Yüksek Çözünürlüklü Böcek Fotoğrafçılığı için Odak Yığma Protokolü

Summary

Amaç, taksonomi, biyolojik çeşitlilik araştırmaları, ekolojik çalışmalar ve kamu iletişimi için keskin, yüksek çözünürlüklü görüntüler oluşturmak amacıyla uygun fiyatlı ekipmanlar kullanarak böcek fotoğrafçılığı için erişilebilir, standartlaştırılmış bir odak yığma yöntemi sunmaktır.

Abstract

Burada, modüler dijital görüntüleme sistemi kullanılarak fotografik odak yığımı yoluyla böcek örneklerinin yüksek çözünürlüklü, genişletilmiş alan derinliği görüntüleri elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, ekipman montajı, kalibrasyon, görüntü alımı ve sonradan işlem işlemlerini birbirine bağlayan standart bir iş akışı sağlar. Tam kare aynasız kamera (61 MP) ile mikroskop objektif ve senkronize strob aydınlatması kullanılarak, protokol 0.76 m–0.19 m arasında piksel ölçekleri elde eder ve alt mikron odak artışlarıyla (0.2 m) artefaktsız kompozitler üretir. Bu işlem, rutin laboratuvar koşullarında haftada yaklaşık 20 son görüntü yakalayabilir ve işleyebilir. Mevcut stacking çözümlerine kıyasla, bu düşük maliyetli hibrit kurulum (ticari sistemlerin maliyetinin %30'unu <) erişilebilirliği en üst düzeye çıkarırken kırınım sınırlı görüntü kalitesini korur. Temsil edici uygulamalar arasında, taksonomi, biyolojik çeşitlilik dijitalleştirmesi ve tanıtım için renk kalibrasyonlu tanımlama plakalarının üretimi yer almaktadır. Protokolün standart yapısı, laboratuvarlar ve saha istasyonları arasında tekrarlanabilirliği kolaylaştırır; hem kaynak sınırlı hem de kurumsal ortamlarda büyük ölçekli böcek görüntüleme kampanyalarını destekler.

Introduction

Böcekler, Dünya'daki en çeşitli organizma grubunu temsil eder ve ekosistemin işleyişinde kritik roller^{oynar 1}. Ancak küresel değerlendirmeler, dünya genelinde bolluk ve çeşitlilikte endişe verici bir^{azalma olduğunu gösteriyor 2,3}. Böcek morfolojisinin doğru görüntülemesi, taksonomi, ekolojik izleme ve koruma için gereklidir; özellikle birçok taksonun tanımlanmadığı biyolojik çeşitlilik açısından zengin tropikal^{bölgelerde 4}. Ancak, geleneksel makrofotoğrafçılık, sınırlı alan derinliği nedeniyle kısıtlanmaya devam eder; bu da tek bir görüntünün anten veya kanat gibi tam keskin üç boyutlu yapıları kapsaymasını^engeller.

Bilimsel amaçlarla böcekleri fotoğraflama çabaları bir yüzyıldan fazla bir önceye dayanır; erken metodolojik açıklamalar, ince morfolojik detayları yakalamanın doğasında olan zorlukları^vurgular. Geleneksel makrofotografi, yaygın olarak kullanılmasına rağmen, yüksek^{büyütme 7,8'de} elde edilebilen sığ alan derinliği nedeniyle kısıtlanmaya devam etmektedir. Bu sınırlama, antenler, bacaklar veya kanatlar gibi üç boyutlu yapıların belgelenmesini zorlaştırır ve doğru tanımlama veya morfolojik analiz için gereken çözünürlüğe sahip görüntülere yol açar.

Dijital fotoğrafçılık ve görüntü işleme alanındaki gelişmeler önemli ilerlemeleri sağlamıştır. Farklı odak düzlemlerinde çekilen birden fazla görüntünün birleştirilerek tam keskin bir kompozit oluşturulduğu odak yığma, özellikle etkili bir yaklaşım^{olarak ortaya çıkmıştır 9}. Ticari kurulumları düşük maliyetli yarı otomatik çözümlerle karşılaştırarak entomoloji için değeri, tip örnek yaklaşımının büyük ölçekli dijitalleştirme^{potansiyelini ortaya koymaktadır 9}. Sonraki çalışmalar, odak yığma fonksiyonlarına sahip kompakt, uygun fiyatlı kameraların kullanımını incelemiş olup, yaklaşımın iyi finanse edilen kurumların ötesine geçip daha geniş dijitalleşme projelerini destekleyebileceğini^{göstermiştir 10}.

Farklı odak düzlemlerinde çekilen ardışık görüntülerin birleştirilerek tek bir genişletilmiş odak kompoziti oluşturulması — odak üst üste koyma—pratik bir çözüm^{haline geldi 6}. Erken karşılaştırmalı^{çalışmalar 7}, düşük maliyetli yarı otomatik sistemlerin bile ticari mikroskopların performansına yaklaşabileceğini, ancak kaynak sınırlı laboratuvarlar için uygun, standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir protokolün hâlâ eksik olduğunu gösterdi. DISC3D⁸ gibi alternatif 3B görüntüleme yöntemleri hassas modeller sağlar ancak özel donanım ve karmaşık yeniden yapılandırma yazılımı gerektirir, bu da erişilebilirliklerini sınırlar.

Burada, görüntü kalitesi, maliyet ve taşınabilirliği dengeleyen böcek örnekleri için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Sistem, yaygın olarak erişilebilen optik ve mekanik bileşenleri titiz renk kalibrasyonu ve sonradan işlem adımlarıyla entegre eder. Uygunluğu, müze dijitalleştirmesinden yarı kalıcı saha istasyonlarına kadar uzanıyor; bu da araştırmacıların özel ekipman veya yüksek maliyetli otomatik mikroskoplara bağımlı olmadan tekrarlanabilir görüntüler üretmesini sağlıyor. Bu
Çalışma, doğrulanmış, açık bir iş akışı sunarak metodolojik bir boşluğu doldurur
şeffaflık ve tekrarlanabilirlik vurgusuyla uyumlu.

Protocol

1. Ekipman kurulumu

1. Yüksek kaliteli optik bileşenleri uygun fiyatlı ve yaygın olarak erişilebilir ekipmanlarla bütünleştiren modüler bir görüntüleme sistemi tasarlamak (Ek Dosya 1)
2. Hassas mekanik, kontrollü aydınlatma ve gelişmiş optikleri birleştirerek yüksek çözünürlüklü odak yığımı elde edin ve farklı böcek boyutları ve morfolojileri için esnekliği koruyun.
3. Aşağıdaki temel bileşenleri kullanın.
   1. Kamera
      1. İnce morfolojik yapıları detaylı yakalamak için güçlü dinamik aralıklı yüksek çözünürlüklü tam kare dijital kamera kullanın.
      2. Kamerayı son derece özel bir odaklama rayına monte edin (Ek Dosya 1)
   2. Optik
      1. Sonsuzluk düzeltilmiş mikroskop objektiflerini 5X, 7.5X, 10X ve 20X (Ek Dosya 1) gibi büyütmelerle bir tüp sistemine monte edilmiş.
      2. Objektif kurulumunu, daha büyük örnekler için ultra-makro bir lens ile tamamlayın.
      3. Gerekirse farklı büyütme seviyelerine sahip lens tüpleri ekleyin (Ek Dosya 1)
   3. Aydınlatma
      1. Arka dik pozisyona iki stüdyo flaş ünitesi takarak tutarlı ve güçlü aydınlatma sağlar.
      2. İki yüksek hızlı flaş ünitesini öne açılı olarak yerleştirerek kısa flaş süresi ve hızlı geri dönüşüm süresi sağlanır.
      3. Aydınlıkları ayarlanabilir standlara monte ederek eşit ve gölgesiz aydınlatma elde edin (Ek Dosya 1).
      4. Lensin önüne bir difüzör yerleştirin, ışığı yumuşatmak ve sert gölgeleri azaltmak için (Ek Dosya 1).
   4. Destek sistemi
      1. Görüntü yakalama sırasında titreşimi en aza indirmek için bir antititreşim tablosu kurun.
      2. Titreşimleri ve yansımaları azaltmak için bir tripod desteği ve siyah yansıtıcı olmayan bir arka plan kullanın.
      3. Kamerayı stacking sisteminde stabilize etmek için özel bir makro ray ekleyin (Ek Dosya 1).
      4. Konuyu tam hizalamak ve konumlandırmak için üç eksenli döner konumlandırma (Ek Dosya 1) cihazı kullanın.
      5. İnce mm ölçekli makro ayarlamalar yapmak için hassas bir mikrometrik ayarlama aşaması kullanın.
   5. Odaklama sistemi
      1. Adımlı motorla kontrol edilen bir odaklama rafını özel bir kontrol ünitesi ve ağ kablosu aracılığıyla çalıştırın.
      2. Hareket artışlarını 0.2 μm kadar ince ayarlayarak odak yığımı için hassas derinlik örneklemesini sağlayabilirsiniz.
      3. Çok küçük kişileri görmezden gelirken ışık yönünü kontrol etmek ve yansımaları azaltmak için silindirik siyah bir tünel kullanın (Ek Dosya 1).
      4. Flaş ateşlemesini kamera deklanşörü ile tam olarak senkronize etmek için bir tetikleyici kullanın (Ek Dosya 1).
   6. Hesaplama ve aksesuarlar
      1. Görüntü işleme için en az 128 GB RAM'e sahip yüksek performanslı bir dizüstü bilgisayar kullanın.
      2. Hızlı bir hafıza kartı okuyucu, bir grafik tablet ve yüksek hassasiyetli bir fare kullanarak sonradan işlem sürecini hızlandırın.
      3. Saha operasyonları için yeterli depolama sağlamak amacıyla iki yüksek kapasiteli hafıza kartı taşıyın.
4. Sistemi birden fazla üreticiden temin edilen bileşenlerden birleştirerek böcek görüntüleme için optimize edilmiş özel bir hibrit kurulum oluşturun.

2. Renk kalibrasyonu

1. Kamera düzenini siyah boyalı duvarlarla çevreleyerek rastgele ışık ve renk yanlışlıklarını azaltın.
2. 6500 K'de standart bir gündüz aydınlatması kullanın; böylece gün ışığını taklit edin ve görüntüleme koşullarının tutarlı kalmasını sağlayın.
3. Kamera kalibrasyonu yapın.
   1. Kamerayı standart bir renk referans tablosu kullanarak kalibre edin.
   2. Böcek örnekleri için kullanılan aynı gün ışığı dengeli aydınlatma altında renkli referans tablosunu fotoğraflayın.
   3. Renk kalibrasyon yazılımı kullanarak özel bir renk profili oluşturun.
   4. Lens ve aydınlatma varyasyonlarını düzeltmek için son işlem sırasında özel renk profilini uygulayın.
4. Monitör kalibrasyonu yapın.
   1. Monitörü renk yönetim cihazı kullanarak kalibre edin.
   2. Düzenleme monitörünü bir kolorimetre ve profilleme yazılımıyla kalibre edin.
   3. Monitör kalibrasyonunu gamma 2.2 ve beyaz nokta D65'e ayarlayın, görüntüleme koşullarına uyun.
5. Bu çift kalibrasyon iş akışını koruyarak renk doğruluğunu yakalamadan nihai çıktıya kadar koruyun.

3. Üst üste Yığma

1. Her örneği ayarlanabilir desteklere monte ederek sabit konumlandırmayı sağlayın.
2. Motorlu odaklama rafı kullanarak görüntü alın.
3. Örnek boyutuna ve gerekli alan derinliğine göre adım boyutlarını 0.2 ile 2 μm arasında ayarlayın.
4. Her örnek için odak aralığında 50 ila 2.000 arasında görüntü alın.
5. Hareket bulanıklığını en aza indirmek için aydınlatmayı kamera pozlamayla senkronize edin.
6. Ham görüntü dosyalarını hafıza kartlarında depolayın ve edinimden hemen sonra işlem bilgisayarına aktarın.

4.Yazılım

1. Ham dosyaları ilk organizasyon için görüntü yönetim yazılımına aktarın.
2. Tüm görüntüleri seçin ve renk doğruluğunu korumak için kameraya özgü renk profilini uygulayın.
3. Görüntüleri yüksek çözünürlüklü TIFF dosyaları olarak dışa aktarın.
4. TIFF dosyalarını odak yığma yazılımında işleyin.
5. Mevcut üst üstleme yöntemlerini örnek karmaşıklığına göre test edin.
   1. Basit, uniform konularla çalışırken kontrast tabanlı ortalamalama yöntemi kullanın.
   2. Keskinlik ve artefakt azaltma arasında en iyi dengeyi almak istediğinizde derinlik haritası tabanlı bir yöntem kullanın (Ek Dosya 1).
   3. İnce detayları ve karmaşık kenarları yakalamak için piramit tabanlı bir yöntem kullanın; halo ile yapılan eserleri izlerken.
6. Hibrit iş akışını uygulayın.
   1. Önce orijinal görüntü yığınını derinlik haritası tabanlı yöntemle işleyerek güçlü genel keskinlik ve renk hassasiyetine sahip ara bir kompozit oluşturun.
   2. İlk ara çıktıyı sakın mı?
   3. Orijinal yığını piramit tabanlı yöntemle yeniden işleyerek kenar detayını vurgulayan ikinci bir kompozit oluşturun.
   4. İkinci ara çıktıyı saklayın.
   5. Her iki ara çıktıyı da odak yığma yazılımında yeni bir yığın olarak yükleyin.
   6. Derinlik haritası tabanlı yöntemi tekrar uygulayın; bu yöntemi birleştirerek her iki yöntemin güçlü yönlerini birleştiren ve artefaktları en aza indiren nihai bir kompozitte birleştirin.
7. Üst üste yığılmış görüntüyü görüntü düzenleme yazılımında iyileştirin.
   1. Arka planı kaldırın, artefaktları düzeltin ve renk kalibrasyonunu doğrulayın.
   2. Morfolojik görünürlüğü artırmak için ince kontrast ve parlaklık ayarlamaları yapın.
   3. Tekrarlanabilirliği sağlamak için her işlem sonrası adımı kaydlayın.
   4. İleri düzenleme sırasında hassasiyeti artırmak için bir grafik tableti kullanın.
8. İleri düzenleme sırasında aşağıdaki araçları kullanın.
   1. Hedefli düzenlemeler için düzensiz alanlar seçmek için serbest el seçim aracı kullanın.
   2. Aşırı pozlanmış veya düzensiz bölgeleri seçici olarak azaltmak için karartma aracı kullanın.
   3. Detaylı düzenleme sırasında görüntüyü hareket ettirmek ve yeniden konumlandırmak için bir navigasyon aracı kullanın.
   4. Lekeleri, toz izlerini ve küçük kusurları temizlemek için iyileştirme veya düzeltme fırçası kullanın.
9. Kaynak sınırlı ortamlarda verimliliği korurken tam keskin, yayın kalitesinde bir görüntü üretmek.
   ( Ek Dosya 1'i buraya yerleştirin)

5. Hazırlık ve kurulum

1. Görüntüleme iş istasyonunun montajı
   1. Stabil bir yüzeye titreşim sönümleyici bir masa yerleştirin.
   2. Masanın ortasına bir kamera montaj rayı yerleştirin.
   3. Dijital kamera gövdesini raya sert plaka adaptörü ile sabitleyin.
   4. Seçilen mikroskop objektîfini (5×–20×) veya makro lensi uygun tüp adaptörüyle takın.
   5. Eşit aydınlatma sağlamak için iki arka ve iki ön ışık kaynağı difüzörlerle donatılmış şekilde yerleştirilin.
   6. Konu desteğini (XYZ aşaması veya döner tutucu) lens ekseninin hemen altına monte edin.
      NOT: DURAKLAMA NOKTASI: Tam donanım düzeni, tozdan korumak için örtülüyse sonsuza kadar monte edilmiş kalabilir.
2. Sistem hizasının doğrulanması
   1. Optik eksenin örnek düzlemine dik olduğundan emin olun.
   2. Yansımalar simetrik olana kadar sahne mikrometreleriyle yatay ve dikey seviyeleri ayarlayın.
   3. Alanda aydınlatmanın homojen olduğunu doğrulayın; Gerektiğinde difüzörleri yeniden hizala.

6. Renk kalibrasyonu

1. Aydınlatma ve ortam ayarlamak.
   1. ~6500 K'da (gündüz eşdeğeri) dağıtılmış ışık kullanın.
      1. Ortam yansımalarını en aza indirmek için ortamı koyu ve mat yüzeylerle çevreleyin.
   2. Renk kalibrasyonu
      1. Görüntü ışığı altında 24 yamalı renkli referans tablosunu fotoğraflayın.
      2. Eşlik eden kalibrasyon yazılımını kullanarak bir kamera profili oluşturun.
      3. Bu profili, dönüşüm sırasında sonraki tüm ham görüntülere uygulayın.
      4. Ekran monitörünü γ = 2.2 ve beyaz nokta D65 olarak kalibre ederek iş akışı boyunca tutarlı renk renderı sağlanır.

7. Örnek montajı ve odaklama

1. Örneklerin hazırlanması.
   1. Kurutulmuş veya etanol korumalı böcekleri, modelleme kil gibi yumuşak bir montaj tabanına sabitleyin.
   2. Örneği istenen görüşe göre (dorsal, lateral, ventral veya frontal) yönlendirin.
   3. Desteği optik eksenin altına merkeze yerleştirin.
2. Odak yığını aralığının ayarlanması
   1. Odak aralığının başlangıcı ve sonunu en yakın ve en uzak keskin düzlemlerle tanımlayın.
   2. Büyütmeye bağlı olarak 0.2 μm ile 2 μm arasında artan hareketi programlayın.
   3. Yakalama tetikleyicisini senkronize edin ki aydınlatma her görüntü pozlamasında eş zamanlı olsun.
   4. Örnek boyutu ve derinliğine göre 50–2000 görüntü dizilerini yakalayın.
      NOT: DURAKLAMA NOKTASI: Yakalama diziler arasında güvenli bir şekilde duraklatılabilir.

8. Görüntü İşleme

1. Ham görüntüleri dönüştürün ve düzenleyin.
   1. Dosyaları satın aldıktan hemen sonra yerel bir bilgisayara aktarın.
   2. Her yığını, kademeli numaralandırma kullanarak benzersiz bir klasöre gruplayın.
   3. Lens ve renk düzeltme profilleri uygulayın, ardından görüntüleri 16-bit TIFF dosyaları olarak dışa aktarın.
   4. Görsellerin üst üste yığılması
   5. Focus stacking yazılımında TIFF yığınını açın.
   6. İlk kompozit için bir derinlik haritası algoritması ("Yöntem B"ye eşdeğer) seçin.
   7. İsteğe bağlı olarak, kenar geliştirme algoritması ("Yöntem C") kullanarak yeniden üst üste yığın ve her iki çıktıyı birleştirerek keskinliği maksimize ederek haloları azaltabilirsiniz.
   8. Son kompozit versiyonu kayıpsız formatta sakla.
2. Görüntülerin sonradan işlemesi
   1. Kompoziti bir görüntü düzenleme programında açın.
   2. Arka plan artefaktlarını ve tozu seçim ve iyileştirme araçlarıyla kaldırın.
   3. Morfolojik özelliklerin görünürlüğünü artırmak için genel parlaklık ve kontrastı ayarlayın.
   4. İzlenebilirliği sağlamak için her ayarı belgeleyin.
      Not: DURAKLAMA NOKTASI: Temizleme aşaması veri kaybı olmadan daha sonra devam ettirilebilir.

9. Kalite güvencesi ve depolama

1. Son görüntüyü %100 büyütmede inceleyin ve üst üste yığma hizalanmaları veya renk kaymaları kalmadığından emin olun.
2. Tüm görüntüleme parametrelerini (büyütme, adım boyutu, pozlama, yazılım sürümleri) metaveri sayfasına kaydedin.
3. Ham, ara ve son dosyaları yedek sürücülerde depolayın; Dijital bir günlük defteri tutun.

Results

Görüntü Kalitesi ve Çözünürlüğünün Doğrulanması

Odak yığma sistemi, 5×–20× büyütmeler arasında tam keskin, yüksek kontrastlı kompozitler üretti. Hesaplanan piksel ölçekleri, nesne alanında 0,76 μm (5×)–0,19 μm (20×) arasında değişmekteydi ve böcek kütikülü ve uzantılarının sub-mikron yapısal detayları için yeterli örnekleme doğrulandı. 800–2000 karelik temsil yığınları, halo artefaktları olmadan tutarlı düzlem içi keskinlik göstermiştir. Proto...

Discussion

Odak-üst üstleme prosedürünün optimal performansı, (i) kurulumun titreşimden tamamen izole edilmesine, (ii) mikron altı aralıklarla hassas odak rayı kalibrasyonuna ve (iii) tutarlı renk kalibrasyonuna bağlıdır. Bu parametrelerden herhangi bir sapma, halo oluşumunu ve renk kaymalarını önemli ölçüde^{artırır 9}. Mekanik stabilite ve standartlaştırılmış aydınlatmanın birleşimi, görüntü kalitesinin en kritik belirleyicisidir.

Sorun giderme ve ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Destek tablosu	Tercihen 3 kapsül	Tüm kurulum için stabil bir temel	150
Antititreşim tablosu	Özel Yapı	Görüntü yakalama sırasında titreşimleri en aza indirir	3,200
Silindirik siyah tünel	Özel Yapı	Işık yönünü kontrol eder	350
Küçük konularda yansımaları azaltır
Novoflex CASTEL-MICRO odaklama rafı (makro ray)	Step motor– Kontrollü, kontrol ünitesi, ağ kablosu, Euro AC adaptörü	Sub-mikron hassas odaklama (0.2 & mikro; m adım);	3,000
kamera hareketini otomatikleştirir
XYZ döner	Ayarlanabilir montaj	Özenle konu hizalanması ve konumlandırması	500
Kamera	Sony Alpha 7R IV (61 MP tam kare)	Yüksek çözünürlüklü görüntü yakalama	3,000
Aydınlatma	2&Times; Godox SK300II	Eşanlamlı, gölgesiz aydınlatma;	400
Aydınlatma	2&Times; Godox QT600II	kısa flaş süresiyle yüksek hız	1400
Flaş standları	3 ayarlanabilir stand	Işıkların esnek konumlandırılması	100
Işık değiştirici	Difüzör	Tışığı yumuşatır ve sert gölgeleri azaltır	50
Arka Plan	“ Kara delik" kadife	Yansımaları ortadan kaldırır, tekdüze arka plan sağlar	200
Mikroskop amaçları	Mitutoyo Plan Apo Infinity Düzeltildi: 5&Times;	Mikroyapılar için yüksek kaliteli büyütme	1,000
Mitutoyo Plan Apo Infinity Düzeltildi: 7.5& kez;	2,000
Mitutoyo Plan Apo Infinity Düzeltildi: 10& kez;	1,400
Mitutoyo Plan Apo Infinity Düzeltildi: 20& kez;	5,000
Lens tüp sistemi	Mitutoyo M-Plan lenslerinin doğrudan kamera kullanımı (2x, 5x, 7.5x, 10x, 20x)	Mikroskop objelerinin kameraya bağlanması	400
Adaptör	Sony E-mount ile NOVOFLEX evrensel süngü A'ya	Kamera ile optik sistemin mekanik bağlantısı	300
Makro lens	Venus Optics Laowa 100 mm f/2.8 2& kez; Ultra Macro APO (Sony E-mount)	Yüksek büyütmede daha büyük örneklerin görüntülenmesi	550
Tetikleyici	Flaş tetikleyici	Flaş kamera deklanşörü ile senkronize eder	50
Bilgisayar	ASUS veya Alienware dizüstü bilgisayar, ≥ 128 GB RAM, yüksek performanslı işlemci	Görüntü işleme ve depolama	3,000
Depolama medyası	2&Times; SD 256 GB, hızlı SD kart okuyucu	Güvenli yüksek hacimli görüntü depolama ve aktarım	200
Aksesuarlar	Oyun faresi	Düzenleme ve navigasyon sırasında hassasiyet	50
Aksesuarlar	Wacom One (grafik tablet)	Görüntü temizliği ve düzenleme sırasında ince kontrol	500
Toplam maliyet			26.800< güç>