Yöntem makalesi

Xenopus erken embriyogenezinde yeni başlayan transkriptomun metabolik etiketlenmesi

DOI:

10.3791/70591

⸱

27 Mart 2026

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

5-etinil-uridin (5-EU) kullanılarak Xenopus erken embriyolarında transkriptom analizi için yeni başlayan transkriptleri metabolik olarak etiketlemek ve saflaştırmak için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erken embriyogenez, döllenmeden sonra başlangıçta uykuda olan zigotik genomdan yeni bir zigotik genlerin transkripsiyonunu gerektirir. Büyük bir zorluk, yeni transkriptleri doğru şekilde tespit etmek ve zigotik genom aktivasyonu (ZGA) sırasında ifade sürelerini belirlemek olmuştur. Burada, erken Xenopus laevis embriyolarında 5-etinil-uridin (5-EU) ile yeni başlamış transkriptlerin metabolik etiketlenmesi için ayrıntılı prosedürler sunuyoruz. Döllenmeden sonra, 5-EU, ZGA sırasında yeni transkribe edilen RNA'ları metabolik olarak etiketlemek için 1-hücre evresi embriyolarına mikroenjekte edilir. Yeni başlayan EU-RNA'lar, tık kimyasına aracılı reaksiyonlarla biyotinilasyondan sonra saflaştırılır ve yeni oluşan transkriptom yeni nesil dizileme ile belirlenir. Önemli olarak, bu yöntem düşük aktif genlerin karakterizasyonuna olanak tanıyan yüksek hassasiyet ve özgüllüktedir. Bu nedenle, bu yaklaşım erken gelişim sırasında gen transkripsiyonunun dinamiklerini incelemek için güçlü bir araç sağlar ve diğer embriyonik sistemlere veya dokulara genellenebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Döllenmeden sonra embriyo, yumurtada biriktirilen anne faktörlerinin kontrolü altındadır, zigotik genom ise bir süre transkripsiyonel olarak sessiz kalır; Hücre kaderi belirtimi ve germ tabakaoluşumu 1,2,3,4,5,6 dahil olmak üzere sonraki gelişim için gerekli olan yüzlerce ila binlerce genin transkripsiyonu için aktive edilir. Aneden zigota geçiş (MZT) sırasında zigotik genom aktivasyonu (ZGA) olgusu, tüm metazoan türlerde yüksek derecede korunmuştur, ancak ZGA zamanlamasıtürler 1,2,3,4,5,6 arasında değişiklik gösterir. ZGA'nın nasıl düzenlendiğini anlamak, sadece erken gelişimin temel ilkelerini anlamamız için önemli olmakla kalmaz, aynı zamanda gelişimsel bozuklukların teşhisi ve tedavisi ile üreme sağlığını artırmak için yeni stratejiler geliştirme potansiyeli sunar.

ZZA'yı incelemenin en büyük zorluklarından biri, yeni transkriptleri doğru şekilde tespit etmek ve zigotik genom aktivasyonu (ZGA) sırasında başlama sürelerini belirlemek olmuştur. Erkenembriyolarda anne transkriptlerinin baskın olması nedeniyle, bu transkriptlerin yüksek seviyeleri, özellikle düşük aktifleşen genler için, geleneksel toplu RNA-seq kullanılarak ZGA sırasında yeni transkriptlerin tespitini gizleyebilir. Bu zorluğu aşmak için, yeni başlamış transkriptomu 5-etinil-uridin (5-EU) ile metabolik etiketleme kullanarak ölçme yöntemi geliştirdik; ardından yeni başlayan EU-RNA'ların klik kimyası ile biyotinilasyonu ve dizileme için arındırılması (EU-RNA-seq)8,9,10. 4-tiouridin (4sU)11,12 gibi diğer yeni başlayan transkript profilleme yöntemleriyle karşılaştırıldığında, 5-EU etiketleme tıklama kimyası yoluyla oldukça özgüldür, hem görüntüleme hem de dizileme için kullanılabilir ve kimyasal dönüşüm gerektirmez. Ayrıca, yeni kurulan EU-RNA-dizisi son derece hassastır ve yüzlerce geni tespit eder; bunların aktivasyonu geleneksel topluRNA-seq 8 tarafından tespit edilemez. Bu yaklaşım ayrıca, bireysel zigotik gen aktivasyonunun başlangıcını doğru şekilde belirlememizi ve erken embriyogenezde ZGA'nın belirgin uzaylı-zaman desenlerini profillememizeolanak sağladı 8.

Burada, Xenopus laevis erken embriyolarını model olarak kullanarak yeni başlayan transkriptomun profilini çıkarmak amacıyla EU-RNA-seq için örneklerin hazırlanmasına yönelik ayrıntılı prosedürleri açıklıyoruz. Bu protokol, önceki biryöntem 10,13'ten uyarlanmıştır ve prosedürlerde küçük optimizasyonlar yapılmıştır; bunlar arasında 5-EU'nun 1-hücre aşaması embriyolarına mikroenjeksiyonu, yeni yaranan EU-RNA'ların tık reaksiyonu ile biyotinilasyonu ve dizileme için arıtılması (Şekil 1). Tekrarlanabilirliği sağlamak için, erken embriyoların evrelerine bağlı olarak, yeni transkriptlerin bolluğuna bağlı olarak, 1–10 μg toplam RNA giriş olarak kullanılmalıdır, ancak daha düşük miktar hâlâ kullanılabilir. Bu protokol, Drosophila14 ve zebrafish15 gibi diğer embriyonik sistemlerde ve diğerdokularda 13 uygulanabilir. Bu yöntem, gen transkripsiyonu ve çeşitli biyolojik süreçlerdeki düzenleyici mekanizmaları anlamamızda güçlü bir araçtır; erken embriyogenezin yeni prensiplerini ortaya çıkarır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada tanımlanan hayvan çalışmaları, Güney Carolina Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Laboratuvar güvenliği ve atık bertarafı kurumsal düzenlemelere uymalıdır.

1. Reaktiflerin ve Tamponların Hazırlanması

  1. 20x MMR (Marc's Modified Ringer) çözümü: 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl2 ve 40 mM CaCl2 karıştırın. NaOH ile pH'ı 7.8'e ayarlayın. Otoklav yapıp oda sıcaklığında depolayın.
  2. %3 Ficoll (w/v)/0.5x MMR: 1.5 g Ficoll 400'ü 50 mL 0.5x MMR'ye yavaşça ekleyin ve manyetik karıştırma çubuğuyla hafifçe karıştırarak Ficoll tamamen çözülene kadar. Otomatik klavla ve kullanana kadar 4 °C'de tutun.
  3. 5-etinil üridin (5-EU) stok çözeltisi: 50 mM stok çözeltisi yapmak için, 5 mg'lik şişeye 372,8 μL tampon ekleyin (mikroenjeksiyonla uyumlu herhangi bir tampon kullanılabilir, örneğin 1x TBS, pH 7.6). İyi karıştırın ve 2 μL aliquot yapın. -80 °C'de sakla.

2. 5-EU'nun 1-hücreli embriyolara mikroenjeksiyonu

  1. Xenopus embriyolarını elde etmek için, in vitro fertilizasyon (IVF) gerçekleştirmek için standart protokolleri takip edin (örneğin, bkz. Sive ve ark., 2007)16. Embriyo 0.1x MMR'de olmalı, kullanıma hazır olmalı.
  2. Standart cam slayttan (25 mm x 75 mm) yapılmış bir mikroenjeksiyon odasına 1 mL %3 Ficoll/0.5x MMR ekleyin. Mikroenjeksiyon odasının ortasına 20 (veya gerekirse daha fazla) embriyoyu transfer etmek için plastik bir transfer pipeti kullanın.
  3. Cam iğnesinin çok ince ucu dikkatlice ince bir cımbız ile kesin ve iğneyi dikey olarak (ucu aşağıya bakacak şekilde) tezgahın duvarındaki modelleme kiline saplasın. P2 pipetini mikroloader ucuyla kullanarak cam iğnenin üstünden 0.5 μL 50 mM 5-EU ekleyin.
  4. İğneyi mikro manipülatör üzerine monte edin. P10 pipetini kullanarak bir aşama mikrometresine 10 μL halokarbon yağı ekleyin ve stereomikroskop altına alın.
  5. Enjeksiyon hacmini kalibre etmek için, önce ayağını kullanarak mikroenjektöre bağlı zemindeki pedi bastırın ve mikrometredeki halokarbon yağına bir damla enjekte edin. Damlacı boyutuna bağlı olarak, mikroenjektördeki basınç ve enjeksiyon süresini ayarlayarak enjeksiyon hacminin 10 nL, yani mikrometre üzerinde çapı 0,27 mm olarak belirlenir.
  6. Embriyonu tutmak için bir elde cımbız kullanın, diğer elinizle mikromanipülatörü tutun ve 1 hücreli aşamada embriyolara 10 nL 50 mM EU enjekte edin. Embriyodaki nihai 5-EU konsantrasyonu ~0,5 mM'dir.
  7. Mikroenjeksiyondan sonra, embriyoları enjeksiyon odasından %3 Ficoll/0.5x MMR içeren yeni bir cam kaba almak için plastik transfer pipeti kullanın. Enjekte edilen embriyoları Ficoll'da ~1 saat tutun.
  8. Ficoll çözeltisini dikkatlice çıkarın ve ortamı 0.1x MMR ile değiştirin. Embriyoları 0.1x MMR'de tutun ve daha fazla kullanıma kadar. Embriyoların gelişimini sürekli takip edin ve gerekirse anormal embriyoları çıkarın.
  9. Embriyolar istenen gelişim aşamalarına ulaştığında, plastik bir transfer pipeti kullanarak 10 embriyoyu 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpteki kalıntı ortamı dikkatlice çıkarmak için P200 pipeti kullanın ve embriyoları sıvı azotta snap dondurun.
    Not: Titizlik ve tekrarlanabilirliği sağlamak için, sadece normal embriyoları kontrol ile karşılaştırıldığında görünümlerine göre toplayın. Anormal embriyoları daha fazla analizden çıkarıp dışlayın. Gerekirse, negatif kontrollerle mikroenjeksiyon olmadan aynı sayıda embriyo da alın.
  10. Embriyoları -80 °C dondurucuda saklayıp daha fazla kullanıma kadar kullanın.

3. Toplam RNA Ekstraksiyonu ve Konsantrasyon Ölçümü

NOT: Erken embriyolardan toplam RNA'ları izole etmek için silika membranı bazlı toplam RNA çıkarma kiti ve RNA konsantrasyonlarını belirlemek için floresans tabanlı yüksek duyarlılıklı RNA nicelik kiti kullanın. Kitin verdiği talimatları takip edin ve aşağıdaki adımlar kılavuzdan biraz değiştirilmiştir. Aşağıdaki adımlarda kullanılan tüm çözeltiler ve reaktifler RNase içermemelidir.

  1. -80 °C dondurucudan alınan örnekleri buzun üzerine koyun.
  2. Her tüpte RNA çıkarma kitinden 700 μL Buffer RLT ekleyin. P1000 pipetiyle en az 15 kez veya tüm embriyolar çözünene kadar yukarı aşağı pipet yapın.
  3. Örnekleri 20 dakika buzda tutun. Embriyoları tamamen homojenleştirmek için en az 10 kez yukarı aşağı pipetle tekrar nazikçe karıştırın.
  4. Homojenleşmiş embriyolara 700 μL %70 etanol ekleyin. Pipet ile yukarı ve aşağı iyi karıştırın ve karışımın 700 μL'sini spin kolonuna aktarın.
  5. Kolonu 10.000 x g ile 1 dakika boyunca santrifüjlendirin. Akışı at. Santrifüjü tekrar tekrar et, karışımın geri kalanı tamamlanana kadar.
  6. 350 μL Buffer RW1 ekleyin ve kolonu 10.000 x g ile 1 dakika boyunca santrifüj yapın. Akışı at.
  7. Kolondaki zarın ortasına dikkatlice 80 μL DNaz I ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka yapın.
  8. 350 μL Buffer RW1 ekleyin ve kolonu 10.000 x g ile 1 dakika boyunca santrifüj yapın. Akışı at.
  9. 500 μL tampon RPE ekleyin ve kolonu 10.000 x g hassasiyetinde 1 dakika boyunca santrifüj edin. Akışı at. Yıkamayı bir kez daha tekrarlayın.
  10. Kolonu tekrar 10.000 x g ile 2 dakika boyunca santrifüjle kurutun.
  11. Kolonu yeni bir RNase içermeyen tüpe aktarın. Kolondaki zarın ortasına dikkatlice 35 μL RNase-free H2Oekleyin.
  12. Kolonu 10.000 x g ile 1 dakika boyunca santrifüjlendirin. Elütlenmiş RNA'yı topla ve buzda kal.
  13. RNA konsantrasyonunu ölçmek için, önce çalışma çözeltisini RNA nicelendirme kiti kullanarak RNA reaktifini (boya) 1:200 oranında RNA tamponunda seyreltirerek hazırlayın. Çalışma çözeltinin toplam hacmini toplam standart sayısına göre hesaplayın ve her standart veya örnek için 200 μL hazırlayın.
  14. 0.2 mL 8 tüplü bir şerit kur. Her standardı seyreltmek için, çalışan çözeltinin 190 μL'sine 10 μL ekleyin. Her örneği seyreltmek için, çalışan çözeltinin 199 μL'sine 1 μL ekleyin. İyi karıştır.
  15. 8 tüplü şeridi florometreye koy. RNA testini seçin, standartlara göre kalibre edin ve örneklerin konsantrasyonlarını okuyun.

4. Gelişmekte olan EU-RNA Biyotinilasyonu ve Arındırılması

NOT: Tıklama kimyasına dayalı yeni başlayan RNA yakalama kiti, yeni başlayan EU-RNA'ları biotinilasyon ve aşağı çekmek için kullanılır. Kit tarafından verilen talimatları takip edin ve aşağıdaki adımlar biraz değiştirilir. Enjekte edilmemiş embriyolardan alınan RNA'lar ile biyotinilasyon olmayan EU-RNA'lar, pulldown özgüllüğü için arka plan kontrolü olarak kullanılabilir.

  1. RNA Biyotinilasyonu ve Temizliği
    1. Her örnek için, 50 μL tık reaksiyonu oluşturmak üzere 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde aşağıdaki bileşenleri karıştırın: toplam RNA (1–10 μg), 1x EU tampon, 2 mM CuSO4, 0,25 mM biotin azid, 10 mM katkı 1 ve 12 mM katkı 2.
    2. Reaksiyon karışımını oda sıcaklığında nutatorda 30 dakika kuluçka yapın.
    3. Yukarıdaki her reaksiyonda 1 μL glikojen, 50 μL 7,5 M amonyum asetat ve 700 μL soğutulmuş %100 etanol ekleyin. İyi karıştırmak için 5 kez yukarı aşağı pipet yapın.
    4. Tüpü -80 °C dondurucuya koyup gece boyunca sakla.
    5. Tüpü 13.000 x g sıcaklığında 20 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice çıkarın, pelleti rahatsız etmeden.
    6. 700 μL %75 etanol ekleyin ve peleti tekrar süspansiyona almak için nazikçe karıştırın. Tüpü 13.000 x g sıcaklığında 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice çıkarın, pelleti rahatsız etmeden. Yıkamayı bir kez daha tekrarlayın.
    7. Peleti oda sıcaklığında 5–10 dakika hava kurutmasında alın. Pelleti 10 μL RNase-free H2O içinde yeniden süzülür.
  2. EU-RNA Arındırması
    1. Yeni ortaya çıkan EU-RNA'ları aşağı çekmek için, her örnek için yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde 5 μL streptavidin kaplı manyetik boncuk dağıtın.
    2. 9 μL yıkama tamponu 2 ekleyin. İyi karıştırın ve tüpü manyetik bir rafa yerleştirin. 2 dakika bekletin. Üst yüzeyi çıkarın. Yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Boncukları 5 μL Wash Buffer 2'de yeniden askıya alın.
    3. Yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde (her örnek için 15 μL) aşağıdaki ana karışımı hazırlayın: 12,5 μL RNA bağlama tamponu (Bileşen G), 0,2 μL 1:10 seyreltilmiş RNase OUT ve 2,3 μL RNase-free H2O. RNA örneğini içeren her tüpte 15 μL karışım ekleyin.
    4. 69 °C'de bir ısı bloğunda 5 dakika kuluçka yapın. Tüpü buz üzerine koy.
    5. Yukarıdaki önceden yıkanmış boncuklardan 5 μL ekleyin, RNA örneğini içeren her tüpte ekleyin. Oda sıcaklığında nutatorda 30 dakika kuluçka yapın.
    6. 50 μL yıkama tamponu 1 ekleyin. İyi karıştırın ve tüpü manyetik bir rafa yerleştirin. 2 dakika bekletin. Üst yüzeyi çıkarın. Yıkamayı 4 kez daha tekrarlayın.
      Not: İlk yıkamadan sonra, muhtemelen sadece anne transkriptlerini içeren üst örtü, anne transkriptomunu ölçmek için toplanabilir.
    7. 50 μL Wash Buffer 2 ekleyin. İyi karıştırın ve tüpü manyetik bir rafa yerleştirin. 2 dakika bekletin. Üst yüzeyi çıkarın. Yıkamayı 4 kez daha tekrarlayın.
    8. Boncukları 5 μL Wash Buffer 2'de yeniden askıya alın. Boncuklar, yeni gelişmekte olan EU-RNA'ları içerir ve doğrudan cDNA sentezi ve kütüphane hazırlığı için hazırdır.
      Not: Kütüphane hazırlığına geçmeden önce, yeni başlayan transkriptlerin zenginleşmesi, bilinen bireysel genlerin ekspresyonunun ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kullanılarak ölçülmesiyle değerlendirilebilir.

5. RNA Kütüphanesi Hazırlığı ve Dizilemesi

  1. cDNA kütüphanelerini geliştirmek için ticari olarak mevcut kitleri kullanın ve kitin verdiği talimatları takip edin. Kütüphaneleri nicelikten ölçmek ve havuzlamak için NEBNext Library Quant Kit'i kullanarak Illumina için kullanın.
  2. Kütüphaneleri, yaygın olarak kullanılan yeni nesil dizileme kitlerinin talimatlarını takip ederek birleştirin. Kütüphaneleri tezgah üstü sequencer'a yüklemeden önce ~1.8 pM'e kadar seyreltin ve böylece dizileme sırasında ~200k/mm 2 optimal küme yoğunluğu elde edilir. Kütüphaneleri yaygın olarak kullanılan yeni nesil dizileme yöntemiyle sıralayın. Örnek başına ~20 milyon okuma için eşleştirilmiş uçlu 75-bp dizileme kullandım.
  3. Salmon 17 kullanarak dizileri Xenopus laevis genom build 9.2'ye hizalayarak transkriptomik okumaları nicelikleştirin ve DESeq218 ile diferansiyel gen ekspresyonu analizi yapın. Genom tarayıcısında zirveleri görselleştirmek için, dizileri STAR19 kullanarak genoma eşleyin ve Integrative Genomics Viewer (IGV)19'da görüntülenin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xenopus laevis embriyoları (dört biyolojik çoğalanma), döllenme sonrası 5 ila 9 saat arasındaki evrelerde 22 °C'de, yani 5. aşamadan (az büyük ölçekli ZGA) evreden 9. evreye (yüksek ZGA) kadar olan evreleri kapsıyor ve8 üzerindeki protokole göre işlendi. Toplam RNA'lar, saflaştırılmış yeni başlayan EU-RNA'lar ve geçiş RNA'ları kütüphanelerin hazırlanmasında kullanıldı ve sıralandı. Şekil 2'de gösterildiği gibi, 6–9 hpf'deki y...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, erken embriyogenezde yeni ortaya çıkan transkriptomun metabolik etiketlenmesi için ayrıntılı bir protokol sunduk; bunlar arasında 5-EU'nun 1-hücreli embriyolara mikroenjekte edilmesi, toplam RNA'ların çıkarılıp konsantrasyonlarının ölçülmesi ve yeni ortaya çıkan EU-RNA'ların kütüphane hazırlığı ve dizileme için biyotinilasyonu ve arındırılması (EU-RNA-Dizi) dahil (Şekil 1). Yaklaşımın toplam RNA-dili ile karşılaştırıldığında yüksek hassasiyet ve özgü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazar, rekabet eden bir çıkar olmadığını belirtir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pennsylvania Üniversitesi'ndeki Matthew Good laboratuvarına eğitim verdikleri için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, kısmen Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü (R03HD105802) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
µ PUPM MikroenjektörDünya Hassas AletleriUPUMPMikroenjeksiyon (basınçla mikroenjeksiyon) için
5-ehtynyl uridinThermo Fisher ScientificE10345Mikroenjeksiyon için (yeni başlayan traknscriptlerin etiketlenmesi)
ACCU-SCOPE 3075 Zoom StereomikroskoplarıVWR470351-130Mikroenjeksiyon için (embriyoların görselleştirilmesi)
Amonyum asetatSigma-AldrichA2706RNA çökeltmesi için
Askorbin asitSigma-AldrichA7506Tıklama tepkisi için
Borosilikat Cam KapaklarDünya Hassas AletleriTW100-4Mikroenjeksiyon (cam iğne yapma) için
SantrifüjEppendorf5425RSantrifüj için
Click-iT Kisan RNA Yakalama KitiThermo Fisher ScientificC10365Biyotinleştirme ve yeni başlayan RNA'yı arındırmak için
CuSO4Sigma-Aldrich61230Tıklama tepkisi için
DNase IRoche Diagnostics4716728001RNA ekstraksiyonu için
Ficoll 400Sigma-AldrichGE17-0300-10Mikroenjeksiyon için (embriyoların kuluçka aşaması)
Cam Petri Kabı (60 mm)VWR75845-542Döllenme için
GlikojenThermo Fisher ScientificAM9510RNA çökeltmesi için
Halokarbon Yağı 27Sigma-AldrichH8773Mikroenjeksiyon için (enjeksiyon hacminin kalibrasyonu)
L-sisteinSigma-Aldrich168149Embriyoların jellizasyonundan arındırılması için
Mikroloader uçlarıCalibre ScientificEPE-5242956003Mikroenjeksiyon için (cam iğneye 5-EU yükleme)
Illumina için NEBNext Kütüphanesi Quant KitiNEBE7630Kütüphane niceliklendirmesi için
NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (75 CYS)Illumina20024906Dizileme için
Qubi Flex FlorometreThermo Fisher ScientificQ33327RNA konsantrasyonu ölçmek için
Kubit RNA HS Bağlama KitiThermo Fisher ScientificQ32852RNA konsantrasyonu ölçmek için
RNeasy Mini KitQiagen74104RNA ekstraksiyonu için
Aşama MikrometresiWard'ın Bilimi470175-914Mikroenjeksiyon için (enjeksiyon hacminin kalibrasyonu)
NuQuant ile evrensel RNA-dizisiNuGEN0364Kütüphane hazırlığı için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, M. T., Bonneau, A. R., Giraldez, A. J. Zygotic genome activation during the maternal-to-zygotic transition. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 581-613 (2014).
  2. Jukam, D., Shariati, S. aM., Skotheim, J. M. Zygotic genome activation in vertebrates. Dev Cell. 42 (4), 316-332 (2017).
  3. Vastenhouw, N. L., Cao, W. X., Lipshitz, H. D. The maternal-to-zygotic transition revisited. Development. 146 (11), (2019).
  4. Kojima, M. L., Hoppe, C., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition: Reprogramming of the cytoplasm and nucleus. Nat Rev Genet. 26 (4), 245-267 (2025).
  5. Palfy, M., Joseph, S. R., Vastenhouw, N. L. The timing of zygotic genome activation. Curr Opin Genet Dev. 43, 53-60 (2017).
  6. Tadros, W., Lipshitz, H. D. The maternal-to-zygotic transition: A play in two acts. Development. 136 (18), 3033-3042 (2009).
  7. Schier, A. F. The maternal-zygotic transition: Death and birth of rnas. Science. 316 (5823), 406-407 (2007).
  8. Chen, H., Good, M. C. Nascent transcriptome reveals orchestration of zygotic genome activation in early embryogenesis. Curr Biol. 32 (19), 4314-4324.e7 (2022).
  9. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  10. Chen, H. Quantifying nascent transcription in early embryogenesis. Methods Mol Biol. 2923, 143-162 (2025).
  11. Heyn, P., et al. The earliest transcribed zygotic genes are short, newly exmaved, and different across species. Cell Rep. 6 (2), 285-292 (2014).
  12. Bhat, P., et al. Slamseq resolves the kinetics of maternal and zygotic gene expression during early zebrafish embryogenesis. Cell Rep. 42 (2), 112070(2023).
  13. Palozola, K. C., Donahue, G., Zaret, K. S. Eu-rna-seq for in vivo labeling and high throughput sequencing of nascent transcripts. STAR Protoc. 2 (3), 100651(2021).
  14. Kwasnieski, J. C., Orr-Weaver, T. L., Bartel, D. P. Early genome activation in drosophila is extensive with an initial tendency for aborted transcripts and retained introns. Genome Res. 29 (7), 1188-1197 (2019).
  15. Chan, S. H., et al. Brd4 and p300 confer transcriptional competency during zygotic genome activation. Dev Cell. 49 (6), 867-881.e8 (2019).
  16. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. , (2007).
  17. Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
  18. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for rna-seq data with deseq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
  19. Dobin, A., et al. Ultrafast universal rna-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  20. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  21. Ma, S., Hong, Y., Chen, J., Xu, J., Shen, X. Single-cell nascent transcription reveals sparse genome usage and plasticity. Cell. 188 (24), 6873-6891.e23 (2025).
  22. Battich, N., et al. Sequencing metabolically labeled transcripts in single cells reveals mrna turnover strategies. Science. 367 (6482), 1151-1156 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Xenopus EmbriyogeneziZigotik Genom Aktivasyonu5 Etinil ridin aretlemesiMikroenjeksiyon Tekni iClick KimyasRNA Safla t rmaYeni Nesil DizilemeGen Ekspresyon Dinamikleri

İlgili makaleler