Hücre Biyolojisi Uygulamaları İçin Tanımlanmış Sertlikte Poliakrilamid ve Silikon Ekstrasellüler Matris Substratlarının Üretimi

Özet

Hücre dışı matriks (ECM) sertliği hücresel davranışın temel düzenleyicisi olsa da, altta yatan algılama ve transdüksiyon mekanizmaları belirsizdir. Bunu ele almak için, hücre-ECM çapraz konuşmasını anlamamızı ilerletmek için ayarlanabilir sertliğe sahip poliakrilamid ve silikon bazlı substratlar oluşturmak için protokoller sunuyoruz.

Özet

Ekstraselüler matriks (ECM), hücre davranışının kritik bir düzenleyicisidir; ECM sertliği, hücresel sinyal, morfoloji ve kaderi yöneten önemli mekanik bir işaret olarak hizmet verir. Ancak, sertliğe bağlı hücresel yanıtların deneysel araştırması, hassas ayarlanabilir mekanik özelliklere sahip tekrarlanabilir, maliyet etkin ve erişilebilir kültür platformlarının varlığıyla sıklıkla sınırlıdır. Bu protokol, ayarlanabilir sertlikte ECM substratları üretmek için poliakrilamit (PA) ve silikon bazlı yöntemleri tanımlar. Prosedürler, fizyolojik olarak ilgili sertlik aralığında tutarlı hücre yapışmasını sağlamak için substrat hazırlığı, yüzey fonksiyonelleştirmesi ve ECM protein konjugasyonunu özetler. PA tabanlı substratlar, protein ve RNA ekstraksiyonu ile yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme dahil olmak üzere sonraki biyokimyasal testlerle uyumludur. Silikon bazlı substratlar, temel zarda hücre-ECM etkileşimlerinin görselleştirilmesini sağlayan toplam iç yansıtma floresansı (TIRF) mikroskopisi için optimize edilmiştir. Ayrıca, yumuşak substratlar, tutarlı bir görüntüleme düzleminde konumlanmış küreoid kültürleri destekleyecek şekilde uyarlanabilir ve tutarlı görüntü elde etmeyi kolaylaştırır. Bu yöntemler, ECM sertliğinin hücresel süreçleri nasıl düzenlediğini sistematik olarak incelemek için sağlam, maliyet etkin ve tekrarlanabilir platformlar sunar ve hem fizyolojik hem de hastalık bağlamında hücre-ECM çapraz konuşmasına mekanik bir bakış açısı kazandırır.

Giriş

Ekstrasellüler matriks (ECM), dokuların mekanik özelliklerini tanımlayan ve biyolojik işlevlerini destekleyen temel bir yapısal ve biyokimyasal iskeledir. Örneğin, akciğerler ve arterler gibi elastik dokular, solunum sırasında tekrarlanan esneklik-geri tepme döngüleri için gerekli mekanik dayanıklılığı sağlayan kollajen ve elastin bazlı ECM ile zenginleştirilir. Buna karşılık, merkezi sinir sistemi glikozaminoglikan açısından zengin ECM içerir ve bu da nöronal farklılaşma ve sinyal iletimi için optimize edilmiş yüksek uyumlu bir ortam^{oluşturur 1}. Vücuttaki çeşitli dokularda, doku sertliği beyin ve akciğer gibi yumuşak dokularda yüzlerce paskaldan tendon ve kemikte megapaskal ve gigapaskal sertlik seviyelerine kadar (sırasıyla ^2,3) kadar uzanır. Bu mekanik farklılıklar sadece yapısal değildir, aynı zamanda hücre davranışının düzenlenmesinde^{kritik bir rol oynar 4,5}. Örneğin, mezenkimal kök hücreler sertliğe bağlı soy spesifikasyonuna tabi tutulur; yumuşak substratlarda nöronal kaderleri, ara substratlarda miyojenik kaderleri ve sert substratlarda osteojenik kaderleri^{benimserler 6}. ECM sertliğindeki patolojik değişiklikler de anormal hücresel yanıtları tetikleyebilir ve hastalığın başlangıcı ile ilerlemesine katkıda^{bulunabilir 7,8,9}. Benzer şekilde, hücrelerin çevresindeki ECM özelliklerindeki değişiklikler organel fonksiyonlarını ve çeşitli hücre davranışlarını^{da değiştirir 10,11}. ECM'nin sinyal izlemesi, organel fonksiyonu ve hastalık patogenezini yönlendirmedeki önemi kabul edilse de, hücrelerin ECM ipuçlarını algılayıp biyokimyasal sinyallere dönüştürme mekanizmaları hâlâ tam olarak anlaşılmamaktadır.

Hücre-ECM çapraz konuşmasının anlaşılmasındaki ilerleme, ECM özellikleri üzerinde hassas kontrol sunan ve standart biyokimyasal testler ve görüntüleme iş akışlarıyla tam uyumlu kalan deneysel platformların sınırlı bulunabilirliği nedeniyle kısmen engellenmiştir. Ayrıca, hücre-ECM etkileşimlerini incelemek genellikle teknik olarak zor olarak algılanır; çünkü malzeme bilimi, hücre biyolojisi ve biyomühendisliği kapsayan disiplinlerarası uzmanlık gerektirir. Bu yöntem, çoğu ıslak laboratuvar ortamında kolayca hazırlanabilen, tanımlanmış mekanik özelliklere sahip PA ve silikon tabanlı ECM substratları üretmek için adım adım protokoller sunarak bu zorlukları ele almayı amaçlamaktadır.

Ayarlanabilir sertliğe sahip PA hidrojeller mekanik biyolojinin temel unsurlarıdır; ancak faydaları genellikle ECM konjugasyonu için yüksek reaktif maliyeti, tutarsız yüzey işlevselleştirmesi ve büyük ölçekli biyokimyasal iş akışlarıyla kötü uyumluluk nedeniyle sekteye uğrar. Ayrıca, farklı sertlikteki substratlar üzerinde örnek toplama ve görüntüleme için pratik ve standart yaklaşımlar iyi kurulmamıştır. Bu darboğazlar, dört temel yenilikle karakterize edilen tarif edilen PA jel platformumuzla giderilebilir: (i) önemli maliyet azaltımı, (ii) tekrarlanabilir fonksiyonel kimya, (iii) yeniden kullanılabilir donanım yoluyla ölçeklenebilir üretim ve (iv) birçok geleneksel hücre biyolojisi ve biyokimyasal testle sorunsuz entegrasyon. Bu yaklaşım, farklı akrilamid ve bisakrilamid oranlarını kullanarak farklı mekanik özelliklere sahip hidrojeller üretir (Tablo 1). PA jelleri inerttir ve doğrudan ECM proteinlerine konjuge edemez. Bu nedenle, UV başlatılan serbest radikal polimerizasyon reaksiyonu, PA jellerinin yüzeyine di(trimetilolpropan) tetraakrilat, akrilik asit N-hidroksisuçinimid esteri (NHS-akrilat) ve bisakrilamid içeren ince, çapraz bağlantılı bir ağı konjuge etmek için kullanılır (Şekil 1). Bu ağ, ECM proteinleri için çift etkili bir yapışkan yüzey oluşturur: NHS-akrilat, ECM proteinleri için stabil kovalent sabitleme sağlarken, tetraakrilat ise uniform ECM protein adsorpsiyonunu^{kolaylaştırır 12}. Ayrıca, bu substratlardan RNA gibi proteinlerin ve nükleik asitlerin nasıl toplanacağını, western blotting ve ters transkripsiyon-niceliksel polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) gibi aşağı akış hücre biyolojisi analizleriyle uyumlu şekilde nasıl toplanacağını gösteren yöntemler sunuyoruz. Ayrıca, ortaya çıkan uyumlu PA substratları, küreoid oluşumunu ve küreleri tutarlı bir odak düzleminde konumlandırmasını destekler; böylece 3D hücresel davranışların sistematik analizi^{mümkün olur 13}.

Buna karşılık, PA hidrojellerinin optik sınırlamaları, özellikle toplam iç yansıtma floresansı (TIRF) mikroskopisinde ileri görüntüleme yöntemlerinde kullanımlarını kısıtlamaktadır^. Bu kısıtlamayı gidermek için, TIRF görüntüleme için optimize edilmiş mekanik olarak ayarlanabilir silikon tabanlı ECM substratları geliştirdik. Bu malzemeler, cama yakın bir kırılma indisi sergilerken, geniş bir aralıkta ayarlanabilir sertliği korur (Şekil 2A). ECM konjugasyonundan önce, farklı parça oranlarına sahip ince bir silikon jel tabakası, bir kapak camına spin ile kaplanır (Şekil 2B ve Tablo 2). Ancak, silikonların içsel hidrofobikliği ve kimyasal hareketsizliği doğrudan ECM koşujasyonunu engeller. Bu nedenle, ECM ligandlarının kovalent bağlanmasını mümkün kılan yüzey modifikasyon stratejisi uygularız. Oksijen plazma tedavisi, silikon yüzeye hidroksil grupları yerleştirir (Şekil 2C). Sonrasında, (3-aminopropil)trietoksisilan (APTES) bu hidroksil gruplarını reaktif aminə dönüştürür. 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorür (EDC), sıfır uzunlukta bir karbodiimid çapraz bağlayıcı olarak, jel yüzeyindeki amin grupları ile ECM proteinlerindeki karboksil grupları arasında kovalent amid bağlarının oluşumunu kolaylaştırır.

Bu ECM platformları topluca, ECM'e bağlı sinyal mekanizmalarını incelemek için maliyet etkili, tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir sistemler sunar. Esneklikleri, biyokimyasal testler, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve yüksek verimli iş akışlarıyla sorunsuz entegrasyon sağlar; bu da ECM sertliğinin hücresel davranışı nasıl etkilediğini ve hastalık ilerlemesini nasıl yönlendirdiğini araştırmayı mümkün kılar.

Protokol

1. PA tabanlı ECM hidrojellerinin üretimi

1. PA jel tutumu için cam yüzeylerinin işlevselleştirilmesi
   NOT: Tüm adımları oda sıcaklığında bir yörünge sallayıcısında gerçekleştirin. Adımlar arasında kaliteli suyla iyice durulayın.
   1. Cam yüzeyleri kimyasal dirençli bir kabta (örneğin, polistiren) 3 saat boyunca %10 çamaşır suyu ile temizleyin. Camı tamamen kapatacak kadar hacim kullanın ve sıkışmış kabarcıklar veya kuru alanlar olmadığından emin olun.
      DIKKAT: Çamaşır suyu son derece aşındırıcı ve tepkisel bir kimyasaldır. Üreticinin güvenlik talimatlarını takip edin.
   2. Kapak kapaklarını 0,2 M hidroklorik asit (HCl) içinde 16 saat boyunca hafif bir çalkalama ile inkübe edin.
      DIKKAT: HCl çok aşındırıcı ve cilt yanıklarına neden olabilir. Uygun PPE giyin.
   3. 0.1 M NaOH ekleyin ve 1 saat kuluçka yapın.
      DIKKAT: NaOH çözeltileri aşındırıcı ve cilt yanıklarına neden olabilir. Uygun PPE giyin.
   4. Örtü kapaklarını %0,5 APTES oranında yüksek kaliteli suda 30 dakika boyunca kuluçka yapın.
      DIKKAT: APTES toksiktir. APTES ile uygun PPE'li bir buharlı davlatta çalışın.
   5. Geriye kalan APTES'leri çıkarmak için kapağı büyük miktarda suyla durulayın.
      NOT: Eksik yıkama, bir sonraki adımda APTES ile glutaraldehit arasında reaksiyona yol açar ve cam yüzeyinin aktivasyonunu bozacak beyaz çökeltmelere yol açar.
   6. Coverslipleri %0,5 glutaraldehit içinde PBS'de 1 saat kuluçka edin.
      DIKKAT: Glutaraldehit toksiktir. Uygun PPE'li bir duman davlatında glutaraldehit ile çalışın.
   7. Kapak kapaklarını emici malzeme (örneğin, kağıt havlu) üzerinde gece boyunca kurutun. Kapakları temiz, kapalı bir kapta kullanana kadar sakla.
2. PA hidrojel çözeltisi ve jel dökümü hazırlanması
   NOT: Belirtilen elastik modüle sahip hidrojel elde etmek için gereken formülasyonlar Tablo 1'de sunulmaktadır. Farklı deneysel uygulamalar için önerilen jel hacimleri ve cam boyutları Tablo 3'te sunulmaktadır.
   1. PA hidrojel bileşenlerini amonyum persülfat (APS) ve tetrametilenediamin (TEMED) hariç tutulan 1.7 mL mikrosantrifüj tüpünde karıştırın.
      NOT: Büyük hacimler hazırlamayın çünkü yüksek sertlikli jeller hızla polimerleşir ve döküm tamamlanmadan önce sertleşebilir.
   2. PA jel karışımı, APS ve TEMED tüplerini 25 mmHg sıcaklıkta bir vakum odasında 30 dakika boyunca gazdan çıkarın.
   3. Hidrofobik üst örtü sliplerini pamuk çubukla su itici kaplama uygulayarak hazırlayın. Jel polimerizasyonunun tutarlı kalması için örtü örtülerinin lekesiz olduğundan emin olun.
   4. Gazlı çözeltiye APS ve TEMED ekleyin, ardından karışımı aktiv kapak kapaklarına nazikçe pipetleyin.
   5. Hidrofobik örtükleri çözeltinin üzerine yerleştirerek uniform ve ince bir hidrojel tabakası oluşturulur. Jellerin oda sıcaklığında 35 dakika polimerleşmesine izin verin. Kapak kapakları arasında hiç baloncuk sıkışmadığından ve çözeltinin kenarlardan dışarı dökülmediğinden emin olun.
      NOT: Doğru kalınlığı sağlamak için jel dökümü için önerilen hacimleri takip edin; Aşırı ince jeller, hücrelerin alttaki camı^{algılamasını sağlar 15}. Jel sandviçi sökmeden önce, polimerizasyonu doğrulamak için mikrosantrifüj tüpündeki kalıntı karışımı kontrol edin.
   6. Hidrojel sandviçi PBS'ye batırarak katmanları ayırın. Hidrojelin aktif alt kapak kayağına bağlı kaldığından emin olun ve hidrofobik üst kapak kolayca ayrılır.
3. Hidrojellerin ECM ligandlarıyla işlevselleştirilmesi
   NOT: Bu bölümdeki tüm adımlar steril koşullarda, bir biyogüvenlik dolabında yapılmalıdır.
   1. Hidrojelleri %70 etanole batırarak sterilize edin, ardından steril PBS içeren doku kültürü plastik eşyalarına aktarın.
      NOT: Hidrojelleri etanolde uzun süre bırakmayın, çünkü bu jelleri kurutabilir ve ECM konjugasyonunu zayıflatır.
   2. Su, etanol, HEPES ve bisakrilamid içeren bir ana karışım fonksiyonelleştirme çözeltisi hazırlayın (Tablo 4).
      DIKKAT: Bisakrilamid soluma veya yutulma sırasında toksiktir.
   3. UV fotobaşlatıcı ve tetraakrilat seyreltilmiş çözeltiler hazırlayın. Her iki reaktif de etanolde çözünür (Tablo 4).
      NOT: Her seferinde tetraakrilatın seri seyreltmeleri yapılması sağlanır çünkü aşırı polimerleşmeye ve görünür siyah yüzey birikintilerine yol açabilir (bkz. Şekil 3A).
   4. Gerekli NHS-akrilat miktarını analitik bir tereziyle tartın. Kullanımdan hemen önce %50 etanol/%50 suda NHS-akrilatı yeniden askıya alın.
      NOT: Aşırı NHS-akrilat miktarı, görünür siyah yüzey birikintilerinin oluşmasına ve düzensiz ECM kaplamasına yol açabilir (Şekil 3B).
   5. Adım 1.3.2'de hazırlanan ana karışıma UV fotobaşlatıcı, tetraakrilat ve NHS-akrilat çözeltileri ekleyin. PBS'yi aspire edin ve master karışımı jellere ekleyin, böylece tamamen kaplanmış olduklarından emin olun.
   6. Hidrojelleri (doku kültürü kapağı olmadan) 400 saniye boyunca UV ışığına maruz bırakın (dalga boyu 365 nm'den küçük UV ışığı kaynağı).
      DIKKAT: UV ışığı ile çalışırken uygun göz koruması kullanın.
   7. Jelleri çıkarın ve buzun üzerine koyun. Fonksiyonalizasyon çözeltisini aspire edin, ardından jelleri önceden soğutulmuş steril 25 mM HEPES (pH 6,0) ile üç kez yıkayın, ardından önceden soğutulmuş steril %0,9 NaCl ile üç yıkama yapın.
   8. Hidrojelleri, tercih ettiğiniz ECM ligandı ile önceden soğutulmuş steril 100 mM HEPES (pH 8.0) ile 100 mM NaCl ile gece boyunca 4 °C'de yörünge sallayıcısında kuluçka yapın.
      NOT: ECM ligandlarının konsantrasyonu kullanıcının takdirine göre seçilebilir; Ancak, aynı parti içinde farklı sertlikte tüm substratlarda ligand konsantrasyonlarının aynısını korumak kritik öneme sahiptir.
   9. ECM ligand çözeltisini 16 saat sonra dikkatlice aspire edin. Hidrojelleri üç kez PBS ile yıkayın ve nemli kalması için serumsuz baz madde (veya PBS) ekleyin. Jelleri hücre tohumlanmasından önce sterilliği doğrulamak için bir gece boyunca doku kültürü kuluçkasında inkübe yapın.
      NOT: Eğer kontaminasyon varsa, ana kültür ortamında 37 °C sıcaklıkta gece kuluçkasından sonra ortam bulutlu görünecektir.
   10. Jelleri hücre tohumlaması için hemen kullanın veya baz ortamda 4 °C sıcaklıkta en fazla 3 hafta saklamayacaksınız.

2. Mekanik olarak ayarlanabilir silikon bazlı ECM substratlarının üretimi

1. Silikon jel kaplama için cam kapak örtülerinin hazırlanması
   1. 3 M NaOH ile 20 dakika boyunca temiz cam kapak örtülerini kullanın.
   2. Yüksek kaliteli suyla beş kez iyice yıkayın ve sonunda suyu aspire edin. Hava ile kurumasına izin verin ve kalan damlaları veya kalıntıları çıkarmak için azot hava jeti kullanın.
2. Silikon jel hazırlanması
   1. İki bileşenli silikon elastomerin A ve Bileşen B'sini, Tablo 2'de belirtilen ağırlık oranına göre analitik bir tereziye kullanılarak tart. Viskoz çözeltileri çekmek için kesilmiş pipet ucu kullanın.
   2. Bileşen A ve Bileşen B'yi pipet ucu ile iyice karıştırarak tam birleşmesini sağlayın.
   3. Karışımı 25 mmHg sıcaklığında 10 dakika boyunca vakum odasında gazdan çıkarın.
3. Cam kapak örtüklerine jel dökümü
   1. Bir örtü kaplama üzerine yerleştirilmiş kauçuk bir matın üzerine yerleştirin, böylece iyi ortalanmış olduğundan emin olun.
      NOT: Kauçuk mat, doğru vakum sızdırmazlığı sağlar. Yeterli bir sızdırmazlık olmadan, kapak kaydırıcı yerinden çıkabilir ve kırılabilir. Yanlış merkezleme, düzgün olmayan kaplamaya yol açabilir.
   2. Örtü kapatmak için süpürgeyi devreye alın.
   3. Kaplamanın ortasına 100 μL jel karışımı ekleyin. 500 rpm'de 10 saniye spin kaplama, ardından 60 saniye için 8.000 rpm.
   4. Kaplamalı kapak örtüsünü 80 °C'de 2 saat pişirin. Oda sıcaklığına soğumasına izin verin.
      NOT: Kullanmadan önce oda sıcaklığında bir aya kadar saklayın.
4. Silikon jelin ECM ligandlarıyla fonksiyonelleştirilmesi
   1. Silikon jel kaplı kapakları 11 W güçte 5 dakika boyunca oksijen plazmasına maruz bırakın.
      NOT: Oksijen plazmasına daha uzun süre veya daha yüksek bir güçle maruz kalmak, jellerin çatlamasına yol açabilir. Kullanılan ekipmana bağlı olarak güç ve zamanın optimal kombinasyonunun test edilmesi gerekebilir.
   2. %95 etanol, %0,5 APTES ve %4,5 dH_2Oiçeren bir silanizasyon çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Sonraki tüm adımları steril koşullarda bir biyogüvenlik dolabında gerçekleştirin.
      DIKKAT: APTES toksiktir. APTES ile uygun PPE'li bir buharlı davlatta çalışın.
   3. Jel kaplı örtü parçasını silanizasyon çözeltisiyle 10 dakika kuluçka yapın.
   4. PBS ile beş kez iyice yıkayın.
   5. 100 μg/mL EDC içeren ECM çözeltisi ve tercih edilen ECM'yi istenen konsantrasyonda PBS olarak hazırlayın.
      NOT: EDC çözelti olarak kararsızdır ve nem konusunda hassastır. Kullanmadan önce taze hazırlayın ve nemden ve doğrudan güneş ışığından korunaklı bir serin, kuru bir yerde sıkıca kapalı bir şekilde saklayın.
      DIKKAT: EDC yutulduğunda zararlıdır ve solulursa toksiktir. Uygun PPE giyin ve bir duman kapüşonuyla çalışın.
   6. Coverslip'i ECM çözeltisiyle 1 saat boyunca 37 °C'de veya gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
   7. Kapak kağızını PBS ile beş kez yıkayın. Baz ortamla durulayın ve hücreler ekleyin.
      NOT: Optimal hücre yoğunluğu, belirli hücre hattı ve deneysel hedeflere bağlıdır (örneğin, morfoloji için alt konfluent veya hücre-hücre yapışması için tek katman). Örneğin, fibroblastlar için genellikle %50 birleşme elde etmek için 0,1 x 10 6 hücre/^cm2 yoğunluğu kullanılır.

3. İmbünüs boyama ve görüntüleme için ECM substratının hazırlanması

1. PA tabanlı substratlarda immünboyama ve görüntüleme
   NOT: On sekiz milimetrelik PA hidrojelleri genellikle nicel analiz için yeterli görüntülenebilir alan sağlar. Görüntüleme uygulamaları için, hidrojeller dökülür ve 15 mL tüplerden hazırlanmış "turuncu odalarda" immünboyama işlemi yapılır. Portakal odaları, yapısal bütünlüğünü koruyorsa, jel dökümü ve boyama için tekrar kullanın.
   1. Polikarbonat film ve silikon kauçuk filmden yapılmış delme halkaları, 18 mm dış çaplı ve 14 mm iç delikli delikler kullanılarak ara ve contaları hazırlamak.
   2. 15 mL'lik santrifüj tüpünün kapağının ortasında makasla bir açıklık açarak jel döküm ve boyama için bir oda oluşturun.
   3. Santrifüj tüpünü 14 mL işaretinde gördüm. Düzensiz kenarları bistürpelle kesin ve kapağın kenarını törpüleyin, böylece standart 12 kuyu plakaya uyduğundan emin olun.
   4. Hidrojel-kapak kaydırma sandviçi (Bölüm 1'de tarif edildiği gibi) birleştirin, ara halkayı aktive edilen kapak kayağına yerleştirin.
   5. Jeller tamamen polimerize olunca sandviçi sökül.
   6. 18 mm'lik hidrojelleri sterilize edin ve steril PBS içeren 12 kuyruklu doku kültür plakasına aktarın.
   7. Bölüm 1'de açıklandığı gibi ECM ligand fonksiyonelleştirmesini gerçekleştirin.
   8. Tohum hücreleri ile %4 formaldehit ile sabitleyin.
      NOT: Alkol bazlı fiksatörlerden kaçının, çünkü jelleri kurutmaz ve yapısal bütünlüğü zayıflatırlar.
      DIKKAT: Formaldehit zehirlidir ve her zaman bir buhar davlumbazının içinde kullanılmalıdır.
   9. (İsteğe bağlı) Örnekleri santrifüj tüpünün kapağına yeniden monte edin. Hazneyi kapatmak için silikon conta kullanın.
      NOT: Boyamadan önce PBS ile birkaç saat boyunca sızıntı testi yapın. Bu yöntem daha zahmetli görünse de, eşit boyamayı teşvik eder ve antikor tüketimini azaltır.
   10. Kullanıcının tercih ettiği protokollere göre immünoflüoresans boyama işlemi yapılabilir.
   11. Boyamadan sonra, örnekleri %50 gliserol takviyesi olan PBS'de saklayın. Örnekleri mümkün olan en kısa sürede görsün.
       NOT: Sertleşen standart montaj ortamlarından kaçının, çünkü zamanla hidrojelleri çatlayabilir ve örneklere zarar verebilir. Floresans yoğunluğu zamanla azalır; En iyi sinyal kalitesi için 1 hafta içinde görüntü alındı.
   12. Bir doku kültürü kabının cam taban yüzeyine küçük bir damla PBS (veya montaj ortamı) koyun. Lekelenmiş hidrojelleri dikkatlice damla üzerine ters çevirin ki hücreler kapağı cama bakacak şekilde görüntüye geçsin.
2. Silikon bazlı ECM substratlarında immünboyama ve görüntüleme
   1. Örnekleri %4 formaldehit kullanarak sabitleyin ve standart immünoflüoresans protokolü ile doğrudan cam tabanlı bir tabağa boyanın. Alkol bazlı fiksatörlerden kaçının çünkü ECM substratlarını çatlatabilirler.
   2. Görüntü örnekleri doğrudan geleneksel floresans mikroskobu kullanılarak alınır.

4. ECM substratları üzerinde kaplanmış hücrelerden protein ve RNA toplamak

1. Forseps kullanarak, jelleri kültür kabından dikkatlice çıkarıp steril PBS'ye batırarak kalan kültür ortamı ve serumu durulayın.
   NOT: Örtü kaymalarını nazikçe kullanın, çünkü çok kırılgandır ve kolayca kırılabilirler.
2. Hidrojelin kenarını düşük tüy içeren mendillerle nazikçe sığlayarak fazla PBS'yi çıkarın.
3. Bir doku kültürü kabının kapağına uygun miktarda RNA çıkarma tamponu ekleyin.
   NOT: Fenol-guanidin bazlı reaktifler, PA jellerinden RNA ekstraksiyonuyla uyumludur. Protein lüzisi tamponları deneysel gereksinimlere göre kullanılabilir. Hücrelerin tam bozulmasını sağlamak için liz tamponu kuluçkasından sonra örnekleri mikroskop altında görselleştirin.
4. Kaplama kapağını (jel tarafı aşağı) liz çözeltisine yerleştirin. Tüm hücrelerin eşit lizisini sağlamak için hidrojeli dikkatlice birkaç kez kaldırıp indirin.
5. Jel yüzeyini nazikçe kazıyarak lizat serbest bırakın.
   NOT: Ticari plastik hücre kazıyıcıları kullanmayın, çünkü sert plastik yumuşak hidrojellere zarar verebilir ve lizat ile jel parçaları ile kirlenebilir. Ara parça yapmak için kullanılan yumuşak plastik (bkz. Adım 3.1.1) bu amaç için uygundur ve özel kazıyıcı yapmak için yeniden kullanılabilir.
6. RNA veya protein lizatlarını -80 °C'de sakla, daha sonra geleneksel biyokimyasal yöntemlerle daha fazla işlem yapılana kadar veya hemen kullanın.

5. Tek düzlemli küre kültürünün oluşturulması

1. 75 Pa PA hidrojelini 18 mm örtük kapaklarında hazırlayın ve hücre tutumunu kolaylaştırmak için bazal membran ekstraktı (BME) veya başka uygun ECM ligandı ile yüzeyi işlevselleştirin.
2. Tohum hücrelerini istenen yoğunlukta ECM kaplı hidrojellere veya silikon jellere yerleştirin.
3. 2 saat sonra, bağlanmamış hücreleri nazikçe çıkarın ve önceden soğutulmuş bazal ortamda seyreltilmiş bir BME örtü ekleyin.
   NOT: BME ısındıkça polimerleşiyor. Pipetlemeden önce ön soğutma uçları. Dahil edilen BME yüzdesi, istenen mekanik bütünlüğü ve ortaya çıkan 3D iskelenin stabilitesi ile belirlenir.
4. Kültürleri 37 °C'de doku-kültür kuluçkasında 1,5 saat boyunca kuluçka yapın, böylece BME polimerizasyonu sağlanır.
5. 3D jelleri tamamen kapatmak için nazikçe hücre kültürü ortamı ekleyin.
6. Kültürleri standart koşullar altında koruyun. Hücreler, istenen deneysel son noktaya ulaşana kadar zamanla büyümeye ve 3D sferoidlere dönüşmeye devam edecektir.

Sonuçlar

Tablo 1'deki formülasyonlarla üretilen PA jel sertliği, reometre kullanılarak deneysel olarak test edilmiştir. 0,4 kPa, 6 kPa ve 60 kPa nominal sertlik değerlerine sahip ve üç büyüklük mertebesini kapsayan jeller seçildi. Ölçülen sertlik değerleri 400 Pa jel için 363 ± 76 Pa, 6 kPa jeller için 6,41 ± 0,50 kPa ve 60 kPa jeller için 36 ± 8 kPa idi (Şekil 4A). PA jellerine uniform ECM tutunmasını değerlendirmek için, floresan etiketli fibronektin jel yüzeyi...

Tartışma

Özetlenmiş ECM üretim protokolü, tekrarlanabilir, ölçeklenebilir ve maliyet etkin bir iş akışı sağlar ve çoğu laboratuvarda kolayca uygulanabilir. Geleneksel cam ve plastik kültür ürünleri kullanışlı ve hızlı veri toplama imkanı sağlasa da, sentetik substratlar fizyolojik olarak ilgili doku sertliğini taklit edemez. Polidimetilsiloksan (PDMS) veya jelatin metakriloyl (GelMA) gibi alternatif mekanik olarak ayarlanabilir substratlar daha kolay üretilir, ancak genellikle sub-kilopaskal aral...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
(3-Aminopropil)trietoksisilan (APTES)	919-30-2	-	Thermo Fisher Scientific
1.7 mL mikrosantrifüj tüpleri	-	LMCT1.7B	FroggaBio
12 kuyulu doku kültürü işlem görmüş plaka	-	83.3921	Sarstedt
(portakal bölme için) 15 mL santrifüj tüpleri	-	CLS430790	Corning
2-Hidroksi-4′-(2-hidroksietoksi)-2-metilpropiyofenon (Irgacure)	106797-53-9	-	Thermo Fisher Scientific
2% Bisakrilamid çözeltisi	110-26-9	-	Bio-Rad
3-(3-Dimetilaminopropil)-1-etilkarbodiimide hidroklorür (EDC)	25952-53-8	-	Chem Impex International
4′,6-Diamidino-2-fenilindol diklorhidrat	28718-90-3	-	Sigma
4′,6-Diamidino-2-fenilindol diklorhidrat (DAPI)	-	D1306	Invitrogen
40% Akrilamid çözeltisi	01/06/1979	-	Bio-Rad
50% Glutaraldehit	111-30-8	-	Thermo Fisher Scientific
6 cm doku kültürü işlem görmüş tabaklar	-	83.3901	Sarstedt
A549 hücreleri	-	CCL-185	ATCC
Akrilik asit N-hidroksisüksinimid ester	38862-24-7	-	Thermo Fisher Scientific
Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan antikoru	-	A11008	Invitrogen
Alexa Fluor 594 NHS ester (tris(trietilamonyum tuzu))	-	A37572	Invitrogen
Amonyum persülfat	7727-54-0	-	Bio-Rad
Darbe dayanımlı saydam polikarbonat film (0,005 in.; ara parça)	-	85585K72	McMaster-Carr
CY 52-276 silikon jel, Bileşenler A ve B	2624028	-	Dow
Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Kartal Ortamı (DMEM)	-	11995-065	Thermo Fisher Scientific
Etanol, anhidrit	64-17-5	-	Greenfield Canada
Fast SYBR Green Master Mix	-	4385612	Thermo Fisher Scientific
Fetal boğa serumu	-	A52567-01	Thermo Fisher Scientific
Fibronektin	-	356008	Corning
Formaldehit (%16)	-	28908	Thermo Fisher Scientific
HEPES	7365-45-9	-	BioShop
Yüksek sıcaklık silikon kauçuk tabaka (0,020 in.; conta)	-	86435K452	McMaster-Carr
Hidrolorik asit	7647-01-0	-	BioShop
Büyük içi boş delme aracı seti	-	66000	Mayhew Pro
Matrigel	-	356234	Corning
Medya depolama borosilikat cam şişe, 250 mL	-	CLS1395250	Corning
Medya depolama borosilikat cam şişe, 500 mL	-	CLS1395500	Corning
MicroAmp Fast Optical 96 kuyu reaksiyon plakası	-	4346906	Thermo Fisher Scientific
Mikroskop slayt kapakları, 18 mm çap	-	72222-01	Electron Microscopy Sciences
Mikroskop slayt kapakları, 50 mm çap	-	1.84E+16	eBay
PBS (1x)	-	14190144	Thermo Fisher Scientific
PBS (10x)	-	70011044	Thermo Fisher Scientific
Faloidin	17466-45-4	-	Biotium
Fosfo-FAK (Tyr397) antikoru	-	85567	Cell Signaling Technology
Fosfo-MLC (Ser19) antikoru	-	3671	Cell Signaling Technology
Plazma temizleyici	-	PDC-32G	Harrick Plasma
qPCR primerleri (ileri ve geri)	-	N/A	Integrated DNA Technologies
qScript cDNA Sentez Kiti	-	95047	QuantaBio
Rain-X	-	-	Rain-X
Vidayı kapaklar, konik tabanlı, 15 mL	-	62.554.101	Sarstedt
Vidayı kapaklar, konik tabanlı, 50 mL	-	62.547.205	Sarstedt
Serolojik pipet, 10 mL	-	170356N	Thermo Fisher Scientific
Serolojik pipet, 25 mL	-	170357N	Thermo Fisher Scientific
Serolojik pipet, 5 mL	-	170355N	Thermo Fisher Scientific
Serolojik pipet, 50 mL	-	170358N	Thermo Fisher Scientific
Sodyum hidroksit	1310-73-2	-	BioShop
SYPRO Ruby protein jel boyası	-	S12000	Invitrogen
TEMED	110-18-9	-	Bio-Rad
TRIzol reaktifi	-	15596026	Thermo Fisher Scientific
UV odası	-	165-5031	Bio-Rad