Damlacık Arayüz Bilayerları Kullanarak Lipid-Protein Zar Yapı-Fonksiyon Karakterizasyonu

Summary

Gramicidin A-doped damlacık arayüz çift katmanlarını bir yere toplamak, elektriksel olarak uyarmak ve analiz etmek için deneysel bir protokol sunulur. Lipid-protein yapı-fonksiyon ilişkileri, membran alanı, iyonik akı ve tek kanal iletkenliğindeki değişiklikler ölçülerek ve bu yanıtların, elektriksel sinapslardan ilham alan bir membran modelinde iyonik iletkenlikteki plastisite benzeri değişikliklerle ilişkilendirilmesiyle nicelendirilir.

Abstract

Damla arayüz bikatmanları (DIB'ler), kontrollü elektriksel uyarım altında lipid ve lipid-peptid membranlarının elektromekanik özelliklerini incelemek için ayarlanabilir bir platform sunar. DIB'ler, geleneksel yama kelepçe teknikleriyle erişilebilen membran alanlarından çok daha büyük alanlarda hem tek kanallı hem de topluluk iyon iletkenliği ölçümlerini mümkün kılarak elektromekanik deformasyonun ve bunun iyon iletken peptitler üzerindeki etkisinin membran düzeyinde analizlerine olanak tanır. Membran yapısını toplu hidrokarbon yağı fazında sistematik olarak ayarlayarak (örneğin, heksadekan [C16] vs. dodekan/heksadekan [C12/C16] [%25/%75 v/v]), bu aşağıdan yukarıya platform, membran bileşimi ve yağ ortamında sistematik bir değişiklik yapılmasını sağlar; bu da membran viskoelastisiyesini ve yapısal yeniden organizasyonunu etkiler ve böylece peptit iyon iletimini etkiler. Farklı hidrokarbon yağı bileşimleri kullanılarak gramicidin A-doped edilmiş 1,2-diphytanoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (DPhPC) membranlarının montajı ve membranları metastabil elektromekanik durumlara yönlendiren voltaj-darbe protokollerinin uygulanması için ayrıntılı prosedürler sunulmaktadır. Uyarlanabilir membran iyongeçirim, model bir membran sisteminde kısa süreli plastisite-benzeri (STP benzeri) ve uzun vadeli potentiasyon ve depresyona benzer (LTP benzeri/LTD benzeri) tepkileri içeren karakterize edilir. Daha geniş anlamda, bu protokol, bileşime bağımlı, membran düzeyindeki elektromekanik katkıların sinaptik benzeri iletken davranışa sistematik olarak incelenmesi ve lipid zar ortamlarının iyon kanalı fonksiyonunu nasıl modüle ettiğini anlamak için sağlam ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar.

Introduction

Biyolojik zarlar, iyonik iletimi düzenleyebilen ve nöronlar arasında elektriksel ve kimyasal^sinapslar 1,2,3,4 aracılığıyla iletişimi mümkün kılan kritik supramoleküler ^{yapılardır.} Bu tür iletişim, sinapsların yapısal değişikliklerinin güç ve kalıcılıklarını ^5,6 zaman aralığında modüle ettiği sinaptik plastisiteyle daha da kontrol edilir; bu zaman genellikle kısa süreli plastisiteye (STP) ve uzun vadeli potensiyon veya depresyona (LTP veya LTD) olarak tanımlanır. Bu fenomenler, sinirsel aktiviteye yanıt olarak membran iletkenliğinde dinamik değişiklikleri içerir ve genellikle öğrenme ve hafızanın 8 temelini oluşturan nöroplastisite⁷ ile bağlantılıdır^. Geleneksel plastiklik modelleri genellikle protein sentezi, kaçakçılığı veya fosforilasyon yoluyla iyon kanallarının biyokimyasal^{düzenlemesini vurgular9}. Ancak, nöronal plazma zarlarının plastisite modellerinde rolü büyük ölçüde göz ardı^{edilmiştir 10,11}.

Yama-kelepçe yöntemleri, tek iyon kanalı elektrofizyolojisini incelemek için yarım yüzyıldan fazla süredir kullanılmaktadır. Ancak, sadece sağlam sinapslardan veya büyük ölçekli sentetik modellerden çok daha küçük olan membran alanlarını sorgulayabilirler. Bu nedenle, mezoskal membran yeniden düzenlenmesi ve deformasyonunu incelemek için teknik bir sınırlama oluştururlar. Mezoölçek, membran biyofiziğinin birçok yönünü anlamak için giderek kritik bir uzunluk ölçeği^{olarak kabul edilmektedir 12,13}.

İyonik iletimi modellemek için 1,2-diphytanoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (DPhPC) damlacık arayüz çift katmanları (DIBs^)14,15, monovalent peptid katyon ionoforu gramicidin-A (gA) ile doped edilmiş, elektriksel sinapslarda gerçekleşenlere benzer bir yöntem sunulmaktadır. Bu sistem birkaç temel avantaj sunar: (i) DIB'ler, sistematik membran yeniden düzenlenmesine olanak tanıyan ayarlanabilir bir lipid ve yağ^{platformu sağlar 16}; (ii) DIB'ler, tek kanallı ve topluluk kanal olaylarının^17,18 uzunluk ölçekleri aralığında incelenmesine olanak tanır; ve (iii) DIB'ler, kolektif elektromekanik olarak indüklenen membran yeniden yapılandırmasını yakalayan submilimetre² boyutlu membran yamalarının sorgulanmasını sağlarken, tek kanallı iyon iletken olaylarını çözme^{yeteneğini korurken 19,20}. Bu yöntem, geleneksel yama kelepçesiyle erişilenden daha büyük membran alanlarında membran elektromekaniğinin eşzamanlı elektriksel ve optik sorgulanmasını gerektiren çalışmalar için en uygundur; ancak yine de ayrık kanal olaylarını çözme yeteneğini korur. Deneysel amaç, zar bileşimi, yağ ortamı ve uygulanan voltaj dalga formlarının kolektif membran yeniden yapılandırılmasını ve peptit iletimini nasıl etkilediğini incelemek olduğunda özellikle faydalıdır. Bu yöntem, doğal hücresel mimari veya sağlam biyolojik membranlarda protein konformasyon değişikliklerinin doğrudan moleküler okumaları gerektiren deneyler için daha az uygundur^(19,20,21).

Fizyolojik olarak ilgili elektriksel uyarım uygulanarak, DIB'ler dengesiz sabit durumlara sürüklenir; bu durumlarda dinamik elektromekanik yeniden yapılandırma peptit iyon kanalı iletimini değiştirir. İyonik iletimdeki bu ortaya çıkan değişiklikler, sinirbilim^22,23,24'te tartışılan nörolojik STP, LTP ve LTD fenomenlerine tanımlayıcı olarak benzerdir. Mevcut çalışmada, bu davranışlar esas olarak model membran sisteminde viskoelastiklik ve sıkışabilirlik gibi içsel membran mekanik özellikleriyle ilişkili elektriksel uyarıma karşı membran düzeyinde fiziksel tepkiler olarak^{yorumlanmaktadır 25}. Özellikle, burada açıklanan çalışma, lipid çift katmanlarının uyarılma sonrası kalıcı iletkenlik kaymaları ve kapasitif yük depolanması yoluyla temel elektriksel hafıza gösterebileceğine dair önceki kanıtlara^{dayanmaktadır.} 14,15,25,26,27,28,29,30,31,32,33^{. 34}, lipid çift katmanların karmaşık hücresel mekanizmalar olmadan adaptif, sinaptik benzeri işlevselliği nasıl destekleyebileceğine dair yeni içgörüler sunar. Son olarak, bu metodoloji yapı-fonksiyon ilişkilerinin doğrudan incelenmesini ve ortaya çıkan makro ölçekli davranışın basit yapısal yeniden yapılandırılmadan nasıl ortaya çıktığını^{da mümkün kılar} 21,25,27.

Protocol

Tüm cam eşyalarını ve hazırlık ekipmanlarını uygun laboratuvar deterjanlarıyla iyice temizleyin ve numune hazırlamadan önce damıtılmış suyla durulayın. Kontaminasyonu önlemek için her zaman koruyucu gözlük ve nitril veya lateks eldiven takın. Tüm kimyasal atıkları kurumsal güvenlik yönergelerine göre bertaraf et. Uçucu çözücülerin kurumsal güvenlik yönergelerine uygun şekilde saklandığından emin olun. Deney laboratuvarı alanı ve donanımının (Şekil 1A), deney aracının (Şekil 1B) ve elektrik-optik bağlantıların (Şekil 1C) engelsiz ve engellerden arınmış kalmasını sağlamak.

1. Sulu tampon çözeltisi hazırlanır

1. İstenen nihai konsantrasyonları elde etmek için uygun miktarda 3-(N-morfolino) propansülfonik asit (MOPS) ve potasyum klorür (KCl) tartın.
2. MOPS ve KCl'yi ~450 mL damıtılmış suya ekleyin, 500 mL hacimli bir şişe veya dereceli silindirde ve manyetik karıştırma çubuğuyla tamamen çözünene kadar karıştırın.
3. pH ölçümü kalibre edilmiş bir pH ölçer. Sürekli karıştırarak 1 M potasyum hidroksit (KOH) veya hidroklorik asit (HCl) ekleyerek pH seviyesini 7,4'e ayarlayın.
4. Toplam hacmi damıtılmış suyla 500 mL'ye çıkarın ve iyice karıştırın. Tamponu temiz, etiketli bir şişeye aktarın, kaplayın ve 4 °C'de saklayın.
   NOT: Buffer'ı ~2 aya kadar kullanın. Her kullanımdan önce pH'ı 7.4'e doğrulayın ve yeniden ayarlayın.

2. Gramisidin stok çözeltisi hazırlanır

1. Kimyasal bir duman davlumbazında, temiz 20 mL'lik cam şişeye 5 mg gramisidin A (gA) ekleyin. Cam veya gaz geçirmez şırınga ile 10 mL metanol ekleyin ve peptid tamamen çözünene kadar vortex ekleyin. Şişeyi "gA stok" olarak etiketleyin ve -80 °C'de saklayın.
   NOT: Topluluk deneylerinde lipid: peptid azı oranları ~1:^10-4 olarak kullanılır. Tek kanallı deneyler, kısa kayıt sürelerinde (<1 dakika) bireysel olayları çözmek için ~10–100 kat daha düşük peptit (1:^10-5–^10-6) kullanır. Sulandırılmış stok hazırlamak, düşük molyar oranlarda (< ~ 1:^10-4) pipetleme hassasiyetini artırır.
2. Tozu temizlemek için argon gazı ile iki tane daha temiz 20 mL cam şişesini ~5 saniye boyunca temizleyin.
3. Temiz, gaz geçirmez bir şırınga kullanarak, her arındırılmış şişeye 9,9 mL metanol verin.
4. 100 μL gA stok çözeltisini steril gaz geçirmez bir şırıngalla bir şişeye pipet ile toplam 10,0 mL hacmi elde etmek için kullanın. Bu şişeye "A" etiketi verin. Metanolde konsantrasyon = 2,66 μM gA.
5. 100 μL çözelti "A"yı ikinci cam şişeye pipet ile 10,0 mL toplam hacim elde edin. Bu şişeye "B" çözeltisi olarak etiketleyin. Konsantrasyon = 26,6 nM gA metanolde.
6. Şişeleri kapaklı kapatın ve parafilm ile sarın.
7. Tüm gA çözeltilerini kullanana kadar -80 °C sıcaklıkta sakla.

3. Lipid-peptid veziküllerinin hazırlanması

1. Argon gazlı temiz 20 mL'lik cam şişeni ~5 saniye boyunca temizleyin.
2. Şişeye 4 mg 1,2-diphytanoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (DPhPC) lipid ekleyin.
3. Bir duman davlumbazında, cam pipet kullanarak 1 mL metanol ekleyin. Tüm lipidler çözülene kadar nazikçe döner veya girdabla hareket ettirin.
4. 500 μL gaz geçirmez bir şırınga kullanarak, 178 μL "A" çözeltisi eklenin (topluluk düzeyinde STP deneyleri için; DPhPC:gA molar oranı = 1:^10-4) veya tek kanallı deneyler için 890 μL "B" çözeltisi; DPhPC:gA molar oranı = 1:5×^10-6) DPhPC metanol çözeltisine. Nazikçe vortex ile karıştırın.
5. Duman kapasasındaki hafif bir argon akışı altında, metanol buharlaştırılıp şişenin dibinde ince, düzgünce bir lipid filmi oluşana kadar buharlaştırın.
6. Açık şişeyi 40 °C'lik vakum fırına koyun ve kalan çözücü çıkarmak için 10–12 saat veya gece boyunca tam vakum çekin.
7. Şişe vakum fırınından çıkarılır ve STP deneyleri için Bölüm 1'de hazırlanan 0,1 M KCl tampondan 2 mL eklenir; böylece süspansiyonda sırasıyla 2,36 mM ve 236 nM nihai lipid ve gramisidin konsantrasyonları elde edilir. Tek kanallı deneyler için, Bölüm 1'de hazırlanan 2 mL 1 M KCl tampon ekleyin. Vortex ile lipid filmini yeniden nemlendirmek ve 2 mg/mL lipid süspansiyonu elde etmek için kullanılır; böylece süspansiyonda sırasıyla 2,36 mM ve 11,8 nM nihai lipid ve gramisidin konsantrasyonu elde edilir.
8. Şişeni -80 °C'de en az 6 dakika dondurun, ardından 40 °C'lik sıcak plakada veya su banyosunda 6 dakika eritin. Kısa bir süreliğine Vortex karıştırıyor. Bu donma-erime döngüsünü altı kez tekrarlayarak çok lamellar vezikül oluşumunu teşvik edin.
9. Üreticinin talimatlarına uygun olarak 0.1 μm gözenek çaplı izli membran içeren bir lipid vezikül ekstruderi monte edin. 500 μL tamponu ekstruderden 3 kez geçirerek membranı nemlendirin, sızıntı olmadığını kontrol edin ve tamponu atın.
10. Eritilmiş lipid-peptid süspansiyonundan 1 mL ekstrudere yüklenin ve 0,1 μm membrandan 31 geçiş yapın; böylece ~100 nm çapında unilameller veziküller elde edin ve boyut homojenliği sağlansın.
11. Ekstrüze edilmiş vezikülleri (Büyük unilamellar veziküller, LUV) 1 mL'lik bir PCR tüpüne aktarın, etiketleyin ve 4 °C'de depolayın. Hazırlıktan sonraki 2 hafta içinde kullanın.
12. Kalan ekstrüze edilmemiş lipid-protein süspansiyonunu orijinal şişeye mühürleyin, parafilm ile sarın ve daha sonra kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.
13. Daha önce dondurulmuş, ekstrüze edilmemiş örnekler kullanılıyorsa, sıcak plaka ile 40 °C'de tekrar eritilin veya numunenin oda sıcaklığına ısınmasına izin verin, ardından numuneyi dışarıya çıkarın.

4. Agaroz jelinin hazırlanması

1. Temiz bir 50 mL cam beakeri sıcak tabağa yerleştirin. Lipid filmini hidretlemek için kullanılan aynı tampondan 50 mL (örneğin, 10 mM MOPS, 0.1 M KCl, pH 7.4) bir agaroz tableti ekleyin ve %1 agararoz jel çözeltisi oluşturulur.
2. Temiz bir Teflon karıştırma çubuğu ekleyin ve tablet dağılana kadar sertçe karıştırın.
3. Beaker'i alüminyum folyo ile kaplayın ve metal spatula ile küçük bir havalandırma deliği açın. Sıcak plaka sıcaklığını 220–230 °C olarak ayarlayın. Çözelti berrak hale gelir ve yuvarlanan bir kaynamaya ulaşır, bu da agarozun tamamen çözüldüğünü gösterir.
4. Isıyı kapatın ve folioyu dikkatlice çıkarın. Temiz metal spatula ile herhangi bir yüzey filmini sökün. Elektrot kaplaması için hemen sıcak agaroz çözeltisini kullanın veya daha sonra kullanmak için bedekte soğuyup sertleşmesine izin verin.
5. Elektrod agaroz kaplamasından sonra, katı agarozu folyo ile kaplayın, parafilm ile mühürleyin, etiketleyin ve 4 °C'de saklayın. Gerekirse, tamamen eriyene kadar kaynatarak kaynamaya kadar ısıtın.

5. Elektrotların hazırlanması

1. 0.125 mm çapında gümüş tel, başlık elektrotları için ~70 mm uzunluklarda ve topraklama elektrotları için ~130 mm uzunluklarda kesin.
2. Açık alev (örneğin, elde tutulan çakmak veya Bunsen ocağı) kullanılarak, her gümüş telin bir ucunu alevin en sıcak merkezi konisinde yatay olarak tutarak uç eriyip ~0,2 mm çapında küresel bir top oluşturana kadar tutun (Şekil 2A).
3. Kabloları temiz bir yüzeye yerleştirin ve topların küresel ve benzer boyutta olup olmadığını mikroskop altında doğrulayın. Bir top dikdörtgen veya düzensizse, ucunu kesin ve eritme işlemi tekrarlanıyor (Adım 5.2).
4. Her iki gümüş telin uçlarını taze ev çamaşır suyu (sodyum hipoklorit, NaClO) içeren cam bir kaba yerleştirin. Topların tamamen suya battığından emin olun ve yüzeyi klorlamak için en az 1 saat kuluçka yapın, böylece Ag/AgCl oluşun. Soluk kahverengi-gri görünüm, başarılı klorlama olduğunu doğrular (Şekil 2B).
5. Topun uçları mat gri renkte olduğunda telleri çamaşır suyundan çıkarın, damıtılmış suyla iyice durulayın ve temiz, tüy içermeyen bir yüzeye kuruması için serin.
6. Bir baş aşama pipet tutucu ve bir topraklama elektrot tutucu edinin. 100 mm borosilikat cam kapiler (1.0 mm OD, 0.58 mm ID) cam kesici ile ikiye bölün.
7. Bir yarım kapiller baş sahne pipet tutucusuna yerleştirin ve tutucuyu sıkıştırarak sabitleyin. Topraklama elektrot tutucusuna tam 100 mm bir kapiller takın ve sabitleyin.
8. 130 mm gümüş telin bilyesiz ucunu, top ucunun ~20 mm çıkana kadar toprak elektrot kapiler içine sokun. Kabloyun karşı ucunu tutucuya bantlayın, toprak bağlantısı için ~5 mm açıkta bırakın.
9. Bir sonraki adımı başlık elektrodu için 70 mm bir tel ile tekrarlayın; böylece tel ile baş aşama konnektörü (altın renkli parça) arasında sağlam temas sağlansın. Headstage konnektör ucundan fazla kabloları kesin.
10. Her klorlu gümüş topu agaroza, top şaftı birleşiminin hemen üstüne batırarak ince, düz bir kaplama oluşturulur. En az 10 kez girip çık.
11. Elektrodu çekin ve agarozun oda sıcaklığında jelleşmesine izin verin. Gerekirse daldırmayı tekrarlayın, böylece onlarca mikrometre kalınlığında pürüzsüz, eşit bir agaroz kabuk elde edin. Tel üzerinde çok yüksek veya çok düşük kaplama yapmaktan kaçının (Şekil 2C).
12. Başlık ve topraklama elektrotlarını mikromanipülatörlere monte edin. Açıkta kalan toprak kablosunu (~5 mm) amplifikatör toprağına timsah klipsi ile bağlayın.
13. Cimbizle, her elektrodu top ucu ile kapiller arasında nazikçe bükerek, böylece top ucu mikroskop aşamasına dik olsun. Mikroskop görsel ve video yakalama görüntülerinde optik bozulmayı en aza indirmek için 90°'den fazla eğimliklerden kaçının.
14. Elektrot tutucularındaki yönü, agaroz kaplı top uçlarının mikroskobun görüntüleme düzlemine dik olacak şekilde ayarlanır (Şekil 3A).

6. Damla arayüz çift katmanlarının (DIB) oluşumu

1. Tersist mikroskobun sahnesine temiz, şeffaf bir petri kabı yerleştirin. Kabı alkan yağı ile (örneğin, %100 heksadekan veya %25/75% v/v dodekan/heksadekan) ~ 5 mm derinliğe kadar doldurun (Şekil 1B).
2. Mikromanipülatör kontrolleri kullanılarak, her iki agaroz kaplı top ucu yağ yüzeyinin ~2,5 mm derinliğine kadar indirin. Mikromanipülatör ile hızlı hareket etmekten kaçının, böylece elektrodla top başı ile petri kabına çarpışmalarını önleyin.
3. Mikroskop odakını her iki top uçları ve agaroz kaplamaları keskin odaklı hale getirene kadar ayarlayın. Elektrotları görüş alanının kenarına yakın konumlandırın ki her ikisi aynı anda gözlemlenebilecek şekilde değerlendirin.
4. Kalibre edilmiş 2 μL pipet kullanılarak, ekstrüze edilmiş lipid-peptid vezikül süspansiyonunu aspire eder. Süspansiyondan 250 nL'ni her agarose kaplı top ucuna yavaşça dağıtın; her biri için ayrı bir pipet ucu kullanılarak, agaroz kabuğuna pipet ucu değmeden.
   NOT: El titreşimlerini en aza indirmek ve stabiliteyi artırmak için, her iki dirseğinizi anti-titreşim masa kenarına sabitleyin. Pipetleme bileğini pipetleme olmayan elle stabilize edin, pipeti yavaşça yağın içine batırın ve elektrota yavaş yavaş yaklaşın. Damla yüklemesi sırasında kısa süreli nefes tutma, istenmeyen hareketleri daha da azaltabilir.
5. Damlacıkların yayılıp agaroz kabuğunu kaplamasına ve elektrottan yerçekimiyle uzaklaşmasına izin verin. Açıksa, Petri kabı duvarından yan tarafta sarkma gözlemleyin (Şekil 3B).
   NOT: Damla sarkması için gereken süre, vezikül boyut dağılımı, sıcaklık ve agaroz topoğrafyasına bağlıdır. DPhPC DIB'leri için, damla^{biriktirme 15'ten} en az 5 dakika sonra bekleyin.
6. Damla hazır olup olmadığını değerlendirmek için anti-titreşim tablosunu hafifçe itin. Sarkan damlaların elektrot hareketine göre hafif bir gecikmeyle hareket ettiğini doğrulayın; bu da tam kaplı lipid monotabakalı damlacıkların oluşmasını gösterir.
   NOT: Gecikmeli hareket, sulu damlanın etrafında bir lipid monotabakasının oluşmasının yüzey gerilimini önemli ölçüde düşürmesi ve elektrotun yağda hareket ettirildiğinde fiziksel tepkinin gecikmesiyle gerçekleşir.
7. Bu davranış gözlemlenmezse, 2–3 dakika daha bekleyip işlemi tekrarlayın.

7. Elektriksel kurulum ve çift katmanlı izleme (görsel ve elektrik)

1. Mikroskop, titreşim karşıtı masa, Faraday kafesi ve amplifikatörü, dijitalleştirici, fonksiyon üretyeni ve bilgisayar dahil tüm elektrik bileşenlerinin ortak bir toprakla bağlı olduğundan emin olun (Şekil 1).
2. Cihaz bağlantılarını üreticinin kurulum rehberine göre düzenleyin. Temel elektriksel ve optik konfigürasyon için şematik referans olarak Şekil 1C'yi kullanın. DIB deneyleri için^{topraklama 35}, donanım/yazılım yapılandırması ve pipet ofset ayarı ile ilgili ayrıntılı talimatlara bakabilirsiniz.
   NOT: Malzemeler Tablosu'nda listelenen tüm yazılım ve donanım için ekipmana özgü kurulum talimatlarını takip edin.
3. Baş kava ve toprak elektrotlarını patch-clamp amplifikatoruna bağlayın.
4. Harici bir fonksiyon üretecini (veya alım yazılımının çıkış kanalını) 10 Hz, 10 mV üçgen gerilim dalgası oluşturmak üzere yapılandırın. Bağlı bir osiloskopta ve alma yazılımında genlik ve frekansı doğrulayın.
5. Damlacıklar ~ 10 dakika sarktıktan sonra, mikromanipülatörleri kullanarak iki damlayı nazikçe temas ettirin. Elektrot pozisyonlarını, damlaların temas alanının başlangıçta çaplarının ~ 1/^dörtte bir kısmından fazla olmayacağı şekilde ayarlayın.
6. 10 Hz, 10 mV üçgen dalga formunu açın ve kapasitif akım tepkisini amplifikatör ve erişim yazılımıyla izleyin.
7. Kendiliğinden çift katmanlı oluşumu bekleyin; bu, elektriksel olarak genişleyen zirveden zirveye kapasitif akım yanıtıyla ve optik olarak çift katmanlı temastan kaynaklanan artan iç yansıma (oval görünüm) ile gösterilir (Şekil 4). Saf lipid çift katmanların üçgen voltaj uyarısına dikdörtgen akım platoları gösterdiğini, gA-doplanmış çift katmanların ~1:^10-4 lipid: peptidlerin ensemble ionik iletimini yansıtan eğimli platolar sergilediğini doğrulayın.
8. Damla temas alanını, elektrotları hafifçe hareket ettirerek ayarlayın; 10 Hz, 10 mV üçgen dalga formuna tepeden tepeye kapasitif akım yanıtı ~100–200 pA arasında olur; C16 veya C12/C16 yağlarında ~250–500 pF³³ kapasitans aralığına karşılık gelir.
   NOT: Yüksek frekanslı darbeler veya sıfır olmayan DC tutma voltajları, elektroıslanmaya ve aşırı çift katmanlı genişlemeye neden olabilir, bu da damlacık birleşmesine ve çift katmanlı yırtılmaya yol açabilir. 100–200 pA aralığı, çift katmanlı stabilitesi ile sinyal-gürültü arasında denge sağlar ve uyarım sırasında yeterli alan genişlemesine olanak tanır.
9. DIB birleşirse, elektrotları yağdan çıkarır. Elektrot başlıklarını lipid örnekleri ve agaroz için kullanılan aynı sulu tampon ile iyice durulayın.
10. Petri kabındaki sulu damlaları steril bir şırıngayla çıkarın. Gerekirse taze yağla doldurun, elektrotları tekrar batırın. LUV çözeltisini Bölüm 6'da tarif edildiği gibi elektrotlara yeniden yükleyin ve işlemi tekrarlayın.
11. Stabil kapasitif veya iletken yanıtlar doğrulandıktan sonra, üçgen dalga formunu kapatın ve uyarım protokolleri uygulamadan önce DIB'nin en az 15 dakika dengelenmesine izin verin.

8. Elektriksel uyarılma protokolleri

1. Nabız deneyleri (topluluk STP benzeri ve LTP / LTD benzeri tepkiler)
   1. Fonksiyon üretecini veya alım yazılımını, istenen genlik, süre ve darbeler arası aralıkta voltaj darbeleri iletecek şekilde yapılandırın (örneğin, PPF [eşleştirilmiş darbe kolaylaştırma] ve PPD [eşleştirilmiş darbe depresyonu] desenleri).
   2. Video yakalama yazılımını açın. Uygun kamera ve objektif lens ayarlarını seçin. Kare hızını en az 20 kare/s'ye ayarlayın ve kayıt sırasında sabit kaldığından emin olun.
   3. Veri toplama yazılımında, mevcut sinyal için örnekleme frekansını en az 5 kHz olarak ayarlayın.
   4. Yeni bir protokol oluşturmak için Acquire > New Protocol'e veya mevcut bir protokolü değiştirmek için Acquire > Edit Protocol tuşuna tıklayın. Acquisition Mode sekmesinde Epizodik Uyarım seçeneğini seçin. Koşu/deneme sayısını 1, süpürme/ koşuyu 1 olarak ayarla.
   5. Tarama süresini toplam deneysel süreden 4 saniye daha uzun olarak ayarlayın. 120 saniyelik bir STP protokolü (60 s PPF + 60 s PPD) için, uyarı öncesi ve sonrası başlangıç değerini 2 saniye için tarama süresini 124 saniyeye ayarlayın.
   6. Girişler sekmesinde, kayıt kanalını mevcut girişe atayın. Çıkışlar sekmesinde, uyarım kanalını elektrotları kontrol eden voltaj çıkışına atayın.
   7. Waveform sekmesini açın. A Sütununda, Tipi Step, First Level 0 mV ve First Duration olarak 2000 ms olarak ayarlayarak pre-stimulasyon temel çizgisi tanımlanır.
   8. B Sütununda (PPF) Tipi Adım olarak ayarlayın. İstenen voltaj genliğini (örneğin +100 mV), darbe süresini (örneğin 100 ms) ve Tren Hızını belirleyerek hedef görev döngüsüne karşılık gelen darbeler arası aralığı (örneğin %90,9) ayarlanır.
   9. C Sütununda (PPD), benzer şekilde Tip'i aynı genlik ve darbe süresiyle Step olarak ayarlayın, ancak istenen daha düşük görev döngüsüne (örneğin %28,6) ulaşmak için Tren Hızı veya darbe aralığını artırın.
   10. D Sütununda, A Sütununa (0 mV, 2000 ms) benzer bir uyarım sonrası temel çizgisi yapılandırın.
       NOT: Waveform sekmesindeki tüm dönemlerin toplam süresi, Mod/Hız sekmesindeki tarama süresini aşarsa, hata çözülene kadar tarama süresini biraz artırın.
   11. Protokolü tanımlayıcı bir isimle kaydedin (örneğin, "STP_120s").
   12. Video kaydını başlatın, ardından kırmızı daire "Kaydet" düğmesine tıklayarak hemen elektrik toplama/uyarıma başlayın. Alternatif olarak, uyarımın başlangıcı video kaydı ve elektrik alımını aynı anda tetikleyecek şekilde dijital bir tetikleyici yapılandırın.
   13. Uyarımanın ilk 60 saniyesi (PPF) için, ölçülen akım yanıtı genellikle ilk darbeden artar ve t = 60 saniye ile görünür bir platoya ulaşabilirken, son 60 saniye uyarımda (PPD) ölçülen akım yanıtı genellikle azalır (Şekil 5). Protokolün sonunda, elektrik alımını ve video kaydını aynı anda durdurun.
2. Tek kanallı deneyler
   1. Patch clamp amplifikatörün ön panelinde, External Command Input anahtarını KAPALI konuma getirin. Tutma voltajını +200 mV'a ayarlayın. Amplifikatörün dahili düşük geçirim filtresini 1 kHz'e ayarlayın. Edinim yazılımında, örnekleme hızını 10–50 kHz olarak ayarlayın ve sürekli "boşluksuz" kayıt modu seçin.
      NOT: Yüksek örnekleme hızları, elde edilen verilerin sinyal-gürültü oranını azaltabilir. Hızlı kapılı geçişler veya kısa ömürlü titreme durumları çözülürken daha yüksek örnekleme oranlarının kullanılması önemlidir. Gramicidin A'nın ortalama açık ömürleri genellikle 0.1 saniye ile 10 saniye arasında değişirken, titreme durumları alt ms ve μs zaman ölçeklerinde meydana gelebilir; bu nedenle, bu tür olayları yakalamak için ~50 kHz örnekleme hızları^{gerekebilir 36}. JSMURF ile sonraki tek kanallı idealizasyon analizi, değişken sinyal-gürültü^{oranları 37} ile kayıtlar arasında sağlam olay algılamaya olanak tanır.
   2. Harici bir komut uygulanmadığından, temel akım sinyalini kaydetmeye başlayın. Amplifikatorda, Voltaj Komutunu KAPA'dan "+"'a geçirerek DIB'e +200 mV DC voltaj uygulanır.
   3. Tek kanallı olayları yakalamak için ~15 saniyelik kayıt yapın ve temel kaymayı sınırlayın. Lipid:gA azı donun konsantrasyonu 1:5×^10-6 _olduğunda, kaydedilen akım kanal iletkenliği kapı olaylarının oluşumu ve ortadan kalkması nedeniyle adım benzeri görünür.
   4. Kaydı durdurmadan önce, Voltaj Komutunu "+" dan tekrar KAPALI olarak değiştirin. Veri alımı durdurun ve kaydı tanımlayıcı bir dosya adıyla kaydedin (örneğin, "DIB_C16_postPPF_200mV.abf").
      NOT: Tanımlanmış sürede tek kanallı kayıtlar, PPF/PPD için Bölüm 8'de tanımlanan sabit genlik ve sürelerle programlanmış Epizodik Uyarım ile de gerçekleştirilebilir. "Post-PPF" tek kanallı deneyler için, +200 mV DC voltajlı Epizodik Uyarım , PPF'nin 60 saniyesinden hemen sonra biriktirilir.

9. Membran alanı ve akı ekstrapolasyonu

1. Her topluluk deneyinin (STP, LTP/LTD) sonunda, mikromanipülatörlerle bir elektrodu yavaşça yanlatılara hareket ettirerek DIB'i ayırın.
2. Mikromanipülatör elektrot tutucusunu gevşet ve elektrodu tutucusunda ~45° döndürerek 125 μm gümüş telin görüntüleme düzleminde olmasını sağlar.
3. Elektrot yüksekliğini tel mikroskop altında keskin odakta olana kadar ayarlayın. Kamera yazılımıyla odaklı gümüş telin bir fotoğrafını veya ekran görüntüsünü çekin. Ölçek görüntüsünü piksel boyutunun milimetreye kalibrasyonu için daha sonra kaydedin.
4. Kaydedilen akım izlerini, ref. 28'de belirtilen prosedürlere göre işleyerek sürekli, artefaktsız akım vs zaman verisi elde edin (Şekil 6A).
5. Çerçeve-zaman eşlemesini, çerçeve indekslerini ölçülen kare hızına bölerek ve satın alma zaman damgalarına eşleyerek belirleyin.
6. Ölçek kalibrasyon görüntüsünü ve deney karelerini görüntü analiz yazılımına aktarın.
7. Ölçek kalibrasyon görüntüsünden bilinen tel çapını (125 μm) kullanarak yazılım kalibrasyon fonksiyonu (Analyze > Set Scale) kullanılarak mekânsal ölçeği ayarlayın.
8. Her deney için akı hesaplamaları için, toplam uyarılma süresini kapsayan N zaman noktası seçin (örneğin, 120 saniyelik deney boyunca 30 zaman noktası). İlk zaman noktasının ilk uyarı darbesine karşılık geldiğinden emin olun.
9. Her zaman noktasında, DIB çapını iki katmanlı kenar kesişimi boyunca bir çizgi çizerek ve uzunluğunu kalibre edilmiş birimlerle kaydederek ölçün.
10. Her ölçülen çapı, dairesel geometriyi varsayarak veya belirli lipid-yağı konfigürasyonu için uygun elips geometrik ölçek faktörünü kullanarak membran alanına (A) dönüştürün. Ortaya çıkan alanları, farklı deneysel koşullar için membran alanı evrimini zaman içinde değerlendirmek için kullanın (Şekil 6B).
11. Her zaman noktası için, ilgili akım değerini alana bölerek akı (I/A) elde edilir. Tüm N akı veri noktasını ilk akı değerine bölerek normalize edilmiş akı elde edilir; normalleştirilmiş akı analizi istendiğinde (I/A) / (I₀/_{A 0) ilk} darbeye normalize edilir (Şekil 6C).
12. Akışı veya normalize akını zaman ile darbe sayısı ile zaman arasında çiz. Tüm topluluk deneyleri için tekrar akış analizi (STP, LTP/LTD) (Şekil 6D).
13. PPD veya 2 dakikadan sonra ilk darbeye göre sürekli akı yükselmeleri veya normalleşmiş akı artışlarını gelişmiş iletken yorumlayın; ana dönüşler veya ilk darbe değerinin altında düşüşler depresif iletkenliği gösterir. Ortaya çıkan zaman dicillerini kullanarak yanıtları kısa vadeli plastisiteye benzer davranış (<2 dakika) veya uzun vadeli potensiye / depresyon benzeri davranış (> ~5 dakika) olarak sınıflandırın.

10. Tek kanallı analiz

1. Ham tek kanallı kayıtları tercih edilen bir analiz ortamına veya clampSeg arayüzüne aktarın ve yazılım fonksiyonlarının tam açıklamaları ve açıklamaları^{için 37'ye} bakın.
2. Deneysel alım filtresine uygun dijital bir alçak geçirim filtresi uygulayın (örneğin, 1 kHz Bessel).
3. Parametre yapılandırması.
   1. Alfa (α) = 0.05 seti ile her tespit edilen adımın rastgele gürültü dalgalanması olasılığı %<5'e sahip istatistiksel güven seviyesini tanımlar.
   2. Gürültü dağılımını tahmin etmek ve olay algılamanın istatistiksel sağlamlığını artırmak için 1 s segment başına 5.000-10.000 Monte Carlo yinelemesi belirtin.
      NOT: Analiz süresini azaltmak için mümkünse 1 s "parça" kadar paralel hesaplamalı işlem kullanın.
   3. JSMURF algoritmasını filtrelenmiş akım izinde çalıştırın.
4. Model doğrulama.
   1. İdealize edilmiş (kare dalga) iletkenlik izini filtrelenmiş akım izinin üzerine bindirin ve adım geçişlerinin deneysel sinyaldeki ani değişikliklerle örtüştüğünü görsel olarak doğrulayın.
   2. İdealize edilmiş izin konvolveli rekonstrüksiyonunu oluşturmak ve ham^{iz 37} üzerine bindirmek için bilinen alçak geçirimli filtre özelliklerini kullanın. Yeniden oluşturulan sinyalin kaydedilen akımın zamanlama ve genlik zarfıyla yakından eşleşip eşleşmediğini doğrulayın.
5. İletkenliğin ve ömür sürelerinin nicelendirilmesi.
   1. İdealize edilmiş izdeki en düşük stabil platoyu kapalı baz durumu olarak tanımlayın. İlk sıfır olmayan plato genliğini birincil açık durum iletkenliği (tek kanal seviyesi) olarak tanımlayın.
   2. Bu genliğin daha yüksek tam sayı katlarını çok kanallı açık durumlar olarak sınıflandırın (2+, 3+ vb.). Tam açık seviyelerden daha düşük olan ama stabil olan ara platoları alt iletkenlik durumları olarak tanımlayın.
   3. İdealize edilmiş izden her olayın genliğini ve süresini çıkarıp kutulayın; böylece iletkenlik genliği histogramları ve ömür boyu histogramlar oluşturulur.
6. Genlik histogramları ve ömür boyu dağılımları
   1. İdealize edilmiş iletkenlik-genlik histogramlarını, doğrudan filtrelenmiş verilerden üretilen genlik histogramlarıyla karşılaştırın. İdealize histogramların ayrık iletkenlik^{durumlarına (37}) karşılık gelen daha keskin, daha iyi ayrılmış zirveler gösterdiğini doğrulayın.
   2. Her deneysel koşul için, hayatta kalma fonksiyonu N(t)/N(0)'ı hesaplayın; burada N(0) açık olayların toplam sayısıdır (tam ve alt iletkenlik), N(t) ise t'den uzun süreli olayların sayısıdır. Kapalı durum aralıklarını bu analizden hariç tutun.
   3. N(t)/N(0) ile zaman karşılaştırması ve eşleştirilmiş üstel bozulma fonksiyonlarını tercih edilen bir yazılımda doğrusal olmayan en küçük kare rutini kullanarak çizin.
   4. Genlik histogramlarındaki iletkenlik dağılımı zirvelerindeki sağa kaymaları artan iletkenlik, N(t)/N(0)'daki daha uzun bozulma zaman sabitleri ile zaman grafiklerinde artan açık durum kararlılığı ve sola kaydırılmış dağılımları daha kısa kanal ömürleri olarak yorumlayın.
      NOT: Hava akımları, titreşim ve yakındaki hareket eden nesneler gibi çevresel rahatsızlıkları en aza indirin. Optik masaya yaslanmaktan kaçının ve sohbetleri deneysel kurulumdan uzak tutun. Elektromanyetik paraziti azaltmak için cep telefonlarını, tabletleri, dizüstü bilgisayarları ve diğer kişisel elektronik cihazları Faraday kafesinden en az 1,5 m uzakta tutun. Optik olarak şeffaf bir yağ rezervuarı kullanın ve damlacıkların ve çift katmanların kenarlarını keskinleştirmek için mikroskop aydınlatması ve kontrastını optimize edin. Sınır kontrastını artırır ve DIB çapının manuel ölçümlerini kolaylaştırırsa gri tonlu videolar alın ve/veya dışa aktarılsın. Sıcaklık etkilerini araştırmayan deneyler için, laboratuvar ortamının, mikroskop standının ve yağın 21–22 °C olarak tutulduğundan emin olun.

Results

DIB deneysel kurulumu
Kayıt sistemi, anti-titreşim masasında bir Faraday kafesi içinde yer alır; elektrik ve video verileri iki ayrı bilgisayar tarafından alınır (Şekil 1A), ancak bölünmüş ekran özellikli tek bir bilgisayar kullanılabilir. DIB örnek ortamı, belirli bir alkan yağı hacminde batırılmış iki agaroz kaplı elektrottan oluşur (Şekil 1B). Şekil 1C bu el yazmasında tanımlanan deneysel kurulum için temel elektriksel ve optik bağlantıların bir şemasını gösterir.

Şekil 1: Deneysel kurulum. (A) Yükseltic, dijitalleştirici, gürültü filtresi, fonksiyon üreteçleri ve elektrik ile video alımı için çift bilgisayar arayüzü dahil olmak üzere ana bileşenlerle birlikte anti-titreşim masası ve Faraday kafes muhafazası gösterilmiştir. (B) DIB örnek ortamının ve elektrotların üst ön görünümü. (C) Bu el yazmasında tanımlanan deneysel kurulumla ilişkili elektriksel ve optik bağlantıların şeması. Tüm bireysel bileşenler laboratuvar binasında ortak bir noktaya sahiptir. Tüm deneyler oda sıcaklığında (21–22 °C) gerçekleştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ag/AgCl elektrotlarının hazırlanması ve kalite kontrolü
Gümüş tel ucu eridiğinde küresel bir küre oluşur (Şekil 2A); Düşük kaliteli erimeler dikçe veya düzensiz görünür. Çamaşır suyu ile klorlanma, mat bir kahverengi-gri Ag/AgCl yüzeyi oluşturur (Şekil 2B). Topun üzerinde onlarca mikrometre kalınlığında ince, düz bir agaroz tabakası stabil damla desteği ve düşük empedanslı elektrokimyasal bağlantı için gereklidir; oysa düzensiz kaplama kötü damla tutumuna yol açar (Şekil 2C).

Şekil 2: Elektrot hazırlığı. (A) İyi ve düşük kaliteli elektrot erimelerinin mikroskop görüntüleri. (B) Klorlanmamış ve klorlu elektrot başlıklarının karşılaştırılması. (C) İyi ve düşük kaliteli agaroz kaplamalarına örnekler. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Elektrot kurulumu. (A) Monte edilmiş elektrot açısı hizasının üstten görünümü. (B) LUV yüklemesinden hemen sonra sarkmayan damlacıkları, monokatman oluşumundan sonra sarkan damlacıklarla karşılaştırmanın yan görünümü. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Elektrot konumlandırması ve damla sarkma davranışı
Yukarıdan aşağıya bakıldığında, optik bozulmayı en aza indirmek için elektrotların doğru açısal konumlandırılması gösterilir (Şekil 3A). Yan görünümler, LUV çözeltisi yüklendikten hemen sonra sarkmayan ve 5 dakika sonra sarkan lipid kaplı damlacıkları karşılaştırır (Şekil 3B). DIB oluşturmak için kullanılan sarkan damlalar, lipid monokatmanlarından kaynaklanan yüzey geriliminde önemli azalma nedeniyle harekete karşı gecikmeli fiziksel tepki gösterir; bu da tamamen lipid monolayer ile kaplanmış askı sulu bir damlanın oluşmasını görsel olarak doğrular. Sarkılma sağlandıktan sonra, üçgen dalga uyarısı kullanılarak çift katmanlı oluşum ve^{stabilitenin elektriksel doğrulanması sağlanır.}

Şekil 4: Damla arayüzü çift katmanlı oluşumu. (A) Damla temasından sonra çift katmanlı oluşumu ve genişlemeyi gösteren zaman geçişli dizisi. (B) İki katmanlı çapı ve alan tahmini için kullanılan iç membran yansıması. DIB görüntüleme, sistemin altından ters mikroskop aracılığıyla yapılır. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

DIB oluşumu ve alan ölçümü
Ardışık görüntüler, iki sarkan damlacık temas ettiğinde spontane çift katmanlı "fermuarlama" ve alan genişlemesini yakalar (Şekil 4A). Damla temasındaki parlak, iç oval şekilli yansımalar, bilayer çapını ve dolayısıyla membran alanını zaman içinde tahmin etmek için kullanılır (Şekil 4B).

Şekil 5: STP protokolü—uyarım ve yanıt. Eşleştirilmiş nabız kolaylaştırma (PPF, 0–60 s, kırmızı) ve çiftli nabız depresyonu (PPD, 60–120 s, mavi) sırasında temsil eden akım yanıtları (üstte) ve ilgili uyarım protokolü (altta) gösterilmiştir. PPF ve PPD darbeleri 100 ms süreli, OFF süreleri sırasıyla 10 ms ve 250 ms olup, %90,9 ve %28,6 görev döngüleri sağlar. Kolaylaştırma, iyon akımındaki net artışlara karşılık gelir; depresyon net azalmalara karşılık gelir. Güncel yanıtlar yalnızca ON dönemlerinde kaydedilir; görselleştirme için, darbeler arasındaki veriler aktarılır ve akımdaki genel eğilimleri vurgular. PPF ve PPD fazlarındaki darbe şematik zaman uzunlukları ve darbe sayısı ölçek olarak çizilmez ve görselleştirme amacıyla gösterilir. Podar PT ve ark.^,25'ten CC BY-NC-ND 4.0 altında temsil eden akım yanıt verileri. Telif Hakkı © 2025 Yazar(lar)). PNAS tarafından yayımlanmıştır. Uyarma şeması, mevcut el yazması için değiştirilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Kısa süreli plastisiteye benzeri davranışı (STP benzeri) indüksiyon için elektriksel uyarılma protokolü
Burada belirtilen uyarım desenleri, Koner ve Najem ^28,29'a benzer şekilde, sinirbilim terminolojisine benzederek çiftli nabız kolaylaştırma (PPF) ve depresyonu (PPD) temsil eder. Çiftli nabız kolaylaştırma (PPF; 0–60 s) ve çiftli nabız depresyonu (PPD; 60–120 s), sırasıyla 10 ms ve 250 ms OFF zamanlarına sahip 100 ms darbeler kullanılarak sağlanır; bu da PPF için %90,9 ve PPD için %28,6 görev döngülerine karşılık gelir. Üst panel ON dönemlerinde temsilli akım yanıtlarını gösterirken, alt panel uyarım desenini gösterir.

STP ve ardından gelen uzun süreli uyarım sırasında akım, alan ve iyon akısı
C16 ve C12/C16 yağlarında gA-doplanmış DPhPC çift katmanları için normalize akım (I/I₀) PPF ve PPD sırasında gösterilmiştir (Şekil 6A). 30 zaman noktasında ölçülmüş normalize edilmiş membran alanı (A/_{A 0}), farklı akımlara rağmen her iki petrol koşullarında da benzer alan evrimini ortaya koymaktadır (Şekil 6B). Normalleştirilmiş akım ve alan verileri, petrol koşutu başına 28 bağımsız DIB'± ortalama Güney Güney bulutları ve çubukları olarak temsil edilir. Normalize akı, J/J₀ = (I/I₀)/(A/_{A 0),} alandan bağımsız iletkenlik değişikliklerini ayırır ve basit alan genleşmesinin ötesinde membran iletimindeki değişikliklerle tutarlıdır (Şekil 6C). Ancak bu değişiklikler hem tek kanallı iletkenliğin hem de aktif yönlendirici kanalların sayısının katkılarını yansıtabilir. 30 dakikaya kadar uzatılmış PPD uyarısı, C16 membranlarında uzun vadeli depresyon benzeri (LTD) davranış oluştururken, C12/C16 membranlarında LTP benzeri davranışla tutarlı yüksek akıntıyı korur (Şekil 6D). Bu veriler birlikte, zar bileşiminin hem kısa hem uzun ölçekli plastisiteye benzer iyonik akı değişikliklerini modüle ettiğini göstermektedir.

Şekil 6: STP ve LTP/LTD'ye geçiş sırasında DIB'lerin akım, alan ve hesaplanan iyonik akısı. (A) C16 (turuncu) ve C12/C16 (mavi) yağlarında gA doplanmış DPhPC membranları için PPF (0–60 s, beyaz fon) ve PPD (60–120 s, gri arkaplan) sırasında normalize edilmiş akım (I/I₀) ve C12/C16 (mavi) yağlarda her durum n = 28 bağımsız oluşturulmuş DIB'den oluşur. (B) 30 zaman noktasında ölçülen normalize edilmiş membran alanları (A/A₀), farklı akım yanıtlarına rağmen karşılaştırılabilir alan yörüngelerini gösteriyor; veriler, aynı n = 28 bağımsız DIB'de petrol koşutu başına ortalama ± S.D. olarak gösterilir. (C) Normalize akı, J/J₀ = (I/I₀)/(A/A₀)), ilgili akım ve alan ölçümlerinden hesaplanır ve alan etkilerinin ötesinde iletkenlik değişikliklerini vurgular. (D) Uzun süreli PPD uyarısı altında uzun vadeli davranış: İlk 120 saniyelik STP'den (gri tonlu) sonra, DIB'ler 30 dakikalık PPD'ye maruz kaldı; ON = 100 ms ve OFF = 250 ms (düz kırmızı/yeşil) veya 30 s (turuncu/gri) darbeler oldu. C16 membranlarında akı kökene veya altına kadar azalır, bu LTD benzeri davranışı gösterir, ancak C12/C16 membranlarında yüksek kalır ve kalıcı LTP benzeri davranışı gösterir. Gölgelenmiş bölgeler, I/I₀ ve A/A₀'dan yayılan hatayı temsil eder. (D)'deki genişletilmiş PPD veri setleri, 120 s protokolü için yağ koşulu başına n = 6 bağımsız DIB'den alındı, ardından genişletilmiş PPD koşulu başına 3 DIB'den alındı. Tüm veri noktaları yalnızca görselleştirme amacıyla bağlanmıştır. A, B ve D panelleri CC BY-NC-ND 4.0 altında yeniden üretilmiştir. Telif Hakkı © 2025 Yazar(lar)). PNAS tarafından yayımlanmıştır. Panel C, mevcut makale için Podar PT ve ^ark.25'te bildirilen verilerden yeni oluşturulmuştur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

PPF uyarısı sonrası C16 yağında oluşan gA-doplanmış DIB'den temsil eden 15 s tek kanallı akım izi
İz, 1 kHz alçak geçirecek filtreyle 50 kHz'de yakalanan ham sinyali, 250 Hz 8 kutuplu Bessel filtreli iz ve idealize edilmiş JSMURF uyumunu içerir. En düşük kararlı seviye kapalı durumu tanımlarken, daha yüksek seviyeler tek kanallı, çok kanallı ve alt iletkenlik olaylarına karşılık gelir. Bu izler, iletken genlik ve ömür boyu analizin temelini oluşturur. Belirtilen iletkenlik durumu kalma süresi, genliği ve süresi, birden fazla eşzamanlı tam ve/veya alt iletkenlik olaylarının birleşimi yansıtan belirli bir iletkenlik seviyesinin süresini temsil eder.

İletkenlik genliği ve ömür boyu dağılımları
C16 ve C12/C16 membranları için iletkenlik genlik histogramları (Şekil 7A–B), PPF öncesi ve PPF sonrası koşulları DPhPC:gA molar oranı 1:5×^10-6 ile karşılaştırır. Verilerin altındaki Gauss yaklaşımları, PPF sonrası ortalama iletkenlik zirvelerindeki kaymaları gösterir ve alt iletkenlik ile çok kanallı durumlara karşılık gelen ayrı zirveleri çözer. İletkenlik dağılımlarının istatistiksel karşılaştırmaları, Welch'in t-testi ve Mann-Whitney U-testi (α = 0.05) kullanılarak birleştirilmiş olay düzeyindeki veriler üzerinde yapıldı; her koşul 3 bağımsız DIB kaydı ve belirli bir iletkenlik durumu için N, bu kayıtlar arasında toplanan toplam tespit edilen olay sayısını gösteriyordu. Yaşam boyu olasılık dağılımları, N(t)/N(0), öncesi ve sonrası (Şekil 7C–D), C12/C16 zarlarının C16'ya göre daha uzun kuyruk iletkenlik dağılımları ve değişen ömürler geliştirdiğini göstererek, kanal kararlılığındaki değişiklikleri gösterir. Histogram verileri, her koşul için elde edilen filtrelenmiş 15 saniyelik izi (kırmızı iz) temsil eder. İletkenlik durumu yaşam boyu dağılımları, her koşul için 3 bağımsız DIB kaydından oluşturuldu; noktalı eğriler bireysel tekrarları, katı eğriler ise N(t) / N(0) ile t'ye karşı küresel üstel uyumları gösterir.

Şekil 7: İletkenlik genlik histogramları ve iletkenlik durumu kurşun zaman dağılımları. (A) C16 ve (B) C12/C16 membranlarında gA aktivitesi için iletkenlik genlik histogramları, PPF öncesi (gri) ve PPF sonrası (turuncu / mavi) koşulları 5 × 10-6 gA:lipid molar oranında karşılaştırır. Histogramların altındaki Gauss yaklaşımları, tek ve çok kanallı durumlar için ortalama iletkenlik zirvelerinde ve standart sapmalarda kaymaları gösterir. PPF sonrası ortalama iletkenlikteki kaymalar, kesik çizgilerle (siyah = PPF öncesi; mavi/turuncu = PPF sonrası) ve oklarla gösterilir. Her koşul 3 bağımsız DIB kaydını temsil eder. İletkenlik dağılımlarının istatistiksel karşılaştırmaları, Welch'in t-testi ve Mann-Whitney U-testi (α = 0.05) kullanılarak birleştirilmiş olay düzeyindeki veriler üzerinde yapıldı; burada verilen iletkenlik durumu için N, bu üç kayıt boyunca toplanan toplam tespit edilen olay sayısını ifade eder. Alt iletkenlik olayları da analize dahil edildi; her zar durumu için ilk açık durum zirvesinin solunda temsil eden altilkens dağılımları gösterildi. C16 (C) ve C12/C16 (D) membranlarında PPF uyarısından önce (turuncu / mavi) ve sonrası (koyu turuncu / koyu mavi) 5×10-6 M gA:lipid'de iletkenlik durumu olaylarının yaşam boyu olasılık dağılımları, Şekil 7A–B'de gösterilen iletkenlik analizlerine karşılık gelir . Burada, N(t), t'den uzun süreli tam ve alt iletkenlik olaylarının kümülatif sayısını temsil eder. Noktalı çizgiler, bireysel tekrarlardan elde edilen yaşam boyu dağılımlarını gösterir (koşul başına n = 3 bağımsız DIB), katı yerleştirmeler ise doğrusal olmayan eğri uyum yazılımı kullanılarak gerçekleştirilen küresel üstel uyumları gösterir. Paneller A–D, Podar PT ve ark.25'ten alınmış ve mevcut el yazması için CC BY-NC-ND 4.0 altında derlenmiştir. Telif Hakkı © 2025 Yazar(lar)). PNAS tarafından yayımlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: PPF uyarımından sonra C16'da DIB'ler için tek kanallı davranışın incelenmesi—mevcut yanıt izi. (A) Örnek 15 s akım izi, ham veriyi gösteren (mavi), 250 Hz 8 kutuplu Bessel alçakgeçirici filtre (kırmızı) ile filtrelenmiş ve iletkenlik durumlarını tanımlamak için kullanılan idealize edilmiş iz (yeşil). En düşük kararlı seviye, temel "kapalı" durumu tanımlar. (B) 2^{. ve 3. tam} iletkenlik seviyeleri arasında tespit edilen temsil alt-iletkenlik seviyeleri, genlik histogramındaki belirgin ara zirvelerle doğrulanmış (bkz. Şekil 7A, turuncu). İletkenlik döl süreleri, kapalı durum hariç her tanımlanan iletkenlik seviyesinin süresinden çıkarılarak N(t)/N(0) yaşam dağılımları oluşturulur. Podar PT ve ark.^{, 25'ten} CC BY-NC-ND 4.0 altında yeniden üretilmiştir. Telif Hakkı © 2025 Yazar(lar)). PNAS tarafından yayımlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

PPF'yi takip ederken, C12/C16 zarları iletkenlik genlik dağılımlarında belirgin sağa kayma gösterir; bu, iletkenlik durumu yaşam dağılımlarında sola kaymayı göstermektedir; bu da kanal açık sürelerinin kısamasıyla uyumludur. Bu değişiklikler, PPF sırasında C12/C16 çift tabakasının elektromekanik inceltmesiyle uyumludur; bu da ref. 25'te bildirilen doğrudan mekanik ve kalınlık ölçümleriyle desteklenir; bu ölçüm, gA üzerinden iyon taşınımındaki enerjik bariyeri düşürür ve açılış başına iyon verimliliğini artırırken kanal kararlılığını azaltır. Buna karşılık, C16 zarları her iki dağılımda da minimum değişiklik gösterir ve bu da sınırlı yapısal uyum sağlamalarını vurgular. Bu sonuçlar birlikte, DIB platformunun membran elektromekanik adaptasyonunun hem topluluk hem de tek kanal korelasyonlarını yakalarken, membran bileşimine bağlı dinamiklerden kaynaklanan iyonik iletkenlikte STP benzeri ve LTP/LTD benzeri değişiklikleri de dahil olmak üzere (Şekil 8).

Discussion

Pratik anlamda, bu yöntem üç temel deneysel yetenek sunar: lipid bileşimi ve yağ fazı boyunca çift katmanlı bileşimin kontrol edilebilir varyasyonu, membran yeniden yapılandırmasının eşzamanlı optik ve elektriksel izlenmesi ve tek kanallı elektrofizyoloji ile mezoskal membran mekaniğini birleştiren membran alanı^{rejimine erişim} 14,15,20,21,25 . Bu özellikler, yöntemi özellikle basitleştirilmiş membran sistemlerinde yapı-fonksiyon çalışmaları için kullanışlı kılar; burada tam hücresel karmaşıklık yerine membran elektromekaniği ilgi çekici deneysel perspektif 14,15,20,21,25,39.

Bu protokol, alkan yağlarında gramicidin A-doped DIB'lerin montajı ve analizini, fizyolojik olarak ilgili elektriksel uyarım altında lipid membranlarının yeniden yapılandırılma yeteneğini^{incelemeyi açıklar} 14,15,25,35,38. Yama kelepçe^{teknikleri 21} ile karşılaştırıldığında, DIB platformu membran yamalarını sorgularken, ayrık iyon kanalı^{olaylarını yakalamak} için yeterli çözünürlüğü koruyarak 14,15,19,20,21,28,38 . Bu yetenek, mezoölçekli elektromekanik yeniden yapılanma (örneğin, elektroıslatma ve elektrokompresyon gibi) çözümlenmesinde ve bunun mikroskobik kanal davranışına bağlanması için özellikle değerlidir; bu davranışlar birlikte STP-, LTP- ve LTD benzeri membran iletkenliği fenotiplerini fizyolojik olarak uyarılmış^{uyarım altında oluşturur} 13,25,27,38 . Mevcut DIB sistemi, ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11} biyolojik sinapslarının moleküler karmaşıklığını çoğaltmak için tasarlanmamıştır . Buna göre, STP, LTP, LTD, PPF ve PPD gibi terimler, tanımlı uyarı protokolleri altında membran iyonik iletiminde kısa ve uzun zaman ölçekli artış ve azalmaları belirtmek için tanımlayıcı, benzetme temelli anlamda kullanılır. Bu çalışmanın temel bulguları, DIB'lerde membran elektromekaniği, iletkenlik adaptasyonu ve bileşime bağlı denge dışı yeniden yapılandırma açısından en doğrudan şekilde yorumlanır; bu da sinaptik plastisiteye dair faydalı kavramsal benzetmeler ve fiziksel bakış açıları sunabilir; ancak nöronal devrelere veya biyokimyasal sinaptik^{düzenlemeye mekanik eşdeğerlik anlamına gelmiyor} 10,11,25,38.

Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için birkaç teknik adım kritik öneme sahiptir. Ag/AgCl elektrodun dikkatli hazırlanması, gümüş küresel ucunun eşit erimesi, kapsamlı klorlama ve ince, eşit bir agaroz kaplaması dahil, damla tutumunun stabil olmasını ve düşük empedanslı elektrokimyasal^{bağlantı 20,35} sağlar. Damla sarkmasının görsel olarak doğrulanması ve elektrot yönünün doğru olması, video kaydı sırasında optik bozulmayı en aza indirir ve membran alanı ölçümlerinin doğruluğunu artırır. Bilinen gümüş tel çapı kullanılarak alınım sonrası ölçek kalibrasyonu, membran alanı ve iyon akışının güvenilir şekilde hesaplanması için temel olan sağlam piksel-mm dönüşümü sağlar. Bu çalışmada, membran iletkenliği (akı) birim alan başına akım (I/A) olarak tanımlanır ve elektroıslama sırasında DIB alanı değiştiği için, doğru akı niceliklendirmesi zamanla eşleştirilmiş akım ve çift katmanlı alan^{ölçümleri gerektirir} 13,25,27,35.

Bu yaklaşım aynı platform 14,15,20,25,35,38 içinde tamamlayıcı topluluk düzeyinde ve tek kanallı okumaları da destekler. Topluluk düzeyinde, senkronize video ve elektrik kayıtları, alan (elektroıslatma) ve akımdaki dinamik değişiklikleri nicelikle ölçülür; bu değişimden iyon akısı (akım/alan) türetilir. Elektriksel uyarım altında, zarlar denge dışı sabit durumlara (NESS) sürüklenir; burada bileşime bağlı membran yeniden yapılandırması, kısa zaman ölçekli plastisite benzeri tepkiler üretir ve uzun süreler içinde daha uzun zaman ölçekli potensiye benzeri veya depresyon benzeri davranışlara evrilebilir (min)25,26,28,29,30,31,32,^33,38. Tek kanal düzeyinde, analiz, akım izlerinin kademeli iletkenlik seviyelerine (kapalı, tek kanallı, çok kanallı ve alt iletkenlik durumları) idealize edilmesini içerir. Geleneksel kare dalga idealizasyon araçları genellikle sınırlı sayıda ayrık seviyeyi çözer; daha karmaşık veya gürültülü veriler için JSMURF gibi modelsiz idealizasyon yöntemleri tercih^{edilir 37}. JSMURF ile analiz edilen kısa DC tutma potansiyelleri, heterojen gürültü altında istatistiksel olarak titiz bir olay tespiti sağlar ve iletkenlik-genlik histogramları (tamsayı ve alt iletkenlik seviyeleri) ile N(t)/N(0) yaşam dağılımları sağlar. İdealize edilmiş ve filtrelenmiş genlik histogramlarının üst üste bindirmesi, iletkenlik durumu atamalarının görsel ve nicel çapraz doğrulamasını sağlarken, bilinen alçak geçirim filtresinden geçen idealize izler parametre seçimlerini ve olay^{sadakatini doğrular.}

Burada çevre yağ fazında (örneğin, C16 vs C12/C16) ayarlanmış zar bileşiminin, elektriksel uyarımda çift katmanlı viskoelastiklik ve yeniden yapılanma kapasitesini modüle etmesi beklenmektedir; bu, önceki^{çalışmada bildirilen doğrudan ölçümlerle uyumlu} olarak 22,25,39. Daha uyumlu membranların PPF^22,23,25 sırasında daha büyük EC kaynaklı inceltme ve gA ile geliştirilmiş hidrofobik uyum göstermesi beklenmektedir; bu da LTP benzeri davranış olarak stabilize edilebilecek tek kanallı iletkenlik ve kolaylaştırma artışına yol^{açar 25,38}. Buna karşılık, daha sert zarlar sınırlı yapısal tepki, PPF ve PPD sırasında daha küçük iletkenlik değişiklikleri ve uzun süreli nabız altında LTD eğilimi gösterir. Bu bileşime bağlı sonuçlar, malzeme özelliklerinin membranları farklı, işlevsel olarak ilgili uzun vadeli rejimlere nasıl yatkın^{olduğunu ortaya koymaktadır} 22,23,25,39.

DIB platformunun da önemli sınırlamaları^{vardır 21}. Burada geliştirilen mekanik yorum, yağ bileşimindeki farklılıkların çift katmanlı malzeme özelliklerini ve elektromekanik yeniden yapılandırılmaya yatkınlığı değiştirdiği, bunun da gramisidin A^iletimi 22,23,25 modüle ettiği yönündedir. Bu yorum, önceki çalışmayla desteklenmektedir; bu çalışma doğrudan membran viskoelastisliği, yüzey gerilimi ve bu membran koşulları ve uyarım altında dinamik membran kalınlığı^{değişikliklerini ölçmüştür. 22}. Ancak mevcut çalışmada, bu malzeme özellikleri her deneyde aynı anda ölçülmemiş ve bu nedenle burada C16 ve C12/C16 ortamlarında zarların elektriksel uyarılmasına yönelik farklı yapısal ve mekanik yanıtları desteklemek için kullanılmıştır; verilerin mekanik yorumunu bağımsız olarak oluşturmak yerine. Ayrıca, topluluk akımı ve akı hem tek kanal iletkenliğindeki değişiklikleri hem de ileken kanal sayısındaki değişiklikleri yansıtabilir; bu değişiklikler membran alanı, peptid difüzyonu ve denge dışı koşullarda dimerleşme ile değişebilir^. 17,18,22,23. Çevresindeki yağ fazı da uyarım sırasında iki katmanlı çekirdeğe dinamik olarak sızabilir veya geri çekilebilir; bu da tek kanallı kayıtlarda taban kaymasına ve membran bileşimindeki kademeli değişikliklere katkıda bulunur 13,21,25. Bu faktörler birlikte, statik membran özelliklerini tanımlamak için uzun süreli sabit gerilim kayıtlarının kullanımını sınırlar ve DIB'lerin kapalı denge membranları yerine açık, dinamik sistemler gibi davrandığını^vurgular 13,21,25. Böylece, mevcut protokol uyarıma bağımlı, plastisiteye benzer iletkenlik değişikliklerini amaçlanan deneysel^{zaman ölçekleri 25,38} boyunca yakalarken, doğrudan mekanik ölçümleri eşzamanlı elektriksel ve optik kayıtlarla birleştiren gelecekteki çalışmalar, potansiyel olarak floresans tabanlı tek molekül görüntülemeyle birlikte, membran yeniden yapılanma, kanal iletkenliği ve kanal popülasyonu gibi katkıları daha tam olarak çözmek için gereklidir^21,25.

Yaygın arıza modları arasında kararsız damla tutması, eksik damla sarkması, çift katmanlı oluşum sırasında erken damla birleşmesi ve alan analizinde çift katmanlı kenarın kötü optik tanımlanması yer alır. Kararsız damla tutuşması genellikle düzensiz gümüş küre geometrisi veya düzensiz agaroz kaplama nedeniyle oluşur ve top simetrisinin doğrulanması ve düzgün bir agaroz kabuğunun korunmasıyla azaltılabilir. Elektrot yüklemesi ayrıca nanolitre boyutunda sulu damlaların submilimetre elektrot kafasına manuel olarak biriktirilmesini gerektirir; bu da farklı kırılma indekslerine sahip ortamlar arasında (hava ve yağ) önemli el-göz koordinasyonu ve derinlik algısı gerektirir. Sonuç olarak, pipet ucu istemeden agarose kabuğuna temas edebilir veya dağıtım sırasında elektrot başlığını ıslatabilir. Bilek desteği, yağda yavaş pipet ilerlemesi ve nefes tutma gibi stabilite artırıcı teknikler ve tekrarlanan pratik ile birlikte yükleme becerisi artırılabilir. Ayrıca, eksik sarkma veya gecikmeli monotabaka oluşumu vezikül heterojenliği, sıcaklık değişimi veya agaroz topoğrafyasından kaynaklanabilir ve damla^{biriktirme sonrası bekleme süresinin artırılması ile iyileştirilebilir 15,20,35}. İki katmanlı oluşum sırasında koalesans genellikle aşırı temas alanı veya aşırı agresif elektriksel uyarımla (> ± 200 mV) ilişkilidir ve daha küçük başlangıç damlacık temas alanları kullanılarak azaltılabilir; böylece tek katmanlı stabilizasyon için ek zaman sağlanır ve düşük genlikli üçgen dalga kapasitans yanıtı doğrulanır,^ardından 25,35,38 darbe vurulur.

Bu kısıtlamalara rağmen, DIB platformu son derece ayarlanabilir, ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir 14,15,20,21,25,35,38,40 ve lipid mekaniğinin iletimdeki katkısını izole ederek protein merkezli elektrofizyolojiyi^tamamlar 22,23,25 . Topluluk ve tek kanallı ölçümleri tek bir sistemde birleştirerek, bu protokol, elektriksel çalışma ve zar viskoelastikiliğinin nasıl birleşerek sinaptik benzeri iletken davranışlar (STP benzeri, LTP benzeri ve LTD benzeri tepkiler) ürettiğini kontrol edilebilir, aşağıdan yukarıya doğru model 25,29,30,31,32,33,38 şeklinde pratik bir yol sunar. Bu nedenle, metodoloji, zarlarda bileşime bağlı öğrenme kurallarının sistematik olarak incelenmesi ve mekanik ve elektriksel güçlerin membran proteinlerini konak çift katmanlarına zamansal ve mekansal ölçeklerde nasıl bağladığını niceltmek için^{bir temel sunar 21,22,23,25}. Bu yetenekler birlikte, DIB'leri karmaşık nörobiyolojik davranışları yönetilebilir, test edilebilir biyofiziksel mekanizmalara dönüştürmek için güçlü bir çerçeve^{olarak konumlandırır} 10,11,25,38.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-diphytanoy-sn-glisero-3-fosfokolin (DPhPC)	Avanti Polar Lipidleri	850356P/850356C	Liyofilize toz (P) veya kloroform (C)  olarak satın alınmıştır;
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Agarose (0.5g agarose tabletleri)	Kıyaslama	A2501	Toz formunu veya tabletleri kullanabilirsiniz
Agilent Technologies 33522A dalga formu jeneratörü	Keysight	–	BNC kablo çıkışlı herhangi bir dalgaform jeneratörü kullanabilirsiniz
Argon (Ar) gazı	Airgas	AR UHP300; 72-402221259-1	Argon Sıkıştırılmış; Ultra Yüksek Saflık
Analitik denge	Mettler Toledo	Model: MS304S/03	0.0001 g hassasiyetle herhangi bir laboratuvar düzeyinde analitik denge
Axopatch 200B Amplifikatör & nbsp;	Moleküler Cihazlar	–
BK Precision 4017B 10 MHz DD Süpürme/Fonksiyon Üreteci	Digi-Key	BK4017B-ND
Borosilikat Cam Kapaklar	Dünya Hassas Aletleri	1B100F-4
Clampex pCLAMP 11 Yazılım Paketi	Moleküler Cihazlar	–
DigiData 1550B sistemi	Moleküler Cihazlar	–	Buna bir mini ekstruder, 2 şırınga, 100 PC membran, 100 filtre desteği ve 1 tutucu/ısıtma bloğu dahildir
Dodekan, %99	Sigma-Aldrich	112-40-3
tutucu/ısıtma bloğu ile ekstruder seti	Avanti Polar Lipidleri	610000
Fiji yazılımı	ImageJ	–
Dondurucu (-80 derece ve derece; C)	Fisher Scientific	Isotemp; Model: 8964; S/N: 828278-21
Cam Eşyaları	VWR International	–
Gramicidin-A	Millipore Sigma	368020
Heksadekan, %99	Sigma-Aldrich	544-76-3
Hum Bug Gürültü Giderici (60Hz)	A-M Sistemleri	726300
Ters Mikroskop Sistemi (Nikon Ti2-A)	Nikon	–	Herhangi bir ters veya dik mikroskop kullanılabilir
İzopropil Alkol	VWR International	BDH1133-4LP
Mikroelektrot Tutucu	Dünya Hassas Aletleri	MEH1S
Mikromanipülatörler	Sutter Enstrümanı	MP-285	Manuel manipülatörler kullanılabilir
Mikroskop Kamerası	Olympus	DP74
Microsoft Excel	Microsoft	–
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
NIS-Elements Mikroskop Kamera Yazılımı	Nikon	–	Canlı görüntü ve/veya video yeteneğine sahip kamera yakalama yazılımı kullanılabilir. Canlı görüntü ve eşzamanlı ekran kaydı, video yakalamanın yerine kullanılabilir.
Parafilm M Çok Amaçlı Laboratuvar Filmi	Parafilm	PM999
Petri Kabı	-	-	Tabağın alt kısmı şeffaf olmalı ve ideal olarak yan duvar da
Potasyum Klorür (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Tozsuz Yumuşak Nitril Muayene Eldivenleri	VWR International	CA89-38-272
Soğutucu (4 derece ve derece; C)	Fisher Scientific	KAT NO: 97-938-1; Model NO: 3556FS
Gümüş tel	GoodFellow	147-346-94
Karıştıran Sıcak Plaka	Termo Bilimci	SP131325