Pectobacterium brasiliense'de belirteçsiz gen silinmesi ve yüksek yoğunluklu Tn5 transpozon mutagezi için toksin tabanlı karşı seçim sistemi

Özet

Burada, patates kara bacak ve yumuşak çürümeden sorumlu bir fitoplatogende Pectobacterium brasiliense'de işaretsiz gen silinmeleri oluşturmak ve genom çapında Tn5 ekleme mutant kütüphaneleri oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, verimli ters genetik analiz sağlar ve bu organizmadaki virülansla ilişkili genlerin fonksiyonel karakterizasyonunu kolaylaştırır.

Özet

Pectobacterium brasiliense, patates yumuşak çürüme, kara bacak ve hava sapı çürümesinden sorumlu yüksek patojenik bir bakteridir. Patojenik mekanizmalarının açıklanması hastalık kontrolü için gereklidir; ancak bu organizma için genetik araçlar sınırlı kalır. Belirteçsiz gen silinmesini ve yüksek yoğunluklu Tn5 transpozon mutagenezini mümkün kılmak için toksin tabanlı bir karşı seçim sistemi geliştirilmiştir. pLP12 plazmidinden türetilen vmi480 toksini, intihar vektörü pKV2'nin oluşturulmasında karşı seçim belirtisi olarak kullanıldı. Bu sistem kullanılarak, P. brasiliense SM suşundaki recA geni başarıyla silinmiştir. Ortaya çıkan recA mutant, pKV2-LLtnp taşıyan RHO3 yardımcı suşuyla konjugasyon yoluyla 12.000'den fazla mutantı içeren bir Tn5 yerleştirme kütüphanesinin oluşturulmasında ebeveyn suş olarak hizmet etti. Bu türev plazmidde, vmi480 toksini, polar etkileri azaltmak için dışa dönük bir lak promotoru kontrolü altında hiperaktif bir Tn5 transpozazı ile değiştirildi. Yüksek verimli yumru aşılama testleri, bitki hücre duvarını bozan enzimlerin salgılanmasını sağlayan temel virülans belirleyicisi olan tip II salgı sistemine yerleştirilmeler dahil olmak üzere patojenlik eksikliği olan mutantların tanımlanmasını mümkün kıldı. Bu platform, fonksiyonel genomikleri destekler ve ekonomik açıdan önemli olan bu patojende virülans mekanizmalarının araştırılmasını kolaylaştırır.

Giriş

P. brasiliense, Pectobacterium cinsi içindeki en agresif türlerden biridir ve patates yumuşak çürüme, kara bacak ve hava sapı^{çürümesi 1'in} neden olmasıdır. Bu hastalıklar, dünyada üçüncü en önemli gıda kaynağı olarak sıralanan ve Çin'in tarımsal üretim sisteminin önemli bir bileşeni olan patateste tahmini %30 verim kaybına yol^{açmaktadır 2}. Ekonomik etkisine rağmen, P. brasiliense'nin patojenliğini yöneten moleküler mekanizmalar yeterince anlaşılmamıştır; bunun büyük nedeni bu tür için verimli ve tekrarlanabilir genetik manipülasyon^{araçlarının} eksikliği ^3,4,5.

Birçok fitopatogenik bakteride fonksiyonel genomik çalışmalar, sağlam allel değişim ve transpozon mutagenez sistemlerine dayanır; ancak P. brasiliense için benzer genetik araçlar sınırlı veya verimsizdir. Özellikle, bu türle uyumlu etkili karşı seçim belirteçleri nadirdir. sacB geni, çeşitli bakterilerde gen silinmesi için karşı seçim belirteci olarak yaygın olarak kullanılırken, P. brasiliense seçim sürecinde %50'ye kadar yüksek tolerans gösterebilir^. Bu tolerans muhtemelen toksinlere karşı hassasiyetin azalmasını yansıtır; muhtemelen sukrozun şeker polimerlerine enzimatik dönüşümünden kaynaklanır. Ayrıca, yüksek sakaroz konsantrasyonları zararlı osmotik^{şoka neden olabilir 6}. Ayrıca, Tn5 transpozon yerleştirme kütüphanesi yapımı gibi verimli büyük ölçekli mutagenez yöntemleri bu organizma için henüz tam olarak kurulmamıştır.

Bu teknik sınırlamaları gidermek için toksin bazlı bir karşı seçim sistemi geliştirildi ve P. brasiliense için sağlam bir Tn5 mutajezi tarama çalışma akışı oluşturuldu. Geleneksel sukroz bazlı yöntemlere kıyasla, bu toksin temelli yaklaşım belirgin avantajlar sunar; bunlar arasında seçim katığı artırılması, çift çapraz olayların tanımlanmasında özgülüğün artması ve kafa karıştırıcı osmotik stresin ortadan kaldırılması gibi avantajlar bulunur. Benzer vmi480 toksin-antitoksin bazlı sistemler, Vibrio türü^7'de seçilme engellerini aşmak için başarıyla uygulanmıştır. Yerleşik metodoloji, bilinmeyen genlerin yüksek verimli fonksiyonel karakterizasyonuna son derece uygulanabilir ve diğer ilişkili yumuşak çürüme Pectobacteriaceae türlerine uyarlanabilecek çok yönlü bir platform sağlar.

Protokol

1. P. brasiliense'de markersiz recA silinme mutantının oluşturulması

1. E. coli donör suşundan standart DNA hazırlık prosedürleriyle P. brasiliense SM ve pKV2 plazmidinden (antibiyotik seçim belirteci ve çoklu klonlama noktasının modifiyasyonu ile türetilen pLP12) genomik DNA çıkarmak.
2. Ekstrakt edilen genomik DNA ve plazmid DNA'nın kalitesi ve konsantrasyonunu agaroz jel elektroforezi ve NanoDrop spektrotometrisi ile doğrulayın.
3. Plazmid pKV2'yi EcoRI ve NheI ile 37 °C'de 5 saat boyunca çift sindirim yaparak lineerleştirin. Agaroz jel elektroforezi ile tam sindirimi doğrulayın ve lineerize plazmid arındırılır.
4. Genom analiz yazılımı kullanarak recA geninin yukarı ve aşağı akışında yaklaşık 800 bp bölgeyi belirleyin ve ilgili primer çiftleri LBF/LBR ve RBF/RBR'yi tasarlayın (Bu çalışmada kullanılan tüm primerler için materyal tablosuna bakınız).
5. Her iki homolog kolu standart PCR döngüsü koşullarında güçlendirin ve PCR ürünlerini arındırın. 50 μL PCR genellikle 2,5 μg ürün verir.
   NOT: Primerlerin Tm değerleri ve GC içeriği, homolog bölgelerin sınırları değiştirilerek ayarlanabilir.
6. Rekombinant intihar plazmidi pKV2-recA'yı, saflaştırılmış homolog kolları lineerize plazmid omurgasına bağlayarak DNA montaj kiti kullanarak birleştirin.
7. Montaj karışımını ısı şokuyla kimyasal olarak yetkin E. coli S17-1 λpir hücrelerine dönüştürür, hücreleri LB ortamında geri kazanır ve kanamisin (LB + kan) içeren LB agar üzerine levha yapar.
   NOT: Kullanılan son konsantrasyonlar 50 mg/mL kanamisin, %0,2 (w/v) glikoz, %0,3 (w/v) arabinoz ve 0,3 mM 2,6-diaminopimelik asit (DAP)'dir.
8. Pozitif klonları kısıtlama sindirimi veya koloni PCR ile doğrulayın. (Bu çalışmada kullanılan tüm medium tarifleri için materyal tablosuna bakınız).
9. Doğrulanmış pKV2-recA plazmidi çıkarın ve onu ısı şoku dönüşümü ile E. coli WM3064'e dönüştürün (beklenen dönüşüm hızı 10⁶ cfu/μg >).
10. LB agar'da kanamisin ve diaminopimelik asit (DAP) içeren dönüştürücüleri seçebilirsiniz.
11. İki ebeveynsel konjugasyon yaparak donör suşunun (WM3064 pKV2-recA) ve alıcı P. brasiliense SM'nin gece kültürlerini 1:1 (v/v) oranında karıştırın; genellikle donör ve alıcı hücrelerin mililitresinde 10⁴ ila^{10 6} transkonjugant elde edilir.
12. Karışık kültürü steril suyla bir kez yıkayın, karışımı kanamisin ve DAP ile takviye edilmiş LB agar'a yerleştirin ve 28 °C'de 48–72 saat kuluçka yapın.
    NOT: Eğer transkonjugant gözlemlenmezse, donor-alıcı oranı konjugasyon verimliliğini artırmak için 2:1'e (v/v) çıkarılabilir. Yüksek arka plan büyümesi gözlemlenirse, kalıntı DAP karışık kültürü steril suyla iki kez yıkayarak çıkarılabilir.
13. Konjugasyon karışımını geri kazanın ve karşı seçim için kanamisin ve glikoz içeren LB agar üzerine (DAP olmadan) levha yapın.
14. 6–8 koloni seçin ve onları hem LB + kan hem de LB + kan + arabinoza kopyalayın.
15. LB + kan üzerinde büyüyen ancak LB + kan + arabinozda büyüyemeyen kolonileri seçin; Bunlar ilk çapraz adaylar.
16. İlk çapraz suşları LB ortamına doğrulanmış ve gece boyunca kuluçka geçir. Kültürler, L-arabinoz içeren LB agar üzerine kaplama ile ikinci homolog rekombinasyonu indükleyin.
17. Birkaç koloni seçin ve bunları LB + arabinose ve LB + kan üzerine replika plaka yapın. LB + arabinoz üzerinde büyüyen ancak LB + kan üzerinde büyümeyen kolonileri seçin; bunlar varsayılan recA silme mutantları.
    NOT: İkinci çapraz olaydan sonra koloni gözlemlenmezse, hedef genin bakteriyel büyüme için potansiyel önemliliği değerlendirilmelidir. Alternatif olarak, yukarı ve aşağı akış homolog bölgeler homolog rekombinasyon verimliliğini artırmak için 1.200 bp'ye kadar genişletilebilir.
18. Hedef genin çerçeve içi silinmesini doğrulamak için recA promotoru ve terminatör bölgeleri arasında amplifikasyon için tasarlanmış primer çift checkF/checkR ile koloni PCR ile recA mutantlarını doğrulayın. PCR ürününü kesin olarak kare içi recA'nın silinmesini doğrulamak için sıralayın.
19. Başarılı silinme, PCR ürün boyutunun azalmasıyla gösterilir; bu da vahşi tip parça uzunluğundan silinmiş gen segmentinin özgün uzunluğuna karşılık gelmelidir.

2. P. brasiliense'de Tn5 mutajenez için pKV2-LLtnp inşası

1. pMCS2-LLtnp^8'den Tnp transpozaza kasetini Tnp-F/Tnp-R primer çifti kullanarak güçlendirin ve pKV2'den oriγR6K Tn5 omurgasını ori-F/ori-R primer çifti kullanarak güçlendirin. Tüm PCR ürünlerini DNA arıtma kiti kullanarak arındırın.
2. Saflaştırılmış Tnp kaseti ve oriγR6K Tn5 omurgasını bir DNA montaj kiti kullanarak birleştirin. Montaj karışımını ısı şokuyla kimyasal olarak yetkin E. coli S17-1 λpir hücrelerine dönüştürür, LB ortamında geri kazanır ve kanamisin (LB + kan) ile takviye edilmiş LB agar üzerine plaka yapar.
3. Pozitif klonları koloni PCR ile ori-F/ori-R ve Tnp-F/Tnp-R primer çiftleriyle doğrulayın.
4. E. coli RHO3 yetkin hücrelerini tek bir koloniyi LB ortamına aşılayıp gece boyunca kuluçka geçirerek hazırlayın. Kültürü 1:100 oranında taze LB ortamına sulandırın ve OD₆₀₀ 0.6'ya kadar büyütün.
5. Kültürü buz üzerinde soğutun ve hücreleri önceden soğutmuş 0,1 M CaCl₂ ile üç kez yıkayın. Son peleti 500 μL önceden soğutmuş %20 gliserolde tekrar askıya alın ve −80 °C'de saklanın.
6. Doğrulanmış rekombinant plazmid (pKV2-LLtnp) 10 μL'sini ısı şoku ile (beklenen dönüşüm hızı 10 6 cfu/μg > 100 μL RHO3 yetkin hücrelere dönüştürür. 30 dakika buzda kuluçka yapın, 42 °C'de 45 saniye ısı şoku yapın, ardından 2 dakika buzda soğutun.
7. 500 μL LB ortam ekleyin ve 37 °C'de 1 saat boyunca karıştırarak kuluçka yapın. Kanamisin ve DAP içeren LB agar (LB + kan + DAP) üzerine levha koyun ve gece boyunca 37 °C'de kuluçka yapın.
8. Pozitif RHO3 dönüştürücülerini Tnp-F/Tnp-R kullanarak koloni PCR ile doğrulayın.

3. P. brasiliense'de Tn5 transpozon mutant kütüphanesinin inşası

1. P . brasiliense ΔrecA'yı LB ortamında 28 °C'de yetiştirin ve RHO3/pKV2-LLtnp'yi kanamisin ve DAP (LB + kan + DAP) ile desteklenen LB ortamında 37 °C'de yetiştirin. Her iki suşun da OD₆₀₀ 1'e ulaşmasına izin verin.
2. 100 μL P. brasiliense ΔrecA ile 100 μL RHO3/pKV2-LLtnp karıştırın, karışımı santrifüj edin, süpernatı atın ve yıkanmış peleti 10 μL LB ortamında yeniden süspansiyona ekleyin.
3. Yeniden askılanan karışımı DAP ile takviye edilmiş bir LB agar plakasına yerleştirin ve 28 °C'de 8 saat kuluçka yapın, böylece konjugasyon sağlansın.
4. Konjugasyon karışımını 1 mL steril LB ortamla durulayarak geri kazanın. Kısa bir santrifüj yapın, üst parçayı atın ve peleti LB ortamında iki kez yıkarak DAP'ı çıkarın.
5. Yıkanmış peleti 300 μL LB ortamında tekrar askıya alın ve 10x seri seyreltme ile kanamisin ve glikoz (LB + kan + glikoz; DAP olmadan) takviye edilmiş LB agar'a yerleştirerek transkonjugantlar için seçilir.
6. Plakaları 28 °C'de 48 saat kuluçka edin. Beş koloni seçin ve her birini koloni PCR'lerine göre ori-F/ori-R ve Tnp-F/Tnp-R primer çiftleriyle doğrulayarak Tn5 transpozonunun başarılı bir şekilde tanıtıldığını doğrulayın. Genomda Tn5 yerleşimini doğrulamak için beş koloninin tamamını sıralayın.
   NOT: Mutant kütüphanesinin resmi inşasından önce, konjugasyon plakasından rastgele altı tek koloni seçiliyordu. Yerleştirme bölgelerini belirlemek için plazmid kurtarma testleri yapıldı; iki farklı kısıtlama enzimi ayrı ayrı olarak paralel kontrol grubu olarak kullanıldı. Toplamda 36 dizileme okuması elde edildi. Tek bir Tn5 yerleştirme olayı ancak her koloni için altı yerleşim noktası aynen özken doğrulanmıştır.
7. Mutant kütüphane kapasitesini çekim adımını tekrarlayarak ve koloni numaralarını sayarak tahmin edin. Kütüphane büyüklüğünün 12.000 koloniyi aşmasını sağlayarak aşağı akış taraması için yeterli genomik kapsama sağlanmasını sağlamak.
   NOT: Düşük mutagenez sıklığı gözlemlenirse, transpozisyon verimliliğini artırmak için E54K/M56A/L372P mutantı gibi hiperaktif bir Tn5 transpozaz varyantının kullanılması düşünülmelidir.
8. 6. adımda elde edilen bireysel mutant kolonileri, her kuyu başına 200 μL LB + kan içeren 96 kuyu talı plakalara aktarın. Plakaları gece boyunca 28 °C'de inkubasyon ile 200 rpm'de sallayın.
9. Her kuyuya yaklaşık %20 nihai konsantrasyon elde etmek için 133 μL steril %50 gliserol eklenir. 96 kuyu plakalarını uzun vadeli koruma için −80 °C'de mühürleyin ve saklayın.

4. Patates yumru ve pot aşısı yoluyla yüksek verimli patojenlik testleri

1. Patates kök köklerini (cv. Favorita) steril suyla durulayarak, %75 etanolde kısa süreliğine batırarak ve temiz bir tezgahta hava ile kurutarak hazırlayın. Kökleri ~8 mm kalınlığında kesimlere ayırın ve dilimleri steril 90 mm Petri kaplarına yerleştirin. Biyolojik kopyalar için en az üç dilim hazırlayın.
2. Her mutant süzmeden 1 μL'sini, 96 kuyu mutant kütüphanesinin plaka düzenini takip ederek çok kanallı pipet kullanarak patates dilimlerine aşılayın. P . brasiliense ΔrecA'yı pozitif kontrol olarak, LB + kan ise negatif kontrol olarak dahil edin.
3. Aşılanmış patates dilimlerini 28 °C'de 7–8 saat kuluçka yapın. ΔrecA kontrolüne kıyasla gözle görülür şekilde azalmış macerasasyon veya daha küçük lezyon alanları gösteren mutantları kaydetmiştir. Lezyon alanını uzunluğu ve genişliğini ölçerek niceliklerini ölçebilirsiniz. Bunları birincil tarama adayları olarak belirleyin.
   NOT: Mutant kültürlerin ve kontrollerin OD₆₀₀ değerlerinin aşılamadan önce 0.8'e normalleştirildiğinden emin olun.
4. İkincil tarama için, her aday süzmeden 5 μL taze patates dilimlerine aşılayın (her dilim için 6 suş, eşit aralık). Her suş için üç biyolojik replikat hazırlayın. 28 °C'de 7–8 saat kuluçka yapın ve zayıflamayı doğrulamak için lezyon boyutlarını kaydedin.
5. Sürekli virülans azalması gösteren suşları LB + kan plakalarına çizerek izole edin. Plakaları gece boyunca 28 °C'de inkübe edin ve doğrulanmış azaltılmış virülanslı mutantları sonraki analiz için 4 °C'de depolayın.
6. Tüm bitki doğrulaması için, patates saplarını 150 μL bakteriyel süspansiyon ile 1 x 10⁸ CFU/mL olarak normalleştirerek aşılayın. Bazal sap bölgesine steril bir şırınga ile süspansiyon enjekte edin. 48 saat sonra hastalık gelişimini gözlemleyin. Üç bireysel bitki üzerinde biyolojik çoğaltmalar yapın.
7. Hastalık şiddetini kara bacak hastalığı derecelendirme ölçeği ("6 puanlık sıralı ölçek: 0, 1, 3, 5, 7, 9") kullanarak puanlayın ve Hastalık Endeksi'ni şu şekilde hesaplayın:
   1. Derece 0: Tüm bitkide hastalık belirtisi yok.
   2. 1. derece: Gövde lezyonları gövde çevresinin üçte birinden fazlasını kaplamaz ve/veya bireysel yapraklar solmuştur.
   3. 3. derece: Kök lezyonları gövde çevresinin yarısından fazlasını kaplar ve/veya yaprakların yarısından azında hafif solma gösterir ve/veya birkaç alt yaprakta lezyonlar bulunur.
   4. 5. Derece: Gövde lezyonları gövde çevresinin yarısından fazlasını kaplar ve/veya yaprakların yarısından fazlasında hafif solma gösterir.
   5. 7. Derece: Gövde lezyonları tüm sap çevresini sarar ve/veya yaprakların üçte ikisinden fazlası solmuştur.
   6. 9. Derece: Bitkinin tüm yaprakları solmuş veya ölü.
      
8. Kesin zayıflatılmış mutantların uzun vadeli depolama stoklarını, steril %50 gliserol ile kültürleri %25 nihai konsantrasyona karıştırarak ve -80 °C'de saklayarak hazırlayın.

5. Plazmid kurtarma yöntemiyle Tn5 yerleştirme noktalarının tanımlanması

1. İlgilendiğiniz Tn5 mutantını yetiştirin ve bakteriyel genomik DNA çıkarma kiti kullanarak genomik DNA çıkarın. Aşağı akış sindirimi için yeterli girdi sağlamak amacıyla DNA konsantrasyonunu nicelikle ölçemek.
2. 10×0 μL reaksiyon tamponu ve 5 μL enzim içeren 100 μL reaksiyonda 1–2 μg genomik DNA EcoRI ile sindirin ve karışımı 37 °C'de en az 3 saat kuluçka edin. Sindirimin tamamlandığını agarose jeli kullanarak doğrulayın.
3. Sindirilen DNA'yı 1/10 hacim 3 M sodyum asetat ve 3 hacim mutlak etanol ekleyerek çökeltin. İyice karıştırın ve -20 °C'de 1 saat kuluçka yapın.
4. 13.500 x g sıcaklıkta 5 dakika santrifüj yapın ve pelleti sıralı olarak %75 etanol ve mutlak etanol ile yıkayın. Pellet hava ile kurutulup 17 μL steril suya süzülür.
5. Sindirilen DNA parçalarını 2 μL 10× T4 DNA ligaz tamponu ve 1 μL T4 DNA ligaz ekleyerek kendi kendine ligasyonla sınır. Arka plan dönüşümünü kontrol etmek için negatif bir kontrol (ligazsız) ekleyin. Ligasyon reaksiyonunu 4 °C'de gece boyunca inkubasyon ile kısıtlama parçalarının daireselleştirilmesini teşvik etmektir.
6. Ligasyon karışımının 10 μL'sini, daha önce tarif edildiği gibi ısı şoku dönüşümü kullanarak kimyasal olarak yetkin E. coli S17-1 λpir'e dönüştürün. LB'deki hücreleri 1 saat boyunca geri alın ve kanamisin içeren LB agar'a (LB + kan) levha ile Tn5 kaseti taşıyan plazmidleri seçin.
7. Rastgele beş kanamisin dirençli koloni seçin ve standart bir plazmid miniprep kiti kullanarak plazmid DNA'sını çıkarın. Her plazmidden 500 ng'nin HindIII ile sindirilip 37 °C'de 5 saat kuluçka yapılarak plazmid yapısını doğrulamak. Agaroz jel elektroforezi ile sindirim kalıplarını analiz edin.
8. Plazmid bant boyutları beklenen parça desenleriyle eşleşiyorsa, Tn5 uçlarında bulunan 5' ME primer kullanılarak Sanger dizileme işlemi yapılsın.
9. BLAST veya genom analiz yazılımı kullanarak Tn5 5'-ME bölgesinin aşağısındaki 50-100 bp'lik yan dizisini P . brasiliense SM genomuna hizalayarak kesin Tn5 yerleştirme noktasını belirleyin.
10. Her mutant için beş bağımsız dizileme reaksiyonunun hepsinin aynı genomik koordinata (%98 dizilik kimliği >) eşlediğini doğrulayın.
11. Beş dizileme reaksiyonundan herhangi biri farklı bir genomik koordinata eşleşiyorsa, bu mutantta birden fazla Tn5 yerleştirme noktasının bulunduğunu gösterir. Bu durumlarda, tüm yerleşim pozisyonlarını belirlemek için ek kolonileri analiz edin. Alternatif olarak, daha kesin yerleştirme bölgesi haritalaması elde etmek için Southern blotting veya tam genom dizileme işlemi yapılabilir.
12. Tüm dizileme reaksiyonlarında tek ve tutarlı bir yerleştirme noktasına sahip mutantları, sonraki fenotipik veya genetik analizler için uygun gerçek Tn5 tek girişli mutantlar olarak tanımlayın.

Sonuçlar

P. brasiliense'deki sucB mutasyonunun neden olduğu istikrarsızlığı aşmak için, plazmid pLP12'den alınan vmi480 toksini karşı seçim belirtisi olarak kullanıldı ve antibiyotik direnç kaseti değiştirilerek ve klonlama alanı konfigürasyonu ayarlanarak modifiye edilmiş intihar vektörü pKV2 (Şekil 1A) oluşturuldu. Belirtissiz bir recA silinme mutantı oluşturmak için, recA geninin sol ve sağ homolog kolu ~800 bp pKV2'ye klonlandı ve ardından çift çapraz rekombina...

Tartışma

Bu çalışmada geliştirilen genetik manipülasyon stratejisi, patatesin birincil yumuşak çürüme patojeni olan P. brasiliense'de fonksiyonel genomik^{için bir seçenek sunar 9,10}. Toksin tabanlı bir karşı seçim sistemi intihar plazmid omurgasına entegre edilerek, işaretsiz bir ΔrecA mutantı üretildi. Bu yaklaşım, geleneksel sacB tabanlı sistemlere göre önemli avantajlar sunar; sacB genellikle P. b...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Bacterial genomic DNA extraction kit	Bakterilerin genomik DNA'sını çıkarın	Tiangen	DP302-02
Diaminopimelik asit	1 L ortamda 0,3 mM	Macklin	D836611-5g
DNA assembly kit	DNA birleştirme	Vazyme	C116-02
DNA purification kit	DNA saflaştırma	Tiangen	DP214-02
Kanamycin	50 mg/mL	Aladdin	K103025-25g
Glucose	%0,2 (w/v)	Aladdin	G116305-250mg
Tryptone	1 L ortamda %10	OXOID	LP0042B
Yeast Extract	1 L ortamda %5	OXOID	LP0021B
NaCl	1 L ortamda %10	Biofroxx	1249KG001
Agar	1 L ortamda %15	Biofroxx	8211GR500
L-arabinose	%0,3 (w/v)	Aladdin	A106196-25g
Plasmid Miniprep kit	Plasmid çıkarma	Tiangen	DP103-02
EcoRI	Restriksiyon endonükleaz	Yugong Biotech	EG15536
NheI	Restriksiyon endonükleaz	Yugong Biotech	EG15552
HindIII	Restriksiyon endonükleaz	Yugong Biotech	EG15539
T4 DNA ligase	Lineer DNA kendiliğinden daireselleşmesi	Yugong Biotech	EG15205
Centrifuge	RWD	M1324R
PCR Thermal Cycler	BIO-GENER	GET3XG
Digital camera	SONY	ILCE-7M4
Electrophoresis system	LY	DYY-6C
Water bath	JOANLAB	WB100-1F
Gel documentation system	Thermo Fisher Scientific	iBright CL750
Autoclave	Yamato	SQ510C
Shaking incubator	ZHICHU	ZQZY-AR8
Constant temperature incubator	ZQ	DHP-9272
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	Lite Plus
UV-Vis spektrofotometre	HITACHI	U-3900
Elektroporator	BIO-RAD	MicroPulser
Suşlar ve plazmitler
P. brasiliense SM	Patates patojen bakteri	Laboratuvar suş koleksiyonu
E. coli S17-1 λpir	E. coli yetkin hücreler	WEIDI	DL2010S
E. coli WM3064	E. coli yetkin hücreler	BIO SCI BIO	C1039
E. coli RHO3	E. coli yetkin hücreler	Laboratuvar suş koleksiyonu
pKV2	Modifiye edilmiş intihar plazmidi	Bu çalışmada oluşturulmuştur
pLP12	intihar plazmidi	Laboratuvar suş koleksiyonu
pMCS2-LLtnp	Tn5 taşıyan fragmanı sağlayın	Laboratuvar suş koleksiyonu
pKV2-LLtnp	Tn5 fragmanını taşıyan modifiye plazmid.	Bu çalışmada oluşturulmuştur
Pimers
LBF (ctgaaagcttctgcaggagctcgctgacccaacaatccttgattaagatgaggc)		Özelleştirilmiş
LBR (gttcagccaccattctgctcctgtcatgcggcgt)		Özelleştirilmiş
RBF (caggagcagaatggtggctgaacgggttgtgac)		Özelleştirilmiş
RBR (gatcctgcagcggagcggccgcgcagatcgcgggcaaggttagtc)		Özelleştirilmiş
checkF (ctatgcgcttcgcataccgtgc)		Özelleştirilmiş
checkR (gctcttgctcataattgtcctgg)		Özelleştirilmiş
TnpF (ggaatctagaccttgagtcgatatcactctcgtttaatgctg)		Özelleştirilmiş
TnpR (acaaacaaaaccaaattctgtacggcgaag)		Özelleştirilmiş
ori-F (taatcgccttgcagcacatc)		Özelleştirilmiş
ori-R (ggtatgagtcagcaacacct)		Özelleştirilmiş
5’ME (attcattaatgcagctggcacg)		Özelleştirilmiş