Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Döngüsel Hücre Stres Gerilim Sistemi kullanarak İskelet Kök Hücrelerine Çekme Kuvveti Uygulamak İçin Vitro Bir Sistem

47 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70570

⸱

12 Haziran 2026

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Emergency and Trauma of Ministry of Education, Hainan Academy of Medical Sciences, Hainan Medical University

Bu makalede

Özet

Fare periostal iskelet kök hücreleri (SSC) FACS ile izole edilip in vitro kültüre alındı. SSC'lere döngüsel çekme mekanik uyarısı uygulayan kontrol edilebilir deneysel bir sistem kurulmuştur; bu da hücresel yaşlanma ile ilişkili genlerin, özellikle p16 ve p21'in ekspresyonunun azalmasına yol açmıştır.

Özet

Kemik, vücuttaki fiziksel ipuçlarına sürekli yanıt veren önemli bir mekanik duyarlı organdır. Mekanik uyarım, iskelet gelişimi, homeostaz ve yaralanma onarımında önemli roller oynasa da, iskelet kök hücrelerinin (SSC) mekanik strese spesifik yanıtları henüz tam olarak anlaşılmamaktadır. Bu soruyu ele almak için, fare periosteal SSC'lerini izole etmek ve mekanik uyarım uygulamak için in vitro bir model oluşturduk. Fare periost hücreleri ilk olarak enzimatik sindirimle elde edildi ve SSC'ler daha sonra belirlenmiş yüzey belirteçlerine dayalı floresans-aktive hücre sıralaması (FACS) ile izole edildi. Kültüre bağlandıktan sonra, SSC'ler döngüsel hücre stres-gerilim sistemi kullanılarak çekme mekanik uyarıma tabi tutuldu. Bu sistem, kültürlenen hücrelere çekme kuvvetinin tekrarlanabilir uygulanmasını sağlar ve mekanik girdiye SSC yanıtlarının analizi için bir platform sağlar. Bu yaklaşımı kullanarak, mekanik uyarıma sonrası SSC'lerde hücresel yaşlanma ile ilişkili genler p16 ve p21'in ifadesinin belirgin şekilde azaldığını tespit ettik. Bu bulgular, çekme uyarımının in vitro koşullarda SSC'lerde yaşlanmaya bağlı değişiklikleri etkileyebileceğini göstermektedir. Genel olarak, bu protokol mekanik uyarım altında SSC davranışını incelemek ve mekanik ipuçlarının SSC fonksiyonunu nasıl etkilediğini araştırmak için faydalı ve uygun bir platform sağlar.

Giriş

İnsan vücudundaki en büyük ve en önemli destekleyici organ olan iskelet sistemi, sadece bağlanma noktaları ve diğer organlar için koruma sağlamakla kalmaz, aynı zamanda motor fonksiyonun temelini de oluşturur. Bu nedenle, iskelet sistemi hem iç hem dış ortamlardan gelen çeşitli mekanik uyaranlara sürekli maruz kalır. Mekanik uyarılma sinyalleri kemik gelişimi ve işlevsel bakım için eşit derecede önemlidir. 1893 yılında, kemik yoğunluğu ile kemiklerin taşıdığı mekanik kuvvet arasında belirli bir pozitif korelasyon olduğu öne sürülmüştür; bu Wolffyasası 1'dir. Son yıllarda bazı çalışmalar, kemik 2,3,4,5 normal gelişimi için iskelet sisteminin mekanik kuvvetler taşımasının önemini göstermiştir. İskelet sisteminin mekanik kuvvete verdiği yanıt kısmen kemikteki hücresel bileşenlerebağlıdır 6. Osteositler, iskelet sistemindeki hücresel bileşenlerin %85 ila %90'ını oluşturur. Geniş dağılımları ve benzersiz dendritik hücre morfolojileri nedeniyle, osteositler mekanik yanıt açısından şu anda en kapsamlı incelenmiş iskelet hücretipidir 7,8. Osteositlerin mekanik kuvvete yanıt verme yeteneğinin yanı sıra, iskelet öncü hücreleri de bunda vazgeçilmez bir rol oynar. Periost öncül hücrelerin mekanik sinyallere verdiği yanıtın kader dönüşümlerini düzenlediği ve böylece doku hasarınınonarımını etkilediği bulundu.

İskelet kök hücreleri (SSC'ler), kemik büyümesi, bakımı ve onarımı için gerekli olan olgun kemik hücre tiplerine ayrılabilen, kendini yenileme yeteneğine sahip dokuya özgü kök hücreler türüdür. 2015 yılında, fare SSC'leri için yüzey işaretleyicigenleri 10 tespit edildi. Daha sonra, birçok çalışma SSC'lerin kemik gelişimi, homeostaz bakımı ve kemik yaralanması onarımı gibi çeşitli alanlarda çok önemli bir rol oynadığınıda göstermiştir 11,12. İskelet sisteminin mekanik kuvvetlere yanıt verme özelliği nedeniyle, mekanik kuvvet sinyallerini iskelet kök hücrelerinin işlevini düzenlemede vazgeçilmez bir faktör olarak kabul edebiliriz. SSC'lerin mekanik uyarım altındaki davranışsal değişikliklerini incelemek için, in vitro mekanik kuvvet uygulamak için uygun bir deneysel sistem kurmamız gerekir.

Hücreler için in vitro mekanik uyarının başlıca yöntemleri arasında sıvı kesme gerilimi, sıkıştırıcı gerilim, çekme kuvveti, hidrostatik basınç, matris sertliği ve matristopolojisi 6,13 bulunur. Fare SSC'lerinin yüzey işaretleyici genlerine dayanarak, fare periosteal SSC'leri akış sitometrisi ile elde edildi; çünkü kırığın onarımında yer alan SSC'ler esas olarak periost14'ten kaynaklanmaktadır. Daha sonra, periost SSC'lerine uygun bir çekme kuvveti uygulandı; bu gerginlik hücre gerilim sistemi ile uygulandı. Çekme kuvveti uyarısından sonra hücre örnekleri alınabilir ve transkriptom dizileme, proteom dizileme ve ATAC-seq dahil olmak üzere çoklu omik analizler yapılabilir. Bu nedenle, bu protokolün oluşturulması, mekanik uyarıma SSC yanıtlarını incelemek için sağlam bir temel sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokoldeki fare deneylerinin tamamı, Çin Bilimler Akademisi'nin Şanghay Biyokimya ve Hücre Biyolojisi Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (SIBCB-S350-2312-41) tarafından onaylandı.

1. Farelerde periostal hücrelerin izolasyonu

  1. 4-6 haftalık fareleri CO₂ ötenazi kutusuna yerleştirin ve nefes kesilene kadar 3 dakika boyunca sürekli CO₂ tabi bırakın.
  2. Farelerin vücut yüzeyini %75 alkolle dezenfekte edin. Arka uzuvları ayırmak için oftalmik makas kullanın. Daha sonra sivri forseps ve oftalmik makasla arka uzuvlardan iskelet kaslarını çıkararak femur ve tibia eklem bölgelerinin sağlam kalmasını sağlar.
  3. İzole kemikleri soğutulmuş PBS'de koruyun ve ardından kemiklerin her iki ucunu düşük eriyen agarozla (%5-10 TAE tamponu içinde) kaplayın.
  4. Femur ve tibias'ı, 1 mg/mL kollagenaz, 2 mg/mL dispaz II ve 0.1 mg/mL DNaz I içeren minimum temel ortam alfa (α-MEM) ile 37°C ve 0.3 × g içeren 37°C ile 0.3 g ile iki kez sindirin. Sindirilen hücreleri kültür ortamına (α-MEM + %10 fetal sığır serumu (FBS)) toplayın.
  5. Hücre süspansiyonunu 40 μm hücre süzgeciyle filtreleyin ve ardından 500 × g boyunca 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve üst yüzeyi çıkarın.
  6. Hücre çökelmesini kırmızı kan hücresi lizisi tamponu ile 2 dakika boyunca yeniden askıya alın ve reaksiyonu akış sitometri tamponu (PBS + %2 FBS) ile sonlandırın.
  7. Hücreleri 500 × g ile 5 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı atın. Hücreleri akış sitometrisi tamponu ile 1 × 107 hücre/mL ile yeniden askıya alın, böylece hücre sıralaması yapılır.

2. Floresansla aktive hücre sıralaması

  1. Hücre süspansiyonunu aşağıdaki antikorlarla boyandırın: PerCP/Cy5.5 ile konjuge edilmiş anti-fare CD45, PerCP/Cy5.5 ile konjuge anti-fare CD31, PerCP/Cy5.5 ile konjuge anti-fare Ter119, FITC ile konjuge edilmiş anti-mouse 6C3/Ly-51, Brilliant Violet 605 ile konjuge anti-mouse CD90.2, PE/Cy7 ile konjuge anti-mouse CD105, APC ile konjuge anti-mouse CD200.
  2. Yukarıdaki antikorları 1:500 oranında seyreldin ve ışıktan korunarak 30 dakika boyunca buzda kuluçka yapın.
  3. Hücreleri akış sitometrisi tamponu ile yıkayın ve floresansla aktive hücre ayırıcı ile hücre ayırtımı yapın, böylece CD45- CD31- Ter119- CD90.2- 6C3- CD105- CD200+ SSC'ler elde edin. Kültür ortamı ile sıralanmış SSC'leri toplayın. Alınan verileri FlowJo v10.8.1 yazılımıyla analiz edin.
  4. Kültür tabaklarındaki sıralanmış SSC'leri, %5CO2 hücre kuluçka makinesinde genleşme ortamıyla genişletin. Mekanik uyarımdan önce bir pasaj yapılabilir.
    NOT: Her çift 6 haftalık fareden yaklaşık 1×10,5 periosteal SSC alınabilir.

3. SSC'lerin mekanik uyarılması

  1. Fare kuyruğu tip I kolajenini sterilize edilmiş 0,02 M asetik asitte son konsantrasyona 0,15 mg/mL olarak seyreldin. Bu çözelti 3 kez tekrar kullanılabilir ve 4 °C'de tutulmalıdır.
  2. 6 kuyruklu esnek tabanlı kültür plakasının her kuyusuna 1,5 mL seyreltilmiş Rat kuyruğu tip I kolajeni ekleyin. Plakaları oda sıcaklığında 1 saat kapladıktan sonra, fazla kollajen aspirasyonu ve plakaları daha sonra kullanmak üzere PBS ile bir kez yıkayın.
  3. NOT: Hemen kullanım için, plaka kalan asid gidermek için PBS ile durulanmalıdır. 4 °C'de saklamadan önce, plaka tamamen kurutulmuş kapağı çıkarılmış şekilde yapılmalıdır.
  4. Kültürlenmiş fare periost SSC'lerini sindirin, 500 × g seviyesinde 5 dakika boyunca santrifüj yapın, hücre çökelmesini kültür ortamında yeniden süspansiyona getirerek 1 ×10 5 hücre/mL hücre yoğunluğu elde edin, 6 kuyruklu esnek tabanlı kültür plakasının her kuyusuna 2 mL hücre süspansiyonu ekleyin ve hücre kuluçka makinesine yerleştirin.
  5. Hücreler tohumlandıktan 24 saat sonra, esnek tabanlı kültür plakasını gerilmiş taban plakasına yerleştirin ve mekanik kuvvet uyarısı olmadan kontrol grubu olarak başka bir hücre esnek tabanlı kültür plakası tutulur.
  6. FX-6000 Sürüm 1.0 yazılımında parametreleri şu şekilde ayarlayın: Esneme gücü %8, frekans 0,1 Hz, dalga formu kare dalga olarak, dalga formu görev döngüsü %80 ve 12 saat esneme süresi.
    NOT: Gerilmiş taban plakasında, 6 kuyruklu esnek tabanlı bir kültür plakası yerleştirmek için dört pozisyon vardır. Deney için gereken hücreler 4'ten azsa, boş pozisyonlar yeni 6 kuyruklu esnek tabanlı kültür plakalarıyla doldurulmalıdır. Uygun mekanik uyarı uygulandıktan sonra, SSC'ler hücre farklılaşması veya proliferasyonu gibi fonksiyonel testlerden geçebilir veya çok omik dizileme için örnekler çıkarılabilir.

4. Gerçek zamanlı nicel PCR (RT-qPCR)

  1. Hücrelerin mekanik uyarısı tamamlandıktan sonra, kültür ortamı atılır, hücreleri bir kez PBS ile yıkanır, TRIzol Reaktif ile toplam RNA çıkarılır ve RNA ters transkripsiyonu yapılır.
    NOT: RNA çıkarımı tamamlandıktan sonra, -80 °C'de depolanabilir. Ters transkripsiyondan elde edilen cDNA, sonraki testler için -20 °C'de de depolanabilir.
  2. RT-qPCR'i gerçek zamanlı PCR sistemiyle gerçekleştirin. Kullanılan primer setleri şunlardır:
    Hprt: ileri 5'-GTTAAGCAGTACAGCCCCAAA-3',
    Hprt: ters 5'-AGGGCATATCCAACAACAACAAACTT-3',
    s16: ileri 5'-GGTCACACGACTGGGGGATT-3',
    s16: ters 5'-GCACCGTAGTTGAGCAGAAGAG-3',
    p21: ileri 5'-GCCTGGTTCCTTGCCACTTCTT-3',
    p21: geri 5'-ATTACGGTTGAGTCCTAACTGCCATC-3'.

5. Mekanik stresin kısa süreli tedavisinin etkileri

  1. FX-6000 Sürüm 1.0 yazılımında parametreleri şu şekilde ayarlayın: Esneme şiddeti %8, frekans 0,1 Hz, dalga formu kare dalga olarak, dalga formu görev döngüsü %80. Hücreler, mekanik gerilim uyarısından 10 dakika ve 60 dakika sonra RIPA lizin tamponu I (fosfataz inhibitörü kokteyli ve proteaz inhibitörü kokteyli ile) ile lizize edilir.
  2. Western blot'u Erk ve p-Erk antikoru ile yapın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokolün uygulanmasından sonra, farelerin periostal SSC'lerine başarıyla çekme kuvveti uygulanmıştır. İlk olarak, SSC'ler fare periostumundan akış sitometrisi ile alınmıştır. Akış sitometrisi sonuçları, periostumdaki SSC oranının Lin- (CD45-, CD31-, Ter119-) CD90.2- 6C3- (Şekil 1) oranının neredeyse %30'unu oluşturduğunu gösterdi ki, bu da kemik iliğindeki orandan çok daha yüksekti. Periost SSC'lerin kemik geli...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Son yıllarda, kemiklerin farklı bölgelerinden iskelet kök hücre belirteç genleri sürekli olarak keşfedilmiştir 11,12,17. Ancak, özellikle mekanik kuvvet uyarısı düzenlemesi açısından SSC'nin doğrudan düzenlenmesi üzerine yapılan araştırmalar hâlâ derinleşmeye ihtiyaç duymaktadır. Şu ana kadar iskelet kök hücrelerinin/öncü hücrelerin mekanik düzenleyici etkileri üzerine yapılan araştırmalar esas ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.

Teşekkürler

Çin Bilimler Akademisi'nin Şanghay Biyokimya ve Hücre Biyolojisi Enstitüsü'nün akış sitometrisi için çekirdek tesisine ve hayvan çekirdeği tesisine teşekkür ederiz. Çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32471190, 82502903) ve Hainan Eyaleti Yabancı Uzmanlar Programı (506068033010) tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
α-MEMCorning10-022-CVperiosteal hücreler İzolasyonu
APC anti-mouse CD200BioLegend123809SSCs sıralama
BioFlex 6-Well Kültür Plakası FlexcellBF-3001AHücre kültürü
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD90.2BioLegend140317SSCs sıralama
KollagenazSigmaC0130periosteal hücreler İzolasyonu
Dispase IISigmaD4693periosteal hücreler İzolasyonu
DNase ISigmaDN25periosteal hücreler İzolasyonu
Fetal Bovin SerumGibcoA5356701SSCs sıralama
FITC anti-mouse 6C3/Ly-51BioLegend108305SSCs sıralama
 Flexcell Gerilme Sistemi FlexcellFlexercell FX-6000 Hücre gerilimi
Flow Sitem ve Çeşit AyırıcıBDBD FACSAria FusionSSCs sıralama
MesenCult Genişleme Kiti (Fare)Kök hücre05513Hücre kültürü
PE/Cy7 anti-mouse CD105BioLegend120409SSCs sıralama
PerCP/Cy5.5 anti-CD31BioLegend102522SSCs sıralama
PerCP/Cy5.5 anti-CD45BioLegend103132SSCs sıralama
PerCP/Cy5.5 anti-mouse TER-119BioLegend116228SSCs sıralama
 PrimeScript RT Reaktifi KitiTaKaRaRR037ART-qPCR
Rat kuyruğu tip I kollajenCorning354236Hücre kültürü
gerçek zamanlı PCR sistemiThermo Fisher ScientificQuantStudio 1 PlusRT-qPCR
 kırmızı kan hücresi lizis tamponu Beyotime C3702periosteal hücreler İzolasyonu
TRIzolSigmaT9424RT-qPCR
Fosfataz İnhibitör Kokteyli IIMCEHY-K0022WesterBlot
 RIPA Lizis Tamponu ISangon BiotechNO. C500005WesterBlot
Proteaz İnhibitör Kokteyli MCEHY-K0010WesterBlot
p44/42 MAPK (Erk1/2) Antikoru Cell Signaling Technology9102WesterBlot
Fosfo-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) Tavşan Monoklonal AntikoruCell Signaling Technology4370WesterBlot

Kaynaklar

  1. Wolff, J. Das Gesetz der Transformation der Knochen. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 19, 1222-1224 (1893).
  2. Li, X., et al. Stimulation of Piezo1 by mechanical signals promotes bone anabolism. eLife. 8, 49631(2019).
  3. Sun, W., et al. The mechanosensitive Piezo1 channel is required for bone formation. eLife. 8, 47454(2019).
  4. Wang, L., et al. Mechanical sensing protein PIEZO1 regulates bone homeostasis via osteoblast-osteoclast crosstalk. Nat Commun. 11, 282(2020).
  5. Zhou, T., et al. Piezo1/2 mediate mechanotransduction essential for bone formation through concerted activation of NFAT-YAP1-ß-catenin. eLife. 9, 52779(2020).
  6. Wang, L., et al. Mechanical regulation of bone remodeling. Bone Res. 10, 16(2022).
  7. Qin, L., Liu, W., Cao, H., Xiao, G. Molecular mechanosensors in osteocytes. Bone Res. 8, 23(2020).
  8. Uda, Y., et al. Osteocyte Mechanobiology. Curr Osteoporos Rep. 15, 318-325 (2017).
  9. Wang, L., et al. Piezo1 balances the osteogenic-tenogenic plasticity of periosteal progenitor cells through the YAP pathway. Cell Rep. 44, 115630(2025).
  10. Chan, C. K., et al. Identification and specification of the mouse skeletal stem cell. Cell. 160, 285-298 (2015).
  11. Feng, H., et al. Skeletal stem cells: origins, definitions, and functions in bone development and disease. Life Med. 1, 276-293 (2022).
  12. Yuan, G., et al. Skeletal stem cells in bone development, homeostasis, and disease. Protein Cell. 15, 559-574 (2024).
  13. Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. J Cell Mol Med. 17, 823-832 (2013).
  14. Jeffery, E. C., et al. Bone marrow and periosteal skeletal stem/progenitor cells make distinct contributions to bone maintenance and repair. Cell Stem Cell. 29, 1547-1561 (2022).
  15. Liu, Y. L., et al. Fibrous periosteum repairs bone fractures and maintains the healed bone throughout mouse adulthood. Dev Cell. 59, 1192-1209 (2024).
  16. Hu, H., et al. ZKSCAN3 counteracts cellular senescence by stabilizing heterochromatin. Nucleic Acids Res. 48, 6001-6018 (2020).
  17. Li, Q., Xu, R., Lei, K., Yuan, Q. Insights into skeletal stem cells. Bone Res. 10, 61(2022).
  18. Shen, B., et al. A mechanosensitive peri-arteriolar niche for osteogenesis and lymphopoiesis. Nature. 591, 438-444 (2021).
  19. Yu, H. S., et al. Impact of mechanical stretch on the cell behaviors of bone and surrounding tissues. J Tissue Eng. 7, 2041731415618342(2016).
  20. Chang, X., Xu, S., Zhang, H. Regulation of bone health through physical exercise: Mechanisms and types. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1029475(2022).
  21. Ma, Q., et al. Significance of mechanical loading in bone fracture healing, bone regeneration, and vascularization. J Tissue Eng. 14, 20417314231172573(2023).
  22. Sakurai, M., Ishitsuka, K., Becker, H. J., Yamazaki, S. Ex vivo expansion of human hematopoietic stem cells and clinical applications. Cancer Sci. 115, 698-705 (2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Mekanik Stim lasyonIn Vitro ModelPeriosteal H crelerH cre Ay klamaFloresan Aktive Ay klamaH cresel SenesansY zey Belirte leri
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.