Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Toxoplasma gondii için Sürün Tipi için Çok Lokus Dizileme

265 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70645

⸱

26 Mayıs 2026

 , 
1Department of Biosciences, Durham University, 2Department of Parasitology, Faculty of Veterinary Medicine, New Valley University

Bu makalede

Özet

Burada, seçilmiş genetik belirteçlerin taşınabilir nanopore dizileme kullanılarak Toxoplasma gondii suşlarını hızlı tanımlama ve genotipleme protokolü sunuyoruz; bu protokol, laboratuvarda bakımı yapılan izolasyonlarda ölçeklenebilir, hedeflenmiş suş tanımlamasını mümkün kılacak ve gelecekte gözetim ortamlarında uygulanabilecek bir yöntemdir.

Özet

Toxoplasma gondii , küresel olarak yayılan ve önemli genetik çeşitlilikle karakterize edilen bir apicomplexan parazittir ve suş ayrımcılığı için doğru moleküler yaklaşımlar gerektirir. Bu protokolün amacı, kültürlenmiş T. gondii izolalarının hedefli çoklu lokuslu genotiplenmesi için tekrarlanabilir bir iş akışı oluşturmaktır. Bu işlem, temsil Tip I (RH) ve Tip II (ME49) suşlarının in vitro yayılmasını, genomik DNA'nın çıkarılmasını, SAG2 ve SAG3 genlerinin lokus-spesifik amplifikasyonunu ve tek-nükleotid polimorfizmlerini (SNP) ve yerleştirme/silinme (INDEL) olaylarını tespit etmek için dizileme tabanlı analizleri içerir. Dizileme verileri, yüksek güvenli uzlaşma dizileri oluşturmak ve gerilime özgü polimorfizmlerin tanımlanması için karşılaştırmalı hizalama yapmak için işlenir. Bu iş akışının arketipik suşlara uygulanması, yüksek haritalama verimliliği, hedef lokuslar arasında tutarlı okuma derinliği ve beklenen amplikon boyutlarının doğru geri kazanımı göstererek, lokus düzeyindeki genetik varyasyonun güvenilir tespitini doğruladı. Kapsamlı genotip ataması ek standartlaştırılmış belirteçlerin dahil edilmesini gerektirse de, bu protokol laboratuvarda korunan T. gondii izolalarının hedefli genetik karakterizasyonu için ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir bir çerçeve sağlar ve tutarlı çoklu lokus dizisi analizini destekler.

Giriş

Toxoplasma gondii, küresel olarak yayılan bir apicomplexan parazit ve büyük bir gıda ve su kaynaklı zoonotik tehdittir ve neredeyse tüm sıcak kanlı hayvanları enfekte edebilir; kesin konakçılar ise kedilerioluşturur 1. İnsanlarda ve hayvanlarda enfeksiyon genellikle doku kistlerinin veya sporüllenmiş oosistlerin yutulmasıyla gerçekleşir ve parazitin taşizoit ve bradyzoit evreleri arasında geçiş yapabilme yeteneği, sinir ve kas dokularında uzun süreli kalıcılığı sağlar; bu da hem et yoluyla hem de çevresel bulaşıma katkıdabulunur 2,3.

Avrupa ve Kuzey Amerika'da üç klonal soy (Tip I, II ve III) hakim olmasına rağmen, atipik ve rekombinant suşlar dahil olmak üzere geniş genetik çeşitlilik, özellikle zengin vahşi yaşam rezervuarlarına sahip bölgelerde küresel olarak belgelenmiştir4. Bu nedenle, doğru suş ayrımcılığı, iletim dinamiklerini aydınlatmak, salgınları araştırmak ve bölgesel epidemiyolojiyi anlamak için gereklidir. PCR-RFLP, Sanger tabanlı çoklu lokus dizisi tipleme (MLST) ve mikro uydu analizi gibi geleneksel genotipleme yaklaşımları, T. gondii popülasyon yapısını anlamamıza önemli katkılar sağlamıştır, ancak çözünürlük, verimlilik ve genotip içi varyasyonu tespit etme yetenekleri açısından sınırlıdır. Bu yaklaşımlar genellikle birden fazla ayrı reaksiyon gerektirir ve polimorfiklokus 1 içindeki yerleşmeleri, silinmeleri veya karmaşık haplotipleri tespit edemeyebilir. Kısa okuma yeni nesil dizileme (NGS), nadir varyantların tespitini geliştirmiş ancak karmaşık yapısal değişiklikleri belirlemede kısıtlıkalıyor 4.

Uzun okuma dizileme platformları, özellikle Oxford Nanopore Technologies, artık yapısal varyantları ve yüksek polimorfik lokusları çözmek için uygun sürekli yüksek hassasiyetliokumalar üretme yeteneği sunuyor 5. Taşınabilirlikleri, gerçek zamanlı analiz yetenekleri ve amplikon tabanlı iş akışlarıyla uyumlulukları, saha uygulamaları ve salgın araştırmaları için umut vadeden araçlarhaline getirir 6. Bu avantajlara rağmen, rutin T. gondii genotiplemesi için standartlaştırılmış çoklu lokuslu uzun okuma iş akışları sınırlı kalmaktadır.

Bu boşluğu gidermek için, iki polimorfik lokusu hedefleyen ölçeklenebilir uzun okuma amplikon dizileme iş akışı oluşturduk (Şekil 1). Konsensus parlatma ve varyant çağırma boru hattıyla birleşince, bu yaklaşım SNP ve INDEL'lerin doğru tespitini sağlar ve sürünm seviyesi ayrımını destekler. Protokol, PCR amplifikasyonu ve uzun okuma dizileme için donanımlı laboratuvarlar için uygundur ve kültürlenmiş izolatlarla doğrulanmıştır. Birincil klinik veya çevresel örneklere uyum mümkün olabilirken, bu tür uygulamalar ek optimizasyon ve doğrulama gerektirir. Genel olarak, bu iş akışı hedefli moleküler karakterizasyon için yapılandırılmış bir çerçeve sağlar ve epidemiyolojik araştırmaları destekleyebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, yerleşik laboratuvar parazit suşları ve ticari olarak elde edilen insan fibroblast hücre hatlarını kullandı. Doğrudan insan veya hayvan denek yoktu.

NOT: Aksi belirtilmedikçe, bu protokolde kullanılan tamponlar ve reaktifler Malzeme Tablosu'nda listelenen ticari kitler içinde sağlanır.

1. Biyobelirteç seçimi

  1. ToxoDB (https://toxodb.org/toxo/app) genom veritabanından SAG2 ve SAG3'ün genomik dizilerini FASTA formatında indirin.
  2. EMBOSS Water (https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/psa/emboss_water) kullanarak çift dizili hizalama gerçekleştirin.
  3. Dizileme süresini en aza indirmek ve verimli PCR amplifikasyonunu sağlamak için amplikon bölgelerini ≤1.600 baz çifti (bp) seçin.
  4. Her bölgenin sürün farklılaşması için bilgilendirici SNP'ler veya INDEL polimorfizmaları içerdiğinden emin olun.

2. Toxoplasma gondii tachyzoitlerin kültürü ve hasadı

  1. Konak hücre kültürlerinin bakımı
    1. Sertifikalı ticari bir kaynaktan insan sünnet derisi fibroblastları (HFF) alın ve bunları, %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin streptomisin ile desteklenen Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı içeren tam büyüme ortamında kültürleyin.
    2. Kültürleri %5 CO₂ ile 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka içinde kuluçka yapın.
  2. Parazit hatlarının bakımı ve genişletilmesi.
    1. Fibroblast monotabakalarını, konak hücre başına 1–3 parazit enfeksiyon çokluğunda takizoidler kullanılarak %80–90 birleşimde enfekte edin. Yaklaşık 1 ×10 6 fibroblast içeren bir T25 şişesi için, 1–3 ×10,6 taşizoit ekleyin.
    2. Kültürleri her gün 20× veya 40× büyütmede ters ışık mikroskobu ile inceleyin. Konak hücre lizisini yaygın monokatmanlı bozulmayı gözlemleyerek tanımlayın.
      NOT: Kültürle ilgili artefaktlardan kaçınmak için 20. geçişin ötesi fibroblast kültürleri kullanmayın.
    3. Takizoidlerin hasadı.
      1. ≥%90 konak hücre lizisi görünürken kültürler toplayın.
      2. 1.300 × g'de 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
      3. Pelleti 10 mL steril fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla nazik pipetleme ile yeniden süsle tutun ve tekrar 1.300 × g ile 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Bir kez daha tekrarlayın.

3. Genomik DNA çıkarımı ve amplikon üretimi

  1. Silika sütunu tabanlı genomik DNA arıtma kiti kullanarak genomik DNAçıkarma 7. 50 μL elution tamponu içinde DNA elütasyonu.
  2. Mikrohacimli spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçin.
  3. DNA'yı kısa süreli depolama için 4 °C'de, uzun süreli depolama için −20 °C'de depolayın.
  4. PCR reaksiyonlarını yüksek isabetli DNA polimeraz ana karışımı, lokus-spesifik primerler (Ek Tablo 1) ve nükleaz içermeyen su ile hazırlayın.
  5. Aşağıdaki döngü koşullarında kalibre edilmiş termal döngücü kullanarak PCR amplifikasyonu yapılacaktır: (a) 30 saniye boyunca 98 °C'de başlangıç denatürasyonu, (b) 10 saniye boyunca 98 °C'de 35 döngü; loküs-spesifik tavlama: SAG2 için 60 °C, SAG3 için 68 °C, 30 saniye; 20 saniye için 72 °C, (c) Son uzatma: 72 °C 2 dakika.
  6. PCR ürünlerini %1,5 agaroz jel üzerinde elektroforezle doğrulayın.
  7. PCR ürünlerini, üreticinin talimatlarına göre kolon tabanlı PCR ve jel ekstraksiyon arıtma sistemi kullanarakarındırmak 8. 15–20 μL elyut tamponu içinde elülasyon DNA'sı.
    NOT: PCR verimliliği ve verimi, düşük DNA şablon kalitesi, konsantrasyon veya optimal olmayan reaksiyon koşulları nedeniyle azalabilir. Amplikon verimi düşükse, DNA şablon bütünlüğünü agaroz jel elektroforezi ile ve konsantrasyon ile saflığı spektrofotometre ile doğrulayın. PCR tavlama sıcaklıkları ve primer konsantrasyonları da kullanılan primer çiftleri için optimize edilmeli ve PCR döngü numarası gerektiğinde artırılmalıdır.

4. Uzun okuma dizileme için kütüphane hazırlığı

  1. Son tamir ve dA-tailing
    1. Tüm reaktifleri eritin ve girdabla iyice karıştırın. DNA kontrol örneğini sadece ilk kullanımda 10,5 μL elusiyon tamponu ile seyreldin ve buz üzerinde tutun.
      NOT: Her kullanımdan önce manyetik boncukları iyice vortex yapın.
      DIKKAT: End-Prep Enzim Karışımını vortex etmeyin; Nazikçe pipetle karıştırın.
    2. Her DNA örneğini 200 fmol (~1 kb parça için ~130 ng) 0.2 mL PCR tüplerine pipetleyin ve nükleaz içermeyen suyla hacmi 11,5 μL'ye ayarlayın.
    3. Her tüp başına 1 μL seyreltilmiş DNA kontrol örneği ekleyin ve pipetle 10–20 kez karıştırın.
    4. Her örnek için 1.75 μL Reaksiyon Tamponu ve 0.75 μL Enzim Karışımı (%5 fazlalık dahil) içeren bir son hazırlık master karışımı hazırlayın.
    5. Her sample'a 2.5 μL master mix ekleyin, nazikçe karıştırın ve kısa bir süre aşağı çevirin.
    6. 20 °C'de termal döngülü bir cihazda 5 dakika kuluçka, ardından 5 dakika boyunca 65 °C'de kuluçka yapın.
  2. Uç hazırlanmış DNA'nın arındırılması
    1. 15 μL reaksiyonu 1,5 mL düşük DNA bağlayan mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    2. 15 μL yeniden asılmış manyetik boncuklar ekleyin, nazikçe karıştırın ve kısa bir süre döndürün.
    3. Örnekleri oda sıcaklığında rotator mikserinde 5 dakika kuluçka yapın.
    4. Yıkama için taze %80 etanol hazırlayın.
    5. Tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin, boncuklar pelet çıkana kadar ve süpernatantı dikkatlice çıkarın.
    6. Boncukları 200 μL %80 etanol ile iki kez yıkayın.
      NOT: Boncukların tamamen pellet olmasına izin verin, sonra etanolü dikkatlice çıkarın.
    7. ~30 saniye boyunca havada kurutulan boncuklar; Çatlamayı önlemek için aşırı kurutmaktan kaçının.
    8. Boncukları 10 μL nükleaz içermeyen suya yeniden süsleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika kuluçka yapın.
    9. Tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin ve 10 μL elüatı temiz, düşük DNA bağlayan mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    10. Spektrofotometrede 1 μL kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçin.
  3. Yerel barkodlama
    1. Çözülme kütüğü/TA Ligase Master Mix, EDTA, Kısa Parça Tamponu (SFB) ve Native Barkodlar (NB01–NB24).
    2. 1–24 numaralı örneklere bireysel barkodlar atayın.
    3. Barkodlama reaksiyonunu 7.5 μL uçtan hazırlanmış DNA, 2.5 μL Doğal Barkod ve 10 μL Blunt/TA Ligaz Master Mix ile birleştirin
    4. 10–20 kez pipetle iyice karıştırın.
    5. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın ve reaksiyonu 4 μL EDTA ile sonlandırın, pipetle iyice karıştırın ve kısa bir süre çevirin.
    6. Barkodlu örnekleri 1.5 mL düşük DNA bağlayan mikrosantrifüj tüpüne biriktirin. Toplam havuzlanmış örnek hacminin 0,4× seviyesinde manyetik boncuklar ekleyin (örneğin, 575 μL havuzlu DNA'ya 230 μL boncuk ekleyin). Pipotle iyice karıştırın, ardından oda sıcaklığında rotator mikserinde 10 dakika kuluçka yapın.
    7. Boncukları 700 μL Kısa Parça Tamponu (SFB) ile yıkayın. Boncukları yeniden süzülmeye fırlatın, aşağı döndürün, sonra örneği manyetik rafa geri döndürün ve boncukların pellet olmasına izin verin. Tamponu pipet kullanarak çıkarın, sonra atın.
    8. Önceki adımı tekrarlayın.
    9. Aşağı döndürün ve tüpü manyetik rafın üzerine geri koyun. Kalıntı tamponları pipetleyin.
    10. Tüpü manyetik raftan çıkarın ve peleti 35 μL nükleazsız suya hafifçe söndürerek tekrar askıya alın.
    11. 37 °C'de aralıklı karıştırarak 10 dakika kuluçka yapın, ardından eluatı temiz, düşük DNA bağlayan mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  4. Adaptör ligasyonu ve kütüphane temizliği
    1. 30 μL havuzlu barkodlu DNA, 5 μL Doğal Adaptör, 10 μL Ligasyon Tamponu (5×) ve 5 μL T4 DNA Ligaz ile ligasyon reaksiyonu birleştirin.
    2. Reaksiyonu iyice karıştırın, nazikçe pipetle ve kısa bir süre aşağı döndürün. Reaksiyonu oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka edin.
    3. Reaksiyona 20 μL yeniden askılanmış manyetik boncuk ekleyin ve pipetle karıştırın. Oda sıcaklığında rotator mikserinde 10 dakika kuluçka yapın.
    4. Numuneyi ve pelleti manyetik rafta aşağıya döndür. Tüpü mıknatısın üzerinde tutun ve pipetten yukarıdan uzak tutun.
    5. Boncukları 125 μL Kısa Parça Tamponu (SFB) ekleyerek yıkayın. Boncukları tekrar süzülmeye çevirin, aşağı döndürün, sonra tüpü manyetik rafa geri koyup boncukların pellet oluşmasına izin verin. Üst patronu pipet ile çıkarın, sonra atın.
    6. Önceki adımı tekrarlayın.
    7. Aşağı döndürün ve tüpü tekrar mıknatısın üzerine yerleştirin. Kalan üst yüzeyi pipetleyin. Tüpü manyetik raftan çıkarın ve pelleti 15 μL Elution Buffer (EB) içinde yeniden süspansiyona yerleştirin.
    8. Aşağı çevirin ve 37°C'de 10 dakika kuluçka yapın. DNA elütasyonunu teşvik etmek için her 2 dakikada bir 10 saniye boyunca hafifçe hareket ettirerek örneği karıştırın.
    9. Boncukları bir mıknatısa pellet yapın, eleme berrak ve renksiz olana kadar en az 1 dakika boyunca.
    10. DNA kütüphanesini içeren 15 μL eluatı temiz 1,5 mL düşük DNA bağlayan mikrosantrifüj tüpüne alıp tutun.
    11. Son kütüphaneyi spektrofotometre kullanarak nicelikle hesaplayın.

5. Akış hücresi hazırlanması ve nanopore dizileme

  1. Akış hücresi hazırlığı
    1. Akış hücresini kontrol edin ve ≥80 aktif gözenek olduğunu doğrulayın.
    2. Astar karışımını, 117 μL flush çözeltisi ile 3 μL tether çözeltisi mikrosantrifüj tüpünde birleştirerek toplam hacmi 120 μL olarak hazırlayın. Hava kabarcıklarının oluşmaması için pipetle nazikçe karıştırın. Tüm 120 μL priming karışımını yavaşça akış hücresi priming portuna yükleyin, böylece yükleme sırasında hava kabarcıkları oluşmamasını sağlayın.
  2. Kütüphane yükleme ve sıralama
    1. Dizileme karışımını 15 μL Dizileme Tamponu (SB), 10 μL Kütüphane Boncukları (LIB) ve 5 μL DNA kütüphanesi birleştirerek hazırlayın. Kabarcık oluşmaması için 3–5 kez yukarı ve aşağı pipetle nazikçe karıştırın. Ortaya çıkan 30 μL dizileme karışımı yüklenmeye hazırdır veya gerekirse 45 μL'ye ayarlanabilir.
    2. Dizileme karışımından 30–45 μL akış hücresi numune portuna yavaşça yükleyin, çözeltiyi damla olarak dağıtın.
      DIKKAT: Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının ve pipet ucunun membrana değmesine izin vermeyin. Dağıtımdan sonra yükleme portunu sıkıca kapatın.
    3. Gerçek zamanlı temel arama etkinleştirildiğinde dizileme yapmaya başlayın ve gözenek aktivitesini izleyin.
    4. Doğru baz çağrı, güvenilir uzlaşma dizisi oluşturma ve düşük frekanslı varyantların güvenli tespiti için yeterli okuma derinliği sağlamak için, amplikon başına ≥500× kapsama sağlanana kadar (önerilen ≥1000×) dizileme devam etmelidir.
      NOT: Düşük dizileme kapsamı belirginse, gerekli konsantrasyonda yüksek kaliteli amplikon girişi, yeterli aktif akış hücresi gözenekleri sağlanın ve önerilen kapsama ulaşılması için dizileme süresini uzatın.

6. Veri işleme ve varyant analizi

  1. Taban çağırma ve demultiplexleme
    1. Platform ile ilişkili temel çağrı yazılımı ve varsayılan yüksek doğruluk ayarlarıyla yüksek doğruluklu baz çağrısı yaparak örnek başına FASTQ dosyaları oluşturmak. Demultiplex barkodla okuyor ve kalite kontrol filtrelerini geçen okumaları saklar.
  2. Okuma haritalama ve BAM işleme
    1. Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) genom veritabanından Toxoplasma gondii referans genom montajı GCF_000006565.2 (TGA4) dosyasını indirin. SAG2 analizi için VIII (NC_031476.1) kromozom ve SAG3 analizi için XII (NC_031480.1) kromozom ekstraktı. Referans dizilerini SAMtools kullanarak indeksleyin ve uzun okunan hizalama endeksi oluşturucu kullanarak hizalama indeksi oluşturun.
    2. Nanopore dizileme verileri için optimize edilmiş uzun okuma hizalama algoritması kullanılarak indeksli referans genomuna harita okumaları yapılır (örneğin, uzun okuma eşleme için ön ayar; -ax harita-ont).
    3. Hizalama çıktısını BAM formatına dönüştürün, SAMtools kullanarak BAM dosyalarını sıralayın ve indeksleyin. Picard araçlarıyla her BAM dosyasına okuma grubu bilgisi ekleyin. Derinlik istatistiklerini kullanarak ortalama lokus kapsama oranını hesaplayın ve flagstat metrikleriyle haritalama istatistikleri oluşturun.
  3. Uzlaşma dizisi oluşturma
    1. Varsayılan parametrelerle sinir ağı tabanlı konsensus parlatma algoritması kullanarak amplikon başına konsensus dizileri oluşturun. Aşağı akış analizi için FASTA formatında konsensus dizilerini dışa aktarın.
    2. Halka açık genomik veritabanları kullanarak referans tabanlı hizalama ve karşılaştırmalı dizi analizi yap. Genom görselleştirme yazılımı kullanarak okuma hizalamalarını ve polimorfik pozisyonları görselleştirin.
  4. Varyant çağrısı
    1. Varyant algılama, uzlaşmaya dayalı bir varyant çağırma algoritması kullanılarak gerçekleştirilir. Tek nükleotid polimorfizmalarını (SNP'ler) ve yerleştirme/silme olaylarını (INDEL'ler) varyant seçim araçları kullanarak ayırın (Ek Dosya 1).
    2. Kalite filtreleme eşiklerini uygulayın. SNP'ler için, örneğin QD < 2.0, FS > 60.0 veya MQ < 40.0 ile filtre varyantları kullanılır. INDEL'ler için, örneğin QD < 2.0 veya FS > 200.0 ile filtrelenen varyantları filtreleyin.
    3. Standart VCF işlem araçlarıyla filtrelenmiş VCF dosyalarını sıkıştırın ve indeksleyin. VCF özet araçları kullanarak varyant istatistikleri oluşturun.
  5. Genotip ataması
    1. SAG2 ve SAG3 bölgelerinden lokus özgül varyantları çıkarın ve polimorfik profilleri referans suş dizileriyle karşılaştırarak T. gondii genotiplerini atamak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Toxoplasma gondii'nin genomik DNA'sı, iki genetik belirteç olan SAG2 ve SAG3'ü hedef alan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile başarıyla amplifikasyona alınmıştır (Şekil 2). Arıtma sonrası, PCR ürünleri agaroz jel elektroforezinde beklenen boyutlarda belirgin bantlar elde etti; bunlar 639 bp (SAG2) ve 1158 bp (SAG3) olarak karşılık geldi. Bu bantların netliği ve tutarlılığı, hedef gen parçalarının sonraki dizi an...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, Oxford Nanopore uzun okuma dizilemesinin Toxoplasma gondii'nin hızlı ve güvenilir genotiplenmesi için hedefli çoklu lokus yaklaşımıyla birleşiminin faydasını göstermektedir. İki iyi karakterize edilen yüzey antijen lokusu olan SAG2 ve SAG3'e odaklanarak, RH (Tip I) ve ME49 (Tip II) suşlarının karşılaştırmalı analizleriyle Oxford Nanopore tabanlı çoklu lokus dizileme için konsept kanıtı oluşturuyoruz ve platformun suşa özgü genetik varyasyonu çözme k...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Mısır Yükseköğretim ve Bilimsel Araştırma Bakanlığı tarafından finanse edilmiştir; bu bakanlık Londra'daki Mısır Kültürel ve Eğitim İşleri Bürosu tarafından temsil edilmektedir ve UKRI MRC (MR/X502947/1) tarafından temsil edilmektedir. Şekil 1 BioRender.com

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Agarose powderThermo Fisher Scientific16500100Jel elektroforezi için
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995065Hücre kültürü ortamı
epi2me-labs/wf-amplicon Nextflow workflow (v1.2.1)Oxford Nanopore Technologies, UKN/ANanopore amplikon dizileme verilerini işlemek ve analiz etmek için Nextflow workflow; tekrarlanabilir MinION veri analizi için sürüm 1.2.1 kullanılmıştır.
epi2me-labs/wf-alignment Nextflow workflow (v1.2.3)Oxford Nanopore Technologies, UKN/ANanopore dizileme okumalarını referans sekanslara hizalamak ve IGV kullanarak entegre görselleştirme için Nextflow workflow; tekrarlanabilir MinION veri analizi için sürüm 1.2.3 kullanılmıştır.
Ethyl alcohol, pureMerck Life Science51976-500ML-FBoncuk temizleme için
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichMFCD00132239Hücre kültürü takviyesi
Flow Cell Wash KitOxford Nanopore TechnologiesEXP-WSH004Akış hücresinin yıkanması
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (10 kb)Thermo Fisher ScientificSM1331Boyut onayı
HFF-1 human foreskin fibroblast cell lineAmerican Type Culture Collection (ATCC)SCRC-1041Neonatal sünnet derisinden izole edilmiş insan deri fibroblastları; parazit çoğaltımı için kullanılır
MinION Flow Cell (R10.4.1)Oxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN114Dizileme için akış hücresi
MinION Mk1B Sequencing DeviceOxford Nanopore Technologies, UKMIN-101BNanopore diziler; dizileme MinKNOW yazılımı (v25.09.16) kullanılarak cihaz kontrolü ve gerçek zamanlı baz çağrısı ile gerçekleştirildi.
MinKNOW SoftwareOxford Nanopore Technologies, UKN/AMinION Mk1B cihaz kontrolü, gerçek zamanlı dizileme ve baz çağrısı için kullanılan yazılım; sürüm 25.09.16.
Native Barcoding Kit 24 V14Oxford Nanopore TechnologiesSQK-NBD114.24Çoklu örnekler için barkodlama
NEB Blunt/TA Ligase Master MixNew England BiolabsM0367DNA ligasyonu
NEBNext Quick Ligation ModuleNew England BiolabsE6056Adaptör ligasyonu
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5×)New England BiolabsB6058DNA ligasyonunda kullanılır
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing ModuleNew England BiolabsE7546Kütüphane hazırlık
Nuclease-free waterThermo Fisher ScientificR0581Moleküler biyoloji sınıfı
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel740609.5PCR ürünü saflaştırma
Penicillin–Streptomycin (1%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)15140-122Antibiyotik karışımı
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific (Gibco)10010023Yıkama tamponu
Q5 High-Fidelity 2× Master MixNew England BiolabsM0492SYüksek doğruluklu polimeraz
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen69504DNA ekstraksiyonu
Quick T4 DNA LigaseNew England BiolabsM2200Adaptör ligaz enzimi
SYBR Safe DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102DNA boyama boyası
TriTrack DNA Loading Dye (6×)Thermo Fisher ScientificR1161Jele örnek yükleme
Trypsin–EDTA (0.25%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)25200056HFFs'lerin pasajajı için
1× TAE or 1× TBE buffer——Çalıştırma tamponu
2× PCR premix——PCR için hazır karışım

Kaynaklar

  1. Uzelac, A., Djurkovic-Djakovic, O. Isolation, genotyping and phenotyping Toxoplasma gondii in Europe - A critical perspective. Food Waterborne Parasitol. 40, e00279(2025).
  2. Yaman, Y., Bay, V., Kişi, Y. E. Discovery of host genetic factors through multi-locus GWAS against toxoplasmosis in sheep: addressing one health perspectives. BMC Veterinary Research. 21 (1), 263(2025).
  3. Khedr, A. A., et al. Exploring the role of chitosan and curcumin-loaded chitosan nanoparticles against chronic Toxoplasma infection in experimental mice. Scientific Reports. 15 (1), 41765(2025).
  4. Joeres, M., et al. Genotyping of European Toxoplasma gondii strains by a new high-resolution next-generation sequencing-based method. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 43 (2), 355-371 (2024).
  5. Gohar, Y., et al. Intra-strain genetic heterogeneity in Toxoplasma gondii ME49: Oxford Nanopore long-read sequencing reveals copy number variation in the ROP8-ROP2A locus. BMC Genomics. 26 (1), 1094(2025).
  6. Koutsogiannis, Z., Denny, P. W. Rapid genotyping of Toxoplasma gondii isolates via Nanopore-based multi-locus sequencing. AMB Express. 14 (1), 68(2024).
  7. DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook. , QIAGEN. (2023).
  8. User manual PCR clean-up and Gel extraction. , MACHEREY-NAGEL. (2024).
  9. Karst, S. M., et al. High-accuracy long-read amplicon sequences using unique molecular identifiers with Nanopore or PacBio sequencing. Nature Methods. 18 (2), 165-169 (2021).
  10. Yu, P. -L., et al. Next-generation fungal identification using target enrichment and Nanopore sequencing. BMC Genomics. 24 (1), 581(2023).
  11. Vilares, A., et al. Towards a rapid sequencing-based molecular surveillance and mosaicism investigation of Toxoplasma gondii. Parasitology Research. 119 (2), 587-599 (2020).
  12. Fazaeli, A., Ebrahimzadeh, A. A new perspective on and re-assessment of SAG2 locus as the tool for genetic analysis of Toxoplasma gondii isolates. Parasitology Research. 101 (1), 99-104 (2007).
  13. Targa, L. S., et al. Toxoplasma gondii SAG2, SAG3 and GRA6 alleles and single nucleotide polymorphism in congenital infections with known parasite load and clinical outcome. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 65, e8(2023).
  14. Rico-Torres, C. P., et al. Can cloning and sequencing help to genotype positive Toxoplasma gondii clinical samples? Results and validation using SAG3 as a model. Infect Genet Evol. 101, 105283(2022).
  15. Sanchez, S. G., Besteiro, S. The pathogenicity and virulence of Toxoplasma gondii. Virulence. 12 (1), 3095-3114 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Genotipleme İş AkışıGenomik DNA EkstraksiyonuLokusa Özgü AmplifikasyonSAG2 GeniSAG3 GeniTek Nükleotid PolimorfizmiSekans Hizalama
Toxoplasma gondii için Sürün Tipi için Çok Lokus Dizileme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.