Bilgisayar Destekli Aktif Maddelerin Taraması ve Ateş ve Öksürük Keşfi için Dong İlacının Doğrulanması

Özet

Burada, ağ farmakolojisi taraması, moleküler kenetlenme ve LPS kaynaklı fare modeli doğrulamasını entegre ederek çok boyutlu bir "bileşen-hedef-yolu-hastalığı" ağı oluşturduk. Net anahtar parametreler belirleyerek, Tong etnik tıbbının aktif bileşenlerinin etkin şekilde tanımlanmasını ve tekrarlanabilir bir sürecin doğrulanmasını sağlar.

Özet

Dong etnik tıbbındaki aktif bileşenleri sistematik olarak taramak ve doğrulamak için Lengyuxiao Tang (LYXT; Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L. ve Zingiber officinale Roscoe) ile ateş ve öksürük tedavisi için bu program, ağ farmakolojisi tahmini ile deneysel doğrulamayı birleştiren bir metodoloji süreci oluşturdu. İlk olarak, geleneksel Çin tıp sistemleri farmakoloji veritabanı ve analiz platformu (TCMSP) kullanılarak, kriterler olarak oral biyoerişilebilirlik (OB) ≥ %30 ve ilaç benzerliği (DL) ≥ 0.18 ile LYXT'nin temel aktif bileşenleri taranmış ve ateş ile öksürük için ilgili hedefler birden fazla hastalık veritabanından toplanmıştır. Daha sonra, "bileşen-hedef-hastalık" etkileşim ağı oluşturuldu ve topolojik analiz, gen ontolojisi (GO) ve Kyoto genler ve genomlar ansiklopedisi (KEGG) yol zenginleştirmesi yoluyla temel eylem hedefleri (CYP3A4, POR) ve ana sinyal yolları (MAPK yolu) belirlendi. Moleküler kenetlenme teknolojisi, ana bileşenlerin çekirdek hedeflere bağlanma yeteneğini doğrulamak için kullanıldı. Son olarak, kronik bronşit fare modeli lipopolisakkaritin (LPS) burun içi indamlamasıyla kurulmuş ve tahmin edilen ana aktif bileşenlerin in vivo anti-inflamatuar etkinliği doğrulanmıştır. Sonuçlar, ağ farmakolojisi ile taranan β-karoten ve saparenol gibi bileşenlerin hayvan deneylerinde farklı derecelerde anti-enflamatuar etkiler gösterdiğini ve mekanizmalarının MAPK/p38 sinyal yolunun inhibisyonunu içerebileceğini gösterdi. Bu şema, geleneksel etnik tıplarda aktif bileşenlerin taraması ve mekanizma araştırması için tekrarlanabilir bir örnek sunar.

Giriş

Dong tıbbı, Guizhou, Hunan ve Guangxi'deki Dong etnik grubu tarafından uygulanan Geleneksel Çin Tıbbı (TCM) çerçevesinde bir etnomedikal sistemdir. Nesiller boyu geliştirilen birikimli ampirik bilgilerini temsil eder. Bu sistem, bitkisel tıp, akupunktur, kemik sabitleme, masaj, diyet terapisi ve manevi uygulamaları entegre eder. Grubun kendine özgü özellikleri, grubun tarihsel coğrafi izolasyonu ve sözlü geleneğinden kaynaklanır; bu gelenekler, yerel çevreye ve kültürel inançlara uyarlanmış benzersiz, uygulamaya dayalı bir farmakopi geliştirmiştir.

Kalıcı ateş, vücudun sıcaklığını kontrol edememesiyle ortaya çıkan bir durumdur; bu durum vücudun işlevsiz olduğunun bir işaretidir ve insan hücrelerinde kendini korumanın hayati bir^{işlevidir 1}. Dong milletine ait ısıtıcı ilaçların tedavisi için birçok farklı yöntem mevcuttur. Bunlar arasında ateş, iç ateş ve dış ateş olarak sınıflandırılır. İç ateş, iç hastalıklardan kaynaklanan ısıyı ifade ederken, dış ateş ise soğuk veya travmanın yarattığı^{ısıyı ifade eder 2}. Dışsal ateş genellikle gastrointestinal^{fonksiyonları etkiler 3}. Dong ulusal doktorları ateşi tedavi etmek için soğuk antipiretik tedavi kullanır. Çeşitli Dong ilaçları arasında, Lengyuxiao Tang (LYXT), ateş ve ağrı için kullanılan standart bir karışımdır; Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L. ve Zingiber officinale Roscoe'dan oluşur; bunlar sürekli dövülür ve suyla^{karıştırılır 4}. Başlıca soğuk algınlığından kaynaklanan ateş ve baş ağrısı için kullanılır.

Ancak, LYXT'nin aktif bileşenleri ve altındaki moleküler mekanizmalar hâlâ yeterince anlaşılmamaktadır. Bu boşluğu gidermek için, mevcut çalışma potansiyel aktif bileşenleri ve hedefleri tahmin etmek için ağ farmakoloji yaklaşımı kullanmıştır. Bu tahminleri doğrulamak için, ateş ve öksürükle ilişkili temel inflamatuar yanıtları, örneğin lökosit infiltrasyonu ve pro-inflamatuar sitokin üretimini taklit eden iyi kurulmuş bir lipopolisakkarit (LPS) kaynaklı fare akciğer iltihabı modeli seçildi.

İlaç keşfi sürecinde, çeşitli çalışmalar bileşiklerin birden fazla protein hedefiyle etkileşime girebileceğini ortaya koymuştur. Bu nedenle, "bir ilaç, bir biyolojik hedef" paradigması sistem farmakolojisi paradigmasına kayıyor. Virüs veya bakterilerin birkaç biyolojik hedef proteiniyle etkileşime giren bir bileşik, faydalı farmakolojik etkiler^{sağlayabilir 5}. Ağ farmakoloji analizi, pahalı ve uzun ilaç keşif sürecini hafifletmenin uygulanabilir ve güçlü bir yoludur. İlaçlar arasındaki etkileşimleri daha iyi anlamamıza, hastalığın neden olan mekanizmalarını tahmin etmemize, yan etki olmadan amaçlanan farmakolojik etkiler için alternatif ilaç üyeleri önermemize ve geleneksel tıbbın biyoaktivitelerini tahmin etmemize yardımcı olabilir. Kemoinformatik yaklaşımlar, moleküler kenetlenme ve veri tabanlı modelleme, biyoaktiviteleri tahmin etmek ve mekanizmaları analiz etmek için başarıyla uygulanmıştır. Bu yöntemler, klinik potansiyele sahip antiviral ve antibakteriyel bileşiklerin hızlı keşfini kolaylaştırır ve bu yaklaşımlar ilaçların etkinliği ve yan etkilerini açıklamak için de^{kullanılır 6}. Örneğin, küçük bir molekül olan imatinib mezilat, kronik mielojen lösemide neden olan ajanın, füzyon proteini Bcr-Abl'nin bir inhibitörüdür, ancak aynı zamanda Abl, Kit ve PDGFR⁷ gibi birkaç tirozin kinazın aktivitesini de engeller. Bu nedenle, ilaçları ve hedeflerini belirleme araştırmaları, hastalıkların tedavisinde hâlâ kritik öneme sahiptir; bu da ilaç bileşiklerinin moleküler düzeyde hastalıkları tedavi etmek için ne kadar etkili olduğunu anlamamıza yardımcı olur. Hesaplamalı modelleme ve ağ analizi yaklaşımları, potansiyel ilaçları ve hedefleri doğru şekilde taramaya olanak tanırken, çoklayıcı etkileşim analizi deneysel doğrulama için teorik bir temel ve pratik rehberlik sağlayabilir. Bu makalede, etkileşimde bulunan genler/proteinlerin yeniden tırıltımı için arama aracı (STRING), açıklama, görselleştirme ve entegre keşif (DAVID) veritabanı ve diğer veri tabanları kullanılarak, dinamik gen ontolojisi (GO) analizi ve yol analiziyle birleştirilerek ateş ve öksürük için Dong ilacının aktif bileşenleri ve ilgili etki proteinleriyle ilgili veriler toplandı ve aktif bileşenlerin kombinasyon tedavisi mekanizması incelendi. Dong ilacı LYXT üzerine daha fazla araştırma için spesifik bir teorik referans sağlayabilir, etnomedikal formüllerin farmakolojik mekanizmalarını incelemek için tekrarlanabilir bir strateji sunar ve yeni anti-inflamatuar ajanların geliştirilmesine dair içgörüler sunar.

Protokol

Hayvan deneyi programı, Lanzhou Üniversitesi Deneysel Hayvan Etik Komitesi (D2024-292) tarafından incelenmiştir. Hayvan koruma, hayvan refahı ve etik ilkelerine ile ulusal deneysel hayvan refahı etiğinin ilgili hükümlerine uygundur.

1. Veritabanı ve yazılımın hazırlanması

1. Aktif madde taraması ve hedef gen toplama
   1. TCM sistem farmakoloji veritabanı ve analiz platformuna (TCMSP) (https://tcmsp-e.com/) erişin ve LYXT formülasyonundaki her bitkinin Latince isimlerini kullanarak, yani Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L. ve Zingiber officinale Roscoe'yu kullanarak her bitkiyle ilişkili tüm kimyasal bileşikleri elde etmek için ayrı aramalar yapın.
   2. Her bitki için alınan bileşikleri filtrelemek için tarama kriterlerini şu şekilde uygulayın: Verbena officinalis L. için, oral biyoyararlanılmayı (OB) ≥% 30,1 ve ilaç benzerliğini (DL) %0,12 ≥ belirleyin; Zingiber officinale Roscoe için OB ≥ %60 ve DL ≥ 0.13 olarak ayarlandı; Semen Pharbitidis için OB ≥ %16,93 ve DL ≥ 0,50 olarak belirlendi. Sonra, üç bitkiyi de filtrelenmiş bileşik listelerini birleştirin ve benzersiz TCMSP tanımlayıcılarına dayalı tekrarlanan girişleri kaldırarak LYXT'deki son aktif bileşikler listesini oluşturun.
   3. Bu aktif bileşiklerle ilişkili tüm hedef proteinleri, bileşik tanımlayıcıları ve hedef protein isimlerini içeren bir tablo olarak TCMSP veritabanından dışa aktarın, ardından bu hedef protein listesini UniProt veritabanına (https://www.uniprot.org/) aktarın.
   4. UniProtKB ID eşleme aracını kullanarak tüm hedef protein isimlerini protein adından gen adına eşleme yönü ayarlanmış şekilde resmi insan gen sembollerine dönüştürün ve geçerli bir gen sembolü olmayan girişleri kaldırarak LYXT aktif bileşenleriyle ilişkili hedef genlerin nihai listesini oluşturun.
2. Hastalık hedef gen toplama ve örtüşme analizi
   1. GeneCards veritabanından ateş ve öksürükle ilgili genleri (www.genecards.org) ayrı ayrı araarak "fever" ve "öksürük" anahtar kelimeleriyle indirin, alaka puanı 5 ≥ olan genleri koruyun ve her iki aramanın sonuçlarını veritabanında birleştirin.
   2. Ateş ve öksürükle ilgili genleri terapötik hedef veritabanından (TTD) (db.idrblab.net/ttd) ayrı ayrı araarak "fever" ve "öksürük" anahtar kelimeleriyle indirin, tüm ilgili hedef genleri indirin ve her iki aramanın sonuçlarını veritabanında birleştirin.
   3. PharmGkb veritabanından ateş ve öksürükle ilgili genleri (www.pharmgkb.org) ayrı ayrı araarak "fever" ve "öksürük" anahtar kelimeleriyle indirin, tüm ilgili genleri indirin ve her iki aramanın sonuçlarını veritabanında birleştirin.
   4. Ateş ve öksürükle ilgili genleri İnsan'da Online Mendel Mirası (OMIM) veritabanından (www.omim.org) ayrı ayrı araarak indirin; "fever" ve "öksürük" anahtar kelimeleriyle arayış, ilgili tüm genleri indirin ve her iki aramanın sonuçlarını veritabanında birleştirin.
   5. DrugBank veritabanından (go.drugbank.com)⁸ ateş ve öksürükle ilgili genleri ayrı ayrı araarak "fever" ve "cough" anahtar kelimeleriyle indirin, tüm ilgili genleri indirin ve her iki aramanın sonuçlarını veritabanında birleştirin.
   6. Beş veritabanının tamamından elde edilen gen listelerini tek bir kapsamlı listeye birleştirin ve tekrarlanan gen sembollerini çıkararak ateş ve öksürükle ilgili hastalık hedef genlerinin nihai listesini oluşturun.
   7. Aşama 1.2.6'daki hastalık hedef listesini, 1.1.4 aşamasındaki LYXT aktif bileşen hedef gen listesiyle karşılaştırın; her iki listede ortak olan örtüşen genleri seçin ve bu örtüşen gen listesini CSV dosyası olarak dışa aktarın.
3. ID dönüşümü ve kesit analizi
   1. Üst üste düşen gen listesini 1.2.7 aşamasından R ortamına yükleyin ve DAVID web sitesine (https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp) erişin.
   2. Örtüşen gen listesini DAVID'e yükleyin; tür Homo sapiens , liste tipi ise gen sembolü olarak ayarlanmış, ardından fonksiyonel açıklama aracını çalıştırarak kesit analizi yapın.
   3. Kesişen proteinlerin sembol ID'lerini, DAVID içindeki gen ID dönüşüm fonksiyonunu kullanarak ensemble ID'lerine dönüştürün; dönüşüm yönü gen sembolünden topluluk ID'ye ayarlanır.
   4. Dönüştürülmüş ensemble ID listesini orijinal gen sembolleriyle birlikte CSV dosyası olarak aktarın, böylece sonraki zenginleştirme analizi yapılabilir.

2. Hayati etkin bileşenlerin ve hedef proteinlerin taraması

1. Bileşik hedef ağ inşası
   1. Kesişen gen listesini 1.2.7 aşamasındaki ve 1.1.4 aşamasındaki LYXT aktif bileşen hedef gen listesini R ortamına yükleyin, ardından hem hedef genlerle hem de kesişen genlerle ilişkili bileşikleri belirlemek için karşılaştırma analizi yapın.
   2. Bileşik hedef ilişki verilerini Cytoscape sürüm 3.8.1'e aktarın ve aktif bileşenler ile ilgili hedefler arasındaki etkileşimleri görselleştirmek için "LYXT-Fever ve öksürük-hedef" ağ diyagramını oluşturun.
2. Protein-protein etkileşim veri toplama
   1. LYXT aktif madde hedefleri ile ateş ve öksürük hedeflerinin kesişimi için gen ID dosyasını https://stringdb.org/ STRING veritabanına aktarın, tür olarak Homo sapiens'i seçin ve veri işleme yöntemi olarak birden fazla proteini seçin.
   2. Protein-protein etkileşimlerini güven eşiğini 0.90 ≥ ayarlayarak ve çok düşük korelasyona sahip proteinleri izole ederek filtreleyin, ardından filtrelenmiş etkileşim verilerini içeren bir TSV dosyası oluşturularak sonraki analiz için oluşturulur.
3. Kesişim analizi doğrulaması
   1. R dilini kullanarak aktif bileşenlerin hedef proteinleri ile ateş ve öksürük hedef proteinleri arasındaki kesişimi analiz edin ve 1.2.7. adımda tanımlanan örtüşen gen setini doğrulayın.
   2. Bu onaylanmış örtüşen gen setini sonraki protein-protein etkileşimi (PPI) ağ analizi için hazırlayın.

3. Ana hedef proteinlerin taraması

1. PPI ağ görselleştirmesi
   1. 2.2.2 adımından filtrelenmiş etkileşim verilerini Cytoscape sürüm 3.8.1'e aktarın ve ağ görselleştirme aracıyla PPI ağ diyagramını çizin.
   2. Cytoscape içinde CytoNCA eklentisini kurun ve açın, ardından bu eklentiyi kullanarak ağdaki her düğüm için aşağıdaki parametreleri hesaplayarak topolojik analiz yapın: derecelik merkeziyeti (DC), aralık merkeziliği (BC), yakınlık merkeziliği (CC), özvektör merkeziyeti (EC), ağ merkeziyeti (NC) ve yerel ortalama bağlantı (LAC).
2. Medya tabanlı tarama kullanarak anahtar hedef protein tanımlaması
   1. CytoNCA'dan hesaplanan topolojik parametre tablosunu tüm düğüm tanımlayıcılarını ve bunlara karşılık gelen DC, BC, CC, EC, NC ve LAC değerlerini içeren bir CSV dosyası olarak dışa aktarın.
   2. Ağdaki tüm düğümler arasında derecenin merkezilik (DC) medyan değerini hesaplayın ve DC'si medyan değerin iki katından büyük olan tüm düğümleri belirleyin.
   3. Ağdaki tüm düğümlerde yakınlık merkeziyeti (CC) ve aralık merkezilik (BC) için medyan değerleri hesaplayın, ardından 3.2.2 numaralı adımda tanımlanan düğümlerden, yalnızca aynı anda medyan değerden büyük CC ve medyan değerden büyük BC'yi sağlayan düğümleri tutun; bu, Kibble ve ^ark.9 tarafından tanımlanan tarama yaklaşımını izlemektedir.
3. Son anahtar hedef derleme
   1. 3.2.3 adımından itibaren tutulan düğümlerin tanımlayıcılarını ana hedef proteinler listesine derleyin ve bu listeyi bir CSV dosyası olarak dışa aktarın.
   2. Bu medyan tabanlı tarama kuralı (DC medianın iki katından fazla, CC medyandan büyük ve BC mediandan fazla) makale boyunca anahtar hedef belirleme için tek kriter olarak uygulanarak protokolde belirlenen birleşik tarama yaklaşımıyla tutarlılık sağlanır.

4. GO zenginleştirme analizi ve KEGG yol analizi

1. DAVID veritabanı kullanılarak fonksiyonel zenginleştirme analizi
   1. Tanabe ve ^ark.10 tarafından tanımlanan yöntemi takip ederek, 1.3.4 aşamasından itibaren kesişen gen listesini gen sembolü formatında https://david.ncifcrf.gov/ DAVID veritabanına yükleyin, türü Homo sapiens olarak ayarlayın, liste tipini gen sembolü olarak ayarlayın.
   2. Biyolojik süreç için GOTERM_BP_DIRECT , hücresel bileşen için GOTERM_CC_DIRECT ve moleküler fonksiyon için GOTERM_MF_DIRECT seçerek GO zenginleştirme analizi yapın ve KEGG_PATHWAY seçerek KEGG yol zenginleştirme analizi yapın.
   3. Anlamlılık eşiğini p < 0.05 olarak ayarlayın ve birden fazla test için Benjamini-Hochberg yanlış keşf oranı (FDR) düzeltmesini uygulayın, ardından zenginleştirme sonuçlarını terim isimleri, gen sayıları, p-değerleri, FDR ile ayarlanmış p-değerleri ve ilgili genleri içeren CSV dosyaları olarak indirin.
2. OmicShare bulut platformu kullanarak balon grafik oluşturma
   1. 4.1.3 adımındaki GO zenginleştirme sonuçlarını https://www.omicshare.com/tools numarasında OmicShare bulut platformuna aktarın ve GO zenginleştirme balonu tablosu aracını seçin.
   2. Terim isimlerini, gen sayılarını ve p-değerlerini içeren sonuç dosyasını yükleyin, ardından aracı en düşük p-değerine sahip ilk 20 terimi gösterecek şekilde yapılandırın.
   3. X eksenini zenginleştirme oranını, y ekseni GO terimlerini, kabarcık büyüklüğünü gen sayısını temsil etmek için ve baloncuk rengini p-değerini temsil etmek için ayarlayın.
   4. Balon tablosunu oluştur ve yüksek çözünürlüklü bir görüntü dosyası olarak indir.
3. KEGG haritalayıcı kullanılarak KEGG yol görselleştirmesi
   1. KEGG yol zenginleştirme sonuçlarını p-değerine göre artan sırayla sıralayın ve en küçük p-değerine sahip ilk 20 yolu seçin.
   2. Her seçilen yol için, yol diyagramını elde etmek için https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html tarihinde KEGG veritabanına erişin.
   3. Her yolda bulunan kesişen gen listesinden hedef proteinleri, zenginleştirme sonuçlarından alınan yol gen setleriyle çapraz referans yoluyla belirleyin.
   4. https://www.kegg.jp/kegg/mapper/'de KEGG haritalayıcı aracına erişin, Renk Yolu fonksiyonunu seçin, kesişen gen sembollerinin listesini ve KEGG yol tanımlayıcısını girin ve belirlenen hedef proteinlerin kırmızı renkle vurgulandığı renk kodlu bir yol diyagramı oluşturun.
   5. Tüm zenginleştirme analizi çıktılarını, üç kategori için GO zenginleştirme CSV dosyalarını, KEGG yol zenginleştirme CSV dosyasını, baloncuk grafiği görseli ve en iyi 20 yol için renk kodlu yol diyagramlarını derleyin, ardından bu dosyaları aşağı akış analizi için dışa aktarın.

5. Moleküler kenetlenme doğrulaması

1. RCSB PDB veritabanından https://www.rcsb.org/'de hayati proteinlerin (örneğin CYP3A4 ve POR gibi ağ analizinde ana hedefler olarak tanımlanan CYP3A4 ve POR gibi) 3D yapılarını indirin; aktif alanı tanımlamak için Homo sapiens'ten 2.5 ≤şçözünürlüğe sahip yapıları seçin ve aktif bileşiklerin (beta-karoten dahil, spathulenol ve beta-sitosterol) PubChem veritabanından SDF formatında kullanıldı.
2. AutoDockTools kullanarak su moleküllerini ve birlikte kristalleşmiş ligandı çıkararak, polar hidrojenler ekleyerek ve Gasteiger yüklerini atayarak protein yapılarını hazırlayın, ardından hazırlanan proteinleri PDBQT formatında kaydedin, bileşik SDF dosyalarını Open Babel kullanarak PDB formatına dönüştürün, AutoDockTools'ta her ligand için dönebilir bağları tespit edin ve ligandları PDBQT formatında kaydedin.
3. 60 × 60 × 60 şboyutlarında kenetlenme ızgara kutusunu tanımlayın, ardından her ligand-protein çifti için 10 bağlanma pozu oluşturmak için 8 ve num_modes 10 olarak belirlenmiş şekilde AutoDock Vina ile moleküler kenetlenme gerçekleştirin.
4. Ortaya çıkan kenetlenme dosyalarını ve ilgili hedef dosyalarını PyMOL'a aktarın, en düşük bağlanma enerjisine (en negatif değere) sahip kenetlenme modelini temsil edici poz olarak belirleyip kaydedin.
5. Daha sonra bu modeli https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/'de PLIP veritabanına göndererek küçük moleküller ve proteinler arasındaki etkileşimleri, hidrofobik etkileşimler, π-stacking ve tuz köprülerini analiz etmek için gönderin.
6. LYXT'deki tüm aktif bileşenlerin bağlanma enerjilerini ateş ve öksürükle ilişkili hedef proteinlere karşı hesaplayıp derleyin, ardından sonuçlar bölümünde sunulmak üzere bileşik isimlerini, hedef proteinleri, bağlanma enerjilerini (kcal/mol) ve temel etkileşim türlerini içeren bir özet tablo oluşturun.
   NOT: Ağ farmakoloji analizi için kullanılan R alfabesi, Ek Dosya 1'de mevcuttur.

6. Hayvan deneyi

1. Deneysel zaman çizelgesi
   1. Hayvanları 1 hafta boyunca alıştırın, ardından 0. gün LPS veya tuzlu su uygulaması yapın, 7. günden 20. güne kadar 2 hafta boyunca günlük ilaç tedavisi uygulanır ve 21. gün örnek alınarak ötenazi uygulanır.
2. Hayvan edinimi ve gruplanması
   1. 25 ±± 4g ağırlığında 60 yetişkin erkek C57BL/6 fare satın alın, fareleri 1 hafta boyunca besleyin, ardından rastgele normal tuzlu bir grup (6 fare) ve LPS yaralı bir grup (54 fare) olarak ayırın.
   2. Tedaviye başlamadan önceki 7. günde, LPS yaralı grubu rastgele olarak yedi alt gruba ve her biri 6 fare ile ayrılır: model grup, pozitif grup (deksametazon, 50 mg·^kg-1·^d-1), LYXT tedavi grubu (200 mg·^kg-1·^d-1), beta-karoten grubu (50 mg·^kg-1·^d-1), spathulenol grubu (50 mg·^kg-1·^d-1), ve beta-sitosterol grubu (50 mg·^kg-1·^d-1).
      NOT: Tedavi uygulaması ve sonuç değerlendirmeleri kör edildi.
3. LPS kaynaklı akciğer iltihabı modeli
   1. Anestezi için intraperitoneal enjeksiyonla %2 pentobarbital sodyum ve 60 mg/kg dozda uygulanır. Kuyruk sıkıştırma tepkisi olmamasıyla orta derinlikte anestezi doğrulamak. Son olarak, kaydedilen vücut ağırlığına dayanarak, 10 mg/mL konsantrasyonda LPS'nin gerekli enjeksiyon hacmini hesaplayın.
   2. Burun uygulamasına hazırlanın; LPS çözeltisinin hassas hesaplanmış hacmini pipete çekin. Fareyi sağ elinizle kuyruğunun tabanını kavrayarak sıkıca tutun, sol elin başparmağı ve işaret parmağıyla başını kulaklarından nazikçe sabitleyin.
   3. Sıvıyı yavaşça dışarı atarak pipet ucunda küçük bir damla (yaklaşık 2 μL) oluşana kadar. Damlayı dikkatlice farenin sağ burun deliğine yaklaştırın ve temas edince. Hemen ve hızlı bir şekilde sol eli 30–40 cm yukarı kaldırın, ardından onu ve fareyi nazikçe başlangıç pozisyonuna geri getirin.
      NOT: Yukarı doğru durumu korumak için farenin burun deliklerine dikkat etmek gerekir.
   4. Aynı yöntemi kullanarak küçük sıvı damlaları farenin sol burun deliğine enjekte edin ve sıvı infüzyon tamamlanana kadar ardışık olarak sol ve sağ burun deliklerine ekleyin.
   5. Sonra fareyi bırakın, fareyi fare tahtasına bantla sabitleyin ve karın yüksek, başı eğilmiş pozisyonda 4 saatten fazla tutun. Fare uyandıktan sonra, Lorenz ve ^ark.11 tarafından tanımlanan yöntemle tekrar kafese kalın.
4. Bronkoalveolar lavaj sıvısı toplanması
   1. LPS yaralı grup farelerini rastgele olarak yedi gruba ayırın: negatif kontrol grubu, model grubu, pozitif grup (deksametazon, 50 ^mg.kg-1.d-1), LYXT tedavi grubu (200 ^mg.kg-1.d-1), Beta-karoten grubu (50 ^mg.kg-1.d-1), spathulenol grubu (50 ^mg.kg-1.d-1) ve beta-sitosterol grubu (50 ^mg.kg-1.d-1), her grupta altı fare bulunmak.
      NOT: LYXT'yi şu şekilde hazırlayın: Pharbitis nil (L.) Choisy, Verbena officinalis L. ve Zingiber officinale Roscoe tozunu 5:3:2 kütle oranında karıştırın.  Tozu suyla 1:30 (g/mL) karıştırın ve 80 °C'de reflü ile 2 saat geçirin. Çözeltiyi filtreleyip konsantre edin (30 °C, 0,01–0,08 MPa) ve suda çözerek 2 g/mL bir çözelti hazırlanır. Beta-karotin, beta-sitosterol ve spathulenol deneysel doğrulama için referans standartları olarak kullanıldı. İlaçları her gruba günde bir kez, LPS tedavisinden 1 hafta sonra verin. Jin ve ^ark.12'ye göre, hayvanları aşırı dozda tiopental (100 mg/kg) ötenazi.
   2. Ventrikülü No. 23 kanülle entübe edin. Sonra, 25 cm H₂O basıncı altında akciğer dokusuna yavaşça 10 mL PBS enjekte edilir ve bu lavajı yaklaşık 6 kez tekrarlayarak bronkoalveolar lavaj sıvısı (BALF) elde edilir; bu, Pinheiro ve ^ark.13 tarafından tanımlanan yöntemi izlemektedir.
5. BALF ve serumda lökosit ve sitokin analizi
   1. Toplanan BALF'yi 500 × g'de 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Hücre pelletini 1 mL PBS ile yeniden askıya alın, tripan mavisiyle 1:10 seyreltin ve 400 ×büyütme ile ışık mikroskopu altında hemositometre ile toplam lökositleri sayın.
   2. BALF süpernatantını ve kalp ponksiyonundan serum örneklerini toplayın.
   3. Üreticinin talimatlarına göre ticari ELISA kitleri kullanarak TNF-α, IL-1β ve IL-18 konsantrasyonlarını ölçmek, mikroplaka okuyucu ile 450 nm'de absorbansı okumak ve standart eğrilerden konsantrasyonları hesaplamak. BCA testi kullanarak BALF'deki protein konsantrasyonunu belirleyin.
6. HE ve WB analiziyle aktif bileşenlerin doğrulanması
   1. LYXT etkinliğine katkıda bulunan aktif bileşenleri belirlemek için, LPS kaynaklı akciğer iltihabı modelini 6.3. bölüm uyarınca yeniden kurun.
   2. 60 fare satın alın, bir hafta boyunca uyum sağlayın ve rastgele beş gruba (n = 12 her biri) bölünün: model grubu, LYXT grubu (200 mg·^kg-1·^d-1), beta-karoten grubu (50 mg·^kg-1·^d-1), spathulenol grubu (50 mg·^kg-1·^d-1) ve kombinasyon grubu (her biri 25 mg^·kg-1·^d-1 ).
   3. 0. günde LPS uygulayın ve 6.3. adımda açıklandığı gibi 7. günden 20. güne kadar tedaviler uygulanın. 21. günde, akciğer^{dokusu 14} toplayın.
7. Histolojik analiz
   1. Sol akciğer üst lobunu %4 paraformaldehit ile 24 saat sabitleyin, parafine gömülün, 5 μm kesitler kesilin ve hematoksilin ile eozin (HE) boyama işlemi yapılsın.
   2. Bölümleri ışık mikroskobu altında 200× ve 400× büyütmede inceleyerek inflamatuar hücre infiltrasyonu ve alveolar duvar kalınlaşmasını değerlendirin. Temsilci görüntüler yakalayın.
8. Western Blot analizi
   1. Proteaz ve fosfataz inhibitörleriyle radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) tamponunda akciğer dokusunu homojenleştirin. 12.000 × g sıcaklığında 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın ve bisinkoninik asit (BCA) testiyle protein konsantrasyonunu belirleyin.
   2. Her kuyu başına 30 μg protein sodyum dodesilsülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) jellerine yükleyin, poliviniliden florür (PVDF) membranlarına aktarın ve %5 yağsız sütle blokleyin.
   3. P-p38, p38, TNF-α, IL-1β, IL-18 ve β-aktine karşı primer antikorlarla gece boyunca 4 °C'de, ardından HRP ile konjuge ikincil antikorlarla kuluçka yapın.
      NOT: Antikorların seyreltilmesi Malzeme Tablosu'nda belirtilmiştir.
   4. ECL alt tabakası kullanarak bantları görselleştirin, görüntüler yakalayın ve ImageJ ile yoğunlukları niceleyin. Hedef protein ekspresyonunu β-aktine veya toplam p38'e normalize edin.

Sonuçlar

TCMSP veritabanı, 409 aktif LYXT bileşeni toplamak için kullanıldı. Bunların 58 bileşeni Verbena officinalis L.'den, 86'sı Semen Pharbitidis'ten ve 265 aktif bileşen Zingiber officinale Roscoe'dan geldi. Endekse göre yirmi altı ana aktif madde tarandı; OB %30,1 ve DL ≥%30,1 ≥ DL %0,12, OB %60 ≥ %60, DL ≥ Zingiber officinale Roscoe için 0,13, OB ≥% 16,93 ve DL ≥ Semen Pharbitidis için 0,50 (Tablo 1).

LYXT'nin...

Tartışma

Bu makale, ateş ve öksürük için kullanılan geleneksel bir Dong ilacı karışımı olan LYXT'nin 26 aktif bileşenini ve 207 potansiyel hedefini başarıyla belirlemiştir. Önemli bulgular arasında, ağ topoloji analiziyle CYP3A4'ün kritik hedef protein olarak tanımlanması ve LPS kaynaklı akciğer iltihabı modelinde LYXT, beta-karoten ve spathulenol'ün aktif bileşikler olarak önemli anti-inflamatuar etkileri olan deneysel doğrulanması yer almaktadır. Bu bulgular, ağ farmakolojisini (veritabanı tara...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anti-IL-18	Proteintech, Wuhan, Çin	27095-1-AP	Tavşan poliklonal, 1:500
Anti-IL-1β	Proteintech, Wuhan, Çin	66737-1-Ig	Fare monoklonal, 1:500
Anti-p38	Proteintech, Wuhan, Çin	14064-1-AP	Tavşan poliklonal, 1:1000
Anti-p-p38	Proteintech, Wuhan, Çin	28796-1-AP	Tavşan poliklonal, 1:1000
Anti-TNF-α	Proteintech, Wuhan, Çin	80258-6-RR	Tavşan monoklonal, 1:500
Anti-β-aktin	Proteintech, Wuhan, Çin	66009-1-Ig	Fare monoklonal, 1:2000
AutoDock Vina	https://vina.scripps.edu/	Sürüm 1.5.6	Moleküler kenetlenme yazılımı
AutoDockTools	https://autodock.scripps.edu/	Sürüm 1.5.6	Moleküler kenetlenme hazırlama aracı
BCA Protein Test Kiti	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD	23225	Protein konsantrasyonu belirleme için
Beta-karoten	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD	83-46-5	Yüksek saflık standardı, %>95
Beta-sitosterol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD	83-46-5	Yüksek saflık standardı, %>95
C57BL/6 fareleri	Lanzhou Üniversitesi&NBSP Tıbbi Hayvan Merkezi;	-	Yetişkin erkek, 25 yaş ve üzerine; 4 g
Sitoscape	https://cytoscape.org/	Sürüm 3.8.1	Ağ görselleştirme ve analiz yazılımı
Deksametazon	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD	D4902	Pozitif kontrol
ECL Substratı	MilliporeSigma, Burlington, MA, ABD	WBKLS0500	Western leke tespiti için
ELISA Kitleri
GraphPad Prizması	https://www.graphpad.com/	8.0 veya üzeri sürümler	İstatistiksel analiz ve grafik yazılımı
Hematoksilin ve Eosin (H& E) Boyama Kiti	Pekin Solarbio Bilim & Technology Co., Ltd, Pekin, Çin	G1120	Akciğer dokusu boyama için
Histoloji
HRP ile konjuge edilmiş anti-fare	Proteintech, Wuhan, Çin	SA00001-7G	İkincil antikor, 1:5000
HRP ile bağlanmış anti-tavşan	Proteintech, Wuhan, Çin	SA00001-7H	İkincil antikor, 1:5000
IL-18 ELISA Kiti	Pekin Solarbio Bilim & Technology Co., Ltd, Pekin, Çin	SEKH-0016	BALF ve serumda IL-18 ölçümü için
IL-1β ELISA Kiti	Pekin Solarbio Bilim & Technology Co., Ltd, Pekin, Çin	SEKM-0004	IL-1 ve beta ölçümü için; BALF ve serumda
ImageJ	https://imagej.nih.gov/ij/	Sürüm 1.53	Görüntü analiz yazılımı
Lipopolisakkarit (LPS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD	L2630	From  Escherichia coli  O111:B4
LYXT Ham Maddeleri	Huaihua Üniversitesi	-	Toz karışımı  Pharbitis nil  (L.) Choisy,   Verbena officinalis L., ve  Zingiber officinale  Roscoe (5:3:2, k/k/k/k/gel)
Diğer Malzemeler
Pentobarbital sodyum	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD	P3761	Anestezi için %2 çözelti
PLIP	https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/	-	Protein-ligand etkileşim profilleyicisi
PVDF zarları	MilliporeSigma, Burlington, MA, ABD	IPVH00010	Western blot transferi için
PyMOL	https://pymol.org/	Sürüm 2.5	Moleküler görselleştirme yazılımı
R	https://www.r-project.org/	4.0 veya üzeri sürümler	İstatistiksel hesaplama ve grafik yazılımı
Spathulenol	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, ABD	HY-N1205	Yüksek saflık standardı, %>95
STRING	https://stringdb.org/	-	Etkileşimde Bulunan Genler/Proteinlerin Geri Getirilmesi İçin Arama Aracı
TCMSP	https://tcmsp-e.com/	-	Geleneksel Çin Tıp Sistemleri Farmakoloji Veritabanı
Thiopental	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD	T102	Ötenazi için
TNF-α ELISA Kiti	Pekin Solarbio Bilim & Technology Co., Ltd, Pekin, Çin	SEKM-0034	TNF-&alpha ölçümü için; BALF ve serumda
UniProt	https://www.uniprot.org/	-	Protein dizisi ve açıklama veritabanı