Bronşiyal Astım Tedavisinde Guben Pingchuan Granülünün Mekanizmasını İnceleme

Özet

Bu protokol, Guben Pingchuan granüllerinin bronşiyal astımda etki mekanizmasını ağ farmakolojisi, moleküler kenetlenme ve in vivo doğrulama kullanarak inceler.

Özet

Bu çalışma, Guben Pingchuan granüllerinin bronşiyal astım tedavisinde etki mekanizmasını ağ farmakolojisi, moleküler kenetlenme ve deneysel doğrulama kullanarak incelemektedir. Aktif bileşenler ve ilgili hedefler TCMSP, HERB ve SymMap veritabanları kullanılarak belirlendi. Bronşial astımla ilgili hedefler GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank ve PharmGKB'den toplandı. Örtüşen hedefler belirlendi ve bileşen-hedef ile protein-protein etkileşim (PPI) ağları inşa edildi. Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizleri yanlış keşif oranı (FDR) düzeltmesiyle gerçekleştirildi. Bağlanma afinitesini değerlendirmek için moleküler kenetlenme yapıldı, ardından in vivo doğrulama yapıldı. Toplamda 121 aktif bileşen ve 234 ilaç ile ilgili hedef tespit edildi ve 155 örtüşen hedef ortaya çıktı. Temel hedefler arasında TP53, AKT1, TNF ve IL6 vardı. KEGG analizi, deneysel doğrulama için seçilen PI3K–Akt sinyal yolunun önemli zenginleşmesini gösterdi. Moleküler kenetlenme, çekirdek bileşenler ile AKT1 arasında güçlü bir bağlanma yakınlığı ortaya koydu. Ovalbuminle indüklenen astımlı sıçanlarda, Guben Pingchuan granülü serum IL-4 ve IL-10 seviyelerini düşürdü, akciğer dokusunda FoxP3 ekspresyonunu artırdı ve PI3K ile AKT mRNA seviyelerini yükseltti. Bu bulgular, Guben Pingchuan granülünün PI3K–Akt. sinyal yolunu modüle ederek, inflamatuar sitokinleri düzenleyerek ve düzenleyici T hücresi fonksiyonunu artırarak bronşiyal astımı hafiflettiğini göstermektedir.

Giriş

Bronşiyal astım, hava yolu iltihabı, hava yolları aşırı tepkisi, mukus aşırı sekreyasyonu ve hava yolu yeniden şekillendirmesiyle karakterize edilen heterojen kronik bir solunum yolu^{hastalığıdır 1}. Patogenezi, bağışıklık hücresi aktivasyonu, inflamatuar aracılar ve çoklu sinyal yolları arasında karmaşık etkileşimleri içerir. Klinik olarak, astım tekrarlayan hırıltı, nefes nefesi, göğüs sıkışması ve öksürük ile ortaya çıkar. Hava yolu iltihabı, hastalığın başlangıcı ve ilerlemesini temel alan merkezi bir mekanizmadır ve IL-6, IL-4, IL-17 ve TNF-α. gibi pro-inflamatuar sitokinlerin artan salgılanması, eozinofiller ve nötrofiller dahil inflamatuar hücrelerin sızması ve hava yolları düz kas proliferasyonu, bazaz zarının kalınlaşması ve mukus bezi hiperplazisi^(2˒3) gibi yapısal değişikliklerle karakterize edilir. Bu patolojik süreçler nihayetinde hava yolu tıkanıklığına ve hava akışının bozulmasına yol açar.

Astım patofizyolojisi, tek bir mekanizma yerine birden fazla etkileşimli sinyal yolu tarafından düzenlenir. PI3K–Akt sinyal yolu, özellikle Treg/Th17 eksenini FoxP3 ekspresyonunu düzenleyerek bağışıklık dengesini modüle etmekte kilit bir rol oynar. Bu yol ayrıca IL-17 ve TNF sinyal yolları ile etkileşime girerek inflamatuar yanıtları ve hava yolu yeniden modellenmesini artırır; bu da hastalık heterojenliğine ve tedavi direncine^{katkıda bulunur 3,4}. Epidemiyolojik veriler, astım prevalansında küresel olarak sürekli artış olduğunu göstermektedir; dünya genelinde 358 milyondan fazla etkilenen kişi ve Çin'de yaklaşık 45,7 milyon yetişkin hasta ^5,6. Mevcut tedavi stratejileri öncelikle soluma β₂-agonistler ve glukokortikoidlere dayanır; ancak bu tedaviler sınırlı patolojik mekanizmaları hedefler ve bazı hastalarda yan etkilere ve glukokortikoid direncine yol açabilir. PI3K–Akt. gibi yolların düzensizliği, terapötik yanıt verebilirliğinin azalmasıyla ilişkilendirilmiş olup, çok hedefli terapi yaklaşımlarına olan ihtiyacı^{vurgulamaktadır 7,4}.

Geleneksel Çin tıbbı (TCM), astımı "Xiao Sendromu" olarak sınıflandırır; bu Sendromu, akciğer, dalak ve böbrek fonksiyonlarında eksiklikler ve dış patojenik faktörlerin birleşmesiyle ilişkilidir. TCM formülasyonları, çok bileşenli, çok hedefli özellikleri nedeniyle astım yönetiminde yaygın olarak^{kullanılmıştır 8,9}. Tek hedefli farmakolojik ajanların aksine, TCM bileşikleri, birden fazla biyolojik yolun düzenlenmesini koordine ederek terapötik etkiler uygular ve astım^10'un karmaşık patofizyolojisiyle uyumludur. Ağ farmakolojisi, ilaç bileşenleri, hedefler ve hastalık yolları arasındaki etkileşimleri analiz etmek için sistem düzeyinde bir yaklaşım sunar ve temel biyoaktif bileşiklerin ve moleküler mekanizmaların tanımlanmasını^{sağlar 11}. Moleküler kenetlenme, küçük moleküller ile hedef proteinler arasındaki bağlanma afinitesini değerlendirerek bu yaklaşımı daha da tamamlar.

Guben Pingchuan granülü, Ephedra sinica (Ephedra Otsu), Psoralea corylifolia meyvesi, Prunus armeniaca tohumu (Kayışı tohumu), Pseudostellaria heterophylla kökü, Perilla frutescens meyvesi, Eriobotrya japonica yaprağı (Loquat yaprağı), Lilium brownii soğanı ve Epimedium brevicornum dahil olmak üzere sekiz bitkisel bileşenden oluşan geleneksel bir Çin tıbbi formülüdür. Bu formülasyon geleneksel olarak hayati enerjiyi güçlendirmek, balgamı çözmek ve hırıltı hafifletmek için kullanılır. Önceki klinik çalışmalar, bronşiyal astımda terapötik etkinliğini göstermiş olup, geleneksel tedavilere kıyasla daha yüksek yanıt oranlarına^{sahiptir 12}.

Temel etki mekanizmasını açıklamak için, ağ farmakolojisi, moleküler kenetlenme ve in vivo deneysel doğrulamayı birleştiren entegre bir yaklaşım uygulanır. Ağ farmakolojisi, bronşiyal astımla ilişkili aktif bileşenleri ve potansiyel hedefleri belirlemek için kullanılır. Moleküler kenetlenme, ana bileşikler ile hedef proteinler arasındaki etkileşimleri değerlendirmek için kullanılır. Daha sonra, kritik sinyal yolları üzerinde, özellikle PI3K–Akt. yolunda düzenleyici etkilerin değerlendirilmesi için hayvan modelinde deneysel doğrulama yapılır. Bu yaklaşım, Guben Pingchuan granülünün çoklu hedefli terapötik etkilerine mekanik içgörüler sağlamayı ve bronşial astım tedavisinde uygulanmasını desteklemeyi amaçlamaktadır.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri Liaoning Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmış (Onay No.: 21000042023058) ve kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokolde kullanılan araştırma araçları Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Veritabanları ve yazılımlar

1. Aşağıdaki veritabanlarına ve yazılımlara erişin: TCMSP, HERB, SymMap, PubChem, STRING, GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank, PharmGKB, DAVID, UniProt ve Cytoscape (sürüm 3.9.1).

2. Bileşen hedeflerinin edinilmesi

1. TCMSP^{veritabanı 13'ten} Ephedra Otsu, Kayısı tohumu, Pseudostellaria kökü, Perilla meyvesi, Loquat yaprağı, Lilium türleri ve Epimedium'un kimyasal bileşenlerini alın. Psoralea'nın bileşiklerini HERB ve SymMap veritabanlarından alın.
2. Ağızdan kullanılan biyoyararlanıllık (OB ≥% %30) ve ilaç benzerliği (DL ≥ 0.18) kullanılarak aktif bileşikleri ^taramak.
3. TCMSP kullanarak hedef genleri tahmin edin. UniProt veritabanını kullanarak tüm hedefleri Homo sapiens seçerek standartlaştırın. İnsan dışı girişler, açıklamasız proteinler ve modası geçmiş tanımlayıcılar dahil olmak üzere yetkili ve geçersiz hedefleri kaldırın.

3. Bronşiyal astım hedeflerinin edinilmesi

1. GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank ve PharmGKB'yi "bronşiyal astım" anahtar kelimesiyle arayın. GeneCards alaka puanını >4'e ayarlayın. Tüm alınan hedefleri birleştirin ve kopyaları kaldırın.

4. Kesişim hedeflerinin tanımlanması

1. İlaç hedeflerini ve hastalık hedeflerini çevrimiçi bir Venn analiz aracına ithal edin. Örtüşen hedefleri belirleyin ve sonraki analiz için toplam sayı kaydolun.

5. Bileşen–hedef ağının inşası

1. Kesişim hedeflerini Cytoscape 3.9.1'e aktarın. Bileşen–hedef ağını kurun. Düğüm boyutunu ve rengini derece değerlerine göre ayarlayın.

6. Protein-protein etkileşim (PPI) ağının inşası

1. Kesişim hedeflerini STRING veritabanına yükleyin. Homo sapiens'i seçin ve güven puanını ≥0.900'e ayarlayın. Ağı dışa aktarın ve Cytoscape'e aktarın.
2. Topolojik parametreleri hesaplayın (derece, ortalık, merkezilik ve yakınlık merkeziliği). Medyan eşikler ve derece >20 kullanılarak temel hedefleri belirleyin.

7. GO ve KEGG zenginleştirme analizi

1. Örtüşen hedefleri DAVID veritabanına yükleyebilir veya R paketi clusterProfiler kullanarak analiz edebilirsiniz.
2. Biyolojik süreç, hücresel bileşen ve moleküler fonksiyon kategorileri için Gen Ontolojisi (GO) zenginleştirme analizi yap.
3. KEGG yol zenginleştirme analizi yapın. Yanlış keşif oranı (FDR) düzeltmesi uygulanır ve anlamlılık eşiğini FDR < 0.05 olarak ayarlayın.
4. En iyi zenginleştirilmiş terimleri bar grafikleri veya baloncuk grafikleri kullanarak görselleştirin.

8. Moleküler kenetlenme

1. PubChem'den çekirdek bileşiklerin 2D yapılarını indirin. ChemOffice kullanarak 3D yapılar oluşturup mol2 dosyası olarak kaydedin.
2. RCSB PDB veritabanından protein yapılarını indirin. PyMOL kullanarak su moleküllerini ve ligandlarını çıkarın.
3. AutoDock Vina kullanarak moleküler kenetlenme gerçekleştirin. Grid kutusu parametrelerini tanımlayın ve kenetlenme simülasyonları çalıştırın.
4. Bağlama enerjilerini (kcal/mol) ve anahtar etkileşimli kalıntıları kaydedin. Moleküler modelleme, görselleştirme ve simülasyon platformları kullanarak kenetlenme sonuçlarını görselleştirin.

9. Deneysel doğrulama

1. Hayvanlar
   1. 48 erkek Sprague–Dawley sıçanı (9 haftalık, 220–240 g) alın. Ev hayvanları 20–25 °C sıcaklıkta, standart koşullarda %55–%60 nem ile birlikte.
2. İlaçlar ve reaktifler
   1. Ephedra Otsu, Psoralea, Kayısı tohumu, Pseudostellaria kökü, Perilla meyvesi, Loquat yaprağı, Lilium ve Epimedium içeren Guben Pingchuan granülleri hazırlayın.
   2. Malzeme Tablosu'nda listelenen deksametazon, ovalbütin (OVA), alüminyum hidroksit, ELISA kitleri, RNA ekstraksiyon kitleri ve antikorlar hazırlayın.
3. Enstrümanlar
   1. Mikroplaka okuyucu, elektroforez sistemi, parafin mikrotomu ve görüntüleme sistemi dahil standart laboratuvar ekipmanlarını hazırlayın.
4. Hayvan gruplanması ve tedavisi
   1. Fareleri rastgele altı gruba (n = 8) ayrıldırın: boş kontrol grubu, model grubu, deksametazon grubu (0,3 mg/kg), düşük dozlu Çin tıbbı grubu, orta doz Çin tıbbı grubu ve yüksek doz Çin tıp grubu.
   2. 1., 7. ve 14. günlerde, model grubundaki sıçanlara, düşük doz Çin tıp grubuna, orta doz Çin tıp grubuna, yüksek doz Çin tıp grubuna ve deksametazon grubuna 1 mL intraperitoneal enjeksiyon uygulanarak model grubu, düşük doz Çin tıbbı grubu, yüksek doz Çin tıbbı grubu ve deksametazon grubu ile karşılaştırılabilir.
   3. 1, 7 ve 14. günlerde boş kontrol grubundaki farelere %0,9 fizyolojik salin içeren 1 mL intraperitoneal enjeksiyon uygulanır.
   4. 15. ila 21. günler arasında, günde bir kez 20 dakika boyunca nebulize inhalasyon uyarısı yapın. Model grubunda, düşük doz Çin tıp grubunda, orta doz Çin tıp grubunda, yüksek doz Çin tıp grubunda ve deksametazon grubunda farelere %5 OVA nebulize inhalasyon uygulanır.
   5. 15-21. günler arasında boş kontrol grubundaki farelere %0,9 fizyolojik tuzlu nebulize soluma uygulanır.
   6. Atanan tedavi grubuna göre 22-36. günler arasında günde bir kez oral gazajla uygulanır.
   7. Deney boyunca vücut ağırlığını ve genel durumu günlük olarak takip edin. Deneysel zaman çizelgesi Tablo 1'de özetlenmiştir.
5. Histopatoloji
   1. Akciğer dokusu topla. Örnekleri düzeltin, gömleyin ve kesinleyin. Hematosilin–eozin boyama işlemi yapın.
   2. Kolajen birikimini değerlendirmek için Masson boyama işlemi yapın.
6. RT-PCR analizi
   1. Akciğer dokusundan toplam RNA çıkar.
   2. Donmuş akciğer dokusunu ultra-düşük sıcaklık koşullarında homojenleştirin. Numuneyi tarttıktan sonra, hızla sıvı azot içeren önceden soğutulmuş bir harca aktarın ve toz haline getirin.
   3. Toz örneği santrifüj tüpüne aktarın. Her 50–100 mg dokuya 1 mL TransZol UP ve 0.2 mL RNA ekstraksiyon reaktifi ekleyin. Tüpü oda sıcaklığında 5 dakika salla.
   4. Numuneyi 1000 × g ve 2–8 °C sıcaklıkta 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Renksiz sulu fazı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
   5. 1 mL TransZol UP ile 0.5 mL izopropanol ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın.
   6. Örneği 1000 × g ile 10 dakika boyunca santrifüj yapın. 1 mL %75 etanol ekleyin ve 5 dakika boyunca tekrar santrifüj yapın.
   7. Üst yüzeyi atın ve çökeltiyi oda sıcaklığında 5 dakika hava ile kurutun. Çökeltiyi 50–100 μL RNA çözeltisinde çözüp 10 dakika kuluçka yapın.
   8. Numuneyi uzun vadeli koruma için −70 °C'de sakla.
   9. cDNA sentezlenin ve PI3K ile AKT ekspresyonunu ölçmek için nicel PCR yapın.
7. ELISA
   1. Serum örneklerini 4 °C'de eritin. IL-4 ve IL-10. seviyelerini üretici talimatlarına göre ELISA kitleriyle ölçün.
8. İmmünohistokimya
   1. %4 paraformaldehit içeren sabit akciğer dokusu, parafine gömülü, dilimlenmiş, mumdan arındırılmış ve hidratlandırılmış.
   2. Antijen toplama, bloklama ve antikor kuluçka işlemi yapın. FoxP3 immünohistokimya kitine göre boya, DAB boyama çözeltisi ve pozitif ifade ise kahverengi-sarı veya koyu kahverengi boyama olarak görülür.
   3. Mikroskop altında gözlem ve fotoğraf çekmek, ayrıca FoxP3 ifadesinin nicel istatistiksel analizi için Image J yazılımını kullanmak faydalı olmak.
9. İstatistiksel analiz
   1. Shapiro–Wilk testi kullanılarak veri normalliği ve Levene testi kullanılarak varyans homojenliği test edilir.
   2. Verileri uygun şekilde tek yönlü ANOVA veya parametrik olmayan testlerle analiz edin. Veriyi ortalama ± standart sapma olarak ifade edin.
   3. p < 0.05'i istatistiksel olarak anlamlı olarak tanımlayın. ★★p < 0.01 ve ★p < 0.05 kontrol grubuna karşı; ◆◆p < 0.01 ve ◆p < 0.05 model grubuna karşı; ##p < 0.01 ve #p < 0.05 vs deksametazon grubuna karşı.

Tablo 1: Deneysel zaman çizelgesi. Duyarlılık, zorluk ve tedavi prosedürlerinin programı. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Aktif bileşenlerin taraması
Hedef aktivite filtresi sonrası TCMSP veritabanından toplam 121 aktif bileşen tespit edildi. Bunlar arasında Ephedra Otu 23, Psoralea'dan 7, Kayısı tohumundan 19, Pseudostellaria kökünden 8, Perilla meyvesinden 16, Loquat yaprağından 18, Lilium'dan 7 ve Epimedium'dan 23 bileşen yer almaktadır. (Tablo 2). Luteolin, kersetin, β-sitosterol, kaempferol, stigmasterol ve (+)-katekin da...

Tartışma

Bronşiyal astım, solunum bölümünde yaygın bir^{hastalıktır 16}. Alerjenler ve hava yolu aşırı teippin nedeniyle oluşan bir obstrüktif hava yolu^{bozukluğudur 17}. Klinik sıkdansı yüksek, tekrarlanmaya yatkındır ve tedavisi zordur; bu da hastaların sağlığını ve yaşam kalitesini önemli ölçüde etkiler. 2025 Küresel Astım Girişimi (GINA), inhalasyonlu glukokortikoid tedavisinin astım¹⁸ için etkili olduğunu bildirmektedir; anca...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
qPCR Kit	Novogene	NQ-001, 2×1mL	Hedef genlerin bağıl mRNA ekspresyonunun tespiti
aluminum hydroxide Al(OH)3	Shanghai Yubo Biotechnology Co., LTD	YB-AL001, 500g	Antijen bağışıklık yanıtını artırmak için immünolojik adjuvan
BCA protein Konsantrasyon Test Kiti	Fode Biotechnology Co., LTD	FD2001, kutu başına 100 adet	Numune yüklemeyi standardize etmek için toplam protein kantitasyonu
Kimilüminesans görüntüleme sistemi	Tanon	5200Multi	WB bandı görüntüleme, jel ve blot görüntüsü toplanması ve analizi
Renk Önceden boyanmış Protein Marker	Biolaibo Teknoloji Co., LTD	BL005, 10-180kDa, 500μL	Elektroforez deneyleri için protein moleküler ağırlığı referansı
Gelişmiş RNA Ekstraksiyon Kiti	Whole Golden Branch	ET111-01v2, kutu başına 50 adet	Dokulardan ve hücrelerden toplam RNA'nın ekstraksiyonu ve saflaştırılması
Enzim-bağlı immünosorban test okuyucu	U.S. Biotek Company	Epoch/BioTek	Numunelerde sitokinlerin ve protein içeriğinin kantitatif tespiti
FOXP3 primer antikoru	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	AG5002, 50ul/adet	İmmünolojik test için FOXP3 proteinine hedefli bağlanma
Jel Hızlı Hazırlama Kiti	Shanghai Yamei	PG212, 30 set	Elektroforez için ayrım jeli ve istife jelinin hızlı hazırlanması
masson Boyama Kiti	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1340, 100 tablet	Dokuda kollajen lifleri ve fibroz gözlemi için özel boyama
OVA	Beijing Boaotoda Teknoloji Co., LTD.	OVA-10g, ≥98%	Alerjik hayvan modellerinin oluşturulması için klasik alerjen
Primer Antikor Seyreltme çözeltisi	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	P0256-100ml	Primer antikoru seyreltme, aktiviteyi koruma ve spesifik olmayan bağlanmayı azaltma
Rat IL-10ELISA Kiti	Andy Bio	E-30649, 96T	Rat IL-10 anti-enflamatuar faktörünün kantitatif tespiti
Rat IL-4ELISA Kiti	Andy Bio	E-30623, 96T	Rat Th2 enflamatuar faktörü IL-4'ün kantitatif tespiti
Ters Transkripsiyon Kiti	Baori Medikal Teknoloji Co., LTD	E047-01A	Sonraki gen analizi için RNA'nın cDNA'ya ters transkripsiyonu
Doygun Oil Red O Kiti	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1261, 50mL×2 şişe	Doku yağ damlacıklarının özel boyanması ve tespiti
Shangyang Anti-Tavşan İkincil Antikoru	Proteintech Biological Co., LTD	SA00001-2, 1mL	WB renk reaksiyonu için tavşan primer antikoru ile bağlanır
TBST Tamponu	Wuhan Sewell Biotechnology Co., LTD	G2150, 1L / şişe	Western blot'ta membran yıkama ve antikor seyreltme tamponu
Transfer Elektroforez Sistemi	Shanghai Jingcanshi Precision Machinery Co., Ltd.	PowerPac Basic	Protein elektroforezi ve Western blot membran transferi için kullanılır
Ultra düşük sıcaklık buzdolabı	Zhongke Meiling	MDF-382	Reaktifler, protein örnekleri ve dokuların düşük sıcaklıkta kriyopreservasyonu
Dikey elektroforez tankı	BIO-RAD	JY-ZY5	Protein ve nükleik asit örneklerinin dikey elektroforetiği ile ayrılması