Yöntem makalesi

Tavşanlarda Korneal yara onarımı için zenginleştirilmiş foto-çapraz bağlı jelatin–riboflavin hidrojellerin üretimi ve cerrahi uygulaması

DOI:

10.3791/70579

⸱

24 Nisan 2026

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Histology, School of Medicine and Nursing, University of the Basque Country UPV/EHU, 2BEGIKER Ophthalmology Research Group, IIS Biobizkaia, 3Department of Ophthalmology, University Hospital of Cruces

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tavşanlarda kornea stromal yara onarımı için yerinde mavi ışık-çapraz bağlanabilir jelatin–riboflavin hidrojelinin hazırlanması, zenginleştirilmesi ve uygulanması için tekrarlanabilir bir protokol sunulur; bu süreç cerrahi müdahale, kısmi tarsorrafi ve ameliyat sonrası bakım için prosedürel adımlar içerir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, tavşanlarda kornea stromal yara onarımı için yerinde mavi ışık-çapraz bağlanabilir jelatin hidrojel üretmek, takviye etmek ve cerrahi olarak uygulamak için adım adım bir protokol sunmaktadır. Hidrojel öncüsü, steril ve ışık korumalı koşullarda hazırlanmış, steril filtrelenmiş ve kullanımdan önce ısıtılmış olarak kullanılan bir hidrojel öncüsü olarak %5 (w/v) jelatin ve %0,01 (w/v) riboflavin fosfattan oluşur; bu koşullar steril ve ışık korumalı koşullarda hazırlanır, böylece enjeksiyon yapılabilir viskozite elde edilir. İnsan amniyotik membran ekstraktı veya tavşan otolog serumunun isteğe bağlı olarak dahil edilmesi detaylıdır. İstek üzerine jelleşme, göz yüzeyinde λ = 420–480 nm arasında mavi ışık kullanılarak toplam 2 dakika boyunca tetiklenir. In vivo yöntem, tekrarlanabilir ön stromal keratektomi (trefin çapı 6,5 mm; derinlik yaklaşık 187 μm), ardından hidrojel dolgu, ışık aktivasyonu ve kısmi lateral tarsorrafi ile tedaviyi stabilize etmek, yara iyileşmesini desteklemek ve ameliyat sonrası bakımı standartlaştırmak için uygulanır. Temsil eden in vitro sonuçlar, jel benzeri viskoelastik davranış ile kesme incelmesi ve hızlı iyileşme ile yüksek optik geçirimlilik (%90 > 500 nm'nin üzerinde kornea kullanımı için uygunluk göstermektedir. In vivo hidrojel bazlı tedaviler, progresif epitel kapanışı, iyi göz toleransı (3 ve 7 günde düşük Draize puanları) ve biyodegradasyon ile doku değişimiyle uyumlu zaman bağımlısı görünür hidrojel kaybını destekler. Tekrarlanabilirliği sağlamak için kritik adımlar ve duraklama noktaları vurgulanır; çözünürme ve filtreleme sırasında sıcaklık kontrolü, ışıktan koruma ve çapraz bağlama sırasında lamba konumlandırması dahildir. Protokol, dikişsiz, hassas yerleştirilmiş, ışıkla aktive edilen hidrojel stabilizasyonu sağlar ve çoklu biyoaktif takviyelerin eklenmesiyle uyumludur. Bir sonraki nesil oftalmik biyomalzemelerin preklinik değerlendirmesi için pratik bir platform sağlar ve kornea yara onarımı için foto-çapraz bağlanabilir hidrojel tedavilerinin çevrilmesini kolaylaştırır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kornea, gözün kırılma gücünün yaklaşık üçte ikisini oluşturan şeffaf, avasküler bir yapıdır ve yapısal ve işlevsel bütünlüğünü görme1 için hayati öneme sahiptir. Dış çevreye doğrudan maruz kalması nedeniyle kornea, travma, enfeksiyon, kimyasal hasar ve ameliyat sonrası komplikasyonlara karşı son derece hassastır 2,3. Epitel bütünlüğünün hızlı ve etkili şekilde geri getirilememesi, kalıcı epitel kusurlarına (PED) ve kronik kornea ülserlerine yol açabilir; sonuçta stromal erime, perforasyon, yara izi oluşu ve geri döndürülemez görmekaybına yol açabilir 4,5. Geleneksel tedaviler—kayganlaştırıcılar, antibiyotik profilaktisi ve otolog serum göz damlaları dahil—genellikle sadece kısmi fayda sağlar ve orta ile şiddetli kusurlarda stromal onarımı yeterince teşviketmez 6,7,8.

Bu sınırlamaları gidermek için, yarayı koruma, epitel onarımını destekleme ve stromaldoku 9,10,11,12,13,14 onarma yetenekleri nedeniyle biyomateryal bazlı tedaviler umut vadeden alternatifler olarak ortaya çıkmıştır. Hidrojeller, biyouyumlulukları, optik şeffaflıkları, ayarlanabilir mekanik davranışları ve terapötik ajanları sürebilme yetenekleri nedeniyle özellikle caziptir. Jelatin 15,16,17, kolajen 18,19,kitozan 20,21, polietilen glikol (PEG)22,23 ve hyaluronik asit18,24 dahil olmak üzere hem doğal hem de sentetik hidrojeller, kornea yarasının iyileşmesini teşvik etme potansiyeli göstermiştir. Bunlar arasında, jelatin bazlı hidrojeller, kollajen kaynaklı bileşimleri ve içsel hücre yapışması motifleri nedeniyle özellikle değerlidir.

Foto-çapraz bağlanabilir hidrojeller, doğrudan göz yüzeyinde talep üzerine katılaşma imkanı sağlayarak hassas yerleştirme ve dikişler olmadan daha iyi mekanik stabiliteler sağlar. Keratokonus tedavisi için geliştirilen riboflavin aracılı çapraz bağlama, mükemmel biyouyumluluk, oftalmik güvenliği ve görünür veya UV ışığı altında çapraz bağlanmayı tetikleyen reaktif oksijen türleri üretme yeteneği sayesinde hidrojel fotopolimerizasyonu içinuyarlanmıştır 25,26. Mavi ışık (≈445 nm) özellikle kornea uygulamaları için avantajlıdır; verimli çapraz bağlama sağlarken UV ile ilişkili riskleriönler. 27,28,29.

Bu makale, %5 (w/v) jelatin ve %0,01 (w/v) riboflavin fosfattan (RFP) oluşan foto-çapraz bağlanabilir hidrojelin üretimi, zenginleştirmesi ve cerrahi uygulamasını sunmaktadır. In vitro hidrojel hazırlama için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır; bu protokol insan amniyotik membran ekstraktı (HAMe) veya otolog serumun (AS) isteğe bağlı olarak dahil edilmesi ile tavşan stromal keratektomi modelinde in vivo uygulamayı içerir. HAMe, göz yüzeyinde anti-inflamatuar, anti-fibrotik ve pro-rejeneratif etkileruyguladığı bilinir (30,31,32,33,34,35), otolog serum ise epitel rejenerasyonu için gerekli olan A, EGF, fibronektin ve diğer büyüme faktörlerinin gözyaşı benzeri konsantrasyonları sağlar 36,37,38. Bu elementler birlikte yeniden epitelizasyonu destekler, iltihabı azaltır ve stromal bozulmayı potansiyel olarakönler.

Tanımlanan yaklaşım kontrollü fotopolimerizasyon ve özelleştirilebilir biyoaktivite sağlasa da, uygulama kapasitesi şu anda yüzeysel ve orta stromal kusurlarla sınırlıdır ve mavi ışığa doğrudan maruz kalma gerektirir; bu da opak veya derin infiltrasyon dokularda kullanımı kısıtlayabilir. Hidrojel hazırlama ve zenginleştirme, oftalmik müdahale ve ameliyat sonrası bakım, kısmi lateral tarsorrafi dahil olmak üzere, bu makale kornea onarımını destekleyen tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar; ışıkla aktifleşen hidrojel teknolojilerinin klinik uygulamaya aktarılmasını kolaylaştırır ve kornea rejeneratif araştırmaları için standartlaştırılmış platformların geliştirilmesine katkıda bulunur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan plasentaları, bağışçılardan bilgilendirilmiş onayla, Helsinki Bildirgesi'ne ve Cruces Üniversitesi Hastanesi Etik Komitesi'nin onayıyla alındı (onay numarası CEIC E15/03). Tüm hayvan deneyleri, Bask Bölgesi Üniversitesi Hayvan Araştırmaları Etik Komitesi (UPV/EHU) tarafından onaylandı (onay numarası CEEA M20/2023/038) ve ARVO Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvan Kullanımı Bildirimi'ne uygun şekilde gerçekleşti. Tüm prosedürler UPV/EHU hayvan tesisinde (SGIker) gerçekleştirildi ve biyolojik ürünlerle ilgilenirken steril teknik kullanıldı (Sınıf II biyogüvenlik kabinəsi).

1. Hidrojel sentezi

  1. Jelatin–riboflavin öncül çözeltiler (%5 ve %10 w/v)
    NOT: Yalıtımı ışığa karşı korumak için loş ışık altında çalışın veya kehribar şişeler veya alüminyum folyoya sarılmış şişeler kullanın. Hidrojel biyolojik kullanım için tasarlandığında, tüm adımları steril koşullarda laminar akış başlıkta yapın.
    1. Gerekli miktarda jelatin ve riboflavin fosfat (RFP) tartın: 10 mL %5 (w/v) + %0,01 (w/v) RFP öncüsü için 500 mg jelatin ve 1 mg RFP ağırlık yapın. 30 mL %10 (w/v) + %0,02 (w/v) RFP stoku için, 3 g jelatin ve 6 mg RFP ağırlık yapın.
    2. Jelatin ve RFP'yi ilgili deiyonize su hacmine (son hacimin %≈90'ına ekleyin). Toz tamamen dağınılana kadar hafifçe karıştırın.
    3. pH değerini 1 M NaOH kullanarak 7.0'a ayarlayın, pH'ı izlerken tabanı damla olarak ekleyin. Kullanılan NaOH hacmini ve son ayarlanmış hacmi kaydedin. pH ayarlandıktan sonra, çözeltileri deiyonize su ile son hacme getirin.
    4. Çözeltiyi 80 °C'de 200 rpm'de manyetik karıştırma altında 30 dakika boyunca çözüp homojenleştirin.
      NOT: Sıcak çözeltiler (>70–80 °C) sıcaklığa dayanıklı eldivenlerle kullanın.
    5. Çözeltilerin 30–40 °C'ye kadar soğumasına izin verin ve 0,22 μm polietersülfon (PES) hidrofilik membran filtrelerinden steril kehribar şişelere filtreleyin.
      NOT: Gerekirse filtreleme öncesi viskoz çözeltileri nazikçe (40–50 °C ≈) ısıtın; aşırı ısınmaktan kaçının.
    6. Şişeleri bileşim, tarih ve operatör baş harfleriyle etiketleyin. Filtrelenmiş hidrojel çözeltilerini kullanıma kadar 4 °C sıcaklıkta saklayarak saklama süresinin hazırlanma tarihinden itibaren 2 haftayı geçmemesini sağlayın.
  2. Takviyeli jelatin hidrojeller (son hacim: 10 mL)
    1. 4. ve 5. bölümlerde açıklanan prosedürlere uygun olarak otolog serum (AS) veya insan amniyotik membran ekstraktı (HAMe) hazırlayın. Ekstraktları steril ve soğutulmuş tutun, ta ki kullanıma kadar.
    2. Her 10 mL zenginleştirilmiş hidrojel için, %10 (w/v) jelatin + %0,02 (w/v) RFP stokundan 5 mL ve ilgili biyolojik ekstraktı (AS veya HAMe) 5 mL karıştırın.
      NOT: Gerekirse filtreleme öncesi viskoz çözeltileri nazikçe (40–50 °C ≈) ısıtın; aşırı ısınmaktan kaçının.
    3. Sıcak çözeltiyi 0,22 μm PES hidrofilik membran filtresinden steril kehribar şişelere filtreleyin.
    4. Hidrojelleri etiketleyin ve kullanıma kadar 4 °C'de saklayın. Depolama süresinin hazırlık tarihinden itibaren 2 haftayı geçmediğinden emin olun.
      NOT: Tüm atıkları kurumsal biyogüvenlik düzenlemelerine göre bertaraf et.

2. Hidrojel in vitro uygulaması

  1. Hidrojel formülasyonlarını Bölüm 1'de tarif edildiği gibi hazırlayın ve yeterli viskoziteyi korumak için uygulamadan önce 32 °C'de tutun.
  2. Steril teknikle, gerekli hidrojel hacmini hedef kuyuyusuna, kalıba, kaba veya substrata pipetleyin (Şekil 1A).
  3. Led-C kürleme lambasını hidrojel yüzeyinin 2 cm yukarısına yerleştirin. Hidrojeli mavi ışığa (λ = 420–480 nm) maruz bırakarak ve toplam 2 dakika süreyle 850-1000 mW/cm 2 ışık çıkışı sağlayarak yerinde çapraz bağlama başlatın. Aydınlatmayı 20 saniyelik altı darbe olarak verin, darbeler arasında yerel ısınmayı önlemek için 5–10 saniyelik duraklamalar ekleyin (Şekil 1B).
  4. Tam jelleşmeyi görsel olarak ve yüzeye nazikçe dokunarak steril bir cihazla doğrulayın; böylece katı ve manipüle edilebilir bir hidrojel oluşmasını sağlamak için (Şekil 1C,D).
  5. Çapraz bağlanmış hidrojeli hemen kullanın veya sonraki uygulamaya uygun steril koşullarda 4 °C'de saklayın.
    NOT: İşlem boyunca aseptik tekniği koruyun. Cilt veya gözleri doğrudan mavi ışık ışınına maruz bırakmaktan kaçının.

3. İnsan amniyotik zarının (HAM) tedariki

NOT: Plasentaları yalnızca bilgilendirilmiş onay vermiş ve kurumsal ile etik gereksinimleri karşılayan seronegatif bağışçılardan alın.

  1. Bağışçı uygunluğu ve rızası
    1. Her donörün HIV tip 1 ve 2, hepatit B ve C ile frengi için tarama yapılıp negatif test edildiğini doğrulayın.
    2. Ameliyattan önce her bağışçıdan yazılı bilgilendirilmiş onay alın.
    3. Sağlıklı donörlerin seçici sezaryen doğumlarından hemen sonra insan plasentası alın.
  2. Toplama ve ilk işleme
    1. Her plasentayı doğumdan hemen sonra steril paslanmaz çelik bir kapta toplayın.
    2. Ameliyathanede, kan pıhtılarını çıkarmak için plasentayı steril tuzlu çözeltiyle kapsamlı şekilde durulayın. Amniyonu—amniyotik boşluğu kaplayan en iç şeffaf zar—tanımlayın ve steril forseps kullanarak plasenta kenarına doğru nazikçe soyarak koriondan dikkatlice ayırın.
      NOT: Zarları yırtılmayı önlemek için dikkatlice kullanın.
    3. Tam ayrıldıktan sonra, manipülasyonu kolaylaştırmak ve bölünmesini standartlaştırmak için steril nitroselüloz filtre parçalarını HAM stromal yüzeyine takın. HAM'ı üç tanımlanmış bölgeye ayırın (Şekil 2A,B): distal amniyon: 10 cm genişliğinde kesit, medial amniyon: 10 cm genişliğinde kesit, proksimal amniyon: plasenta kenarına kadar uzanan kesit.
  3. Ulaşım
    1. Her HAM parçasını steril bir şişeye yerleştirin; Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamına (DMEM) batırın; bu malzeme 1.25 μg/mL amfoterisin B, 50 μg/mL penisillin-streptomisin ve 50 μg/mL neomisin ile takviye edilmiş.
    2. Her şişeyi donör kodu, tarih ve köken bölgesiyle (distal, medial veya proksimal) açıkça etiketleyin.
    3. Örnekleri derhal laboratuvara temiz ve aseptik soğutucu koşullarda (4 °C) taşımak için kullanılır.
      NOT: Zarları, insan dokusunu düzenleyen kurumsal biyogüvenlik düzenlemelerine uygun UN 3373 (Biyolojik Madde, Kategori B) uyumlu kapalı ve üçlü ambalajlarda taşıyın.
  4. Laboratuvar işlemi
    NOT: Sonraki tüm adımları steril koşullarda Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirin.
    1. Her distal, medial ve proksimal HAM parçasını steril makasla 4.0–4.5 × 4.0–4.5 cm karelere kesin.
    2. Parçaları daha önce bahsedilen antibiyotikli DMEM'e batırın ve kan kalıntılarını çıkarmak için steril kelepçelerle nazikçe fırçalayın. 50 μg/mL penisilin streptomisin içeren DMEM'de 2 x 5 dakika boyunca yıkayın.
    3. DMEM'de antibiyotik kullanmadan 2 x 5 dakika yıkayım.
    4. Bu seçilmiş parçaları steril fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) yıkayın.
    5. Her parçayı herhangi bir kültür ortamı olmadan 5 mL'lik steril bir tüpe aktarın. Örnekleri doğrudan –80 °C'de dondurarak daha fazla kullanıma kadar.

4. İnsan amniyotik membran ekstraktı (HAMe) hazırlığı

NOT: Tüm adımları aseptik ve soğuk koşullarda yaparak protein bozulmasını ve kontaminasyonu en aza indirin.

  1. −80 °C'de depolanan insan amniyotik zarı (HAM) parçalarını içeren tüpleri alın. Tüpleri sıvı azotla 5 dakika boyunca batırarak dokunun sertleşmesini sağlar.
  2. Her donmuş parçayı önceden soğutulmuş bir harva (−80 °C) aktarın ve yumuşak, homojen bir toz elde edilene kadar bir havanla iyice ezin.
  3. Toz örneği hemen bir denge tabağı üzerinde tartarak eritmeyi en aza indirin. Tartılan tozu 5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 3 mL PBS ile 5 μL/mg proteaz inhibitörü kokteyli ile takviye edilerek tekrar süzülün.
    NOT: İşlem sırasında protein bütünlüğünü korumak için tüm tüpleri buzda tutun.
  4. Her örneği sonikatör ve 1,5 mm çapında prob ile %90 genlikte 20 dakika boyunca sonikle geçirin; aşırı ısınmayı önlemek için 15 saniye açık / 15 saniye kapalı döngüler uygulanır.
  5. Lizatları 3.000 × g sıcaklığında 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı pelleti rahatsız etmeden dikkatlice toplayın.
  6. Süpernatantı steril koşullarda 0,22 μm PES hidrofilik membran filtresinden filtreleyin. Filtrelenen HAMe'yi 0,2 mL mikrotüplere aliquot yapın. Aliquotları −80 °C'de depolayın ve daha fazla kullanıma kadar.
    NOT: Depolama süresinin hazırlık tarihinden itibaren 6 ayı geçmediğinden emin olun.

5. Tavşanlardan kan kaynaklı otolog serumun ekstraksiyonu

NOT: İlgili kurumun Hayvan Araştırmaları Etik Komitesi'nin onayı altında ve kurumsal yönergelere uygun olarak Yeni Zelanda Beyaz tavşanlarında (≈2 kg) in vivo testler için tüm prosedürleri gerçekleştirmek.

  1. Tavşanı venipunktur bölgesinde lokal olarak lidokain (topikal veya deri altı) ile anestezi edin.
  2. Merkezi kulak arterinden kanı polimer jel ayırıcısı içeren 4,5 mL kan toplama tüplerine toplayın (Şekil 3A,B). Kanın RT ile 2 saat boyunca kaygısız pıhtı oluşmasına izin verin (Şekil 3C).
  3. Örnekleri 1.000 × g ile 15 dakika boyunca RT'de santrifüj edin. Tavşan otolojik serumunu (AS) oluşturan süpernatı (serum) topla (Şekil 3D).
  4. Serumu 0.22 μm PES hidrofilik membran filtresinden geçirin. Aliquot steril 0.2 mL tüplere koyun ve −80 °C'de saklanın.
    NOT: Depolama süresinin hazırlık tarihinden itibaren 6 ayı geçmediğinden emin olun.

6. In vivo cerrahi işlem

NOT: İlgili kurumun Hayvan Araştırmaları Etik Komitesi'ne uygun olarak tüm deneysel prosedürleri gerçekleştirmeli ve Helsinki Bildirgesi ile ARVO Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı Bildirisi ilkelerine uymalıdır.

  1. Ameliyat öncesi hazırlık
    NOT: Hayvan modeli olarak Yeni Zelanda Beyaz tavşanlarını (≈2 kg) kullanın.
    1. Ameliyattan önce, hayvanların uyluğuna kas içi enjeksiyon yoluyla genel anestezi uygulanır; şu yöntemlerle uygulanır: 1 mL/kg (50 mg/mL) ve 0,3 mL/kg (20 mg/mL) olarak ksilazin. Devam etmeden önce kornea ve ayak refleksinin olmadığını doğrulayın.
    2. Hayvanı steril bir cerrahi platformda lateral decubitus pozisyonuna yerleştirin ve periokulyar bölgeyi povidon-iyot çözeltisiyle dezenfekte edin. İşlem sırasında göz yüzeyinin sürekli maruz kalması için bir göz kapağı spekulumu ameliyatçı göze yerleştirilin.
  2. Ön stromal keratektomi
    1. 6,5 mm çapında vakum trefini tavşan korneasına merkezleyin (Şekil 4A). Cihazı stabilize etmek için emme uygulayın ve trefini üçte üç tur döndürerek yaklaşık 187 μm stromal derinlik elde edin.
    2. Trefinli bölgede hilal bıçağı kullanarak ön stromal keratektomi yapılarak epitel ve ön stromal tabakaları çıkarılarak düzgün bir yara yatağı elde edilene kadar (Şekil 4B).
  3. In vivo hidrojel uygulaması
    1. Kornea kusurunu ilgili hidrojel formülasyonundan 50 μL ile doldurun, optimum viskozite için 32 °C'ye kadar önceden ısıtılmış (Şekil 4C).
    2. Kornea yüzeyini mavi ışıkla (λ= 420–480 nm) 2 dakika boyunca aydınlatarak yerinde çapraz bağlama başlatın. Yerel ısınmayı sınırlamak için darbeler arasında 5–10 saniyelik duraklamalarla altı adet 20 saniyelik darbe verin (Şekil 4D).
  4. Lateral kısmi tarsorrafi
    1. Üst ve alt göz kapağı kenarlarının burun üçte birini tespit ederek gözlem ve tedavi için medial maruziyete izin verin.
    2. İlk dikişi yerleştirin (göz kapağı uzunluğu ve gerekli stabiliteye bağlı olarak 1–2 dikiş kullanın) (Şekil 4E).
      1. Lateral üst göz kapağı kenarını forseps ile tutun. İğneyi gri çizgi / göz kapağı kenarından deri tarafından konjonktival tarafa geçirin; tam kalınlıkta ısırık yapın ancak mümkünse tarsal plakaya derin penetrasyondan kaçının.
      2. İğneyi, konjonktival taraftan cilt tarafına doğru alt göz kapağı kenarının karşılık gelen noktasından geçirerek kapak kenarlarının apozisyonunu oluşturun.
      3. Dikişi sağlam bir cerrah düğümü ve iki kare düğümle bağlayın, düğüm cilt yüzeyinde göz kapağının kenarının hemen üzerinde değil, hafifçe dış tarafında bırakılır.
      4. Ek stabilite gerekirse, aynı tam kalınlıktaki U şeklindeki dikiş veya basit kesintili dikiş kullanılarak ikinci bir dikişi ilk dikişin yaklaşık 3–4 mm medial mesafesine yerleştirin.
      5. Dikiş kuyruklarını tahrişi azaltmak için 3–4 mm olarak kesin, böylece daha sonra çıkarılmak için yeterli uzunluk bırakın.
      6. Göz kapağı appozisyonunun tedavi edilen korneayı koruduğunu ve medial ve temporal konjunktiva/korneaya inceleme ve göz damlası tedavisi için erişim sağladığını doğrulayın. Tarsorrafinin aşırı sıkı olmadığından ve hayvanın göz kapaklarının iskemik olmadığından emin olun (Şekil 4F).
  5. Ameliyat sonrası izleme ve bakım
    1. Keratektomi öncesi deri altı enjeksiyonla 0,05 mg/kg buprenorfin ve her 12 saatte bir 72 saat boyunca analjezi sağlanır.
    2. Enfeksiyonu önlemek için yara tamamen kapanana kadar günde iki kez 3 mg/mL Tobramisin göz damlası verin.
    3. Kornea nemini korumak için kontrol kontrol cihazları da dahil olmak üzere günde dört kez %0,2 %0,2 hialuronik asit (HA) yapay gözyaşı damlası uygulayın.
    4. Tarsorrhaphy'yi günde en az iki kez dikiş gevşemesi, enfeksiyon, lokal doku nekrozu veya aşırı gerginlik belirtileri açısından kontrol edin. Hayvanı normal davranış, beslenme ve göz rahatsızlığı belirtileri açısından gözlem altında tutun.
    5. İşlemden 72 saat sonra dikiş düğümünü kesin ve her dikişi pensasla nazikçe çekin, konjonktival yüzeyde kirleticilerin sürüklenmesine dikkat edin.
    6. Göz kapağı kenarlarını doğru iyileşme için ve kornea yüzeyini epitel bütünlüğü açısından inceleyin. Tam epitel kapanışı görülene kadar göz tedavisine gerektiğinde devam edin.
    7. 3. günden 7. güne kadar göz iyileşmesini ve klinik belirtileri takip edin ve kaydedin; epitel kapanışı, opasitesi ve neovaskülarizasasyonu yarık lamba mikroskobu ve floressein boyama ile değerlendirin.
      NOT: Eğer iskemi, yara açılması veya şiddetli tahriş belirtileri ortaya çıkarsa, dikiş(ler)i derhal çıkarın ve buna göre uygulayın.
  6. Akut göz tahriş değerlendirmesini hızlandırın
    1. Tavşanı nazikçe havlu/battaniye sargısı ile tutun. Önce iris ve konjonktivayı beyaz ışık altında inceleyin.
    2. Konjonktival kızarıklık, kemoz (ödem) ve akıntıyı Draize ölçeğine göre puanlayın ( bkz. Tablo 1 ve Tablo 2).
    3. Tüm altı Draize parametresini veri sayfasına kaydedin. Göz tahriş indeksini (OII) bileşen puanlarının toplamı olarak hesaplayın; OII 0 ile 110 arasında değişir, yüksek değerler daha güçlü tahriş anlamına gelir.
    4. Her gözü OII'ye göre Kay–Calandra kategorilerine göre sınıflandırın; Kategoriyi veri setine kaydedin.
  7. Yara iyileşmesinin fotoğrafik dokümantasyonu
    1. Inferior konjonktival keseye floressein çözeltisi (5 μL) yerleştirilin.
    2. Gözü mavi ışıkla aydınlatın ve korneanın opaklığını (yoğunluk ve alan) ile florescein boyama kapsamını değerlendirin.
    3. Kamerayı manuel beyaz dengesi ayarlanmış, optik yakınlaştırma devre dışı bırakılmış şekilde ayarlayın ve tüm görüntüleri seanslar boyunca aynı parametrelerle yakalamak için yaklaşık 3 cm mesafede konumlandırın. Flüorescein instasyonundan sonra mavi ışık aydınlatması ile ve olmadan epitel kusurlarını belirlemek için görüntüler alın. 0. günde (tarsorrafi öncesi) ve 3. günden (tarsorrhaphy çıkarıldıktan sonra) tam epitel kapanışına kadar günlük görüntüler alın.
    4. ImageJ yazılımıyla görüntüleri analiz edin ve floressein-boyalı bölgelerin alanını nicelikle ölçün.
      NOT: 1. ve 2. günlerde fotoğraf dokümantasyonu genellikle kısmi tarsorrafi nedeniyle mümkün değildir. 1. ve 2. günlerdeki görüntülerin veri setinde eksik olduğunu belirtin ve herhangi bir olumsuz etkinliği (örneğin, tesadiy kornea sürtünmesi) rapor edin.
  8. Ötenazi ve doku koleksiyonu
    1. 21. günde (her iki gözün değerlendirme döneminden sonra), hayvanları kas içi uygulanan ketamin (2 mL/kg) ve ksilazin (0,6 mL/kg) ile derin bir şekilde anestezi yapın.
    2. Marjinal kulak damarına 10 mL doymuş potasyum klorür (KCl) enjeksiyonu ile ötananizasyon yapılır.
    3. Ölüm, rijt mortis ve hayati reflekslerin olmaması ile doku toplama sürecine geçmeden önce doğrulanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hidrojel sentezi ve karakterizasyonu
Hidrojel, foto-çapraz bağlamadan önce ve sonra reolojik ve optik özellikleri belirlenmek için in vitro sentezlenip değerlendirildi. Kesme reolojisi, viskoelastiklik, akma ve akış davranışını karakterize etmek için kullanıldı. Frekans taramaları, G′'nin tüm test edilen frekanslarda G'den daha yüksek kaldığını gösterdi ve bu katı benzeri davranışı gösteriyor (Şekil 5A). 10 rad·s⁻1'deki

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, kornea yara iyileşmesi için foto-çapraz bağlanabilir jelatin–riboflavin hidrojelin hazırlanması, yüklenmesi ve uygulanması için tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar. Tutarlı jel kalitesi elde etmek için birkaç in vitro adım kritik ve en sık çeşitlilik kaynakları oldukları için vurgu gerektirir. İlk olarak, ön çözeltinin karıştırma sırasında 80 °C'de tutulması, jelatin ve riboflavin fosfatın tam çözünmesini sağlar ve optik netlik ve çapraz bağlama uniformisini boz...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma çalışması, Bask Hükümeti Sağlık Bakanlığı'ndan (2023111027 ve IT524-22) alınan hibelerle desteklenmiştir. C.R.-V. Bask Ülkesi Üniversitesi UPV/EHU'dan alınan burs ile desteklenmiştir. SGIker (UPV/EHU) tarafından sağlanan hayvan bakımı ve Analitik ve Yüksek Çözünürlüklü Mikroskopi Hizmeti ile ilgili teknik destek memnuniyetle takdir edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Amphotericin BGibco (Thermo Fisher Scientific)15290018Final concentration: 1.25 μg/mL
Autologous serum, rabbit (AS)Prepared in-house-Prepared from whole blood; filtered through 0.22 μm PES
Blue LED curing lampWoodpecker Medical Instrument CoLED.C modelWavelength: λ=420–480 nm; Distance: 1–2 cm; Light output: 850-1000 mW/cm2
Buprenorphine (Buprecare)Ecuphar578950Dose: 0.05 mg/kg, subcutaneous injection every 12 h for 72 h
CameraPanasonicLUMIX TZ35Camera equipped with Leica optics
Cimarec Digital Stirring HotplateThermo Fisher ScientificSP131320-33220-240 V, Max temperature: 540 °C
Crescent microsurgical bladeBVI Medical373807-
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)Gibco (Thermo Fisher Scientific)11966025-
Eppendorf tubes (0.2 mL)Merck KGaA30124707Kept cold for HAMe prep; aliquoting
Eppendorf tubes (5 mL)Merck KGaA30119606Kept cold for HAMe prep; aliquoting
Fluorescein solution NovartisColorcusi Fluotest2% Fluorescein solution, 5 µl eye drops
Gibco NeomycinMerck KGaAN1142Final concentration: 50 μg/mL
Gelatin powderSigma AldrichG1890Dissolved at 80 °C; pH adjusted to 7.0
Hyaluronic acid artificial tears (0.2%)Chem.-pharm. Fabrik GmbHHylo-Tear-
ImageJ image processing softwareNational Institute of Mental Health-Developed by Wayne Rasband at the Research Services Branch
Ketamine (Ketolar)Pfizer631028.1
LidocaineVet OneNDC 13985-222-04Topical or subcutaneous injection
Penicillin–StreptomycinGibco (Thermo Fisher Scientific)15140-122Final concentration: 50 μg/mL
PES syringe filters, 0.22 μm0.22μm (Millex)Merck KGaASLGP033RS-
Phosphate-buffered saline (PBS)Sigma AldrichP4417-100TAB-
Protease inhibitor cocktailSigma AldrichP8340Added at 5 μL per mg tissue
Povidone-iodine solutionMeda pharma7167204Preoperative disinfection
Riboflavin phosphate (RFP)Sigma AldrichR0630000Concentrations: 0.01% w/v (final); 0.02% w/v (stock)
SonicatorBandelein electronicSonoplus GM mini20-
Sonicator probeBandelein electronicMS 1.51.5 mm dimater probe, 63 mm length.
Tarsorrhaphy sutures (non-absorbable)Alcon 80653080011–2 sutures as needed
Tobramycin ophthalmic solution (3 mg/mL)NovartisTobrexDosing: twice daily until closure
Hessburg-Barron trephine, 6.5 mm diameterJedmed21-8265-
Vacutainer blood collection tubes with polymer gel separatorBD (Becton, Dickinson and Company)367704-
Xylazine solutionLaboratorios Calier SAXylagesicDose: 5 mg/kg intramuscular injection

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meek, K., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Prog Retin Eye Res. 49, 1-16 (2015).
  2. Akowuah, P. K., Cruz, A. D. L., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An epithelial abrasion model for studying corneal wound healing. J Vis Exp. (178), e63112(2021).
  3. Mobaraki, M., et al. Corneal repair and regeneration: current concepts and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 7, 135(2019).
  4. Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: a review article. Med Hypotheses Discov Innov Ophthalmol. 8 (3), 163-176 (2019).
  5. Wilson, S. E., Goshe, J. M. Prevention and treatment of persistent epithelial defects after common refractive surgery procedures. J Refract Surg. 40 (2), 117-124 (2024).
  6. Wirostko, B., Rafii, M. J., Sullivan, D. A., Morelli, J., Ding, J. Novel therapy to treat corneal epithelial defects: a hypothesis with growth hormone. Ocul Surf. 13 (3), 204-212 (2015).
  7. Zernii, E. Y., Baksheeva, V. E., Yani, E. V., Philippov, P. P., Senin, I. I. Therapeutic proteins for treatment of corneal epithelial defects. Curr Med Chem. 26 (3), 517-545 (2019).
  8. Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wu, J., Singh, V., Wilson, S. E. The corneal fibrosis response to epithelial-stromal injury. Exp Eye Res. 142, 110-118 (2016).
  9. Anitua, E., et al. Progress in the use of plasma rich in growth factors in ophthalmology: from ocular surface to ocular fundus. Expert Opin Biol Ther. 22 (1), 31-45 (2021).
  10. Meng, S., et al. A versatile hydrogel with antibacterial and sequential drug-releasing capability for the programmable healing of infectious keratitis. ACS Nano. 17 (23), 24055-24069 (2023).
  11. Rafat, M., et al. Bioengineered corneal tissue for minimally invasive vision restoration in advanced keratoconus in two clinical cohorts. Nat Biotechnol. 41 (1), 70-81 (2023).
  12. Di Girolamo, N. Biologicals and biomaterials for corneal regeneration and vision restoration in limbal stem cell deficiency. Adv Mater. 36 (42), 2401763(2024).
  13. Huang, J., et al. Biologically inspired bioactive hydrogels for scarless corneal repair. Sci Adv. 10 (51), eadt1643(2024).
  14. Brunel, L. G., et al. In situ universal orthogonal network (UNION) bioink deposition for direct delivery of corneal stromal stem cells to corneal wounds. Bioact Mater. 48, 414-430 (2025).
  15. Sani, E. S., et al. Sutureless repair of corneal injuries using naturally derived bioadhesive hydrogels. Sci Adv. 5 (3), eaav1281(2019).
  16. Sharifi, S., et al. Tuning gelatin-based hydrogel towards bioadhesive ocular tissue engineering applications. Bioact Mater. 6 (11), 3947-3961 (2021).
  17. Li, M., et al. A “T.E.S.T.” hydrogel bioadhesive assisted by corneal cross-linking for in situ sutureless corneal repair. Bioact Mater. 25, 333-346 (2023).
  18. Chen, F., Le, P., Fernandes-Cunha, G. M., Heilshorn, S. C., Myung, D. Bioorthogonally crosslinked hyaluronate collagen hydrogel for suture-free corneal defect repair. Biomaterials. 255, 120176(2020).
  19. McTiernan, C. D., et al. LiQD cornea: pro-regeneration collagen mimetics as patches and alternatives to corneal transplantation. Sci Adv. 6 (25), eaba2187(2020).
  20. Feng, L., et al. Thermo-gelling dendronized chitosans as biomimetic scaffolds for corneal tissue engineering. ACS Appl Mater Interfaces. 13 (41), 49369-49379 (2021).
  21. Tang, Q., et al. Exosomes-loaded thermosensitive hydrogels for corneal epithelium and stroma regeneration. Biomaterials. 280, 121320(2022).
  22. Lee, Y. P., et al. Facile fabrication of superporous and biocompatible hydrogel scaffolds for artificial corneal periphery. Colloids Surf B Biointerfaces. 175, 26-35 (2019).
  23. He, B., et al. 3D printed biomimetic epithelium/stroma bilayer hydrogel implant for corneal regeneration. Bioact Mater. 17, 234-247 (2022).
  24. Fernandes-Cunha, G. M., et al. Supramolecular host-guest hyaluronic acid hydrogels enhance corneal wound healing through dynamic spatiotemporal effects. Ocul Surf. 23, 148-161 (2023).
  25. Wang, Q., et al. Photocurable and temperature-sensitive bioadhesive hydrogels for sutureless sealing of full-thickness corneal wounds. Small Methods. 8 (3), 2300996(2024).
  26. Brar, S., Ganesh, S., Reddy, S. S., Nagesh, B. N., Shahanand, D. A prospective, comparative, clinical study to evaluate the safety and efficacy of two different 0.1% riboflavin solutions used in collagen crosslinking treatment for patients with keratoconus. Clin Ophthalmol. 15, 2607-2617 (2021).
  27. Lee, H. J., Fernandes-Cunha, G. M., Myung, D. In situ-forming hyaluronic acid hydrogel through visible light-induced thiol-ene reaction. React Funct Polym. 131, 29-35 (2018).
  28. Fernandes-Cunha, G. M., Lee, H. J., Kumar, A., Kreymerman, A., Heilshorn, S., et al. Immobilization of growth factors to collagen surfaces using pulsed visible light. Biomacromolecules. 18 (10), 3185-3196 (2017).
  29. Schuldt, C., et al. Dose-dependent collagen cross-linking of rabbit scleral tissue by blue light and riboflavin treatment probed by dynamic shear rheology. Acta Ophthalmol. 93 (5), 328-336 (2015).
  30. Kubo, M., Sonoda, Y., Muramatsu, R., Usui, M. Immunogenicity of human amniotic membrane in experimental xenotransplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (7), 1539-1546 (2001).
  31. Garfias, Y., Zaga-Clavellina, V., Vadillo-Ortega, F., Osorio, M., Jiménez-Martínez, M. C. Amniotic membrane is an immunosuppressor of peripheral blood mononuclear cells. Immunol Investig. 40 (2), 183-196 (2011).
  32. Yazdanpanah, G., et al. A light-curable and tunable extracellular matrix hydrogel for in situ suture-free corneal repair. Adv Funct Mater. 32 (24), 2113383(2022).
  33. Niknejad, H., Yazdanpanah, G., Ahmadiani, A. Induction of apoptosis, stimulation of cell-cycle arrest and inhibition of angiogenesis make human amnion-derived cells promising sources for cell therapy of cancer. Cell Tissue Res. 363 (3), 599-608 (2016).
  34. Kakavand, M., Yazdanpanah, G., Ahmadiani, A., Niknejad, H. Blood compatibility of human amniotic membrane compared with heparin-coated ePTFE for vascular tissue engineering. J Tissue Eng Regen Med. 11 (6), 1701-1709 (2017).
  35. Basasoro, A., et al. The influence of amniotic membrane proteins on corneal regeneration when delivered directly or using hydrogel platforms. Front Med (Lausanne). 12, 1498319(2025).
  36. Tsubota, K., Goto, E., Shimmura, S., Shimazaki, J. Treatment of persistent corneal epithelial defect by autologous serum application. Ophthalmology. 106 (10), 1984-1989 (1999).
  37. Geerling, G., MacLennan, S., Hartwig, D. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. Br J Ophthalmol. 88 (11), 1467-1474 (2004).
  38. Jeng, B. H., Dupps, W. J. Autologous serum 50% eyedrops in the treatment of persistent corneal epithelial defects. Cornea. 28 (10), 1104-1108 (2009).
  39. Romo-Valera, C., et al. In vitro evaluation of gelatin-based hydrogels as potential fillers for corneal wounds. Biomacromolecules. 26 (6), 3344-3355 (2025).
  40. Romo-Valera, C., et al. Comparison of the regenerative potential of different functionalized gelatin-based hydrogels as fillers of rabbit corneal wounds. Front Med (Lausanne). 12, 1667446(2025).
  41. Wilhelmus, K. R. The Draize eye test. Surv Ophthalmol. 45 (6), 493-515 (2001).
  42. Kay, J., Calandra, J. Interpretation of eye irritation tests. J Soc Cosmet Chem. 13 (6), 281-289 (1962).
  43. Weidinger, A., Poženel, L., Wolbank, S., Banerjee, A. Sub-regional differences of the human amniotic membrane and their potential impact on tissue regeneration application. Front Bioeng Biotechnol. 8, 613804(2021).
  44. Romo-Valera, C., Etxebarria, J., Freire, V., Durán de la Colina, J., Arluzea, J., et al. An in vitro pre-screening model to evaluate the corneal anti-inflammatory effect of human blood-derived products and amniotic membrane extracts incorporated into gelatine-based hydrogels. Experimental eye research. 260, 110617(2025).
  45. Ingraldi, A. L., Audet, R. G., Tabor, A. J. The preparation and clinical efficacy of amnion-derived membranes: a review. J Funct Biomater. 14 (10), 531(2023).
  46. Murri, M. S., et al. Amniotic membrane extract and eye drops: a review of literature and clinical application. Clin Ophthalmol. 12, 1105-1112 (2018).
  47. Shakouri-Motlagh, A., O’Connor, A. J., Kalionis, B., Heath, D. E. Improved ex vivo expansion of mesenchymal stem cells on solubilized acellular fetal membranes. J Biomed Mater Res A. 107 (1), 232-242 (2019).
  48. Acharya, M., Gour, A., Dave, A. Commentary: tarsorrhaphy. Indian J Ophthalmol. 68 (1), 33-34 (2020).
  49. Dhillon, H., Bahadur, H., Raj, A. A comparative study of tarsorrhaphy and amniotic membrane transplantation in the healing of persistent corneal epithelial defects. Indian J Ophthalmol. 68 (1), 29-33 (2020).
  50. Maharjan, S. S., Pant, A. R., Joshi, P., Shrestha, P., Sharma, R. Outcomes of fungal corneal ulcer with impending perforation after temporary suture tarsorrhaphy. Nepal J Ophthalmol. 14 (27), 72-81 (2022).
  51. Bamrolia, N. R., Arora, R., Yadava, U. Unusual presentation of a case of Sjogren’s syndrome with neurological and ocular manifestation. Cont Lens Anterior Eye. 35 (2), 85-88 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Jelatin HidrojelleriRiboflavin apraz Ba lamaMavi I k apraz Ba lamaTav an KorneasHidrojel retimiAnterior Stromal KeratektomiAmniyotik Membran EkstraktEnjekte Edilebilir HidrojelOftalmik Biyomalzemeler
Video yakında

İlgili makaleler