Yöntem makalesi

Düşük ve Dalgalanan Besin Koşullarında Escherichia coli'nin Incelenmesi için Sürekli Kültür Milifluidik Cihaz

DOI:

10.3791/70652

⸱

7 Temmuz 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, Institute of Environmental Engineering, ETH Zurich, 2Department of Mechanical Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST), 3Department of Plant and Environmental Sciences, Institute of Life Sciences, The Hebrew University of Jerusalem, 4Department of Water Resources and Drinking Water, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology (Eawag)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteri popülasyonlarının sürekli düşük besinli koşullarda (yüzlerce nanomolar konsantrasyona kadar) veya geçici besin dalgalanmaları altında küçük bir zaman ölçeğinde yetiştirilmesini sağlayan milifluidik sürekli kültür cihazı (MCCD) için bir protokol sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğadaki mikrobiyal habitatlar genellikle düşük karışık besin konsantrasyonları, mekânsal heterojenlik ve zamansal dalgalanmalarla karakterize edilir. Ancak, geleneksel laboratuvar kültür yöntemleri bu koşulları tekrarlayamıyor. Parti kültürleri düşük besinli ortamlarda büyümeyi sürdüremezken, kemostatlar tek bir sınırlayıcı besin ile sabit büyümeyi sürdürür ancak hedef olarak tanımlanmış düşük besin karışımı konsantrasyonlarını korumak veya hızlı dalgalanmalar getirmek olduğunda uygulanması zordur. Mikrofluidik sistemler dinamik ortamlar oluşturur ancak popülasyon düzeyinde omik analizler için yeterli biyokütle üretmez. Bu sınırlamaları gidermek için, kararlı ve değişken besin koşullarına mikrobiyal yanıtları incelemek için çok yönlü bir platform olan milifluidik sürekli kültür cihazını (MCCD) tanıtıyoruz. MCCD, bakteri popülasyonlarını Sterivex filtresi (0,45 μm poliviniliden florür [PVDF] gözenekli filtreleme membranı) içinde barındırır; burada sürekli ortam akışı stabil kültür koşullarını sürdürürken besin tükenmesini önler. Özel Matlab yazılımı ile kontrol edilen üç yollu solenoid valf sistemi, hassas ve küçük ölçekli besin dalgalanmalarını mümkün kılar. Bu protokol, MCCD'nin iki modda çalıştırılması için adım adım bir rehber sunar: (1) sabit düşük besin koşulları ve (2) değişken besin koşulları. Bu sistem kullanılarak, Escherichia coli on ila yüzlerce nanomolar konsantrasyonda bulunan amino asitler ve nükleobazların karışımında katlanarak büyüdü ve hücre konsantrasyonlarına yaklaşık 10,9 hücre/mL civarında ulaştı. Doğal mikrobiyal habitatların temel özelliklerini yeniden yaratarak, MCCD, E. coli ve diğer mikrobiyal türlerde kontrollü ama ekolojik olarak önemli koşullar altında bakteriyel büyüme ve fizyolojinin incelenmesini mümkün kılar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğal habitatlardaki bakteriler, hem bileşim hem de konsantrasyon olarak sıklıkla değişen ve geniş bir zaman aralığında dalgalanabilen besin bir manzaraylakarşılaşır; 1,2,3,4. Okyanus 5, toprak3 vebağırsak 6 gibi ortamlarda, mikrobiyal büyüme genellikle bir veya daha fazla temel besin ile sınırlanır ve besin bulunabilirliği fiziksel, kimyasal ve biyolojik süreçler nedeniyle değişebilir. Bu besin karışımları ve dalgalanmaları, mikrobiyal hayatta kalma ve büyüme stratejilerini yönlendirir ve farklı biyolojik organizasyon seviyelerinde yanıtlarışekillendirir 4.

Mikrobiyalin besin dinamiklerine uyumları topluluk, popülasyon ve tek hücre seviyelerinde gerçekleşir. Topluluk düzeyinde, dalgalanmalar türlerin birlikteyaşamasını teşvik edebilir 7, topluluk bileşimi ve metabolik aktiviteyi zamansalvaryasyonla koordine edebilir ve yeni türlerin kolonileşmesi için fırsatlaryaratabilir 9. Popülasyon düzeyinde, değişen besin koşulları, genetik değişiklikler içinseçilerek evrimi hızlandırabilir 10 veya fenotipik değişkenliği tetikleyebilir; bunlar arasında bahis-hedgingstratejileri de var, bu da öngörülemez koşullarda hayatta kalmayı artırır. Tek hücre düzeyinde, bakteriler besin ortamına yanıt olarak fizyolojileriniayarlar 12,13. Yakın zamanda bildirilen bir örnek, dalgalanan koşullarda bakterilere büyüme avantajı sağlayan özel birfizyolojidir 14. Bakteriler sık sık besin sınırlamalarıyla karşılaştığından, düşük ve değişken besin koşullarına nasıl yanıt verdiklerini—hem bireysel hücreler olarak hem de popülasyon veya topluluklar için—incelemek, doğal ortamlarındaki davranışlarını anlamak için gereklidir.

Kemostatlar, tek bir besin tarafından sınırlandırılan büyümeyi incelemek için uygundur, ancak düşük konsantrasyonlu karışımlarda birden fazla besin konsantrasyonunu kontrol etmek amacıyla kullanmak zordur. Kemostatlar, iyi kontrol edilen ve istikrarlı bir ortam sağlayarak besin sınırlamalarına bakteriyel uyumu incelemek için değerli araçlar olmuştur. Ancak, bu çalışmalar doğası gereği büyümenin tek bir temel besin elementiyle sınırlı olduğu koşullara sınırlıdır. Bir kemmostatta, seyreltme oranı ayarlanır ve hücresel büyüme bir sınırlayıcı besin tedarikini dengeler, böylece bireysel besinlerin konsantrasyonları yerine büyüme hızı sabitlenir15. Bu çerçeve, birden fazla karbon kaynağı gibi ikame edilebilir besin karışımları içeren ortamlara kolayca genelleştirilmez çünkü seyrelme oranı yalnızca genel büyüme oranını kontrol eder, her bileşenin16,17 ortamındaki konsantrasyonlarını değil. Sonuç olarak, bireysel besin konsantrasyonları ve ortak kullanım kalıpları mikrobiyal kullanımdan kaynaklanır, dışarıdan reçete edilmez; 16,17.

Ayrıca, kemostatlarda besin dalgalanmaları indüklenebilirken, genellikle büyük kültür hacimleri nedeniyle hızlı dalgalanmalar veya dakika ölçeğinde tek değişimler elde etmek zordur. Mikrofluidik cihazlar, kesin düşük konsantrasyonlu ve dalgalanan besin ortamları oluşturmak için güçlü araçlar olarak ortayaçıkmıştır 14. Video mikroskobu ile eşleştirildiğinde, tek hücreli büyümenin ölçülmesini sağlarlar. Mikrofluidik sistemler, floresan raporlayıcılar kullanarak seçilmiş proteinlerin ifadesinin nicelendirilmesine izin verse de, kemostotların aksine, tipik mikrofluidik cihazlar, bakteri popülasyonunun proteomunu incelemek için omik analizler için gereken biyokütkütle üretemeyecek kadar küçüktür. Bu boşluğu kapatmak için milifluidik sürekli kültür cihazını (MCCD) geliştirdik.

MCCD, kontrollü besin koşulları altında bakteriyel büyümeyi mümkün kılar; bunlar arasında minimum veya hiç tükenmemiş sürekli düşük besin koşulları ve dalgalanan besin koşulları dahil, aşağı akış analizleri için yeterli biyokütle üretebilen sürekli akış kültürü sistemi kullanılır. MCCD, kültür kapı olarak 0,45 μm PVDF filtresi kullanır; bu ortamda bir rezervuardan taze bir ortam veren peristaltik pompa ile sürekli yenilenir (Şekil 1A). Filtrenin gözenekli membranı, besin akışını sağlarken belirli bir besin akışını sağlar; bu da düşük besin konsantrasyonlarında (yüzlerce nanomolar ile mikromolar aralığı) bile besin tükenmesini önler. Biyokütle korunurken taze ortam cihazdan sürekli aktığı için, MCCD, hücrelerin ortam yenilenirken tutulduğuretentostat 18 ile benzerlik taşır. Ancak MCCD, mimarisi ve besin dağıtım biçimi açısından klasik retentostatlardan farklıdır. Retentostat genellikle hücrelerin iyi karışık bir kültür hacminde askıya alındığı karıştırılmış toplu bir reaktor olarak çalışır. Bu koşullarda, besin bulunabilirliği karışma, difüzyon ve hücre alımı arasındaki dengeye bağlıdır ve özellikle düşük besin konsantrasyonları ve yüksek hücre yoğunluklarında yerel tükenme veya gradyanlar ortaya çıkabilir. Buna karşılık, MCCD'de hücreler doğrudan küçük hacimli Sterivex kartuşunun içindeki membran üzerinde toplanır ve sadece birkaç hücre kalınlığında katmanlar oluşturur ve sürekli akan ortama maruz kalır. Kartuş içinde aktif bir karıştırma uygulanmaz; Bunun yerine, ortam yukarı akışta homojenleştirilir ve sürekli akışla teslim edilir. Besinler, ince hücre katmanları üzerinden konvektif taşınımla sağlanır ve difüzyon mesafesi küçük ve akış hızı yüksek olduğundan, yerel besin gradyanları en aza indirilir. Sonuç olarak, popülasyonun deneyimlediği besin koşulları öncelikle gelen ortamın bileşimiyle belirlenir ve bu da karıştırılmış tutma sistemlerinde sağlanamayacağı kadar tutarlı ve iyi tanımlanmış düşük besin koşullarını sağlar.

figure-introduction-1
Şekil 1: Düşük konsantrasyonlu veya dalgalanan besin koşullarında bakteriyel kültür için milifluidik sürekli kültür cihazı (MCCD). (A) Sürekli besin koşulları için MCCD'nin şeması. Peristalttik pompa, bir rezervuardan gelen taze ortamın akışını, bakteri hücreleri içeren 0,45 μm PVDF filtresinden geçirir. Filtredeki gözenekli membran, bakteriyi tutarken ortamın geçmesine izin verir. Sürekli ortam akışı, filtre içinde çok düşük besin konsantrasyonlarında bile sabit besin koşullarını korur. (B) Değişken besin koşulları için MCCD'nin şeması. Peristaltik pompanın yukarısında yazılım kontrollü üç yollu solenoid vana, iki rezervuar arasında ortam akışını dönüşümlü olarak değiştirir (örneğin, yüksek besin konsantrasyonu, CYüksek ve düşük besin konsantrasyonu, CDüşük). Yazılım, valfin piston pozisyonunu kontrol ederek aktif giriş kaynağını belirler. (C) Sürekli besin koşulları için akışkan montaj. Üç silikon tüplü kapağı, taze madde içeren şişeyi kapatır. Bir tüp havalandırma için bir havalandırma filtresine bağlanırken, diğer ikisi filtrelere ortam taşır. Barb-to-Male Luer fitingleri bu tüpleri peristaltik borulara bağlayır ve her peristaltik tüpü tek yönlü bir çek valfine bağlayır; bu da filtreye giriş noktası olarak hizmet verir. Filtre çıkışı ayrıca tek yönlü bir çek valfiyle donatılmıştır. Görüntü, her biri bir filtrede bulunan iki örneği gösteriyor. (D) Değişken besin koşulları için akışkan montaj. Metal platform, özel MATLAB yazılımı aracılığıyla iki solenoid valfi kontrol eden mikrodenetleyici ve elektronik bileşenleri barındırır. Dişli Barb bağlantılı fittingler, solenoid vanaların hem giriş hem çıkışlarını boruya bağlar. Her valf, iki alternatif ortam için iki giriş içerir; burada yüksek besin konsantrasyonlu CHigh (kırmızı etiketli tüpler) ve düşük besin konsantrasyonlu CLow (mavi etiketli tüpler) bulunur. Medya, (C)'deki gibi havalandırma filtresi olan kapalı şişelerde bulunur. Solenoid vanalardan çıkan çıkışlar, sabit durum montajında (C) olduğu gibi peristaltik boru ile filtrelere bağlanır. Görüntü, her biri bir filtrede bulunan iki örneği gösteriyor. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ayrıca, Sterivex filtresinin yukarısında yazılım kontrollü, üç yollu bir solenoid valfin eklenmesi, kullanıcının farklı rezervuarlarda bulunan iki ortam arasında ortam akışını değiştirmesini sağlar (Şekil 1B). Sonuç olarak, cihaz, bakterilerin sabit (düşük konsantrasyon dahil) besin koşullarında stabil bir ortama veya birkaç dakika veya daha uzun dalgalanma aralıklarıyla besin dalgalanmalarına verdiği yanıtı incelemek için kullanılabilir.

Bu protokol, hem düşük besinli hem de dalgalanan besin koşullarında bakterileri incelemek için MCCD'nin montajını ve işletilmesini özetlemektedir. Örneğin, bu protokol MCCD'nin iki çalışma modunda Escherichia coli NCM3722 kullanılarak bir büyüme deneyi yürütmek için adım adım bir rehber sunar: sürekli düşük besin koşulları ve değişken besin koşulları. MCCD sistemi, doğada karşılaşılan besin ortamlarında bakteriyel fizyolojiyi incelemek için çok yönlü bir platform haline getirerek diğer besin koşullarına ve mikrobiyal türlere kolayca uyarlanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sürekli besin koşullarında bakteriyel büyüme

NOT: Bu protokol, çok seyreltilmiş Zengin Tanımlanmış Orta ("düşük RDM") bir durumda E. coli NCM3722 büyüme eğrisinin gerçekleştirilmesi prosedürünü tanımlar. Bu büyüme eğrisi 12 saat sürer ve her 2 saatte bir örnek toplanır (toplamda 6 zaman noktası). Bu protokolün temel prensibi, her zaman noktasının tek bir Sterivex filtresine karşılık gelmesidir (bundan sonra 0.45 μm PVDF filtresi olarak adlandırılır). Bir örnek toplamak için, filtrenin içindeki kültür ters santrifüj edilerek alınır, hücre numarası nicelenir ve filtre atılır. Her 0,45 μm PVDF filtresi yalnızca bir örnek verir. Deneyin hazırlanması için üç temel deneysel parametrenin tanımlanması gerekir: peristaltik pompanın akış hızı, deneyin süresi ve istenen örnek sayısı (yani 0,45 μm PVDF filtre sayısı). İlk akış hızını 2 mL/dakika olarak ayarlayın. Bu parametri gerektiğinde ayarlayın (örneğin, çok seyreltilmiş bir besin tedarikini korumak için akış hızını artırın).

  1. Malzeme ve malzemelerin hazırlanması
    NOT: Her filtre tek bir zaman noktası örneğine karşılık geldiğinden, her 0,45 μm PVDF filtrenin deneysel çalışma süresi toplama süresine bağlı olarak değişir (örneğin, ilk zaman noktası için 2 saat, ikinci zaman noktası için 4 saat vb.)
    1. Gerekli kültür ortamı hacmini formül kullanılarak tahmin edin
      figure-protocol-1,
      burada n örnek sayısıdır (0,45 μm PVDF filtreleri), Q akış hızı (mL/dakika cinsinden) ve ti her örnek için deneysel çalışma süresidir (dakika cinsinden).
    2. Akış oranı değişimini hesaba katmak için ek %20 hacim eklemek için 1.2 ile çarpın. Bu örnek için, hesaplayın
      figure-protocol-2
    3. Hesaplanan hacmi yukarıya yuvarlayın (örneğin, bu örnekte 6.200 mL hazırlayın).
    4. Sterilizasyon için malzeme hazırlayın ( bkz. Tablo 1).
      NOT: Malzemeleri deneyden bir gün önce hazırlayıp sterilize ederek hazırlık sağlanır ve gecikmeleri en aza indirir. Bu malzemeleri otoklav olarak kullanır, tek yönlü Luer valfleri hariç; Valfleri %70 etanol ile sterilize edin.
      1. Altı silikon peristaltik tüpün her iki ucunu "Male Luer to Barb" plastik fitlerine bağlayın; bağlantının Barb ucunu boruya yerleştirin. Male Luer uçlarını kontaminasyonu önlemek için alüminyum folyo ile kaplayın.
        NOT: Deneyde altı adet 0.45 μm PVDF filtre kullanıldığı için altı peristaltik tüp hazırlanmıştır. Tüm tüpler daha sonra aynı peristaltik pompa başlığına monte edilecek, böylece tüm filtreler aynı akışı alır.
      2. Tüpü kapalı, sterilize edilebilir bir kapın içine yerleştirin.
      3. Havalandırma filtrelerini kapalı, steril bir kabın içine yerleştirin.
      4. Tüplü şişe kapaklarını, kapalı, sterilize edilebilir bir kapta silikon boru ile yerleştirin.
        NOT: Bu protokolde kullanılan tüplü şişe kapakları, kapakların üzerinden geçen üç tüple donatılmıştır: 0,45 μm PVDF filtrelerine ortam sağlamak için eşit çaplı iki tüp ve daha geniş çaplı üçüncü bir tüp. Bu tüpler kapaklara sıkıca bağlıdır ve çıkarılamaz.
      5. 12 tek yönlü Luer çek valfini %70 etanol çözeltisine batırın ve sterilizasyon için gece boyunca bırakın.
        NOT: (DURAKLAMA NOKTASI) Sterilize edilmiş malzemeler, deneyden önce oda sıcaklığında 24 saate kadar suda ve mühürlenmiş şekilde saklanabilir. Kullanmadan önce, etanolden vanaları çıkarın ve kalan etanol almak için steril ultra-saf suyla durulayın. Alternatif olarak, çek valfler otoklavlanabilir malzemelerle 3D baskı yapılarak etanol tedavisi yerine otoklavlama ile sterilizasyon yapılabilir.
    5. Peristaltik boruları, havalandırma filtrelerini, şişe kapaklarını, dereceli silindiri ve şişeleri standart laboratuvar eşyalarıyla otoklavlayın.
    6. 6.200 mL düşük zengin tanımlanmış ortam (RDM; bkz. Malzeme Tablosu) Tablo 2'de listelenen reaktifleri karıştırarak hazırlanır.
      NOT: Ortamı, deney gününde, pre-kültüre başladıktan sonraki yaklaşık 5 saatlik bekleme süresinde hazırlayın (bkz. adım 1.2.1). Bu, orta tazeliği korur ve kirlenme riskini en aza indirir.
  2. Bakteriyel ön kültürün hazırlanması
    NOT: Deneyi başlatmak için üstel aşamada bir pre-kültür kullanın. Bu aşamada bakteriler sabit bir hızda büyür, hücre bileşenlerini dengeli bir şekilde sentezler ve belirli bir hücre kütlesinde bölünür. Değişkenliği en aza indirmek ve başlangıç fizyolojik durumunu standartlaştırmak için üstel faz hücreleri kullanın.
    1. Deneyden bir gün önce, şu şekilde bir gece (ON) kültürü hazırlanır: 3 mL tam RDM'yi dondurulmuş gliserol stoklu E. coli NCM3722 ile steril 15 mL kültür tüpünde aşılayın. Kültürü 37 °C'de gece boyunca (~16 saat) 200 rpm'de sallama kuluçkasında sallayarak inkubasyon yapın.
      NOT: (DURAKLAMA NOKTASI) ON KÜLTÜRÜ KULUÇKAYA ALıNDıKTAN SONRA, BU GÜN BAŞKA ADıMLAR UYGULANMAZ. Ertesi gün protokolü devam ettirerek 1.2.2 adımına geçin.
    2. Deney günü, ön kültürü şu şekilde hazırlayın: 6 μL ON kültürünü, 6 mL tam RDM'ye ekleyin. İki 15 mL'lik kültür tüpüne eşit olarak bölünün ve tüpleri A ve B olarak etiketleyin. Her iki tüpü 37 °C'de 200 rpm'de çalkalayarak inkübe yapın.
      NOT: Ön kültür genellikle üssel faza (OD600 ≈ 0.5) ulaşmak için yaklaşık 5 saat gerektirir. Bu dönemi taze ortamı hazırlamak için kullanın (bkz. adım 1.1.6). OD600 yaklaşık 0.5'e ulaşana kadar 1.2.3 adımına geçmeyin.
    3. Optik yoğunluğu (OD) 600 nm'de B tüpü ile izleyin. OD600 yaklaşık 0.5'e ulaştığında deneye devam edin; bu da E. coli NCM3722 için tam RDM'de üstel büyümeyi gösterir (bkz. bölüm 1.4).
      NOT: Tekrarlanabilirliği artırmak ve başlangıç koşullarını standartlaştırmak için deneye üstel faz hücreleriyle başlayın.
  3. MCCD'de sürekli besin koşullarıyla bir deneyin hazırlanması
    NOT: Ön kültür büyümeye başladıktan hemen sonra steril bir biyogüvenlik dolabında 1.3.1'den 1.3.5'e kadar olan adımları gerçekleştirin.
    1. Her şişeye toplam orta hacim tahsis edilsin.
      NOT: Şişeleri orta rezervuar olarak kullanın. İki orta dağıtımlı tüple donatılmış şişe kapakları kullanın; her tüp bir adet 0,45 μm PVDF filtreye medium iletir. Deney boyunca her zaman noktası örneğinin (yani her 0,45 μm PVDF filtre) gerektirdiği miktara göre şişeler arasında toplam orta hacim (1.1.6 adımında hazırlanmış) tahsis edilir.
      1. Her 0.45 μm PVDF filtre için gereken ortam hacmini belirlemek için adım 1.1.1'de verilen formülü kullanın. Örneğin, aşağıdaki terimleri kullanarak:
        figure-protocol-3
        Her zaman noktası için gereken toplam orta hacimler, kronolojik sırayla 288, 576, 864, 1152, 1440 ve 1728 mL'dir.
      2. Hesaplanan orta hacimleri şişeler arasında dağıtın, iki zaman noktası için gereken hacimleri tek bir şişeye gruplayın. Örneğin: ~900 mL bir 1 L şişede (zaman noktaları 1 ve 2 için), ~2.100 mL bir 2.5 L şişede (3 ve 4 zaman noktaları için), ~3200 mL medyum bir 4 L şişede (zaman noktaları 5 ve 6 için).
    2. Her şişeyi tüplü şişe kapaklarıyla kapatın (Şekil 1C). Sızıntıları önlemek için kapakları sıkıca sıkın.
    3. Tüplü şişe kapağından uzanan en geniş silikon tüpe 0.2 μm havalandırma filtresi bağlayın (Şekil 1C). Bu, deney sırasında steril hava değişimine olanak tanır.
    4. Her peristaltik tüpün bir ucunu (önceden bağlanmış donanımlarla; bkz. madde hazırlığı bölüm 1.1.4) tüplü şişe kapaklarından uzanan daha küçük çaplı silikon tüplere takın (Şekil 1C). Sterilliği korumak için güvenli bağlantılardan güvence edin. Serbest Male Luer kilit parçasındaki alüminyum folyo kapağı, deneme başlayana kadar yerinde bırakarak kontaminasyonu önleyin.
    5. Şişeleri, monte edilmiş boru ve peristaltik pompayla birlikte 37 °C ayarlanmış bir kuluçka makinesine yerleştirin. Boruyu peristaltik pompa başlığının kanallarına sabitleyin.
      NOT: Tüm peristaltik tüpler, tek bir peristaltik pompanın aynı pompa başlığına monte edilir, böylece tüm 0,45 μm PVDF filtreler aynı pompadan ortam alır. Tek bir pompa kullanmak, filtreler arasında akış hızının aynı olmasını sağlar ve pompalar arasındaki farklılıklardan kaynaklanabilecek değişkenliği önler.
  4. MCCD'de sürekli besin koşullarıyla yapılan bir deney protokolü
    1. Pre-kültürü (OD = 0.5) 1:10 oranında incelendirin; 600 μL pre-kültür eklenerek 5.4 mL taze düşük RDM eklenin.
    2. 1 mL pipet kullanarak, altı 0,45 μm PVDF filtresinin her birine 1 mL seyreltilmiş ön kültür eklenin.
    3. Tek yönlü çek vanaları otoklavlı ultrasaf suyla durulayın ve her 0,45 μm PVDF filtrenin her ucuna birer tane takın.
    4. Peristaltik boru bağlantılarından alüminyum folyo kapaklarını çıkarın.
    5. Altı 0,45 μm PVDF filtrenin her birini peristaltik boru üzerindeki Erkek Luer fitine bağlayın (Şekil 1C).
    6. Peristalttik pompada akış hızını 2 mL/da'ya ayarlayın ve akışı başlatın. Bu anı zaman 0 olarak tanımlayın.
    7. Çıkışı toplamak için 0,45 μm PVDF filtrelerinin altına bir atık yuvası yerleştirin.
      NOT: Şekil 2A , kuluçka kutusunun içindeki deneyin tam montajını göstermektedir.
  5. Örnek koleksiyonu
    1. 2 saat sonra, 1 L şişeye bağlı iki 0.45 μm PVDF filtresinden birini fişinden çıkarın.
    2. Tek yönlü çek valfleri çıkarın ve 0,45 μm PVDF filtresini girişi aşağıya bakacak şekilde 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
    3. 0.45 μm PVDF filtresini içeren santrifüj tüpünü 2.000 × g sıcaklıkta 2 dakika boyunca santrifüjleyin.
    4. Boru kesici kullanarak, çıkışa en yakın uçtaki plastik kaplamaya hafif bir baskı uygulayarak 0.45 μm PVDF filtresini açın.
      NOT: Kullanımdan önce boru kesicisini dezenfekte edin (örneğin, %70 etanol ile silerek) böylece 0,45 μm PVDF filtresini açarken kontaminasyon önlenir.
    5. Gözenekli membranı içeren iç silindiri serbest bırakın ve membranı tutan filtre bölümünü atın.
    6. 0,45 μm PVDF filtre kaplamasının iç duvarlarını (akış yönüne dik olanları) santrifüj tüpünde toplanan kültür ortamıyla durulayın.
      NOT: Bu adım, santrifüj sırasında duvarlarda sıkışmış hücrelerin toplanmasını sağlar.
    7. Toplanan toplam hacmi 5 mL'lik serolojik pipet ile ölçün.
    8. Sonraki zaman noktalarında (4 saat, 6 saat, 8 saat, 10 saat ve 12 saat), ilgili 0.45 μm PVDF filtreleri fişten çıkar ve 1.5.2–1.5.6 adımlarını tekrarlayın. Bu özel sırayı takip edin:
      1. 4 saat sonra, 1 L şişeye bağlı ikinci 0.45 μm PVDF filtresini fişten çıkarın.
      2. 6 saat ve 8 saat sonra, 2.5 L şişeye bağlı 0.45 μm PVDF filtrelerini fişten çıkar.
      3. 10 saat ve 12 saat sonra, 4 L şişeye bağlı 0.45 μm PVDF filtrelerini fişten çıkarın.
        NOT: Bu sırayı takip ederek örnekleme zaman noktalarını 1.3.1 adımında dağıtılan orta hacimlerle eşleştirin.
  6. Aşağı akış analizleri
    1. Her örnekten üç adet 100 μL aliquot alın ve glutaraldehit ile son konsantrasyona %1,5 sabitlenmiştir.
      DIKKATİ: Glutaraldehit toksiktir, güçlü bir tahrişedici ve potansiyel duyarlılaştırıcıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, nitril eldiven ve koruyucu gözlük) takarak kimyasal bir duman kapüşonunun içinde tutun. Cilt temasından ve solumadan kaçının. Glutaraldehit içeren atıkları kurumsal tehlikeli kimyasal atık düzenlemelerine uygun olarak bertaraf etmelidir.
    2. Sabit örnekleri kullanarak akış sitometrisiyle mikrolitre başına hücre sayısını saymak için floresan DNA boyası ile etiketleyin.
      DIKKAT: Floresan DNA boyaları mutajenik olabilir. Eldiven takın ve boya içeren atıkları kurumsal biyogüvenlik düzenlemelerine uygun olarak bertaraf edin.
      NOT: DNA boyama ve akış sitometrisine alternatif olarak, hücre yoğunlukları, zengin ortamlı agar plakalarına (örneğin LB agar) küçük bir hacim kaplama yapılarak ve koloni oluşturan birimlerin (CFU) sayılması ile tahmin edilebilir.
    3. Mikrolitre başına hücre sayısını, 1.5.7. adımda ölçülen toplam hacmle çarparak 0.45 μm PVDF filtresinde toplam hücre sayısını hesaplayın.
    4. Kalan hacmi 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde 10.000 × g değerinde 4 dakika boyunca santrifüjleyin.
    5. Üst yüzeyi çıkarın.
    6. Hücre pelletlerini gelecekteki analizler için -80 °C'de saklayabilir (örneğin, transkriptomik).

figure-protocol-4
Şekil 2: MCCD'nin deneysel montajı. (A) Sürekli besin koşulları için MCCD kurulumunun fotoğrafı. Kurulum, sabit sıcaklık sağlamak için bir kuluçka kutusunda saklanır ve akış ortamını toplayan atık haznesi vardır. (B) Değişken besin koşulları için MCCD kurulumunun fotoğrafı. Bürokratik etiketli şişe, yüksek besin konsantrasyonlu bir ortam (CYüksek) içerirken, mavi bantla etiketlenmiş şişe düşük besin konsantrasyonlu bir ortam (CLow) içerir. Merkezdeki metal platform, Şekil 1D'de tanımlananlara karşılık gelen besin dalgalanmalarını kontrol eden bileşenleri destekler. Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Dalgalanan besin koşullarında bakteriyel büyüme

  1. Solenoid valf için bir kontrolör montajı
    NOT: MATLAB'da geliştirilen özel grafiksel kullanıcı arayüzü (GUI) üzerinde çalışan bir bilgisayara bağlı mikrodenetleyici tabanlı bir anahtarlama devresi kullanarak üç yollu solenoid valfi kontrol edin.
    1. Solenoid valf kontrol devresini monte edin (Şekil 3A).
      1. Mikrodenetleyicinin dijital çıkış pinini 1 kΩ direnç aracılığıyla bir NPN transistörünün tabanına bağlayın.
      2. Transistörün kollektörünü solenoid valfin negatif terminaline bağlayın.
      3. Transistörün yayıcısını toprağa bağlayın.
      4. Solenoid valfin pozitif terminalini, valf voltajıyla uyumlu harici bir DC güç kaynağına bağlayın.
      5. Solenoid terminallerin üzerine bir diyot yerleştirin. Diyotun çizgili tarafını pozitif besleme hattına bağlayın.
        NOT: Diyot, solenoid kapalıyken oluşan gerilim artışlarını bastırır.
    2. Solenoid vanalara plastik "Hortum Dikenli Dişli" bağlantıları takarak Barb ucunun dışa doğru uzanmasını sağlar.
    3. USB bağlantısı olan bir bilgisayara MATLAB R2022b veya daha sonrasını kurun.
    4. Mikrodenetleyici donanımıyla seri iletişim için gereken MATLAB destek paketini yükleyin.
    5. Mikrokontrolör kartını USB kablosu kullanarak bilgisayara bağlayarak seri iletişim kurun.
    6. MCCD'de dalgalanan besin koşulları oluşturmak için kullanılan MATLAB tabanlı arayüzünü açın (bağlantıda https://github.com/juanitaLara/MCCD).
    7. Solenoid vanalar ile MATLAB GUI platformu arasındaki bağlantıyı doğrulayın:
      1. Matlab'da arayüz platformunu açın ve Connect butonuna tıklayın (Şekil 3B). Komut penceresinde Kontrolcü Bağlandı mesajı görünene kadar bekleyin.
      2. Otomatik işletim paneli altında zaman adımı için bir değer girin (örneğin, Yüksek ve Düşük fazlalar için 5 s).
      3. Solenoid valfleri gözlemleyin ve iki ortam arasında geçiş yaparken çıkardıkları tık sesini dinleyin.
      4. Bir saat kullanarak, solenoid valflerin tam olarak belirtilen aralıkta (örneğin, her 5 saniyede bir) değiştiğini doğrulayın.
        NOT: İletişimi doğrulamak ve valf anahtarlamasını doğrulamak için her deneyden önce bu doğrulamayı yapın. (DURAKLAMA NOKTASI) Solenoid valf çalışması doğrulandıktan sonra, sistem deneye başlamadan önce inkübatör içinde birkaç saat boyunca monte edilmiş halde kalabilir.
  2. Medya ve materyallerin hazırlanması
    NOT: Bu protokol, düşük ve yüksek RDM arasında besin koşullarının 1 saat (yüksek RDM'de 30 dakika, düşük RDM'de 30 dakika) dönüşümlü olarak kullanılmasını içerir. Deney üç saat dalgalanma sürer ve iki örnek toplanır: (1) 3 saat 1 dakika (yüksek RDM fazı, hemen düşükten yükseke geçtikten sonra) ve (2) 3 saat 31 dakikada (düşük RDM fazı, yüksekten düşükten düşüke geçtikten hemen sonra).
    1. Deneysel aşamalara göre gerekli kültür ortamı hacimlerini tahmin edin.
      1. İlk olarak, ilk 3 saat (üç tam dalgalanma dönemi) için gereken hacimleri hesaplayın:
        düşük RDM hacmi =1.2 × 2[mL/min] × 90[deq] × 2[0.45 μm PVDF filtreler] = 432[mL]
        yüksek RDM hacmi =1.2 × 2[mL/min] × 90[dk] × 2[0.45 μm PVDF filtreler] = 432[mL]
      2. Son 30 dakikalık faz için gereken hacmi hesaplayın:
        yüksek RDM hacmi =1.2 × 2[mL/deq] × 30[dk] × 1[0.45 μm PVDF filtreler] = 72[mL]
      3. Hacmleri uygun değerlere yuvarlatın (örneğin, 500 mL düşük RDM ve 600 mL yüksek RDM).
    2. Otoklav sterilizasyonu için malzemeleri hazırlayın ( bkz. Tablo 3) ve 1.1.4 – 1.1.5 adımlarını takip edin.
      NOT: Malzemeleri deneyden bir gün önce hazırlayın ve sterilize edin, böylece hazırlık sağlanır ve deney gününde gecikmeleri en aza indirin (2.2.3 ve 2.2.4. adımlar). Bu düzen, sürekli besin deneylerine kıyasla, medya şişelerini doğrudan solenoid valfe bağlamak için ek tüpler gerektirir (Şekil 1B,D). Bu tüpler yalnızca bir "Barb'dan Erkek Luer'e" bağlantı gerektirir, çünkü solenoid vana fitmanları önceden monte edilmiştir. Bu tüplerin uçlarını otoklavlamadan önce alüminyum folyo ile kaplayın.
    3. Hazırlanan peristaltik borular, havalandırma filtreleri, kapaklar, dereceli silindir ve şişeleri otoklavda sterilize edin.
    4. 4 tek yönlü Luer çek valfini %70 etanol çözeltisine batırın ve sterilizasyon için gece boyunca bırakın.
      NOT: (DURAKLAMA NOKTASI) Sterilize edilmiş çek valfler gece boyunca etanol içinde kalabilir ve oda sıcaklığında 24 saate kadar kapalı tutulabilir. Kullanmadan önce vanaları steril Milli-Q suyla durulayın.
    5. Solenoid vanaları %70 etanol ile 3–5 kez, ardından 3–5 kez ultra saf su ile yıkayarak temizleyin ve sterilize edin.
    6. Deney gününde, pre-kültür hazırlığından sonraki yaklaşık 5 saatlik bekleme süresi boyunca (bkz. adım 2.3), Tablo 4'te listelenen reaktifleri karıştırarak 500 mL düşük RDM ve 600 mL yüksek RDM hazırlanır.
      NOT: Deney gününde ortamın hazırlanması, tazeliği sağlar ve kontaminasyon riskini en aza indirir.
  3. Bakteriyel ön kültürün hazırlanması
    1. 1.2. adımda açıklanan adımları takip edin.
  4. MCCD'de değişken besin koşullarıyla bir deneyin hazırlanması
    NOT: Pre-kültür büyümeye başladıktan hemen sonra steril bir biyogüvenlik kabinde 2.4.1–2.4.4 adımlarını gerçekleştirin.
    1. Her ortamı 1 litrelik bir şişeye yerleştirin.
    2. Şişeleri, üç portlu önceden monte edilmiş kapaklar ve önceden takılmış silikon boru ile kapatın. Sızıntıları önlemek için kapakları sıkıca sıkın.
    3. Her şişe kapağının portlarından birinden uzanan geniş silikon tüpe 0.2 μm havalandırma filtresi bağlayın.
    4. "Giriş borusu"nu ( Şekil 1D'de gösterilmiştir) tüplü şişe kapaklarından çıkan silikon tüplere bağlayın ve ardından solenoid vanalara bağlayın:
      1. Silikon tüpün bir ucunu (sadece bir bağlantı biriktirilmiş olarak) düşük RDM şişe kapağından uzanan boruya takın.
      2. Şişeler inkubatöre götürülene kadar serbest Male Luer kilit bağlantısı üzerinde alüminyum folyo kapağı, kontaminasyonu önlemek için bırakın.
      3. Yüksek RDM şişesi için 2.4.4.1 adımını tekrarlayın.
    5. Şişeleri, monte edilmiş "giriş borusu", peristaltik pompa ve solenoid vanalarla birlikte kontrol cihazı 37 °C'ye ayarlanmış bir kuluçka makinesine yerleştirin.
    6. "Giriş borusu"nu (adım 2.4.4'te takılmış) solenoid vanalarının girişlerine aşağıdaki şekilde bağlayın:
      1. Düşük RDM şişesinden çıkan iki tüpü her solenoid valfindeki iki girişten birine bağlayın ( Şekil 1D'de mavi bantla etiketlenmiş tüpler).
      2. Yüksek RDM şişeyinden çıkan iki tüpü, her solenoid valfindeki iki girişten birine bağlayın ( Şekil 1D'de kırmızı bantla etiketlenmiş tüpler).
    7. Her solenoid valfin çıkışına peristaltik pompa uyumlu silikon tüp (sadece bir bağlantı bağlantısı olan) bağlayın (Şekil 1D). Alüminyum folyo kapağı, deney sterilliği korumaya başlayana kadar serbest Erkek Luer kilit fitininde bırakın.
  5. MCCD'de değişken besin koşullarıyla yapılan bir deneyin protokolü
    1. Solenoid vanalar ile Matlab yazılımı arasındaki bağlantıyı 2.1.7. adımı uygulayarak doğrulayın.
    2. Matlab GUI platformuna dalgalanmalar için istenen zaman adım değerlerini girin: Yüksek RDM'de 1800 s (30 dakika) ve Düşük RDM'de 1800 saniye (30 dakika) zaman adımlarını girin.
    3. Düşük RDM durumunda başlamak için Start from menüsünden Low seçin (Şekil 3).
    4. İki 0.45 μm PVDF filtresini 1.4. adımda açıklandığı gibi tohumlayın.
    5. Deneyi başlatın.
      NOT: Şekil 2B , bu deney için tam akışkan montajını göstermektedir.
  6. Örnek koleksiyonu
    1. Örnek toplayın, örneğin 1.5. adımdaki gibi. İlk 0.45 μm PVDF filtresini 3 saat 1 dakikada, ikincisini ise 3 saat 31 dakikada hasat edin.
      NOT: Önce her iki filtreyi de fişinden çıkarın; Her iki filtre de aynı medya tarafından beslenir.
  7. Aşağı akış analizleri
    1. Akış sitometrisi ile hücre sayısını saymak ve sonraki analizler için örnekleri işlemek ve depolamak için 1.6. adımda açıklanan adımları takip edin.

figure-protocol-5
Şekil 3: Solenoid valflerin besin dalgalanmalarını sağlamak için kontrolörü. (A) Solenoid valfi kontrol etmek için kullanılan elektronik devrenin kablo diyagramı. Devre, bir mikrokontrolör kartı, anahtarlama elemanı olarak kullanılan bir transistör, transistör tabanına bağlı bir direnç ve valf anahtarlama sırasında oluşan voltaj artışlarından devreyi korumak için solenoid valfin üzerinde yerleştirilmiş bir geri dönüş diyotundan oluşur. Mikrodenetleyici, transistörü kontrol eder ve transistör de solenoid valfine verilen gücü değiştirir. Ref. 20'den izin alınarak uyarlanmıştır. (B) Mikrodenetleyici kartı, hem GUI çalıştıran bilgisayara hem de solenoid valflerin ihtiyaç duyduğu voltajla güç kaynağına bağlandıktan sonra, Connect butonuna tıklanarak iletişim kurulur. Valfler, kullanıcının uçurulacak ortamı seçtiği Manuel Çalışma paneli ile manuel olarak çalıştırılabilir (örneğin, "Yüksek" veya "Düşük"). Alternatif olarak, Otomatik İşlem paneli kullanıcıya her aşama (Yüksek ve Düşük) için başlangıç ortamını ve zaman adımlarını (saniye cinsinden) belirte, ayrıca Başlat butonuna tıklayarak işlemi başlatabilir. Gerçek zamanlı monitör, zaman içinde bir adım fonksiyonu (0 = Düşük, 1 = Yüksek) gösterir; bu da önceki saniyelerde hangi ortamın solenoid vanalardan filtrelere aktığını gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, E. coli NCM3722'nin büyüme hızını üç RDM konsantrasyonunda sabit düşük besin koşullarında nicelendirmek için MCCD'yi kullandık. Bu konsantrasyonlar, Neidhardt19 tarafından tanımlanan zengin tanımlanmış ortam (RDM) formülünden türetilmiştir; amino asit ve nükleobaz takviyeleri sırasıyla orijinal formülasyonun %0,5, %0,25 ve %0,01'ine seyreltilmiştir.

Her ortamda büyüme oranlarını nicelendirmek için tekrarlanan büyü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğal ortamların besin karmaşıklığını yakalayan bakteriyel kültürleme yöntemleri, mikrobiyal fizyolojinin basitleştirilmiş laboratuvar koşullarının ötesine ilerlemesi için gereklidir. Doğal ekosistemler, genellikle maksimum büyüme oranlarını desteklemeyen geniş bir konsantrasyon aralığına sahip besinkarışımları içerir; bu oranlar genellikle maksimum büyüme oranları 1,3,4,21,22,23'ü desteklemez.<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını belirtmektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gordon ve Betty Moore Vakfı Su Sistemlerinde Simbiyoz Girişimi Araştırmacı Ödülü (GBMF9197; https://doi.org/10.37807/GBMF9197), Simons Vakfı Mikrobiyal Ekosistemler İlkeleri (PriME) iş birliği aracılığıyla (hibe 542395FY22) ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı 205321_207488 hibesinden R.S.S.'ye verilen desteği minnetle teşekkürle karşılıyoruz. K.S.L., Kore Temel Bilimler Enstitüsü'nden (Ulusal Araştırma Tesisleri ve Ekipman Merkezi; Grant No. RS2025-00554860) ve Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF; Grant No. RS2025-23523643), her ikisi de Kore Hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen, hem de UNIST'in 2025 Araştırma Fonu (1.260002.01) tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1K Ohm DirençBC RoboticsELC-021Güç Derecesi: 1/6 W
1N4001 DiyotBC RoboticsELC-001DC Ters Voltaj: 50 V; Ortalama Düzeltilmiş Akım: 1 A
3-stop platin-kürlenmiş silikon peristaltik hortumInnofluidSE-TUB-SIL-SSS-2.4*0.8İç çap 0,8 mm; dış çap 2,4 mm; kullanılan peristaltik pompa ile uyumlu
3 yollu Solenoid vanalarEmerson Electric Co. 0055A301L0T00F312 V DC, 1 W
Alüminyum folyoOtoklavlanmaya uygun
Arduino Uno Rev4ArduinoSKU ABX00173
OtoklavSystecD-200Veya farklı şirket
Üç portlu kapak kapağı – 1 ve 2 L şişeler içinNalgene2162-0531Veya farklı şirket (seçilen şişelere uygun olduğundan emin olun)
Üç portlu kapak kapağı – 4 L şişe içinNalgene2162-0830Veya farklı şirket (seçilen şişelere uygun olduğundan emin olun)
Hücre yoğunluk ölçer CO8000WPA biowaveOD ölçer
SantrifüjEppendorf5804R50 mL Falcon tüplerine uyan santrifüj
SantrifüjEppendorf5424R1,5 ve 2 mL eppendorf tüplerine uyan santrifüj
Konik santrifüj tüpü - 50 mLFischer Scientific10788561Falcon tüpü
Kültür tüpleri (14 mL, steril)Greiner bio-oneKültür tüpleri
EtanolSigma Aldrich49351170%'e seyreltilmiş
Akış sitometrisiBeckmanC09756CYTOFlex
Glutaraldehit 25%Sigma AldrichG5882Veya farklı şirket
Ayarlanabilir silindirik ölçü kabı - 500 mLNalgene3662-0500 Veya farklı şirket
İnkübasyon kutusuÖzel yapım inkübatör kutusu – yapım ayrıntıları için ilgili yazarlarla iletişime geçin
LabV1 Akıllı Düşük Debi Peristaltik PompaInnofluidSE-LABV1-AMC12(10)Darwin Microfluidics'te mevcut
Erkek Luer-barb bağlantısıAldrichZ2771420,8 mm ID boruyla uyumlu erkek Luer-barb adaptörü (bkz. Şekil 1C)
Erkek Luer-dişli bağlantısıAldrichZ277142Solenoid valfini "giriş borusu"na bağlamak için kullanılır (bkz. Şekil 1D)
MatlabMathworksR2022b veya sonrasıSolenoid valfler için özel yapılmış yazılımı çalıştırmak için yazılım
MOPS EZ Rich Tanımlı Ortam KitiTeknovaM2105Enterobakteriler için MOPS ortamı
Tek yönlü Luer çek valfMasterflex30505-92Ortam rezervuarlarına geri akış önler
Boru kesici - 0-37 mmKS Tools2222051Veya farklı şirket
Pipet setiFisher Scientific05-403-151Veya farklı şirket
Platin-Kürlenmiş Silikon Hortum - 1/16 inNalgene8060-0020İç çap 1/16 in (1,6 mm); dalgalı-besin deneylerinde kullanılır
Platin-Kürlenmiş Silikon Hortum - 1/8 inNalgene8060-0030İç çap 1/8 in (3,2 mm); dalgalı-besin deneylerinde kullanılır
Polipropilen kopolimer şişe - 1 L Nalgene2126-1000Veya farklı şirket
Polipropilen kopolimer şişe - 2 LNalgene2126-2000Veya farklı şirket
Polipropilen kopolimer şişe - 4 LNalgene2126-4000Veya farklı şirket
Serolojik pipet - 5 mLCorningCLS4487Veya farklı şirket
Lehimsiz Ekmek TahtasıBC RoboticsPROTO-001
Sterivex-HV filtresi - 0.45 µm PVDFMilliporeSVHV01015
SYBR Green I Nükleik Asit Jel BoyasıInvitrogenS7563Akış sitometrisinde hücre sayımı için nükleik asit boyası
TIP120 Darlington TransistörüBC RoboticsTRN-005
Tüpler - 1.5 mLEppendorf3810XHücre kültürlerini santrifüjleme ve peletlerin depolanması için tüpler
Havalandırma filtresiMillexSLFG050000.2 µm hidrofobik havalandırma filtresi
Atık kabıHacmi, deneyde kullanılacak toplam ortam hacminden az olmamalıdır

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
  2. Vorholt, J. A. Microbial life in the phyllosphere. Nat Rev Microbiol. 10 (12), 828-840 (2012).
  3. Or, D., et al. Physical constraints affecting bacterial habitats and activity in unsaturated porous media: a review. Adv Water Resour. 30 (6–7), 1505-1527 (2007).
  4. Nguyen, J., et al. Environmental fluctuations and their effects on microbial communities, populations and individuals. FEMS Microbiol Rev. 45 (1), (2021).
  5. Moore, C. M., et al. Processes and patterns of oceanic nutrient limitation. Nat Geosci. 6 (9), 701-710 (2013).
  6. Doranga, S., et al. Nutrition of Escherichia coli within the intestinal microbiome. EcoSal Plus. 12 (1), eesp-0006(2024).
  7. Rodríguez-Verdugo, A., et al. The rate of environmental fluctuations shapes ecological dynamics in a two-species microbial system. Ecol Lett. 22 (5), 838-846 (2019).
  8. Thaiss, C. A., et al. Transkingdom control of microbiota diurnal oscillations promotes metabolic homeostasis. Cell. 159 (3), 514-529 (2014).
  9. Kearney, S. M., et al. Orthogonal dietary niche enables reversible engraftment of a gut bacterial commensal. Cell Rep. 24 (7), 1842-1851 (2018).
  10. Elena, S. F., Lenski, R. E. Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat Rev Genet. 4 (6), 457-469 (2003).
  11. Beaumont, H. J. E., et al. Experimental evolution of bet hedging. Nature. 462 (7269), 90-93 (2009).
  12. Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced growth of Salmonella typhimurium. J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).
  13. Ballesta, J. P. G., Schaechter, M. Effect of shift-down and growth inhibition on phospholipid metabolism of Escherichia coli. J Bacteriol. 107 (1), 251-258 (1971).
  14. Nguyen, J., et al. A distinct growth physiology enhances bacterial growth under rapid nutrient fluctuations. Nat Commun. 12 (1), (2021).
  15. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science. 112 (2920), 715-716 (1950).
  16. Egli, T., Lendenmann, U., Snozzi, M. Kinetics of microbial growth with mixtures of carbon sources. Antonie Van Leeuwenhoek. 63 (3-4), 289-298 (1993).
  17. Lendenmann, U., Snozzi, M., Egli, T. Kinetics of the simultaneous utilization of sugar mixtures by Escherichia coli in continuous culture. Appl Environ Microbiol. 62 (5), 1493-1499 (1996).
  18. Tappe, W., et al. Cultivation of nitrifying bacteria in the retentostat, a simple fermenter with internal biomass retention. FEMS Microbiol Ecol. 19 (1), 47-52 (1996).
  19. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).
  20. Controlling a solenoid valve with Arduino. , Available from: https://bc-robotics.com/tutorials/controlling-a-solenoid-valve-with-arduino/ (2015).
  21. Egli, T. The Ecological and Physiological Significance of the Growth of Heterotrophic Microorganisms with Mixtures of Substrates. Advances in Microbial Ecology. , Plenum Press. New York. (1995).
  22. Koch, A. L. Oligotrophs versus copiotrophs. BioEssays. 23 (7), 657-661 (2001).
  23. Muenster, U. Concentrations and fluxes of organic carbon substrates in the aquatic environment. Antonie Van Leeuwenhoek. 63 (3-4), 243-274 (1993).
  24. Murugan, A., et al. Roadmap on biology in time varying environments. Phys Biol. 18 (4), (2021).
  25. Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. Bacterial mechanosensors. Annu Rev Physiol. 80 (1), 71-93 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

BiyolojiSay 233Say 233Bo De erSayD k besinli ortamlarBesin kar mlarMilifl idiklerBesin dalgalanmalarMikrobiyal fizyoloji

İlgili makaleler