi 50 ms ve m/z tarama aralığı 100 – 1500.
    4. dd-MS2 verilerini çözünürlük 17500, otomatik kazanç kontrol hedefi 1×105, maksimum izolasyon süresi 50 ms, parçalanma için en üst n (n≤10) ebeveyn iyonu ve dinamik dışlama mekanizması ile birleştirin, izolasyon penceresi m/z 2, çarpışma enerjisi 10 V, 30 V, 60 V ve yoğunluk eşiği 1×105 parametreleriyle toplayın.

5. MS verilerinin işlenmesi

  1. Edinilen MS verilerini özel veri işleme yazılımı kullanarak işleyin. Veriyi İtle modülüne gidin ve ham veri dosyalarını yükleyin.
  2. Peak Picking modülünü çalıştırın ve ek iyonları gruplamak ve bileşik özellikler oluşturmak için tepe dekonvolüsyonunu gerçekleştirin.
  3. Aday tanımlaması için referans bileşik veritabanları, hedef tahmin veritabanları ve ilgili yayımlanmış literatürde arama yapın.
  4. Yüksek çözünürlüklü MS verilerine dayanan iki tamamlayıcı tanımlama stratejisi kullanarak bileşikleri tanımlayın.
    1. Referans standart eşleştirmesine dayalı tanımlama. Bileşikleri orijinal referans standartlarıyla karşılaştırarak doğrulayın. Tanımlamaları yalnızca aşağıdaki tüm kriterler karşılandığında kabul edin:
      1. Kütle doğruluğu: Hem öncü iyonların hem de parça iyonların kütle hatası ±5 ppm içinde olmalıdır.
      2. Spektral benzerlik: Deneysel MS/MS spektrumu ile referans standardın MS/MS spektrumu arasındaki kosinüs benzerlik puanı 0,85 ≥ olmalıdır.
      3. İzotop dağılışı: İzotopik desen eşleşme puanı %90 ≥ olmalıdır.
      4. Kromatografik davranış: Tespit edilen bileşik ile referans standardı arasındaki tutma süresi sapması < 0,2 dakika olmalıdır.
        NOT: Yukarıdaki tüm kriterleri karşılayan bileşikler, onaylanmış yapısal tanımlamayı temsil eden MSI Seviye 1 olarak notlanır.
    2. Yüksek çözünürlüklü MS verilerine ve in silico spektral tahmine dayalı tanımlama. Referans standartları olmayan bileşikler için, doğru kütle ölçümleri ve hesaplamalı spektral tahminlere dayalı varsayılan tanımlama yapılabilir. Açıklamaları yalnızca aşağıdaki kriterler karşılandığında kabul edin:
      1. Kütle doğruluğu: Öncü iyonların kütle hatası ±5 ppm içinde, parça iyonların kütle hatası ise ±10 ppm içinde olmalıdır.
      2. Spektral benzerlik: Deneysel MS/MS spektrumunu, Progenesis QI algoritması kullanılarak bileşik SMILES yapısından oluşturulan teorik MS/MS spektrumu ile karşılaştırın. 0,60 kosinüs benzerlik puanına sahip eşleşmeleri ≥ kabul edin.
      3. İzotop dağılışı: İzotopik desen eşleşme puanı %90 ≥ olmalıdır.
      4. Kromatografik davranış tahmini: Deneysel tutma süresi ile makine öğreniminin tahmin ettiği tutma süresi arasındaki sapma 1,0 dakika < olmalıdır.
        NOT: Tutma süresi tahmin modeli, aynı kromatografik koşullar altında analiz edilen 2000'den fazla referans bileşikten deneysel kromatografik veriler kullanılarak eğitilmiştir. Bu kriterleri karşılayan bileşikler, yüksek yapısal güvene sahip varsayılan olarak tanımlanmış bileşikleri temsil eden MSI Seviye 2 olarak notlandırılır.

6. Ağ farmakolojisi

  1. Kan emilen bileşenlerin ve IgAN'a bağlı hedeflerin tanımlanması
    1. YQQJ'nin tanımlanmış prototip kan emili bileşenlerini hedef tahmin veritabanlarına aktarın. Hedef tür olarak "Homo sapiens"i seçin ve potansiyel hedeflerini elde edin. Bunları YQQJ'deki kan emili bileşiklerin hedef seti olarak kaydedin.
    2. Entegre biyoinformatik platformlardan IgAN ile ilişkili hastalık hedeflerini almak için "IgA Nefropati" anahtar kelimesini kullanın. Birden fazla kaynaktan gelen sonuçları birleştirerek önyargıyı en aza indirin.
      NOT: Tutarlılık için alınan tüm hedefleri Gen Sembolü formatına dönüştürmek için protein veritabanı kullanın.
  2. Protein-protein etkileşim (PPI) ağının inşası ve çekirdek hedeflerin tanımlanması
    1. YQQJ kanla emilen bileşiklerin hedef setini IgAN hastalığı hedef setiyle birleştirin ve kesişimlerini çıkarın.
    2. Kesişen hedefleri PPIplatformu 21'e yükleyin. Ayarları yapılandırın: organizmayı Homo sapiens olarak, güven puanını 0.90 olarak ayarlayın ve tüm bağlantısız düğümleri atın.
    3. PPI verilerini görselleştirme yazılımınaaktarın 22. Topolojik analiz eklentisini başlatın. Derecelik merkeziyeti (DC)23, Aralık Merkeziliği (BC)24 ve Yakınlık Merkeziliği (CC)25 hesaplayın.
    4. Topolojik parametre değerleri (DC, BC ve CC) medyanı aşan düğümleri filtreleyerek YQQJ'nin temel terapötik hedeflerini IgAN'a karşı taran.
  3. "YQQJ–kan emilen bileşenler–hedefler–yollar–hastalık" entegre ağının inşası ve analizi
    1. Node özellik dosyasını hazırlayın: İki sütundan oluşan bir tablo oluşturun. İlk sütunu Düğüm Adı , ikinci Düğüm Tipi olarak etiketleyin. Her düğüme beş kategoriden birini (Formül, Kan Emilen Bileşen, Kesişim Hedefi, Yol veya Hastalık) atayın.
    2. Ağ etkileşim (kenar) dosyasını hazırlayın: Düğümler arasındaki bağlantıları tanımlayan bir tablo oluşturun (örneğin, Kan Emilen Bileşenden Kesişim Hedefine). Tüm düğüm adlarının düğüm öznitelik dosyasındaki adlarla eşleştiğinden emin olun, böylece eşleme hataları yaşanmasın.
    3. Ağı içe aktarın ve oluşturun: Ağ görselleştirme yazılımını başlatın. Edge dosyasını yüklemek için File > Import > Network bölümlerine gidin. Önizleme penceresinde, sütunları Kaynak Düğüm ve Hedef Düğüm olarak eşleyin ve başlangıç grafiği oluşturmak için Ok'ye tıklayın.
    4. Düğüm özniteliklerini haritalayın ve görsel stilleri ayarlayın: Düğüm öznitelik dosyasını File > Import > Table üzerinden aktarın. Stil panelini açın ve Node Tipi sütununu düğüm şekli, dolgu rengi ve boyut gibi belirli görsel özelliklere eşleyin.
    5. Topolojik analiz yapın: Topolojik hesaplamalar yapmak için Tools > Analyze Network sayfasına gidin. Derece değerlerine göre çekirdek aktif bileşikleri ve temel terapötik hedefleri filtreleyin ve belirleyin.
      NOT: Çekirdek düğüm tanımlamasında tutarlılığı sağlamak için adım 6.2'de açıklanan aynı topolojik parametreleri kullanın.
    6. Ağ görgesini dışa aktarın: Ağ düzenini tamamlayın. Optimize edilmiş görselleştirmeyi kaydetmek için File > Export > Network to Image'e gidin.
  4. GO zenginleştirme ve KEGG yol analizleri
    1. Gen listesini gönderin: Web tabanlı fonksiyonel açıklama platformunu açın. Adım 1: Gen Listesi Gönder alanına gidin ve daha önce filtrelenmiş çekirdek hedef genlistesini yükleyin 26.
    2. Tür seçin: Adım 2: Tür olarak girin ve 3. adım: Tür olarak analiz için açılır menülerde, analizin doğru biyolojik bağlamda yapıldığından emin olmak için H. sapiens. (insan) seçeneğini seçin.
    3. Özel analizi yapılandırma: Özel Analiz modunu seçin. Zenginleştirme kategorisinde aşağıdaki veritabanlarını kontrol edin: Gen Ontolojisi (GO) Moleküler Fonksiyonu (MF), GO Biyolojik Süreç (BP), GO Hücresel Bileşeni (CC) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) Yolu.
    4. Anlamlılık eşiklerini ayarlayın: P-değer kesme sınırını < 0.01, Minimum Zenginleştirmeyi ≥ 1.5 ve Minimum Örtüşmeyi ≥ 3'e ayarlayın. Diğer tüm parametreleri varsayılan ayarlarında tutun.
    5. Analizi gerçekleştirin: Görevi göndermek için Zenginleştirme Analizi butonuna tıklayın ve hesaplamanın tamamlanmasını bekleyin.
    6. Sonuçları alın ve dışa aktarın: Oluşturulan analiz raporu sayfasına erişin. İndirme butonuna tıklayarak detaylı zenginleştirme verilerini, ilgili çubuk grafikler ve ısı haritalarıyla birlikte elektronik tablo formatında dışa aktarabilirsiniz.

7. Moleküler kenetlenme doğrulaması

  1. Çekirdek hedeflerin yüksek çözünürlüklü (< 2.50 Å) 3D protein yapılarını ve çekirdek kan emilen bileşenlerin 2D kimyasal yapılarını yapısal biyolojiveritabanlarından indirin. 27.
  2. Moleküler kenetlenme yazılımını başlatın ve indirilen yapıları içe aktarın.
  3. Aşağıdaki ön işleme adımlarını sıralı olarak gerçekleştirin: Su moleküllerini elemek için Düzenle > Kaldır sayfasına gidin; Düzenle > Heteroatomları Kaldır seçeneğini seçerek standart olmayan kalıntıları atabilir.
  4. Hidrojenleri Düzenleme > gidin > Polar > sadece polar hidrojen atomları eklemek için ekleyin. İşlenen yapıları Dosya > Kaydet > Yaz PDBQT üzerinden PDBQT formatında kaydedin.
  5. Grid > Grid Box aracıyla kenetlenme noktasını tanımlayın. Grid kutusu boyutları, tahmin edilen bağlama bölgelerinin tam kapsamasını sağlamak için uyarlanabilir şekilde ayarlandı (20–100 Å).
  6. Kenetlenme parametrelerini başlatın: Docking > Macromolecule üzerinden reseptörü seçin > Rigid File Name'i ayarlayın ve ligandı Docking > Ligand Open > ile açın. Kenetlenme parametreleri şu şekilde ayarlandı: tükenmişlik = 32, enerji aralığı = 3 kcal/mol ve en fazla 10 bağlanma modu korundu. Birlikte kristalleşmiş ligandlara sahip proteinler için, kenetleme ızgara kutusu 8.0 şuzantısı olan ligand merkezli ligand merkezine yerleştirilirken, birlikte kristalize ligandları olmayan proteinler için yaklaşık %90 kapsama ile DoGSiteScorer kullanılarak bağlanma cepleri tahmin edilmiştir.
  7. Arama stratejisi olarak Lamarckian Genetik Algoritmasını (LGA) seçin. Simülasyonu Docking üzerinden çalıştırın > AutoDock'u çalıştırın.
  8. Hesaplanan bağlanma enerjisi (kenetlenme puanı) temelinde bağlanma eğilimini değerlendirin28.
    NOT: Daha düşük bağlanma enerjisi, protein-ligand kompleksinin daha güçlü tahmin edilen biyoaktivite ve daha yüksek yapısal stabilitesini gösterir. Uygun bağlanma stabilitesini belirlemek için genellikle ≤ -5.0 kcal/mol eşik kullanılır.

Sonuçlar

YQQJ sulu ekstraktındaki bileşenlerin analizi
YQQJ sulu ekstraktının bileşen analizi, PROTOKOL 4'te belirlenen koşullar altında gerçekleştirilmiştir. UHPLC-Q-Orbitrap HRMS, YQQJ'nin sulu ekstraktını profillemek için hem pozitif hem de negatif iyon tam tarama modlarında kullanıldı ve elde edilen Baz Zirve İyon kromatogramı (BPI) Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu temelde, kendi kendine kurulmuş bir kimyasal bileşen veritabanı ve MS/MS spektral karakterizasyonu birleşerek, sulu ekstrakttan 185 bileşiğin başarılı şekilde tanımlanmasını sağladı ve detaylı bilgiler Ek Tablo 1'de özetlendi. Bileşik tanımlama için kullanılan temsilci MS/MS spektral eşleştirme ve parçalanma desenleri Ek Şekil 1'de gösterilmiştir. Bileşik kategorilerinin istatistiksel analizi, flavonoidler ve terpenoidlerin YQQJ'de baskın bileşenler olduğunu, 94 bileşik oluşturduğunu ve bu oranın en bol oranı oluşturduğunu ortaya koydu.

YQQJ'nin kan emilen bileşenleri
Doğrudan biyoaktif maddeleri in vivo netleştirmek için, YQQJ uygulamasından sonra toplanan serum örnekleri analiz edildi. İlaç kaynaklı bileşikleri endogen serum bileşenlerinden ayırt etmek için karşılaştırma amacıyla boş serumun BPI kromatogramı (Şekil 2) dahil edilmiştir. İlaç içeren serumun BPI'sine (Şekil 3) dayanarak, kan dolaşımına emilen toplam 28 prototip bileşen tanımlandı; bunların arasında flavonoidler, terpenoidler ve steroidler yer almaktadır. YQQJ ekstraktı, boş serum ve ilaç içeren serum boyunca temsil etkili bileşiklerin çıkarılmış iyon kromatografileri (EIC), dolaşımda ilaç kaynaklı bileşenlerin varlığını daha da doğrulamıştır (Ek Şekil 2). Bunlar arasında 10 bileşik Spatholobus suberectus Dunn'dan, 7 bileşik Dioscorea nipponica Makino'dan, 7 Astragalus membranaceus'tan, 6 Hedyotis diffusa Willd.'den, 6 Lonicera japonica Thunb.'dan, 4 Plantago asiatica L.'den ve 4 Rheum palmatum'dan kaynaklanmıştır.L., Ek Tablo 1'de özetlenmiştir.

YQQJ'nin IgAN ile ilişkili kan emili bileşenlerinin hedef tahmini
Kan dolaşımına giren toplam 28 tanımlanmış prototip bileşen hedef tahmin veritabanlarına girildi ve 459 potansiyel hedef ortaya çıktı. Bu arada, entegre biyobilişim platformlarından 2779 IgAN ile ilgili hedef alındı. Kesişim analizi, YQQJ ve IgAN arasında 247 örtüşen hedef tespit etti (Şekil 4).

PPI ağının inşası ve analizi
Kesişen 247 hedef PPI platformuna yüklendi ve görselleştirme yazılımı, üç topolojik parametreye (DC, BC ve CC) dayalı temel hedefleri taramak için kullanıldı. Toplamda 42 hedef nihayet çekirdek düğüm olarak belirlendi. Bu temel hedeflerin taraması için kullanılan iş akışı, Ek Şekil 3'te özetlenmiştir. PPI ağında düğüm boyutu ve rengi parametre değerleriyle değişiyordu (Şekil 5); bunlar arasında TP53, SRC, AKT1, ESR1 ve STAT3 ilk beş çekirdek hedef arasında yer aldı.

YQQJ'nin "formül–kan emili bileşenler–temel hedefler–yollar–hastalık" ağı
YQQJ'nin IgAN'a karşı çok bileşenli ve çok hedefli mekanizmalarını sistematik olarak ortaya çıkarmak için, Görselleştirme yazılımı kullanılarak "Formül–Kan Emilen Bileşenler–Çekirdek Hedefler–Yollar–Hastalık" etkileşim ağı oluşturuldu. Ağ, 96 düğüm ve 459 kenardan oluşuyordu; her kenar iki düğüm arasındaki ilişkiyi veya etkileşimi temsil ediyordu (Şekil 6).

GO ve KEGG zenginleştirme analizleri
42 temel hedefin GO zenginleştirme analizi 1162 BP terim, 52 CC terimi ve 92 MF terimi ortaya çıkardı. Şekil 7 , BP, CC ve MF kategorilerinde en önemli şekilde zenginleşmiş GO terimlerini en çok zenginleştiren ilk 10 terimini göstermektedir. KEGG zenginleştirme analizi, bu temel hedeflerle ilişkili 182 yolu da tespit etmiştir. Şekil 8 , IgAN'ın patogeneziyle yakından ilişkili olan en önemli 20 zenginleştirilmiş yolu göstermektedir. Bu grafiklerde, daha derin kırmızı renkler daha güçlü istatistiksel anlamlılığı gösterirken, daha büyük balon boyutları veya uzun çubuk uzunlukları her yol içinde daha fazla zenginleştirilmiş hedefi temsil eder.

Moleküler kenetlenme değerlendirmesi
Bu çalışmada, IgAN 29,30,31,32 tedavisinde YQQJ'nin ana hedefleri ve ilgili yollarının önceki analizine dayanarak, moleküler kenetlenme için reseptör proteinleri olarak CASP3 (PDB ID: 6X8I), IGF1R (PDB ID: 1JQH), JUN (PDB ID: 8RPP), STAT3 (PDB ID: 6NJS), PRKCB (PDB ID: 8SE3) VE PIK3CA (PDB ID: 5FI4) DAHIL OLMAK ÜZERE ALTı ÇEKIRDEK HEDEF SEÇILDI. IgAN'ın çekirdek TCM patogenezine karşılık olarak, "patojenik rüzgar, nemli ısı ve böbreğe giren toksinler" olarak tanımlanan bu nedenle, ısı temizleyen, nemi gideren ve detoksifikasyon özelliklerine sahip temsilci aktif bileşenler ligand olarak seçilmiştir; bunlar Hedyotis diffusa Willd.'den Deacetylasperulosidic asit ve Geniposidik asit ile Dioscorea nipponica'dan Dioscin olarak seçilmiştir. Makino. Kenetlenme sonuçları Şekil 9'da gösterilmiştir. Tüm ligand-reseptör kombinasyonları arasında, Dioscin seçilen tüm hedeflerde belirgin şekilde daha düşük bağlanma enerjisi gösterdi ve bu da daha yüksek tahmin edilen bağlanma afinitesini gösteriyordu. JUN ile Deacetylasperulosidic asit/Geniposidik asit arasındaki etkileşimler dışında, diğer kenetleme çiftleri de olumlu bağlanma aktiviteleri göstermiştir. Temsilci 3D kenetlenme konformasyonları Şekil 10'da görselleştirilmiştir.

figure-results-1
Şekil 1: YQQJ sulu ekstraktının Temel Zirve İyon kromatografileri. (A) Pozitif iyon modlu BPI kromatogramı. (B) Negatif iyon modu BPI kromatogramı. Kromatografiler, kurulmuş UHPLC-Q-Orbitrap HRMS koşulları altında YQQJ sulu ekstraktının genel kimyasal profilini gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Boş serumun Temel Zirve İyon kromatomografileri. (A) Pozitif iyon modlu BPI kromatogramı. (B) Negatif iyon modu BPI kromatogramı. Kromatografiler, ilaç kaynaklı bileşenleri endogen bileşenlerden ayırmak için ilaç içeren serumla karşılaştırma amacıyla kontrol olarak kullanılan endogen serum arka plan profilini temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: YQQJ içeren serumun Temel Zirve İyon kromatografileri. (A) Pozitif iyon modlu BPI kromatogramı. (B) Negatif iyon modu BPI kromatogramı. Kromatografiler, YQQJ uygulaması sonrası serumda tespit edilen kan emilen bileşenlerin profilini temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: YQQJ ve IgAN arasında örtüşen hedeflerin Venn diyagramı. Diyagram, tahmin edilen YQQJ hedeflerinin sayısını, IgAN'la ilgili hedefleri ve kesişimlerini göstererek, terapötik etkilerde potansiyel olarak yer alan ortak hedefleri vurgular. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Çekirdek hedeflerin protein-protein etkileşimi (PPI) ağı. Düğümler protein hedeflerini, kenarlar ise hedefler arasındaki etkileşimleri temsil eder. Düğüm boyutu ve renk yoğunluğu derece değerlerine karşılık gelir; daha büyük ve koyu düğümler ağ içinde daha yüksek bağlantıyı gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: YQQJ bileşenleri, hedefleri, yolları ve hastalık entegre ağı. Ağ, formül, kan emilen bileşenler, temel hedefler, yollar ve IgAN arasındaki ilişkileri gösterir. Üçgen hastalığı temsil eder; daire yolları temsil eder; V şeklindeki düğüm YQQJ formülünü temsil eder; Elmas otları temsil eder; altıgen bileşenleri temsil eder; Sekizgen, kan emilen prototip bileşenleri temsil eder; dikdörtgen hedefleri temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Çekirdek hedeflerin GO zenginleştirme analizi. Çubuk grafiki, BP, CC ve MF kategorilerinde en zenginleştirilmiş 10 Gen Ontolojisi terimini gösterir. x ekseni GO terimlerini temsil eder ve y ekseni −log10(p-değeri) gösterir; bu da zenginleşmenin önemini gösterir. Kısaltmalar: BP = Biyolojik süreç; CC = hücresel bileşen; MF = Moleküler fonksiyon. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: Çekirdek hedeflerin KEGG yolu zenginleştirme analizi. Balon grafiki, en zenginleştirilmiş 20 KEGG yolunu gösterir. Nokta boyutu zenginleştirilmiş genlerin sayısını gösterirken, renk gradyanı −log10 (p-değeri) gösterir; kırmızı renkler ise daha yüksek istatistiksel anlamlılığı gösterir. X ekseni gen oranını gösterir, y ekseni ise yol terimlerini listeler. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-9
Şekil 9: Moleküler kenetlenme bağlanma enerjisi ısı haritası. Isı haritası, çekirdek hedefler ile ana kan emilen bileşikler arasında bağlanma enerjilerini (kcal/mol) sunar. Düşük bağlanma enerjisi değerleri, tahmin edilen bağlanma eğiliminin daha güçlü olduğunu gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-10
Şekil 10: Temsil eden moleküler kenetleme konformasyonları. (A) Deasetilaseperilosid asidin CASP3 ile bağlanma konformasyonu. (B) Dioscin'in STAT3 ile bağlanma konformasyonu. (C) Geniposidik asidin PIK3CA ile bağlanma konformasyonu. Görüntüler, tahmin edilen ligand–protein etkileşimlerini ve bağlanma yönlerini gösteriyor. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Yüksek çözünürlüklü MS/MS ile temsilci bileşiklerin yapısal tanımlanması. (A) Deacetylasperulosidic asitin deneysel spektrum (üst, kırmızı) ile referans veritabanı spektrumu (alt, mavi) arasında baştan kuyruğuna spektral karşılaştırması. (B) Deacetylasperulosidic asidin yüksek çözünürlüklü MS/MS parçalanma spektrumu. (C) Geniposidik asidin referans veritabanı ile baştan kuyruğuna spektral karşılaştırması. (D) Geniposidik asidin deneysel MS/MS parçalanma spektrumu. (E) Dioscin'in referans veritabanı ile baştan kuyruğuna spektral karşılaştırması. (F) Dioscin'in yüksek çözünürlüklü MS/MS parçalanma spektrumu. Bu paneller, bileşik tanımlama için kullanılan spektral eşleştirmeyi göstermektedir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Örnekler arasında temsil bileşiklerin çıkarılmış iyon kromatografileri (EIC). (A) Deacetylasperulosidic asit EIC. (B) Geniposidik asit EIC. (C) Dioscin'in EIC'si. Her panel için üstteki iz YQQJ sulu ekstraktını (ZY), ortadaki iz boş kontrol serumunu (KBX) ve alt iz ise YQQJ uygulamasından sonra kan emili bileşenler içeren serum örneklerini (GYX) temsil eder. Karşılaştırma, serumda ilaç kaynaklı bileşiklerin varlığını vurgulamaktadır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: Çekirdek hedeflerin taraması için iş akışı. Akış şeması, bileşik hedef tahmini, IgAN ile ilgili hedef toplama, kesişim analizi, PPI ağ inşası ve topolojik parametrelere dayalı çekirdek hedeflerin taraması dahil olmak üzere hedef belirleme sürecini adım adım göstermektedir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Zaman (min)Mobil aşama
A (v%)B (v%)
0982
1.0982
14.07030
25.00100
28.00100
28.1982
30.0982

Tablo 1: UHPLC gradyan elüasyon programı. Tablo, kromatografik ayrım için kullanılan hareketli faz bileşimi ve gradyan koşullarını, zaman noktaları ve sulu (Faz A) ile organik (Faz B) çözücülerin oranlarını da içerir.

Ek Tablo 1: YQQJ sulu ekstraktının kimyasal bileşenleri tanımlandı. Tablo, UHPLC-Q-Orbitrap HRMS tarafından tanımlanan bileşikleri, prototip kan emilen bileşenler (A1–A28) dahil olmak üzere, sınıflandırmaları ve bitkisel kökenleriyle birlikte listelenmektedir. Kısaltmalar: BHSSC = Hedyotis diffusa Willd.; CSL = Dioscorea nipponica Makino; DH = Romatoloji L .; JXT = Spatholobus suberectus Dunn; HQ = Astragalus membranaceus.; CQC = Plantago asiatica L.; JYH = Lonicera japonica. Thunb. Bileşik sınıflar arasında A = Alkaloidler; Ald = Aldehitler; F = Flavonoidler; N = Nükleozidler; O = Diğerleri; OA = Organik asitler; P = Fenoller; PA = Fenolik asitler; Phe = Fenilpropanoidler; Q = Kinonlar; S = Sakariridler; Ste = Steroidler; T = Terpenoidler; Tan = Tanenler. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Mevcut çalışmada, "UHPLC-Q-Orbitrap HRMS tanımlama – serum farmakokimyası analizi – ağ farmakolojisi tahmini – moleküler kenetlenme doğrulaması" adlı entegre bir strateji kullanılarak YQQJ'nin IgAN tedavisinde potansiyel materyal temeli ve mekanizmaları sistematik olarak aydınlanmıştır. Önceki araştırmalar, çoğunlukla MS'ye dayanarak bitkisel formüllerin kimyasal bileşenlerini analiz eden ve ardından sadece ağ farmakolojisi kullanarak mekanizmaları tahmin edençalışmaların aksine, serum farmakokimyası "karmaşık bitkisel bileşenler – kan emilen bileşenler – doğrudan in vivo aktif maddeler – farmakodinamik madde temeli" iş akışını takip eder. Uygulamadan sonra sistemik dolaşıma giren bileşenleri belirleyerek, bu yaklaşım TCM formüllerinin farmakodinamik madde temelini belirlemede etkili bir strateji olarak yaygın olarak kabul edilir.

Bu çalışmada, UHPLC-Q-Orbitrap HRMS analizi başlangıçta YQQJ'de 185 bileşen tespit etti; bunların 28'i prototip kan emilen bileşikler olarak doğrulandı ve böylece sonraki mekanik çalışmalar için güvenilir bir kimyasal temel sağladı. Bu tanımlamanın doğruluğu, tutma süresi, tam kütle ve MS/MS parçalanma bilgisinin kapsamlı eşleşmesine bağlıydı14. Serum farmakokimya stratejisine dayanarak, bu prototip kan emilen bileşikler ağ inşası için başlangıç noktası olarak kullanıldı ve bitkisel bileşenler ile gerçek in vivo etkinlikarasındaki önemi artırdı. Bileşik-hastalık kesişen hedefleri çekirdek düğümlerin PPI tabanlı taraması ve ardından GO ile KEGG zenginleştirme analizleriyle entegre edilerek, IgAN ile ilişkili anahtar sinyal yollarıbelirlendi 15. Moleküler ikiştirme sonuçları, ana kan emilen bileşenlerin Hedyotis diffusa Willd. ve Dioscorea nipponica Makino'dan türetildiğini gösterdi.deneysel olarak doğrulanmış fonksiyonel aktivite yerine tahmin edilen bağlanma eğilimlerine dayalı temel hedeflerle etkileşime girebilir. Bu bulgular, daha fazla deneysel doğrulama beklendiğinde, Deacetylasperulosidic asit, Geniposidik asit ve Dioscin'in YQQJ'nin potansiyel ana farmakodinamik bileşenleri olarak hizmet edebileceği hipotezini desteklemektedir.

Teknik açıdan bakıldığında, örnek ön işleme çok önemliydi. Serumun karmaşıklığı ve endogen proteinlerin (örneğin hormonlar ve enzimler) varlığı nedeniyle, kan emilen bileşenlerin tespit edilmesinde müdahale kaçınılmazdır. Bu çalışmada, metanol çökeltmesi analitleri zenginleştirmek ve arka plan girişimini azaltmak için uygulandı; böylece MS analizinin hem hassasiyeti hem de doğruluğusağlandı34. Kan örnekleme zaman noktalarına gelince, bitkisel formüllerdeki farklı bileşenler belirgin emilim ve in vivo dönüşüm desenleri gösterebilir ve bu da serumda tespit edilebilirliklerini etkileyebilir. Bu nedenle, ön denemelere dayanarak, serum örnekleri son uygulamadan 2 saat ve 8 saat sonra toplanarak dolaşımdaki bileşenlerin kapsamını en üst düzeye çıkarmıştır.

Bu iş akışının başarılı uygulanması için özellikle kritik birkaç prosedürel adımın bulunduğu bulundu. Doğru bileşik tanımlaması, tutma süresi, yüksek çözünürlüklü kütle doğruluğu ve tanısal MS/MS parça iyonları birleşik değerlendirmesine dayanır. Ayrıca, uygulamadan sonra dolaşımda farklı aşamalarda ortaya çıkabilecek kan emili bileşenlerin alınması için uygun serum örnekleme zaman noktaları gereklidir. Bu nedenle, karmaşık biyolojik matrislerde prototip bileşiklerin güvenilir şekilde tespit edilmesini sağlamak için örnek ön işlem ve kromatografik ayırma koşullarının dikkatli optimizasyonu gereklidir.

Örnek hazırlama ve MS analizi sırasında potansiyel analitik zorluklar ortaya çıkabilir. Örneğin, eksik protein çökeltmesi iyonlaşma verimliliğini bastıran matris etkilerine yol açabilirken, aşırı arka plan gürültüsü algılama hassasiyetini azaltabilir. Bu sorunlar, protein çökeltmesi sırasında çözücü oranlarının optimize edilmesi, kromatografik ayrım koşullarının iyileştirilmesi ve MS alım parametrelerinin ayarlanmasıyla azaltılabilir. Veri işleme sırasında, yalnızca veritabanı eşleştirmesine dayandığında yanlış pozitif bileşik açıklamalar meydana gelebilir; bu nedenle, kimlik güvenilirliğini artırmak için MS/MS parçalanma desenlerinin ve tutma davranışlarının manuel doğrulanması önerilir.

Bu çalışmada çeşitli metodolojik hususlar dahil edilmiştir. İlk olarak, oral biyoerişilebilirlik ve ilaç benzerliği gibi geleneksel kriterler uygulanmak yerine, hedef tahmin için yalnızca deneysel olarak doğrulanmış kan emili bileşenler kullanıldı. Bu yaklaşım, önceden belirlenmiş filtreleme eşikleri nedeniyle aktif bileşiklerin potansiyel olarak atlanmasını önlemiş ve in vivo olarak biyolojik olarak kullanılabilir olmayan alakasız bileşenleri ortadan kaldırarak ağtahmininin fizyolojik önemini güçlendirmiştir 16. İkinci olarak, kenetlenmek için aktif ligandların seçimi, özellikle "rüzgar-nemini giderme ve ısı toksini temizleme" işlevlerine sahip bitkilerden kaynaklanan ana bileşenlere odaklandı (Hedyotis diffusa Willd. ve Dioscorea nipponica Makino.), böylece TCM'nin "böbreğe giren rüzgar-nem-ısı toksini" kavramı ile IgAN'ın modern patolojik özellikleri arasında mekanik bir köprü oluşturdu. Bu, formül–desen korelasyonu TCM teorisini destekleyen ön kanıtlar sunar. Üçüncü olarak, veri tabanları arasında veri büyüklüğü ve kalitesinde potansiyel farklılıklar göz önünde bulundurulduğunda, hedef kapsamını genişletmek ve herhangi bir tek veritabanı tarafından getirilen önyargıyı azaltmak için birden fazla platform entegreedildi 35.

Tüm tespit edilen kimyasal bileşenlere doğrudan ağ farmakolojisi uygulayan geleneksel stratejilerle karşılaştırıldığında, mevcut iş akışı deneysel olarak tespit edilen kan emilmiş bileşenlere dayalı kanıt odaklı bileşik önceliklendirmesini vurgulamaktadır. Bu adımlı filtreleme süreci, hesaplamalı analize giren aday bileşik sayısını azaltır ve bileşik-hedef etkileşim ağlarının yorumlanabilirliğini artırır. Ayrıca, ağırlıklı olarak endogen metabolik bozulmaları yakalayan metabolom odaklı çalışmaların aksine, mevcut strateji bitkisel ilaçlardan türetilen dışsal prototip bileşiklere odaklanıyor ve böylece farmakolojik aktivitenin belirli bitkisel bileşenlere daha doğrudan atfedilmesini sağlıyor.

Pratik metodolojik açıdan, bu iş akışı karmaşık bitkisel formülasyonların araştırılması için çeşitli avantajlar sağlar. HRMS'nin serum farmakokimyası ile entegrasyonu, biyoulaşılabilir bileşenlerin güvenilir şekilde tanımlanmasını sağlarken, ağ farmakolojisi ve moleküler kenetlenme kombinasyonu, kimyasal kanıtları mekanik tahminle bağlayan hiyerarşik bir analitik çerçeve oluşturur. Ayrıca, ağ yapısını deneysel olarak doğrulanmış bileşiklerle sınırlamak, ağ karmaşıklığını azaltır ve çekirdek bileşik-hedef etkileşimlerinin daha net tanımlanmasını kolaylaştırır.

Bu çalışmanın da sınırlamaları var. Birincisi, ağ farmakolojisi ve moleküler kenetlenme öngörücü hesaplama yaklaşımlarıdır. Güçlü bağlanma eğilimi, moleküler kenetlenme protein dinamiğini, hücresel bağlamı veya aşağı akış sinyalini hesaba katmadığı için in vivo biyolojik düzenlemeye mutlaka dönüşmez. Ayrıca, mevcut kenetlenme protokolü, birlikte kristalize ligandlar kullanılarak yeniden kenetleme doğrulamasını veya bilinen inhibitörlerle kıyaslama yapmayı içermemiştir; bu da kenetlenme doğruluğunun değerlendirilmesini sınırlayabilir. RMSD tabanlı doğrulama, moleküler dinamik simülasyonları ve deneysel testleri içeren gelecekteki çalışmalar, bu tahminlerin güvenilirliğini daha da güçlendirecektir. Şu anda, grubumuz Dioscin'in JAK2/STAT3 yolu üzerinden etki ettiğini gösteren mekanik doğrulamayı tamamladı; bu da tahminin güvenilirliğini bir ölçüde güçlendirdi ve bu çalışmada belirlenen ana hedefler için kısmi deneysel destek sağlıyor, ancak diğer bileşen–hedef etkileşimleri hâlâ onaygerektiriyor 36. İkinci olarak, bitkiler arasındaki orantılı uyumluluk ve dozaj ilişkileri etkileri mevcut analizde dahil edilmemiştir. Gelecekteki çalışmalar, klinik reçete uygulamalarını daha iyi yansıtmak için doz-etki ağırlıklı ağ modellerigetirebilir.

Sonuç olarak, mevcut iş akışı—kan emili bileşenlerin yüksek çözünürlüklü MS tabanlı tanımı, ağ farmakolojisine dayalı hedef ve yol odaklı analizler ve moleküler kenetlenme doğrulama—karmaşık bir bitkisel formülden aktif materyal temeli ve eylem hedeflerinin verimli şekilde daralmasını sağlar. Bu, takip biyolojik doğrulama için net bir deneysel yön sağlar ve TCM formüllerinin mekanik araştırmalarını hızlandırır. Gelecekte, mekansal metabolomik, organoid modeller ve çoklu omik teknolojilerin entegrasyonu, fizyolojik ve patolojik koşulları daha yakından özetleyen sistemlerde mevcut bulguların dinamik ve üç boyutlu doğrulanmasını ve genişletilmesini mümkün kılabilir; böylece TCM formüllerinin bilimsel temelini aydınlatmak için daha sağlam kanıtlar sağlanabilir.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No.81973675), Yüksek Düzey Çin Tıp Hastanesi Tanıtım Projesi (Hibe No. HLCMHPP2023039) ve Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 7252259) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AutoDock 4.2.6Scripts Araştırma Enstitüsü-
Kromatografik sütunWaters Corp.BERAET UPLC HSS T3
Yüksek hızlı soğutmalı santrifüjHettich Laboratuvarı TeknolojisiMikro 220R
Entegre biyoinformatik platformlarWeizmann  Enstitü   of  Bilim-GeneCards veritabanı (https://www.genecards.org/)
Entegre biyoinformatik platformlarThe  Johns  Hopkins  Üniversite  Okul  of  Tıp-OMIM veritabanı (https://omim.org/).
LC-MS/4 L AsetonitrileThermo Fisher ScientificA955-4
LC-MS/4 L MetanolThermo Fisher ScientificA456-4
LC-MS/4 L SuThermo Fisher ScientificW6-4
LC-MS/50 mL Formik asitThermo Fisher ScientificA117-50
Kütle Spektrometrisi Veri İşleme yazılımıWaters Corp.-Progenesis QI 3.0 yazılımı
Moleküler kenetlenme yazılımıOlson LaboratuvarıAutoDock 4.2.6
PPI platformuSTRING veritabanı şirketi-STRING çevrimiçi platformu (https://string-db.org)
Protein veritabanıAvrupa Biyoinformatik Enstitüsü; İsviçre Biyoinformatik Enstitüsü; Protein Bilgi Kaynağı-UniProt platformu (https://www.uniprot.org/)
Quadrupol orbitrap kütle spektrometresiThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZR
Referans bileşik veritabanlarıTCM Pro 2.0, Pekin Hexin Teknoloji Şirketi, Ltd.-
Döner evaporatörŞanghay Titan Bilimsel Şirketi, LtdTR-3L
Yapısal biyoloji veritabanları.Brookhaven Ulusal Laboratuvarı-RCSB PDB veritabanı (https://www.rcsb.org/)
Yapısal biyoloji veritabanları.Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi-PubChem veritabanı (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)
Hedef tahmin veritabanlarıSIB İsviçre Biyoinformatik Enstitüsü-SwissTargetPrediction veritabanı (https://www.swisstargetprediction.ch)
Hedef tahmin veritabanlarıŞanghay  Enstitü   of  Materia  Medica-TCMSP veritabanı (https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php)
Topolojik analiz eklentisi--Centiscape 2.2 eklentisi; Ağ Analizörü
UHPLC sistemiVanquish Flex-
Ultra yüksek performanslı sıvı kromatografiThermo Fisher ScientificVanquish Flex UHPLC
Ultrasonik çıkarıcıKunshan Ultrasonik Aletler Şirketi, Ltd.KQ3200D
Vakumlu Santrifüj KonsantratörNingBo Scientz Biyoteknoloji A., Ltd.SCIENTZ-1LS
Görselleştirme yazılımı--Cytoscape 3.10.4
Web tabanlı fonksiyonel açıklama platformu.Broad  Enstitü-Metascape çevrimiçi platformu (https://metascape.org)

Kaynaklar

  1. Pattrapornpisut, P., Avila-Casado, C., Reich, H. N. IgA nephropathy: Core curriculum 2021. Am J Kidney Dis. 78 (3), 429-441 (2021).
  2. Pitcher, D., et al. Long-term outcomes in IgA nephropathy. Clin J Am Soc Nephrol. 18 (6), 727-738 (2023).
  3. Shen, X., et al. Long-term outcomes of IgA nephropathy in China. Nephrol Dial Transplant. 40 (6), 1137-1146 (2025).
  4. Roberts, I. S. D. Pathology of IgA nephropathy: A global perspective. Nephrology (Carlton). 29 (Suppl 2), 71-74 (2024).
  5. Floege, J., Bernier-Jean, A., Barratt, J., Rovin, B. Treatment of patients with IgA nephropathy: A call for a new paradigm. Kidney Int. 107 (4), 640-651 (2025).
  6. Zhang, Y., Zhang, H. Current understanding and new insights in the treatment of IgA nephropathy. Nephrology (Carlton). 29 (Suppl 2), 75-79 (2024).
  7. Kang, S. Comparative analysis of western medicine and traditional Chinese medicine. 4th Int. Conf. Social Sciences and Humanities and Arts (SSHA 2025), 2025, , 350-355 (2025).
  8. Wang, X. H., et al. Traditional Chinese medicine in treating IgA nephropathy. J Transl Intern Med. 9 (3), 161-167 (2021).
  9. Zeng, Q., Xu, J. L., Liang, Y., Yu, R. H. Etiology and treatment progress of IgA nephropathy. Med Recapitulate. 28 (1), 163-167 (2022).
  10. Guo, T., et al. Regulation of immune dysfunction in IgA nephropathy. Chin J Basic Med Tradit Chin Med. 30 (3), 552-555 (2024).
  11. Deng, Q. H., Zou, D., Zhang, S. L., Zhou, X. Regulation of mucosal immunity in IgA nephropathy. Acta Chin Med. 40 (5), 1026-1031 (2025).
  12. Zhang, S. Q., Rao, X. R., Dai, X. W. Clinical observation of Yiqi Qingjie Fang. Guangming J Chin Med. (12), 44-45 (2006).
  13. Dong, M. Y., et al. Efficacy of Yiqi Qingjie Fang combined with immunosuppressants. Chin J Integr Tradit West Med. 39 (7), 791-797 (2019).
  14. Yu, Y., Yao, C., Guo, D. A. Chemical basis of traditional Chinese medicine. Acta Pharm Sin B. 11 (6), 1469-1492 (2021).
  15. Zhou, W. X., Cheng, X. R., Zhang, Y. X. Network pharmacology: A new concept. Chin J Pharmacol Toxicol. 26 (1), 4-9 (2012).
  16. Huang, Q., et al. Active components of Eucommia ulmoides. Chin J New Drugs Clin Rem. 40 (6), 460-469 (2021).
  17. Zhang, A. H., et al. Chinmedomics approach. Engineering. 5 (1), 60-68 (2019).
  18. Wang, X., Zhang, A., Sun, H., Yan, G. Serum pharmacochemistry of TCM. Phytother Res. 31, 7-14 (2017).
  19. Liu, R., Zhao, Z., Dai, S., Che, X., Liu, W. Bioactive compound identification. J Agric Food Chem. 67 (13), 3811-3825 (2019).
  20. Xu, S. Y., Bian, R. L., Chen, X. Pharmacological experimental methodology. Chin Pharmacol Bull. (1), 19(1992).
  21. Szklarczyk, D., et al. STRING v11 database. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D607-D613 (2019).
  22. Shannon, P., et al. Cytoscape software. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  23. Jeong, H., Mason, S. P., Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Protein network centrality. Nature. 411 (6833), 41-42 (2001).
  24. Joy, M. P., Brock, A., Ingber, D. E., Huang, S. High-betweenness proteins. J Biomed Biotechnol. (2), 96-103 (2005).
  25. Wuchty, S., Stadler, P. F. Centers of complex networks. J Theor Biol. 223 (1), 45-53 (2003).
  26. Zhou, Y., et al. Metascape resource. Nat Commun. 10 (1), 1523(2019).
  27. Burley, S. K., et al. RCSB PDB resources. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D564-D574 (2025).
  28. Laskowski, R. A., Swindells, M. B. LigPlot+. J Chem Inf Model. 51 (10), 2778-2786 (2011).
  29. Cheung, C. K., et al. Pathogenesis of IgA nephropathy. Nat Rev Nephrol. 21 (1), 9-23 (2025).
  30. Zhao, L., et al. Triptolide and IgA nephropathy. Cell Prolif. 55 (9), e13278(2022).
  31. Tao, J., et al. JAK-STAT activity in IgA nephropathy. Clin J Am Soc Nephrol. 15 (7), 973-982 (2020).
  32. Cox, S. N., et al. Wnt/β-catenin and PI3K/AKT pathways. Kidney Int. 78 (4), 396-407 (2010).
  33. Nie, X., et al. Huagan Jian analysis. Chin Tradit Herb Drugs. 53 (2), 382-394 (2022).
  34. Wu, X. W., et al. Serum pharmacochemistry methodology. Chin J Exp Tradit Med Formulae. 25 (3), 173-179 (2019).
  35. Abbasi, K., et al. Deep learning in drug target prediction. Curr Med Chem. 28 (11), 2100-2113 (2021).
  36. Zhou, L., et al. Dioscorea nipponica mechanisms. J Ethnopharmacol. 353 (Pt A), 120272(2025).
  37. Zhang, K. Y., et al. Dose–effect network pharmacology. Chin J Hosp Pharm. 43 (7), 738-747 (2023).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Molek ler KenetlemeKan taraf ndan Absorbe Edilen Bile iklerBile ik Tan mlamaProtein Etkile im AKEGG YolaGeleneksel in T bb
UHPLC-Q-Orbitrap HRMS'nin ağ farmakolojisi ile entegre edilmesiyle IgA nefropatiye karşı Yiqi Qingjie formülünün maddi temelinin açıklanması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.