Yöntem makalesi

Tert-bütil hidroperoksit kullanarak birincil insan melanositlerinde stres kaynaklı erken yaşlanma için standart bir protokol

DOI:

10.3791/70595

⸱

29 Mayıs 2026

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Biomedical Aging Research, Universität Innsbruck, 2Center for Molecular Biosciences Innsbruck (CMBI), 3European Innovation Center, Proya Europe

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HNM'de erken yaşlanmayı tetiklemek için tBHP kullanılarak standartlaştırılmış bir protokol, büyüme durması, SA-β-galaktosidaz aktivitesi ve SASP faktörleri dahil olmak üzere temel yaşlanma belirteçlerini analiz etmek için standartlaştırılmış protokoller.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UV radyasyonu, hava kirliliği veya sigara dumanı gibi çevresel stres faktörleri, dış cilt yaşlanmasını tetikler. Bu dışsal yaşlanma faktörlerine maruz kalma, yaşlanan hücrelerin birikmesini teşvik eder ve bu da kırışıklıklar ile pigmentasyon bozukluklarının oluşmasına katkıda bulunur. Birincil UV koruması sağlayan melanositler, yaşla birlikte daha az aktivite gösterir. Yaşlanan melanositler yaşlı deride birikir ve cildin yaşlanma görünümüne katkıda bulunur; Ancak, melanositlerin yaşlanmasını inceleyecek çok az model vardır ve bu çalışma, daha ileri araştırmalar için tekrarlanabilir bir model geliştirmeyi amaçlamaktadır. Bu çalışmada, iyi karakterize edilmiş oksidatif stres indükleyicisi tert-bütil hidroperoksit (tBHP) kullanılarak insan neonatal melanositlerinin (HNM) yaşlanma modelini sunuyoruz. tBHP, hücresel antioksidan savunmalarını zayıflatarak ve radikal aşırı üretimi teşvik ederek redoks homeostazını bozar; bu da DNA ve protein hasarına yol açar. tBHP ile işlenmiş melanositlerin yaşlanma fenotipini, sınırlı büyüme potansiyeli, morfolojik değişiklikler ve SA-β-Galaktosidaz aktivitesi gibi yerleşik yaşlanma belirteçlerinin analiziyle karakterize ediyoruz. Bu model, melanositlerde stres kaynaklı erken yaşlanmanı araştırmak için değerli bir araç sunar ve dış deri yaşlanması ile pigmentasyon bozukluklarındaki rollerine dair içgörüler sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cilt yaşlanması iki farklı faktörden oluşur: içsel ve dışsalyaşlanma 1,2. İçsel yaşlanma, doğal kronolojik süreçler ve genetik faktörlerden kaynaklanırken, dışsal yaşlanma, öncelikle ultraviyole radyasyon, ancak aynı zamanda hava kirliliği, sigara dumanı ve kimyasal maddelere birikimli maruz kalmaktan kaynaklanır; bu da yaşlanma sürecini normal kronolojik hızların ötesinehızlandırır 3,4. Çevresel maruziyetler, hücresel antioksidan savunmalarını aşan oksidatif stres oluşturur ve DNA hasarı, protein oksidasyonu ve lipid peroksidasyonuna yol açar. Bu moleküler değişiklikler, kalıcı DNA hasar yanıtlarını ve hücresel işlev bozukluğunu tetikler; sonuçta erken yaşlanmaya yolaçar 5,6. Bu stres kaynaklı yaşlanma, yaşlı cildin kırışıklıklar, düzensiz pigmentasyon, azalmış elastikiyet ve bariyer fonksiyonunun bozulması gibi klinik özelliklerine katkıdabulunur 7.

Melanositler bazal epidermis içinde bulunur ve melani sentezleyip çevresindeki keratinositlere aktararak UV kaynaklı hasara karşı cildin birincil savunması olarak hizmet eder. Paradoksal olarak, bu koruyucu rol onları özellikle oksidatif strese ve dış yaşlanma sırasında erken yaşlanmaya karşı savunmasızkılar 8,9. Melanogenez süreci, tirozinaz-katalize reaksiyonların yan ürünleri olarak önemli reaktif oksijen türleri üretir ve UV radyasyonu ve kirlilik gibi çevresel maruziyetlerle daha da büyüyen doğal bir oksidatif yükoluşturur 10,11. Sonuç olarak, kronik çevresel stres oksidatif hasara, mitokondriyal işlev bozukluğuna ve nihayetinde hücresel yaşlanmaya yolaçabilir 12. Önemlerine rağmen, melanosit yaşlanmasını yöneten moleküler yollar ve oksidatif stresin bu süreci nasıl başlattığı konusunda temel sorular hâlâ devam etmektedir. Ayrıca, yaşlanma eğilimli cilt değişikliklerinin etkeni olarak çevredeki deri mikroçevresi üzerindeki yaşlanma etkisi, özellikle SASP faktörlerinin salınımı yoluyla yeterince anlaşılmamıştır13,14.

Melanositler oksidatif stresle indüklenen yaşlanmaya özellikle hassastır ancak bu süreci inceleyen deneysel modeller sınırlıdır15,16. Çoğu yaşlanma araştırması, fibroblastlarda tekrarlayıcı veya stres kaynaklı yaşlanma modellerine dayanmaya devam etmektedir, ancak bu yaklaşımlar melanositlerin belirgin biyolojisini veya komşu hücrelerle çapraz iletişim yoluyla deri yaşlanmasını etkileme potansiyelini ve kendi SASPprofillerini 17 kapsamamaktadır. Bu boşluk, çevresel stres faktörlerine fizyolojik yanıtlarını daha doğru yansıtan melanositlere özgü yaşlanma modellerine olan ihtiyacıvurgulamaktadır (18,19) ve insan derisi yaşlanmasına katkılarını yansıtmaktadır.

Stres kaynaklı yaşlanma yaklaşımlarının mevcut olmasına rağmen, birincil insan melanositlerinde uygulanması teknik olarak zorludur ve genellikle önemli değişkenlikle ilişkilidir. Melanositler özellikle oksidatif strese hassastır; bu da etkili yaşlanma indüksiyonu ile aşırı sitotoksisite arasında dar bir deneysel pencere oluşturur. Ayrıca, birincil hücre hazırlıklarındaki donöre bağlı farklılıklar, çalışmalar arasında tutarsız sonuçlara katkıda bulunmaktadır. Bu zorluklar sıklıkla az bildirilir ve protokoller genellikle yeterince standartlaştırılmamıştır, bu da tekrarlanabilirliği sınırlar. Mevcut protokol, optimize edilmiş ve tekrarlanabilir bir tedavi rejimi, tanımlanmış doz programı ve birincil insan melanositlerinde yaşlanmanın güvenilir indüksiyonu ve değerlendirilmesi için standart okumalar sunarak bu açığı kapatmaktadır.

Tert-bütil hidroperoksit (tBHP), reaktif oksijen türleri üreterek ve hücresel antioksidan savunmalarını zayıflatarak yaşlanmayı teşvik eden oksidatif stresin iyi karakterize edilmiş bir indüktörüdür. Dermal fibroblastlarda yaşlanmayı tetiklemek için yaygın olarak kullanılmıştır; burada tipik yaşlanma belirteçlerini tetiklerken hücrecanlılığını korurken 20,21 de vardır. tBHP, tanımlanmış biyokimyasal yollar aracılığıyla sürekli oksidatif stres ürettiğinden, oksidatif stres kaynaklı yaşlanmayı incelemek ve oksidatif hasarı yaşlanma süreçleriyle ilişkilendiren moleküler mekanizmaları incelemek için tekrarlanabilir ve erişilebilir bir sistemsunar 22,23. UV tabanlı modellerin aksine, tBHP özellikle kontrollü ve tekrarlanabilir bir oksidatif stres indüksiyonu gerektiğinde, ışınlanma parametrelerinden bağımsız ve özel ekipmana ihtiyaç duyulmadığında avantajlıdır.

HNM, dışsal yaşlanma mekanizmalarını incelemek için uygun bir modelsağlar 24. Sünnet derisinden türeyen birincil hücreler olarak, sağlam stres-yanıt yollarını korurlar ve genetik modifikasyon veya ölümsüzleştirme ile ilişkili artefaktlardankaçınırlar 25. Yenidoğan melanositler, minimum başlangıç hasarı sergileyerek çevresel strestör kaynaklı yaşlanma yollarının net değerlendirilmesini sağlayan optimal deneysel modelsağlar 26,27.

Bu çalışma, birincil insan yenidoğan melanositlerinde tBHP kaynaklı oksidatif stresi kullanarak, yaşlanma araştırmalarında yaygın olarak kullanılan melanositik olmayan ve ölümsüzleştirilmiş hücre modellerinin sınırlamalarını aşmıştır. Melanositlere özgü yaşlanma mekanizmalarını incelemek ve yaşlanma fenotipini belirlenmiş belirteçlerle karakterize etmek için standart bir platform sağlar. Genel olarak, bu protokol melanositlerde oksidatif stres kaynaklı yaşlanmayı incelemek için tekrarlanabilir ve fizyolojik olarak ilgili bir model sunar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, tBHP tarafından indüklenen stres kaynaklı erken yaşlanma mekanizmalarını incelemek amacıyla birincil insan yenidoğan melanositleri (HNM) üzerine yapılan araştırmalar için optimize edilmiştir (Şekil 1). Melanositler, yenidoğan Kafkas sünnet derisinden (hafif pigmentasyon fototipi) türetilmiş ve ticari bir kaynaktan elde edilmiştir. Tedarikçinin belgelerine göre, insan dokuları, Helsinki Bildirgesi ve geçerli veri koruma düzenlemeleri dahil olan yerleşik etik ve yasal çerçevelere uygun olarak tam bilgilendirilmiş ve onay vermiş bağışçılardan toplanmaktadır. Hücreler kimliği silinmiş bir formda sağlandı. Bu çalışmada kullanımları için ek etik onay gerekmemiştir. Tüm deneyler, tutarlılığı sağlamak için aynı melanosit hattı kullanılarak gerçekleştirildi. Farklı birincil hücre hatları kullanıldığında, kültür koşullarının, konsantrasyonların ve işlem prosedürlerinin daha fazla ayarlanması gerekebileceğini unutmayın.

1. Hazırlıklar

NOT: tBHP tedavisine başlamak için, melanositlerin yeterli iyileşme ve birleşme sağlanması için en az üç gün önceden çözülmesi gerekir. Tedavi aşaması 4 gün sürer ve tohumlama günü 0. gün olarak belirlenir. Bu çalışmada kullanılan tüm malzemelerin detayları Malzeme Tablosu'nda verilmiştir.

  1. Kültür ortamını hazırlamak için, melanosit bazal ortamı ilgili büyüme faktörleriyle birleştirin. Her şişenin kapağını alevle ısıtarak içeriğini ortama ekleyin, böylece kirlenme minimuma endirilsin. Hazırlanan ortama %1 (v/v) PenStrep ekleyin ve 4 °C'de kullanana kadar saklayın.
  2. Tohumlamadan önce, DPBS'de soya fasulyesi tripsin inhibitörü seyreltilerek tripsin inhibitörü hazırlanır. Çözeltiyi 0,22 μm bir membrandan (aliquot) geçirin ve −20 °C'de saklayın. Çözüldükten sonra 10 güne kadar kullanılabilir.

2. Hücre Eritilmesi (Gün -3)

DIKKAT: İnsan hücreleriyle temas eden tüm materyaller biyolojik olarak kontamine olarak kabul edilmeli ve kurumsal biyogüvenlik yönergelerine uygun olarak bertaraf edilmelidir. Yaşlanmayı değerlendirmek için, büyüme durdurmayı, SA-β-gal aktivitesini ve ek moleküler belirteçleri değerlendiren tamamlayıcı testler kullanıyoruz. Burada, bu testlerin protokollerini ve bu yaşlanma göstergeleriyle çalışırken beklenen sonuçları sunuyoruz.

  1. 20 mL Dulbecco'nun Fosfat Tampon Salini (hücre kültürü derecesi) oda sıcaklığında 50 mL konik bir tüpe içine pipetleyin. Hücreleri içeren şişeyi eriyene kadar buz üzerinde tutun.
  2. Hücreleri içeren şişeyi açmadan önce kapağı alevle açın, vidayı açın ve yanlarını tekrar alevle ateşleyin, böylece olası kontaminasyonu önleyin.
  3. 500 μL DPBS hücreleri içeren şişeye aktarın. Hücreleri yavaşça pipetleyerek yukarı ve aşağı eritin, ardından tüm içeriği tüpe aktarın.
  4. Oda sıcaklığında 100 × g boyunca 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Ortaya çıkan pellet, bağışçının etnik kökenine bağlı olarak bej veya kahverengimsi (veya daha koyu) görünmelidir.
  5. 14 mL melanosit ortamı içeren bir T75 şişesi hazırlayın.
  6. Bir cam Pasteur pipetini alevle tutun (melanositlerle işlerken her seferinde alev), DPBS'yi dikkatlice aspire edin ve pelleti 1 mL ortamda yeniden süzülün.
  7. Daha önce hazırlanmış şişeye aktarın.
  8. 37 °C, %5 CO₂ sıcaklıkta kuluçka yapın ve her gün mikroskop altında gözlemleyin. En az her 48 saatte bir ortam değiştirin.
    NOT: Her kriyokonserve edilen şişede yaklaşık 1× 10-6 birincil insan melanositi bulunur. Tüm deneyler, 9. pasajdaki hücreler kullanılarak gerçekleştirildi.

3. Hücre tohumlama (0. Gün)

  1. Tohumlama gününde hücrelerin %80–90'ının birleşmesini sağlayın.
  2. Ortamı şişeden aspire edin ve DPBS ile iki kez yıkayın.
  3. Hücreleri 2 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyerek ve 37 °C, %5 CO₂ sıcaklıkta 5 dakika kuluçka geçirerek ayırın.
  4. Tam hücre ayrılmasını doğrulamak için şişeye nazikçe dokunun ve mikroskop altında gözlemleyin (gerekirse daha uzun kuluçka yapın).
  5. Tripsin inhibitörü hacminin 1,5 katı eklenerek reaksiyonu durdurun.
  6. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve DPBS ile son hacmi 10 mL'ye kadar seyreltirin.
  7. Hücre süspansiyonunu 100 × g ile 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
  8. Süpernatantı aspire edin ve ortamda istenen hacme yeniden süzülün.
  9. tBHP ile işlenmiş plakalar için, 10 cm tabak başına 6 × 105 hücre tohumu ekleyin. Kontrol plakaları için, her plaka için tohum 4 × 10-5 hücre ekleyin.
    NOT: tBHP ile işlenmiş plakalar için, deneyler için yeterli hücre bulunduğundan daha yüksek hücre yoğunluğu tohumlayın, çünkü işlem sırasında büyüme hızları kademeli olarak azalacaktır. Mikroskopi deneyleri için örtü kapaklarına hücreler ekilirse, örtü kağıtları 0,1 mg/mL poli-D-lizin ile kaplanmış ve hücre tohumlamadan önce tamamen kurutulmalıdır.
  10. Gece boyunca %5 CO₂ ile 37 °C'de kuluçka yapın. Kontrol plakaları için her 48 saatte bir ortamı değiştirin.

4. tBHP tedavisi (1–4. Gün)

  1. tBHP stokundan (DPBS veya ortamda seyreltilmiş) 10 mM çalışma çözeltisi hazırlayın.
    NOT: tBHP ışığa duyarlıdır: onunla çalışırken kapı kapatın. Çalışan çözüm, 4 °C'de düzgün şekilde saklandığında bir haftaya kadar kullanılabilir. Tedavi programı: 1. gün (tohumlamadan sonraki gün) tBHP maruziyetinin başlangıcını işaret eder. Melanositler günde iki kez, uygulamalar arasında en az 4 saat aralık ile tedavi edilir. Bu program 1. günden 4. güne kadar tekrarlanır ve toplamda 4 gün tedavi sürer. Seçilen tBHP konsantrasyonu ve tedavi programı, dermal fibroblastlarda daha önceki çalışmalardan uyarlanmıştır; burada düşük konsantrasyonlar yaşlanmayı tetiklemek için yeterliydi. Ancak birincil melanositlerde, sağlam yaşlanma indüksiyonu elde etmek için daha yüksek konsantrasyonlar gerekiyordu ve yaşlanma indüksiyonu ile hücre canlılığını dengeleyen titrasyon deneylerine dayanarak 100 μM tBHP optimal olarak belirlendi
  2. Her işlem için 1 saat boyunca hücrelere 100 μM tBHP ekleyin (Başlatmak için, uygun hacimde çalışan çözelti ekleyin ve sıvı ortama pipetlenmesini sağlayın.)
  3. Plakayı ileri geri ve yanlara hareket ettirerek tBHP'yi ortam boyunca eşit şekilde dağıtın.
    NOT: Dairesel hareketlerden kaçının çünkü bu, tBHP'nin ortamda düzensiz dağılımına neden olabilir.
  4. %5 CO₂ ile 37 °C'de tam olarak 1 saat kuluçka yapın.
  5. tBHP tedavisini sonlandırmak için ortamı aspire edin.
  6. Plakaları önceden ısıtılmış DPBS (37 °C) ile iki kez yıkayın.
  7. Tabaklara uygun miktarda taze ortam ekleyin.
  8. Hücrelerin inkubatörde en az 4 saat iyileşmesine izin verin ve ardından tedaviye başlanın.
  9. Bu işlemi aynı gün ikinci tedavi için tekrarlayın ve kalan günlerde devam edin. Tedaviyi tamamladıktan sonra hücreleri 9. güne kadar kültürde tutarak yaşlanma belirteçlerini değerlendirin.
  10. Kontrol plakalarını ve birleşiklerse geçidi izleyin.

5. Büyüme eğrisi analizi

  1. Tohumlama protokolüne uygun olarak tBHP ile işlenmiş hücreleri ve kontrolleri sayın.
  2. TBHP plakaları için 6 ×10-5 hücreden daha az sayarsanız aynı başlangıç yoğunluğunu veya tüm hücreleri yeniden tohumlayın.
  3. Kültürün 4., 9. ve 15. günlerinde hücre sayımları yapıldı.
  4. Büyüme eğrisini aşağıdaki formülle hesaplayın:
    lg (sayı) - log (tohum) / 0.301 + cPDL
    Sayı: Geçişin sonunda elde edilen hücre sayısı.
    tohum: Geçişin başında ilk olarak plakalanan hücre sayısı.
    cPDL: önceki pasajlardan taşınan kümülatif nüfus ikiye çıkma seviyesi.

6. SA-β-galaktosidaz aktivitesi

  1. 9. günde, hücreleri PBS'de iki kez yıkayıp %2 formaldehit ve %0,4 glutaraldehit ile sabitleyin.
  2. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.
  3. Sabit hücreleri, pH 6.0 (150 mM NaCl, 2 mM MgCl, 5 mM potasyum ferrisiyanür, 5 mM potasyum ferrosiyanid, 40 mM sitrik asit, 12 mM sodyum fosfat ve 1 mg/mL 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktozid (X-gal) boyanma çözeltisiyle kuluçka yapın.
  4. CO₂ yokken 37 °C'de 18 saat kuluçka geçirdikten sonra, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.
  5. Işık mikroskobu ile görüntü.
  6. Mikroskop altında mavi lekeli hücrelerin sayısını, mavi hücre sayısını sayarak ve bir alandaki toplam hücre sayısına bölerek niceliklerini ölçebilirsiniz. Sonuçları pozitif hücrelerin yüzdesi olarak ifade edin.

7. İmmünofluoresans boyama

DIKKAT: Formaldehit, glutaraldehit ve paraformaldehit içeren atıklar tehlikeli kimyasal atık olarak ele alınmalı ve kurumsal güvenlik düzenlemelerine uygun olarak bertaraf edilmelidir.

  1. 0.1 mg/mL poli-D-lizin ile önceden kaplanmış kapak örtülerinde kültürlenmiş hücreler kullanın.
  2. 9. gün hücreleri iki kez yıkayın, ardından %4 paraformaldehit ile 15 dakika sabitleyin.
  3. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.
  4. PBS'de %0,3 Triton-X ve %0,1 sodyum sitrat kullanarak permeabilize olun.
  5. Oda sıcaklığında PBS-T'de %1 BSA ile 30 dakika blokla.
  6. Hücreleri, nemlendirilmiş bir odada 4 °C sıcaklıkta gece boyunca kalıcı DNA hasar yanıtını tespit etmek için primer antikor γH2AX ile kuluçka altına alın.
  7. Ertesi gün PBS ile iki kez yıkayın.
  8. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca ikincil bir antikor uygulayın.
  9. Çekirdekleri isterse DAPI ile boya.
  10. PBS-T ile iki kez yıkayın, ardından PBS ile iki yıkama ve ddH2O ile iki yıkama.
  11. Örtükleri monte edin ve görüntülemeden önce tamamen kurumasına izin verin.
  12. ImageJ yazılımı kullanarak ortalama floresans yoğunluğu ve/veya γH2AX odaklarını analiz edin.

8. RNA izolasyonu ve RT-qPCR

DIKKAT: β-merkaptoetanol son derece toksiktir ve buharlı bir davlumbonla tutulmalıdır. β-merkaptoetanol içeren atıklar tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edilmelidir.

  1. 9. günde, hücreleri 2 mL tripsin-EDTA kullanarak tripsinleştirin.
  2. Reaksiyonu durdurun, tripsin inhibitörü miktarının 1,5 katı uygulanır.
  3. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 100 x g hassasiyetinde 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
  4. Süpernatantı dikkatlice aspire edin.
  5. Liz hücre pelletlerini, %1 β-merkaptoetanol içeren 350 μL RLT tamponunda yeniden süzülerek elde edilir.
  6. RNA'yı kolon tabanlı RNA arıtma kiti kullanarak izole edin.
  7. RNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre (260 nm) ile belirleyin.
  8. cDNA sentezi için, standart bir ters transkripsiyon karışımı (RT tamponu, dNTP'ler, rastgele primerler, ters transkriptaz ve RNase inhibitörü dahil) kullanılarak toplam 10 μL reaksiyon hacminde ters transkripsiyon için 1 μg RNA kullanılır ve ardından üreticinin talimatlarına göre termal döngü koşulları uygulanır.
  9. SASP faktörleri için RT-qPCR yapın
    NOT: Seçilen SASP faktörleri (IL-8, IL-6 ve MMP-1), yaşlanmaya bağlı sekretör fenotipin iyi bilinen bileşenlerini temsil eder ve cilt biyolojisiyle ilgililiklerine, inflamatuar sinyal ve ekstraselüler matriks yeniden modellenmesi dahil olmak üzere seçilmiştir
    IL-6 (Ön: 5' AAGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTA 3' Rev: 5' TGTCCTGCAGCCACTGGTTC 3')
    IL-8 (Ön: 5' ACCGGAAGGAACCATCTCAC 3' Rev: 5' AAACTGCACCTTCACACAGAG 3')
    MMP-1 (Ön: 5' CATCGTGTTGCAGCTCATGA 3' Devir: 5' ATGGGCTGGACAGGATTTTG 3')
    GAPDH (Iç: 5' GAGTCAACGGATTTGTCGT 3' Devir: 5' GATCTCGCTCCTGGAAGATG 3')
  10. ΔΔCt yöntemiyle ilgili mRNA ifadesini ve ev geni GAPDH'ye normalizasyonu ile analiz edin.

9. Protein izolasyonu ve Western Blot

  1. 9. günde, protein lizatları toplayın.
  2. Orta amutla aspirasyon yapın ve plakaları soğuk DPBS ile iki kez yıkayın.
  3. Liz hücreleri, 150 μL RIPA tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, %1.5 NP-40, %0.5 sodyum deoksikolat, %0.1 SDS ve 2 mM EDTA) eklendikten sonra mekanik olarak hücre kazıyıcı kullanılarak proteaz inhibitörleriyle takviye edilip 1.5 mL bir tüpe aktarılır.
  4. Üç döngü dondurma ve eritme işlemi yapın, ardından buz üzerinde 30 dakikalık kuluçka yapın.
  5. Santrifüj ile 9600 x g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca koyun.
  6. BCA testi kullanarak süpernatantın protein konsantrasyonunu belirleyin.
  7. Poliakrilamid jeller üzerinde eşit miktarda (20 μg) protein ayırın ve aktive PVDF membranlarına aktarılır.
  8. TBS-T'de %5 yağsız sütte membranları bloklayın.
  9. Primer antikor pRB ve LaminB1 ile gece boyunca 4 °C'de kuluçka yapın.
  10. Ertesi gün, zarları TBS-T'de 3 kez yıkayın.
  11. HRP ile konjuge edilmiş uygun ikincil antikorlarda oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın.
  12. Proteinleri kemilyünüminesans ile tespit edin ve densitometrik analiz yapın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

tBHP tedavisi, insan yenidoğan melanositlerinde büyüme durmasına neden olur.
tBHP tedavisi, tedavi edilmeyen kontrollere kıyasla melanosit çoğalmasını engeller (n = 3) (Şekil 2A). 9. güne gelindiğinde, tedavi edilen hücreler sadece 1.4 cPDL'ye ulaşırken, kontrol hücreleri 3.1 cPDL'ye ulaşır. Bu ayrışma zamanla artar; tedavi edilen melanositler 15. güne kadar 1.9 cPDL platosuna yaklaşırken, kontroller neredeyse 5.1 cPDL'ye ulaşmaya devam e...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, tBHP kullanarak insan neonatal melanositlerinde stres kaynaklı erken yaşlanma (SIPS) indüksiyonu için standartlaştırılmış bir yaklaşım kurmakta ve özellikle bu hücre tipinde yaşlanma incelenmesi için sağlam bir model sunmaktadır. Proliferasyon, morfoloji, SA-β-gal aktivitesi, DNA hasar belirteçleri ve SASP bileşenlerindeki tutarlı değişiklikler, indüklenen fenotipi destekler. Melanositlere odaklanarak, cilt fizyolojisi ve pigmentasyon bozukluklarındaki temel rollerine rağmen...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarlar belirtmemektedir. Lieve Declercq, Proya Europe ile bağlantılıdır; ancak şirket, çalışma tasarımı, veri toplama, analiz, yorumlama veya yayınlama kararı üzerinde hiçbir etkisi olmadı. Yazarlar ayrıca yapay zeka (YZE) araçlarının yalnızca dil düzenleme ve metin iyileştirmesine yardımcı olmak için kullanıldığını belirtmektedir. Tüm bilimsel içerik, deneysel tasarım ve veri yorumu yazarlar tarafından geliştirilip doğrulandı.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Tiroler Wissenschaftsfonds (ZAP746010, F.33287/10-2021, F.50279/7-2024) tarafından finansman sağlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.22 µm membrane filterMerck SLGVR33RS
1 M sitrik asit Merck K91567844aq. dest.'de hazırla
1 M MgCl2MerckA649033aq. dest.'de hazırla
1 M Na2HPO4MerckK56036736aq. dest.'de hazırla
10 M NaOHLab Honeywell30620aq. dest.'de hazırla
37% formaldehitSigma252549
4% paraformaldehitCarlRoth0335.3
5 M Sodyum Klorür SigmaS3014aq. dest.'de hazırla
50% glutaraldehitSigmaG6403
5-Brom-4-Klor-3-indol-β-D-Galaktopiranozid (X-Gal)SigmaB9146
Alexa Fluor-konjuge ikincil antikor 2 mg/mLInvitrogenA11008
BSA (bovin serum albümini)SigmaA7030
Kimyasal ışık veren substratSigmaWBKLS0500
Costar CellLifter Corning3008
Hücre kültürü/mikroskopi için kapak camıEprediaCB00200RA120MNZ0
DermaLife Bazal OrtamCellSystemsLM-0004
DermaLife M Melanosit Kiti CellSystemsLS-1041
Dulbecco's Fosfat Tamponlu Salin SigmaD8537
İnsan neonatal melanositlerCellSystemsFC-0023
LaminB1 antikoru (tavşan)AbcamAB160485% BSA içinde 1:1000 seyrelt
DAPI içeren montaj maddesiAbcamAB104139
Penisilin-Streptomisin çözeltisi SigmaP4333
Poliakrilamid gradyan jelleriBio-Rad456-8095
Poli-D-Lizin, 0.1 mg/mL GibcoA38904-01
Potasyum ferisiyanürSigmaP8131
Potasyum ferrosiyanürSigmaP-9387
pRB antikoru (tavşan)CellSignalling930855% BSA içinde 1:1000 seyrelt
Protaze inhibitör kokteylikendi hazırladığımN/A500 mM NaF; 2 µg/ml Aprotinin; 1 mM PMSF; 1 mM aktive Na-Ortovanadat
RIPA tamponu kendi hazırladığımN/Aiçeren: 50 mM Tris-HCl; 1% NP-40; 0.5% Na-deoksikolat; 0.1% SDS; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA
RLT tamponuQiagen1015762RNeasy Mini Kit'te dahil 
RNeasy Mini KitQiagen74106
Yağsız süt tozu (TBS-T içindeki %5 süt)Sigma70166
Sodyum sitrat (%0.1 çözelti için)SigmaS4641
Soya fasulyesi tripsin inhibitörü, 0.5 mg/mL Thermofisher17075-029
tert-Butil hidroperoksit (tBHP)Sigma458139
Triton X-100 (%0.3 çözelti için)SigmaT9284
Tripsin-EDTA çözeltisiSigmaT3924
β-merkaptoetanolCarlRoth4227.3
γH2AX antikoru (tavşan)CellSignalling2577S1:200 seyrelt 

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hussein, R. S., Bin Dayel, S., Abahussein, O., et al. Influences on skin and intrinsic aging: biological, environmental, and therapeutic insight. J Cosmet Dermatol. 24, e16688 (2025).
  2. Dorf, N., Maciejczyk, M. Skin senescence-from basic research to clinical practice. Front Med (Lausanne). 11, 1484345 (2024).
  3. Grenier, A., Morissette, M. C., Rochette, P. J., et al. The combination of cigarette smoke and solar rays causes effects similar to skin aging in a bilayer skin model. Sci Rep. 13, 17969 (2023).
  4. Varani, J., Dame, M. K., Rittie, L., et al. Decreased collagen production in chronologically aged skin: roles of age-dependent alteration in fibroblast function and defective mechanical stimulation. Am J Pathol. 168, 1861-1868 (2006).
  5. Zhang, S., Duan, E. Fighting against skin aging: the way from bench to bedside. Cell Transplant. 27, 729-738 (2018).
  6. Hussen, N. H. a., Abdulla, S. K., Ali, N. M., et al. Role of antioxidants in skin aging and the molecular mechanism of ROS: a comprehensive review. Aspects Mol Med. 5, 100063 (2025).
  7. Addor, F. A. S. Beyond photoaging: additional factors involved in the process of skin aging. Clin Cosmet Investig Dermatol. 11, 437-443 (2018).
  8. Mucha, M., Skrzydlewska, E., Gęgotek, A. Natural protection against oxidative stress in human skin melanocytes. Commun Biol. 8, 1283 (2025).
  9. Hughes, B. K., Bishop, C. L. Current understanding of the role of senescent melanocytes in skin ageing. Biomedicines. 10, 3111 (2022).
  10. Kamiński, K., Kazimierczak, U., Kolenda, T. Oxidative stress in melanogenesis and melanoma development. Contemp Oncol (Pozn). 26, 1-7 (2022).
  11. Jiménez-Cervantes, C., Martínez-Esparza, M., Pérez, C., et al. Inhibition of melanogenesis in response to oxidative stress: transient downregulation of melanocyte differentiation markers and possible involvement of microphthalmia transcription factor. J Cell Sci. 114, 2335-2344 (2001).
  12. Dańczak-Pazdrowska, A., Gornowicz-Porowska, J., Polańska, A., et al. Cellular senescence in skin-related research: targeted signaling pathways and naturally occurring therapeutic agents. Aging Cell. 22, e13845 (2023).
  13. Green, K. J., Pokorny, J., Jarrell, B. Dangerous liaisons: loss of keratinocyte control over melanocytes in melanomagenesis. Bioessays. 46, e2400135 (2024).
  14. Ali, L., Al Niaimi, F. Pathogenesis of melasma explained. Int J Dermatol. 64, 1201-1212 (2025).
  15. Low, E., Alimohammadiha, G., Smith, L. A., et al. How good is the evidence that cellular senescence causes skin ageing. Ageing Res Rev. 71, 101456 (2021).
  16. Chin, T., Lee, X. E., Ng, P. Y., et al. The role of cellular senescence in skin aging and age-related skin pathologies. Front Physiol. 14, 1297637 (2023).
  17. Gerasymchuk, M., Robinson, G. I., Kovalchuk, O., et al. Modeling of the senescence-associated phenotype in human skin fibroblasts. Int J Mol Sci. 23, 7124 (2022).
  18. Zimmermann, T., Pommer, M., Kluge, V., et al. Detection of cellular senescence in human primary melanocytes and malignant melanoma cells in vitro. Cells. 11, 1489 (2022).
  19. Tang, J., Li, Q., Cheng, B., et al. Primary culture of human face skin melanocytes for the study of hyperpigmentation. Cytotechnology. 66, 891-898 (2014).
  20. Kučera, O., Endlicher, R., Roušar, T., et al. The effect of tert-butyl hydroperoxide-induced oxidative stress on lean and steatotic rat hepatocytes in vitro. Oxid Med Cell Longev. 2014, 752506 (2014).
  21. Wedel, S., Martic, I., Hrapovic, N., et al. tBHP treatment as a model for cellular senescence and pollution-induced skin aging. Mech Ageing Dev. 190, 111318 (2020).
  22. Rabin, D. M., Rabin, R. L., Blenkinsop, T. A., et al. Chronic oxidative stress upregulates drusen-related protein expression in adult human RPE stem cell-derived RPE cells: a novel culture model for dry AMD. Aging (Albany NY). 5, 51-66 (2013).
  23. Shakel, Z., Costa Lima, S. A., Reis, S. Strategies to make human skin models based on cellular senescence for ageing research. Ageing Res Rev. 100, 102430 (2024).
  24. Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. The melanocyte lineage in development and disease. Development. 142, 620-632 (2015).
  25. Goff, P. S., Castle, J. T., Kohli, J. S., et al. Isolation, culture, and transfection of melanocytes. Curr Protoc. 3, e774 (2023).
  26. Martic, I., Wedel, S., Jansen-Dürr, P., et al. A new model to investigate UVB-induced cellular senescence and pigmentation in melanocytes. Mech Ageing Dev. 190, 111322 (2020).
  27. Victorelli, S., Lagnado, A., Halim, J., et al. Senescent human melanocytes drive skin ageing via paracrine telomere dysfunction. EMBO J. 38, e101982 (2019).
  28. Zhang, H., Davies, K. J. A., Forman, H. J. Oxidative stress response and Nrf2 signaling in aging. Free Radic Biol Med. 88, 314-336 (2015).
  29. Birch, J., Gil, J. Senescence and the SASP: many therapeutic avenues. Genes Dev. 34, 1565-1576 (2020).
  30. Kang, H. Y., Ortonne, J. P. What should be considered in treatment of melasma. Ann Dermatol. 22, 373-378 (2010).
  31. Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., et al. ROS, cell senescence, and novel molecular mechanisms in aging and age-related diseases. Oxid Med Cell Longev. 2016, 3565127 (2016).
  32. Almeida, F. V., Douglass, S. M., Fane, M. E., et al. Bad company: microenvironmentally mediated resistance to targeted therapy in melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 32, 237-247 (2019).
  33. Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochem Photobiol. 84, 539-549 (2008).
  34. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., et al. The hallmarks of aging. Cell. 153, 1194-1217 (2013).
  35. Videira, I. F., Moura, D. F., Magina, S. Mechanisms regulating melanogenesis. An Bras Dermatol. 88, 76-83 (2013).
  36. Ratz-Łyko, A., Arct, J. Resveratrol as an active ingredient for cosmetic and dermatological applications: a review. J Cosmet Laser Ther. 21, 84-90 (2019).
  37. Xu, M., Pirtskhalava, T., Farr, J. N., et al. Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age. Nat Med. 24, 1246-1256 (2018).
  38. Ogrodnik, M., Evans, S. A., Fielder, E., et al. Whole-body senescent cell clearance alleviates age-related brain inflammation and cognitive impairment in mice. Aging Cell. 20, e13296 (2021).
  39. Hernandez-Segura, A., de Jong, T. V., Melov, S., et al. Unmasking transcriptional heterogeneity in senescent cells. Curr Biol. 27, 2652-2660.e4 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Melanosit SenesansOksidatif StresStres Kaynakl SenesansSenesans Mark rleriCilt Ya lanmasSA Beta GalaktosidazPigmentasyon BozukluklarRedoks Homeostaz

İlgili makaleler