Yöntem makalesi

Xenopus Erken Embriyolarından Tek Hücrelerin İzole Edilmesi ve Boyutlarına Göre Sıralaması

DOI:

10.3791/70630

⸱

20 Mart 2026

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xenopus laevis erken embriyolarından tek hücrelerin izole edilmesi ve hücre boyutuna göre ayırılması için bir yöntem tanımlıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erken embriyogenez, hücre boyutunda üstel bir azalma gerektirirken, embriyo gelişimin en erken aşamalarında sabit kalır. Fonksiyonel önemi ve hücre büyüklüğünün embriyo gelişimini etkileme mekanizmaları hâlâ büyük ölçüde az incelenmiştir. Xenopus erken embriyosu, bu büyük boşlukları kapatmak için benzersiz bir sistem sunar. Diğer model organizmalarla karşılaştırıldığında, Xenopus erken embriyosu son derece büyüktür ve hayvan kutbundaki küçük hücrelerden vegetal kutbu büyük hücrelere, orta blastula geçişi aşamalarında tüm embriyo boyunca hücre büyüklüğünde bir gradyan içerir. Burada, Xenopus erken embriyolarından tek hücrelerin ayrılması ve boyutlarına göre farklı ağ gözenek büyüklüklerine sahip hücre süzgeçleri kullanılarak ayırılması için bir protokol açıklıyoruz. Görüntüleme ve boyut ölçümleriyle belirlendiği üzere, sıralanmış hücreler beklenen boyut aralığındadır ve canlı hücre analizi veya dizileme için kullanılabilir veya görüntüleme için sabit hale getirilebilir. Bu sistem, erken geliştirme sürecinde boyuta bağlı düzenleyici mekanizmaların ortaya çıkarılmasına yeni bir ışık tutacaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre boyutu değişikliği, erken embriyogenezde yaygın bir özelliktir; döllenmiş yumurta birden fazla bölünme turundan geçerek giderek daha fazla hücre üretir. Hücre büyüklüğünün hücre fonksiyonlarını kontrol eden önemli bir parametre olarak rolü hakkında çok şey bilinse de 1,2,3, ancak hücre büyüklüğünün erken gelişimi nasıl etkilediği daha az bilinmektedir. Çeşitli model embriyon sistemlerde yapılan son çalışmalar, hücre boyutunun zigotik genom aktivasyonunu (ZGA)4 ve hücre kaderibelirtisini 5'i düzenlediğini göstermekte, bu da hücre büyüklüğünün gelişim kararlarında önemli bir rolüdesteklediğini göstermektedir 6,7.

Xenopus erken embriyosu, hücre boyutuna bağlı gelişimsel karar alma süreçlerini incelemek için önemli bir modeldir. Xenopus erken embriyosu büyük olduğu için (~1,2 mm çapında), fiziksel olarak boyutunu kolayca manipüle edebilir; bu da hücre boyutu değişikliğinin doğrudan sonuçlarını değerlendirmek için faydalı olur. Örneğin, farklı boyutlarda mini embriyolar, 1-hücreli embriyoların saçhalkaları 4,8 kullanılarak daraltılması yoluyla üretilebilir ve doz bağımlı ZGA4 gösterilir. Ayrıca, Xenopus erken embriyosu, hayvan-vejetal ekseni boyunca hücre boyutlarının gradyanı içerir; en küçük hücreler hayvan kutbunda, en büyük hücreler ise bitki kutbundadır; bu dahacim 4'te 100 kattan fazla fark gösterir. Önemli olarak, tam montajlı embriyoların tek hücrelerinde yeni başlayan transkriptleri doğrudan görselleştirip nicelikle, ZGA4'ü düzenleyen bir hücre boyutu eşiği tespit ettik. Ayrıca, Xenopus erken embriyolarından tek hücrelerin izolasyonu ve boyutlarına göre sıralaması, hücre boyut eşiği ZGA4'ün önemini doğrulamıştır.

Burada, Xenopus laevis erken embriyolarından tek hücrelerin izole edilmesi ve boyutlarına göre sıralaması için ayrıntılı prosedürleri açıklıyoruz. Xenopus erken embriyoları, Ca2+, Mg2+ serbest ortamda (CMFM)9 kuluçka yoluyla bireysel hücrelere ayrılabilir ve bu tek hücreler, farklı ağ gözenek boyutlarına sahip hücre süzgeçleri kullanılarak ayrıca ayrılabilir. Sıralanan hücreler saflaştırılabilir ve canlı hücre analizi, dizileme veya görüntüleme testleri gibi çeşitli uygulamalarda kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan hayvan çalışmaları, Güney Carolina Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Çözelti hazırlığı

NOT: Protokole başlamadan önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın.

  1. 20× MMR hazırlayın: 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl2 ve 40 mM CaCl2 karıştırın. NaOH ile pH'ı 7.8'e ayarlayın. Otoklav yapıp oda sıcaklığında depolayın.
  2. Ca2+, Mg2+ serbest ortam (CMFM) hazırlayın: 50,3 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 9,2 mM Na2HPO4, 0,9 mM KH2PO4, 2,4 mMNaHCO 3 ve 1,0 mM EDTA karıştırın. Gerekirse pH 7.4'e ayarlayın. Otoklav yapıp oda sıcaklığında depolayın.
  3. 60 mm Petri kabında %1,5 agaroz jeli hazırlayın: 50 ml CMFM'ye 0,75 g agaroz ekleyin. Agarozu mikrodalga fırında çözmek için ısıtın. İnce bir tabakayı 60 mm Petri kabında kaplamak için 5-10 ml agaroz jeli ekleyin.
  4. %15 yoğunluklu gradyan ortamı (ağırlık/hacim)/CMFM hazırlayın: 100 mL CMFM'ye 15 g yoğunluk gradyan ortamı yavaşça ekleyin. Çözülmeyi kolaylaştırmak için, yoğunluk gradyanı ortamı tamamen çözünene kadar bir tabakta ısıtın ve karıştırın. Çözeltiyi kullanana kadar 4 °C'de tutun.
  5. %4 PFA/1× MEM hazırlayın: 1 şişe (10 mL) %16 paraformaldehit stoku ve 4 mL 10× MEM (1000 mM MOPS pH 7.4, 20 mM EGTA ve 10 mM MgSO4) karıştırın. 40 mL'ye ultrasaf su ekleyin.
    NOT: Xenopus embriyolarını elde etmek için, in vitro fertilizasyon (IVF) yapmak için standart bir protokolü takip edin (örneğin, bkz. Sive ve ark., 2007)10. Embriyo 0.1× MMR içinde kullanıma hazır olmalıdır.

2. Erken embriyoların tek hücrelere ayrılması

  1. %1,5 agaroz jeliyle kaplanmış yeni 60 mm petri kabına ~15 mL CMFM ekleyin. Plastik transfer pipeti kullanarak 10-100 embriyoyu (deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak) tabağa aktarın. Kabı stereomikroskop altına alın.
  2. Vitellin zarını dikkatlice çıkarmak için her iki elinizle cımbız kullanın; embriyoların yüzeyine bir cımbızla tutun, diğeriyle soyun. İşlem sırasında embriyolara zarar vermekten kaçının.
  3. Devitelli embriyoları CMFM'de oda sıcaklığında ~1 saat kuluçka edin. Tabağı her 5 dakikada bir çok nazikçe sallayın, böylece hücrelerin ayrışmasını kolaylaştırın. Blastomer yığınları görünmeyene kadar düzenli kontrol edin (Şekil 1).

3. Dissosiyasyon yapmış hücrelerin boyutlarına göre sıralanması

  1. Blastomer ayrışması sırasında, hücre boyalayıcıları (40 μm, 70 μm ve 100 μm) CMFM ile doldurulmuş bireysel Petri kaplarına batırın (Şekil 2). Yemekleri belirtildiği gibi soldan sağa sırayla yerleştirin. Ayrıca, her ayırma sırasında hücre boyalarının kısa süreliğine yıkamak için gruplar arasında iki CMFM dolu tabak daha ekleyin.
  2. İzole tek blastomerleri içeren kabı nazikçe çevirerek yemeğin ortasında zenginleştirin. Blastomerleri dikkatlice CMFM'deki 40 μm boyaıcıya aktarın.
  3. Süzgeçi birkaç kez nazikçe sallayın, blastomerlerin 40 μm < süzgeçten geçmesi sağlanır. Sonra 40 μm süzgeci kısa yıkama için CMFM dolu kaba hızla taşıyın. 40 μm süzgüzcüdeki blastomerleri, yani 40 μm > dikkatlice 70 μm süzgecine aktarın.
  4. Blastomerler 100 μm süzgecinde sıralanana kadar adımları tekrarlayın.
  5. Her tabağı sıralanmış blastomerlerle nazikçe karıştırarak yemeğin ortasında zenginleştirin. Blastomerleri (~4 mL) dikkatlice %15 yoğunluklu gradyan ortamının 0,5 mL üstüne, floresansla aktiflenen hücre ayırma (FACS) tüpünde aktarın (Şekil 3). Karıştırmaktan kaçının.
  6. Tüpü 10 dakika bekletin. Sağlam blastomerler, yerçekimi ile dibine çöker, ayırma ve transfer sırasında patlayan blastomerlerden sarı küreklerinden ayrılır (Şekil 3).
  7. Sonraki deneylerin amacına bağlı olarak, canlı hücre analizine devam edin, blastomerleri RNA çalışması için sıvı azotta dondurun veya blastomerleri immünboya için sabitleyin (Şekil 3).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xenopus laevis embriyoları (n = 50) 9. evrede CMFM ortamında kuluçka edilip bu protokole uygun olarak tek blastomerlere ayrılmıştır (Şekil 1'deki bir örneğe bakınız). Dissosiyasyon yapmış tek blastomerler, yukarıda açıklandığı gibi 40 μm, 70 μm ve 100 μm hücre süzgecileri kullanılarak sıralı olarak sıralandı. Sıralanmamış kontrol karışımı ve tek blastomerler %4 paraformaldehit ile sabitlendi ve parlak alan mikroskobu altında görüntülendi (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre büyüklüğü, hücresel fonksiyonlariçin temel öneme sahiptir ve erken gelişim üzerindeki etkisi model embriyon sistemlerde daha fazla inceleme gerektirir. Burada, Xenopus laevis erken embriyolarından tek hücrelerin izole edilmesi ve hücrelerin boyutlarına göre hücre süzgeçleri kullanılarak sınıflandırılmasının detaylarını anlattık; bu durum hücre büyüklüğü çalışmaları için potansiyel olarak uygulanabilir. Bu yöntem, erken embriyogenezde boyut kontrollü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazar, rekabet eden bir çıkar olmadığını belirtir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pennsylvania Üniversitesi'ndeki Matthew Good laboratuvarına eğitim için teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma, kısmen Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü (R03HD105802) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%16 Paraformaldehit (PFA)EMS15710-SFiksatif çözümü yapmak için
60 mm Tek Kullanımlık Petri KaplarıVWR25384-092Embriyoların kuluçkalanması için
ACCU-SCOPE 3075 Zoom StereomikroskoplarıVWR470351-130Embriyoları görselleştirmek için
AgaroseSigma-AldrichA-9414Petri kaplarının kaplanması için
Hücre Süzgüzcüsü, 100 & mikro; mVWR76327-102Hücreleri boyuta göre ayırmak için
Hücre Süzgüsü, 40 ve mikro; mVWR76327-098Hücreleri boyuta göre ayırmak için
Hücre Süzgüsü, 70 ve mikro; mVWR76327-100Hücreleri boyuta göre ayırmak için
Tek Kullanımlık Transfer PiputlarıVWR414004-035Embriyoların transferi için
Dumont cımbız, Stil 5Elektron Mikroskopi Bilimleri72701-DVitellin zarını çıkarmak için
Cam Petri Kabı, 60 kez ve kez; 15 mmVWR75845-542Embriyoların kuluçkalanması için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. Cell biology. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075(2015).
  2. Xie, S., Swaffer, M., Skotheim, J. M. Eukaryotic cell size control and its relation to biosynthesis and senescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 38, 291-319 (2022).
  3. Chadha, Y., Khurana, A., Schmoller, K. M. Eukaryotic cell size regulation and its implications for cellular function and dysfunction. Physiol Rev. 104 (4), 1679-1717 (2024).
  4. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  5. Hubatsch, L., et al. A cell size threshold limits cell polarity and asymmetric division potential. Nat Phys. 15 (10), 1075-1085 (2019).
  6. Fung, H. F., Bergmann, D. C. Function follows form: How cell size is harnessed for developmental decisions. Eur J Cell Biol. 102 (2), 151312(2023).
  7. Chen, H., Qian, W., Good, M. C. Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development. Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).
  8. Clute, P., Masui, Y. Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos. Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).
  9. Venkataraman, T., Dancausse, E., King, M. L. PCR-based cloning and differential screening of RNAs from Xenopus primordial germ cells: Cloning uniquely expressed RNAs from rare cells. Methods Mol Biol. 254, 67-78 (2004).
  10. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. 2007, (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tek H cre zolasyonuH cre Boyutu Ay klamasBlastomer DisosyasyonuH cre S zge leriYo unluk GradyanFloresan Aktive Ay klamaH cre D ng s AnaliziTek H cre DizilemeKonfokal G r nt leme

İlgili makaleler