Yöntem makalesi

Xenopus Mini Embriyoları Üretmek İçin Fiziksel Manipülasyon

212 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70602

⸱

10 Nisan 2026

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

Bu makalede

Özet

Xenopus laevis 1-hücreli embriyolardan mini embriyolar yapmak için fiziksel bir daraltma yöntemini açıklıyoruz.

Özet

Erken embriyogenezin belirleyici bir özelliği, bireysel hücre boyutunun hızlı ve üstel azalmasıdır; oysa genel embriyo hacmi sabit kalır. Nükleositoplazmik (N:C) oranı, erken embriyogenez için gerekli olan hücresel ve moleküler aktivitelerin düzenlenmesinde kritik bir rol oynar. Bu nedenle, embriyo boyutunun fiziksel manipülasyonu, bu gelişimsel mekanizmaların araştırılmasının önemli bir yoludur. Xenopus laevis'in erken embriyolarının büyük boyutu (~ 1,2 mm çapı) ve yüksek gelişimsel plastisitesi, onları gelişimin düzenleyici mekanizmalarını sorgulamak için fiziksel diseksiyon ve manipülasyon için ideal bir model yapar. Burada, 1-hücreli Xenopus laevis embriyolarını saç düğümleriyle daraltarak değişmiş sitoplazmik hacmi ve N:C oranına sahip mini embriyolar üretmek için bir yaklaşım tanımlıyoruz. Ortaya çıkan mini embriyolar, hücre boyutu küçülmesi ve N:C oranının büyümesiyle doğrudan indüklenen erken zigotik genom aktivasyonunu (ZGA) başlattığı gösterilmiştir. Bu mini embriyolar, diğer embriyonik sistemlere genelleştirilebilir ve böylece erken embriyo gelişiminin boyut aracılı mekanizmalarını analiz etmek için benzersiz ve güçlü bir araç sağlar.

Giriş

Erken embriyogenezin en dikkat çekici özelliklerinden biri, sabit hacmi koruyan bir embriyo içindeki bireysel hücre boyutunun üstel olarak azalmasıdır. Hızlı DNA sentezi ve hücre boyutu küçülmesi, nükleositoplazmik oranın (N:C oranı) artmasına yol açar; bu oran, model embriyonik sistemlerde zigotik gen transkripsiyonu, hücre döngüsü uzaması ve hücre hareketliliği 1,2,3,4 gibi orta blastula geçişinin (MBT) birkaç belirgin aktivitesinin düzenlenmesinde önemli rol oynar . DNA ploidisini değiştirerek N:C oranının manipülasyonu, erken embriyogenezde fonksiyonel önemini çeşitli modelsistemlerinde desteklemektedir 3,4,5,6.

Embriyo boyutunun fiziksel manipülasyonu, erken embriyonik gelişimde düzenleyici mekanizmaları incelemek için önemli birtekniği temsil eder 7. Erken fare embriyolarında N:C oranını değiştiren aspirasyon yoluyla sitoplazmik çıkarma, erkensıkıştırmaya neden olur 8. Ayrıca, zebrafish embriyosunun boyutunu kesmekle azaltmak, somit pullanmasının yeni bir gradyan temellimekanizmasını ortaya çıkardı 9. Ayrıca, Xenopus embriyolarında sitoplazmik hacmi azaltmak, N:C oranına bağlı hücre döngüsüdinamiklerini ortaya çıkardı 10. Önemli olarak, hücre boyutunu küçülterek Xenopus mini embriyoları üreterek ve tek hücrelerde 5-etinil-uridin (5-EU) ile yeni başlayan transkriptleri etiketleyerek, hücre boyutunun azaltılmasının doza bağlı olarak zigotik genom aktivasyonunu (ZGA) indüklediğinigösterdik 11. Bu sonuçlar, hücre boyutunun erken embriyogenezdeki kritik rolünü desteklemektedir.

Burada, saç düğümleri kullanılarak fiziksel manipülasyon yoluyla Xenopus laevis mini embriyolarının oluşturulması için ayrıntılı bir prosedürü açıklıyoruz (Şekil 1)10,11. Bu yaklaşım, Newport ve Kirschner'in (1982) erken Xenopus embriyoları 1'de saç döngüsü daraltmasının temel kullanımına dayanır ve mini embriyoların deneysel araç olarak üretilmesi için net ve güvenilir bir protokol sağlar. Ayrıca, bu yöntem diğer embriyoniksistemler 7 için de geçerlidir; bu da erken embriyogenezin yeni mekanizmalarının ortaya çıkarılmasını kolaylaştırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Burada açıklanan hayvan çalışmaları, Güney Carolina Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Malzemelerin hazırlanması

  1. Çözümler hazırlanıyor
    1. 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl2 ve 40 mM CaCl2 karıştırarak 20× MMR hazırlayın. NaOH ile pH'ı 7.8'e ayarlayın. Otoklav yapıp oda sıcaklığında depolayın.
    2. %3 yoğunluk gradyan ortamı (ağırlık/hacim) çözeltisi hazırlanarak 1,5 g yoğunluk gradyan ortamını 50 mL 0,5× MMR ile karıştırın. Polimer çözünene kadar manyetik karıştırma çubuğuyla nazikçe karıştırın. Kullanıma kadar 4 °C'de tutun.
    3. %1 agaroz jeli, 0,5 g agarozu 50 mL 0,1× MMR ile karıştırarak 60 mm Petri kabında hazırlayın. Mikrodalga fırında ısıtarak agarozu çözür, ardından 5 ml agaroz ekleyerek 60 mm'lik Petri kabının dibini ince bir tabaka halinde kaplayın.
  2. Embriyoları daraltmak için saç düğümlerinin hazırlanması
    1. İnce tüyler al ve ~5 cm diline kes.
    2. Saçın bir ucunu yaklaşık ~1 cm derinliğinde bir P10 ucuna cımbızla yerleştirin.
    3. Bir kaşığa mum koyup mumu eritmek için ısıtın. Saça bağlı P10 ucunu hızla muma batırın ve 1 dakika kurumasına izin verin. Saçın P10 ucunun ucunda sabit olduğundan emin olun.
    4. Bir cımbız kullanarak dikkatlice saçın üst el düğümünü yapın. Halkanın boyutunu ~1.5 mm olarak ayarlayın. Gerekirse çıkıntıyı kısaltın. Düğümü ileride kullanmak için bir kenara bırak.
    5. Yukarıdaki adımları tekrarlayarak gerektiğinde daha fazla saç düğümü yapın.

2. Xenopus mini embriyoları yapmak

  1. Xenopus embriyolarını elde etmek için standart bir protokolü takip ederek in vitro fertilizasyon (IVF) uygulanabilir (örneğin, bkz. Sive ve ark., 2007)12). Embriyo 0.1× MMR içinde olmalı ve kullanıma hazır olmalı.
  2. Erken embriyoların tek hücrelerinde ZGA'yı görselleştirmek ve düzenleyici mekanizmalarını incelemek için, 1-hücre evresi embriyolara 5-etinil-üridin (5-EU) mikroenjeksiyonu yapılarak yeni başlamıştranskriptleri metabolik olarak etiketlemek, 11,13 ve ardından aşağıdaki işlemlere geçilmelidir.
  3. Embriyolar döllenme sonrası ~1 saat (hpf) olduğunda, ~20 embriyoyu 60 mm'lik Petri kabında (%1 agaroz jeliyle kaplı) plastik transfer pipeti kullanarak ~15 mL %3 yoğunluk gradyan ortamı/0,5× MMR içerir.
  4. Bir elde cımbız kullanarak embriyoyu stereomikroskop altında yaklaşık ~45–60 derece döndürerek bitki kutbuna (soluk yarımküre) erişin. Eğik embriyoyu cımbızla tutun ve diğer elinizde 30 G'lik bir iğne kullanarak bitki direğini dikkatlice delin. Embriyoya nazikçe bastırarak biraz sitoplazma salın.
  5. Embriyoda P10 ucunda monte edilen bir saç düğümünü dikkatlice kapatın ki hayvan direği (koyu yarımküre) saç düğümünün içinde olsun. İstenilen mini embriyo boyutuna göre düğümün konumunu ayarlayın.
  6. Bir elinizle P10 pipetini tutun, diğer elinizle cımbız kullanarak düğümün iki üst ucunu zıt yönlere çekin. Saç düğümü embriyoda, hayvan kutbu (sağlam) ile bitki kutbu (sitoplazma salgılanarak) arasında sıkılaşır. P10 ucuna takılı noktadaki saç düğümünü kesin.
  7. İstenilen miktarda mini embriyo oluşturmak için yukarıdaki 2.4–2.6 adımları tekrarlayın.
  8. Embriyolar %3 yoğunluk gradyan ortamında/0,5× MMR'de ~1–2 saat boyunca kalsın. Daha sonra embrayoları rahatsız etmeden P1000 pipetiyle ortamı çıkarın ve 15 mL 0.1× MMR ile yenileyin.
  9. Embriyoların istenen evrelere geçmesine izin verin, ardından cımbızla mini embriyolardaki düğümleri dikkatlice çıkarın.
  10. İstenilen analiz için embriyoları toplayın, örneğin ZGA'yı tek hücrelerdegörselleştirmek 11,13.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Xenopus laevis embriyoları 1-hücre aşamasında, yukarıda açıklandığı gibi saç düğümleriyle daralmıştır. ~Aşama 9'daki kontrol ve mini embriyolar (23 °C'de 8,5 hpf) stereomikroskop altında görüntülendi. Şekil 2'de gösterildiği gibi, bazı mini embriyoların hacmi kontrol embriyolarınınkinin ~1/3'üdür. Bu sonuç, erken Xenopus embriyolarının mini embriyolar oluşturmak için manipüle edilebileceğini ve erken embriyogenezde hücrebo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, Xenopus'ta 1-hücre evresi embriyoları saç düğümleriyle fiziksel olarak daraltarak mini-embriyolar üretme yöntemini tanımlıyoruz. Bu yaklaşım, modelembriyo 11'de hücre boyutunun azaltılmasının ZGA'yı tetiklediğine doğrudan kanıt sunar.

Bu protokolün birkaç yönü, mini embriyoları başarılı bir şekilde üretmek için kritiktir. Saç düğümleri yapmak için ince ve dayanıklı saçlar, tercihen bebeklerin saçları kullanmak önemlidir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazar, rekabet eden bir çıkar olmadığını belirtir.

Teşekkürler

Pennsylvania Üniversitesi'ndeki Matthew Good laboratuvarına eğitim verdikleri için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, kısmen Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü (R03HD105802) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
30-G iğneBD Medical305128Embriyoları delmek için
60 mm Tek Kullanımlık Petri KaplarıVWR25384-092Embriyoların kuluçkalanması için
ACCU-SCOPE 3075 Zoom StereomikroskoplarıVWR470351-130Embriyoları görselleştirmek için
AgaroseSigma-AldrichA-9414Petri kaplarının kaplanması için
Dumont cımbız, Stil 5Elektron Mikroskopi Bilimleri72701-DEmbriyoları ayarlamak ve tutmak için
Ficoll 400Sigma-AldrichGE17-0300-10Embriyoların kuluçkalanması için
TipOne Pipet Uç, 10 ve mikro; LUSA Scientific1111-3700Saç düğümlerini monte etmek için
Mum Bloğu, SiyahCarolina Biyolojik Tedarik Şirketi.974228Saç düğümlerini monte etmek için

Kaynaklar

  1. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
  2. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
  3. Kane, D. A., Kimmel, C. B. The zebrafish midblastula transition. Development. 119 (2), 447-456 (1993).
  4. Lu, X., Li, J. M., Elemento, O., Tavazoie, S., Wieschaus, E. F. Coupling of zygotic transcription to mitotic control at the Drosophila mid-blastula transition. Development. 136 (12), 2101-2110 (2009).
  5. Jevtic, P., Levy, D. L. Both nuclear size and DNA amount contribute to midblastula transition timing in Xenopus laevis. Sci Rep. 7 (1), 7908(2017).
  6. Edgar, B. A., Kiehle, C. P., Schubiger, G. Cell cycle control by the nucleo-cytoplasmic ratio in early Drosophila development. Cell. 44 (2), 365-372 (1986).
  7. Chen, H., Qian, W., Good, M. C. Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development. Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).
  8. Lee, D. R., Lee, J. E., Yoon, H. S., Roh, S. I., Kim, M. K. Compaction in preimplantation mouse embryos is regulated by a cytoplasmic regulatory factor that alters between 1- and 2-cell stages in a concentration-dependent manner. J Exp Zool. 290 (1), 61-71 (2001).
  9. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145 (11), dev161257(2018).
  10. Clute, P., Masui, Y. Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos. Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).
  11. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  12. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. 2007, pdb prot4737(2007).
  13. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  14. Meaders, J. L., Burgess, D. R. Microtubule-based mechanisms of pronuclear positioning. Cells. 9 (2), 505(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Embriyo Boyutu Manip lasyonuN kleositoplazmik OranErken EmbriyogenezGenom AktivasyonuFiziksel S k t rmaSitoplazmik Hacimn Vitro FertilizasyonStereo MikroskopiH cre Boyutu Reg lasyonu

İlgili makaleler