Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Nörodejenetörle İlgili Yaşlanma: Kemirgen beyninin histolojik kesitlerinde β-gal aktivite ve nissl lekesi eşzamanlı değerlendirilmesi

114 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70676

⸱

17 Temmuz 2026

 ,  , 
1Laboratorio de Neuroinmunología, Unidad de Investigación en Medicina Experimental, Facultad de Medicina-UNAM, Hospital General de Mexico "Dr. Eduardo Liceaga"

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz aktivitesini tespit etmek, yaşlanma ve nöronal bütünlüğün eşzamanlı değerlendirilmesi için Nissl boyama yapmak ve yaşlanma yükü ile nörodejenerasyon arasındaki bağlantıları araştırmak için bir araç olarak sunulmaktadır.

Özet

Hücresel yaşlanma, doku yenilenmesini ve işlevini bozan geri dönüş imkesiz hücre döngüsü durmasıyla karakterize edilen fizyolojik bir süreçtir. Bu olgu, merkezi sinir sistemi (CNS) içinde yaşlanan hücrelerin birikmesiyle beslenen nörodejenerasyonun temel bir itici kaynağı olarak ortaya çıkmıştır. Yaşlanan hücreler, kronik nöroinflamasyonu sürdüren ve nöronal mikroçevreyi bozan pro-inflamatuar yaşlanma ilişkili sekretör fenotip (SASP) kazanır. Sonuç olarak, nörogenez, sinaptik plastisite ve nöron hayatta kalma gibi temel süreçler tehlikede bulunur. Geniş bir literatür, hücresel yaşlanmayı Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı veya multipl skleroz gibi çeşitli nörodejeneratif bozukluklar ve beyin iskemi veya travmatik beyin hasarı gibi akut nöronal hasarlarla ilişkilendirir.

Histolojik kesitlerde yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-gal) aktivitesi ve Nissl boyamanın ortak değerlendirmesi, aynı doku bağlamında hücresel yaşlanma ve nöronal bütünlüğü aynı anda değerlendirmek için kapsamlı bir yaklaşım sunar. Bu strateji, belirli hassas bölgelerde (örneğin hipokampus veya korteks) yaşlanmış hücrelerin birikimi ile nöronal kayıp veya doku hasarı arasında kesin mekansal korelasyon sağlar. Yaşlanmanın fonksiyonel bir belirtecini klasik bir nöronal morfoloji ve yoğunluk göstergesi ile entegre ederek, bu yaklaşım analizin yorumsal sağlamlığını güçlendirir. Ayrıca, yaşlanma yükü ile nörodejeneratif değişiklikler arasındaki ilişkinin daha doğru karakterizasyonunu sağlar ve sınırlı doku örneklerinden elde edilen bilgi verimini en üst düzeye çıkarır.

Ayrıca, bu protokol, nörodejeneratif hastalıkların kemirgen modellerinde müdahalelere (farmakolojik, genetik manipülasyon vb.) karşı olarak yaşlanan hücre birikiminin nasıl gerçekleştiğini belirleyebilir ve böylece bu katkıyı patofizyolojilerine analiz etmek için güçlü bir araç sağlar.

Giriş

Hücresel yaşlanma, hücre döngüsünün temelde geri dönülmez bir durması ve kapsamlı makromoleküler değişikliklerle birliktetanımlanır. Ayrıca, yaşlanan hücreler, çeşitli pro-inflamatuar sitokinler, büyüme faktörleri ve proteazların sağlam salgılanmasıyla karakterize edilen bir hipersekretör fenotip (SASP) kazanır. Bu faktörler birlikte, yaşlanmayı pekiştiren ve doku homeostazını etkileyen pro-inflamatuar bir mikro ortamın oluşmasına katkıda bulunur. Merkezi MSS'de, yaşla birlikte yaşlanan hücreler, özellikle yaşa bağlı patolojiye karşı hassas bölgelerde kademeli olarak birikir. Hücresel yaşlanma, yaşlanma ve nörodejeneratif bozukluklarla ilişkili fonksiyonel değişikliklerde önemli bir rol oynar; normal yaşlanma sırasında yaşlanan hücrelerin yükü kademeli olarak artar. MSS'deki birden fazla hücre tipi, astrositler, mikroglia, oligodendrositler, nöronlar ve sinir kök hücreleri gibi yaşlanmayahassastır 4. Biriken kanıtlar, bu CNS hücre popülasyonlarının yaşlanmasının Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, frontotemporal demans, amiyotrofik lateral skleroz ve multipl skleroz gibi çeşitli nörodejeneratif hastalıkların etiyopatolojisinde roloynadığını göstermektedir. Nörodejeneratif bozukluklar hücreselyaşlanma 6 ile ilişkilendirilmiş ve yaşlanmış hücrelerin amiloid-β plakları ve nörofibriller düğümlere yakın yerde biriktiği gösterilmiştir. Kemirgen beyinlerinde (örneğin, 3, 8, 17 ve 24 aylık) SA-β gal aktivitesinde yaşa bağlı artışlar tanımlanmıştır; istatistiksel olarak anlamlı yükselmeler en çok en yaşlı kohortta (24 aylık)7 olarak görülmektedir.

Farklı çalışmalar, beyin yaralanmasının fonksiyonel veya davranışsal korelasyonlarını ele alan patolojik hayvan modellerinde histolojik değişiklikler ile fonksiyonel sonuçlar (bilişsel bozukluk ve metabolik düzensizlik gibi) arasındaki ilişkiye dair önemli bilgilersunmaktadır 8,9.

Kapsamlı araştırmalara rağmen, yaşlanan hücreleri güvenilir şekilde tanımlayan ve onları diğer proliferatif olmayan durumlardan ayıran tek bir evrensel belirteç yoktur; ancak, hücresel yaşlanmanın en yaygın belirteci, pH 6'da tespit edilen lizozomal enzim yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidler (SA-β-gal) olup, β-galaktozidlerin hidrolizini monosakkaridlere dönüştüren bir hidrolaza enzimidir. Önemli ayırt edici faktörlerden biri pH'dır. SA-β-gal, pH 6'da optimal aktivite gösterir; bakteriyel β-galaktosidaz ise pH 7.4'te çalışır ve endogen lizozomal β-galaktosidaz ise 3 ile 5 arasında değişen asitik pHdeğerlerinde çalışır 7,10.

Hücre yoğunluğu ve beyin sitomimarisi, sinirsel organizasyon ve işlevin temel belirleyicileridir. Belirli hücre popülasyonlarının mekânsal dağılımı ve bolluğu, devre fonksiyonu için kritik öneme sahiptir ve bunların doğru nicelendirilmesi, seçici hücresel savunmasızlık veya kaybı içeren nöropatolojik durumların incelenmesi için gereklidir. Nissl boyama, sinirbilimde standart bir yöntem olup, sinir dokusunda nöronal yoğunluk ve sitomimariyi değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir histolojik tekniktir. Nöron somataları içinde Nissl cisimlerini seçici olarak etiketleyerek, bu yöntem beyin bölgeleri boyunca nöronal popülasyonların güvenilir görselleştirilmesi ve nicelendirilmesinisağlar 11. Nissl boyama sağlamlığının yanı sıra, teknik sadeliği, düşük maliyeti ve nispeten kısa işlem süresiyle de karakterize edilir; bu da rutin nöroanatomik ve nörodejenerasyon çalışmaları için pratik ve erişilebilir bir araç haline gelir.

Aynı histolojik bölümde Nissl boyalanması ve yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-gal) aktivitesinin birleşik değerlendirmesi, nöron bütünlüğü ve yaşlanan hücre yükünün aynı anda sorgulanması için sağlam ve mekansal olarak çözümlü bir çerçeve sağlar. Bu bütünleyici yaklaşım, yaşlanmanın bölgeye özgü nörodejeneratif özelliklerle, örneğin nöronal kayıp ve sitomimari bozulma gibi doğrudan eşlenmesini sağlar. Klasik bir yapısal belirticiyi işlevsel yaşlanma göstergesi ile birleştirmek, veri yorumlamasını güçlendirir ve yaşlanan hücre birikimi ile doku işlev bozukluğu arasındaki mekanistik bağlantıları ortaya çıkarırken, sınırlı örneklerden elde edilen analitik verimi maksimize eder.

Önemli olarak, bu strateji özellikle sınırlı doku kullanılabilirliği, uzunlamasına veya müdahale tabanlı tasarımlar (örneğin, senolitik veya senomorfik tedaviler) ve yaşlanmanın nöronal hassasiyetle ilişkilendirildiği karmaşık beyin yapılarında bölgeye özgü analizler için özellikle uygundur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürlerini, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kurumsal ve ulusal yönergelere uygun olarak gerçekleştirmek ve ilgili etik komitesinden önceden onay almak. Bu protokol, mevcut Meksika Resmi Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Standardı (NOM-062-ZOO-1999(Muñoz, 2001)), Etik ve Araştırma Komiteleri tarafından önceden revizyon ve onay ile Meksika Ulusal Otonom Fakültesi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (CICUAL) ile uyumludur (FM/DI/039/2023, CICUAL-009-2023). Hayvanlar, Unidad de Medicina Deneysel Fakültesi'nin vivaryumu tarafından sağlanıyordu.

NOT: Yaşlanmaya bağlı β-galaktosidaz (SA-β-gal) aktivitesinin ve kemirgen beyin dokusunda Nissl boyamanın eşzamanlı değerlendirilmesini sağlamak için, bu protokol %4 paraformaldehit sabit kemirgen beyinlerini kullanmaktadır ve -20 ± 1 °C arasında kriyoseksiyon yapılır. Tüm bölümler önce SA-β-gal aktivitesi için değerlendirilir (adım 1), ardından Nissl boyama (adım 2) ve ardından antifade montaj malzemesi ile monte edilir (adım 3). İşlendikten sonra, slaytlar parlak alan optik mikroskop altında incelenir; böylece ilgilenilen bölgelerin yüksek çözünürlüklü görüntüleri daha fazla analiz için alınabilir.

1. Doku kesitlerinin hazırlanması ve yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-gal) aktivitesinin tespiti

  1. Beyin kesitlerinin hazırlanması
    1. Beyinleri, daha önce Wu ve ark. tarafından daha önce tanımlanan protokole uygun olarak %4 oranında paraformaldehit ile transkardiyak perfüzyon ile eldeedinin 12. Beyinleri, 4 °C'de uzun süreli depolama için %0,01 sodyum azid içeren fosfatlı tuzlu çözeltiye (PBS) aktarın.
    2. Protokole devam etmek için beyni %30 sakaroz solüsyonuna yerleştirin, dip batana kadar bekleyin, ardından -20 ila -80 °C arasında saklayın. Bu protokol, farklı kemirgen beyin dokularında (örneğin, fare, fare, kobay) kullanılabilir ve 2-metilbütanda dondurulabilir.
    3. Doku -20 ± 1 °C sıcaklıkta kriyoseksiyon yapılır; böylece optimal kesme sıcaklığı (O.C.T.) bileşiğine (20–40 μm kalınlıkta) gömülü uniform kesitler elde edilir ve jelatin kaplı cam slaytlara monte edilir.
    4. Bölümleri cam sürgülere monte edin ve kullanana kadar soğuk koşullarda saklayın.
  2. Yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-gal) aktivitesinin tespiti.
    1. SA-β-gal boyama çözeltisi, kullanım gününde taze olarak hazırlanır, tablo 1'de gösterilen çözeltilerden.
    2. SA-β-gal aktivitesinin özgüllüğünü sağlamak için çözeltiyi pH 6.0'a ayarlayın.
      NOT: Kullanımdan önce SA-β-gal boyama çözeltisini hazırlayın; Sulu bir çözeltiye önceden karıştırmaktan kaçının.
      5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranozid (X-Gal) sulu çözeltide stabil değildir.
  3. Doku slaytlarının sıcaklığını dengeleyin.
    1. Soğuk depodan sürgüleri çıkarın.
    2. Slaytları bir Coplin kavanozuna yerleştirin ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika dengelenmesine izin verin.
    3. Coplin kavanozundaki slaytları kapatacak kadar PBS ekleyerek bölümleri nemlendirin.
    4. Kaydırakları RT rejiminde 5 dakika boyunca düşük hızlı yörünge sallayıcısına yerleştirin.
    5. Yıkamayı bir kez tekrarlayın.
  4. Slaytları boyama için hazırlayın.
    1. Fazla PBS'yi emici kağıt kullanarak sürgü kenarlarından nazikçe çıkarın.
    2. Her bölümün etrafına su itici bariyer kalemi kullanarak hidrofobik bir bariyer çizerek dokuya temas etmeyin.
  5. SA-β-gal boyama işlemi yapın
    1. Slaytları nem odasına yerleştirin.
    2. Mikropipet ile, her bölüme yaklaşık 200 μL boyama çözeltisi ekleyin, böylece dokunun tam kaplanması sağlanır.
    3. 37 °C'de 48 saat kuluçka yapın.
    4. İnkubasyondan sonra, emici kağıtla boyama çözeltisini çıkarın.
    5. Slaytları bir Coplin kavanozuna yerleştirin ve kaydırakları kapatmak için PBS ekleyin, ardından RT'de 5 dakika boyunca düşük hızlı yörünge sallayıcısında hafif bir çalkalama yapın.
      NOTLAR: CO₂ kuluçka makinesi kullanmayın. Hemen Nissl boyama işlemlerine geçin.

2. Nissl boyama

  1. Nissl çalışma çözümünü hazırla.
    1. Tablo 2'de açıklandığı gibi stok çözümleri hazırlayın.
    2. Stok çözeltilerinden, 15 mL kresil mor çözeltisi ile 85 mL asetat tamponu karıştırarak Nissl çalışma çözeltisi hazırlanır.
    3. Çökeltiyi temizlemek için çözeltiyi filtre kağıdı ile filtreleyin (4. sınıf, 20-25 μm gözenek boyutu).
    4. Filtre çözeltisinden sonra, en az 30 dakika boyunca 37 °C'de (veya su banyosunda 40–43 °C) önceden ısıtın.
    5. Nissl çalışma çözeltisine hemen kullanmadan önce 10 damla 0.1 M asetik asit ekleyin.
      NOT: Nissl çalışma çözümünü aynı gün içinde en fazla dört kez kullanın; Gece boyunca depolamayın.
    6. Hacimsel bir şişeye 95 mL mutlak etanol ekleyerek ve 15 damla 0.1 M asetik asit ekleyerek asitlenmiş etanol hazırlayın. Damıtılmış suyla 100 mL'ye getirin ve iyice karıştırın.
  2. Slaytları önceden koşullayın.
    1. Slaytları bir Coplin kavanozuna koyup PBS ekleyin, slaytları kapatmak için PBS ekleyin ve 37 °C'de 5 dakika kuluçka yapın.
  3. Lekeli bölümler.
    1. Slaytları önceden ısıtılmış Nissl çözeltisine dikkatlice daldırın, sürgü sürgü.
    2. Slaytları Nissl çözeltisinde 5–20 dakika kuluçka edin.
      NOT: Süre, doku kalınlığına bağlıdır. Her 5 dakikada bir boya takmayı izleyin, ta ki derin mor renk ortaya çıkana kadar.
  4. Bölümleri yıka.
    1. Slaytları damıtılmış suyla 1 dakika boyunca nazikçe durulayın. Coplin kavanozunda taze damıtılmış su ile slaytlara ek 1 dakika aktarın.
    2. Lekelenme kalitesini değerlendirin. Slaytları parlak alan mikroskobu altında gözlemleyin (10× hedef).
    3. Parlak alan mikroskopunda, minimal arka planla yoğun mor noktalı boyama yapılmasını doğrulayın.
      NOT: Eğer arka plan fazlaysa, slaytları 10 saniye boyunca asitlenmiş %95 etanol içinde batırın.
    4. Hemen 10 saniyeliğine mutlak etanole aktarın ve farklılaşmayı durdurun.
      NOT: Gerekirse boyama işlemlerini tekrarlayın, renk zayıfsa boyama adımları (8.1-9.3) tekrarlanın.
  5. Susuz bırakın ve kaydırakları temizleyin.
    1. Kaydırakları en az 5 dakika (gerekirse 2 saate kadar) ksilen içinde batırın.
      NOT: Hızlı çalışın, çünkü doku ~2 dakika içinde susuz kalır.

3. Montaj

  1. Montaj ortamını hazırla
    1. 8 mL montaj ortamını 2 mL ksilen ile karıştırın.
      NOT: Sadece gerekli cildi hazırlayın; Montaj ortamı hızla sertleşir.
    2. Slaytları ksilen üzerindeki çıkar ve kenarlarını nazikçe lekeleyin. Kaydırakları düz bir yüzeye yerleştirin.
    3. ~120 μL montaj ortamını dokuya uygulayın.
    4. Kapak kabarcıklarını önlemek için bir taraftan yavaşça yerleştirin.
  2. Slaytları kurutun ve görüntüler alın.
    1. Sürgülerin RT'de en az 5 dakika kurumasına izin verin.
    2. Parlak alan mikroskobu altında gözlemleyin ve ilgi çeken bölgelerin görüntülerini alın.
    3. Montajdan sonra, montaj ortamının tam kurutması uzun bir süre (24 saat) gerektirir.
  3. Slaytları sakla.
    1. Slaytları uzun vadeli koruma için RT'de saklayın (uzun süre boyunca).

4. Yaşlanma yükünün nicelendirilmesi

NOT: Bu yaklaşım niteliksel bir değerlendirme olarak uygulanır; ancak çalışma tasarımı gerektirdiğinde, nicel analizi de kapsayacak şekilde genişletilebilir.

  1. Yaşlanma yükü, belirli bir ilgi alanı (ROI) içinde yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-gal)–pozitif hücrelerin göreceli bolluğu olarak tanımlayın. Bu metrik, toplam hücre sayısına göre pozitif hücrelerin yüzdesi veya bir alan başına pozitif hücrelerin yoğunluğu (hücreler/mm 2) olarak ifade edin.
  2. İlgi alanı (ROI) seçin. Türe ve yaşa uygun bir beyin atlası kullanarak standartlaştırılmış nöroanatomik işaretlere dayalı yatırım getirisi (ROI) belirlemek. Önerilen bölgeler arasında hipokampal alt alanlar (CA1, CA3, dentat girus) ve tanımlanmış laminar organizasyona sahip kortikal alanlar bulunur.
    1. Her bölüm için ROI başına 3–5 örtüşmeyen alan seçin.
    2. Her hayvan başına en az 2–3 kesit, tutarlı anatomik aralıklarla analiz edilsin.
    3. Tüm örneklerde aynı yatırım getirisi boyutu ve şeklini koruyun.
    4. Kullanıcıyı ROI seçimi sırasında deneysel koşullara kör ederek yanlılığı en aza indirin.
  3. Görüntüler edin.
    1. Dijital kamerayla donatılmış parlak alan mikroskobu kullanarak standart koşullarda görüntü alın:
      1. Tutarlı büyütmeler kullanın (örneğin, bölgesel genel bakış için 10×, nicelik için 20× veya 40×).
      2. Tüm örneklerde sürekli aydınlatma, pozlama süresi ve beyaz dengesini koruyun.
      3. SA-β-gal sinyalinin (mavi) doygunluğunu önleyin ve Nissl boyasının (mor) net görselleştirilmesini sağlayın.
      4. Görüntüleri kayıpsız bir formatta (örneğin, TIFF) takip analizi için kaydedin.
  4. Görüntüleri önceden işleyin.
    1. Görüntü analiz yazılımı (örneğin, ImageJ/Fiji) kullanılarak ön işleme gerçekleştirin13.
      1. Gerekirse görüntüleri RGB formatına dönüştürün.
      2. Düzensiz aydınlatmayı düzeltmek için arka plan çıkarma uygulayın.
      3. Tüm görüntülerde kontrastı eşit şekilde normalize edin ve göreceli sinyal yoğunluğunu değiştirmeyin.
      4. Sinyal sınırlarını bozabilecek aşırı işlemeden kaçının.
  5. SA-β-gal-pozitif hücreleri tespit edin.
    1. Sitoplazma içinde lokalize olmuş belirgin mavi çökelti varlığına dayalı olarak pozitif hücreleri tanımlayın. Mavi sinyali izole etmek için renk eşik kullanabilirsiniz (örneğin, ampirik olarak belirlenmiş ton/doygunluk/yoğunluk aralıkları).
    2. Eşikleri negatif kontroller (genç veya işlenmemiş doku) kullanarak arka plan boyamasını engellemek için doğrulayın.
  6. Nissl boyamada gözlemlenen hücresel profillerle morfolojik tutarlılığı doğrulayın.
  7. Nicelendirme yaklaşımları
    1. Hücre tabanlı nicelik: SA-β-gal-pozitif hücreleri manuel olarak veya yarı otomatik araçlarla sayın. Aynı yatırım getirisi içindeki toplam hücre sayısını Nissl boyama kullanarak belirleyin.
    2. Sonuçları şu şekilde ifade edin:
      Yaşlanma yükü (%) = (SA-β-gal-pozitif hücreler/Toplam hücreler) ' 100
    3. Yoğunluk tabanlı nicelik: birim alan başına SA-β-gal–pozitif hücre sayısını hesaplayın:
      Hücre yoğunluğu = Pozitif hücreler/ROI alanı (mm2)
    4. Eşik tanımı ve kontroller: Tespit eşiklerini ampirik olarak belirleyin:
    5. Arka plan sinyal seviyelerini belirlemek için negatif kontroller kullanın.
    6. Hassasiyeti doğrulamak için pozitif kontrolleri (örneğin, yaşlı beyin dokusu veya stres kaynaklı modeller) dahil edin.
    7. Bir deneydeki tüm örneklerde aynı eşik ayarları uygulanın. Tekrarlanabilirliği sağlamak için tüm eşik parametrelerini belgeleyin.

5. Veri normalizasyonu ve istatistiksel analiz

  1. Hücre yoğunluğundaki bölgesel farklılıkları hesaba katacak şekilde yaşlanma yükünü normalleştirir; Nissl boyama kullanarak ROI başına toplam hücre sayısını tahmin edin—ROI, kesitler ve hayvanlar arasında ortalama ölçümler. Deneysel tasarıma bağlı olarak uygun testler (örneğin, t-testi, ANOVA) kullanılarak istatistiksel analizler yapın.
  2. Verileri ortalama SEM veya SD ± olarak bildirin, biyolojik kopya sayısını (n) belirtin.
  3. Kör etme ve tekrarlanabilirlik: Tüm nicelendirme analizlerini kör koşullarda gerçekleştirin. Tekrarlanabilirliği şu yollarla doğrulamak: (a) En az iki gözlemci tarafından bağımsız analiz veya (b) gözlemci içi değişkenliği değerlendirmek için bir alt küme görüntünün yeniden analizi.
  4. Nicel belirleme stratejisinin sınırlamaları: Mümkün olduğunda nicel sonuçları tamamlayıcı belirteçlerle birlikte yorumlayın. Ayrıca, kesitler arasında boyama yoğunluğundaki değişkenlik, eşik tabanlı niceliklendirmeyi etkileyebilir ve dikkatli kontrol edilmelidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yaşlanmaya bağlı β-galaktosidaz (SA-β-gal) boyama ve Nissl boyamalarının birleşik uygulaması, aynı beyin bölümü içinde yaşlanan hücre yükü ve nöronal sitomimarinin eşzamanlı görselleştirilmesini sağlar.

SA-β-gal boyama prosedürünün (adım 1) ardından, slaytları parlak alan mikroskobu altında inceleyin. Başarılı boyama, β-galaktosidaz aktivitesi sergileyen hücreler içinde belirgin bir mavi çökeltinin varlığıyla gösterilir (Şekil 1)....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Şu anda, CNS'deki yaşlanmış hücreleri tanımlamak, izolasyon yapmak ve seçici olarak çıkarmak için sağlam, spesifik araçların sınırlı bulunması, mekanistik çalışmaların önünde büyük bir engel olarak durmaktadır. Bu metodolojik boşluk, hücresel yaşlanmanın nöropatolojiye nedensel katkılarını, hastalık ilerlemesiyle sadece ilişkilendirilmesinden ayırma yeteneğimizi sınırlar. Burada sunulan iş akışı, SA-β-gal enzimatik algılama ile Nissl karşı boyama yöntemini birleştirerek varsayılan yaşlan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, UNAM (PAPIIT IN224624) ve Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación (SECIHTI) programları Ciencia de Frontera CBF-2025-I-1337 ve UNAM Doktora Programı (POSDOC) tarafından desteklendi. RJRC, CONAHCyT'den 1020262 numaralı burs aldı. VSV, UNAM'daki Programa de Becas Postdoctorales, Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)'dan doktora sonrası burs aldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2-metilbütanSIGMAM32631-500ML
5-bromo-4-kloro-3-indolil β-D-galaktopiranozid (X-Gal)PROMEGAV394A-30 ila -10 °C arasında saklayın
Sitrik asit MERCK251275-5G
Kresil violet asetatSIGMAC5042-10G
Histoloji için DPX Montaj maddesiSIGMA06522-500ML
Filtre kağıdıWhatmanWHA1001929
Glacial asetik asitSIGMA695092-500ML
Hidrofobik kalem MERCKZ672548
Histolojik kalitede KsilenSIGMA534056-500ML
Nem KabiniSTAINTRAY25501
Magnezyum klorür anhidratSIGMAM8266-100GHidratleşmiş magnezyum klorür kullanılırsa molariteyi ayarlayın.
OCTSAKURA FINE TEK4583
Fosfat tamponlu salin (PBS)SIGMAP4417-50TABTicari tabletler kullanılır.
Potasyum ferisiyanit (Potasyum heksasiyanoferrat(III))SIGMAP8131-100G
Potasyum ferrosiyanit (Potasyum heksasiyanoferrat(II) trihidrat)SIGMAP9387-100G
Sodyum asetat anhidratSIGMAS2889-250GHidratleşmiş sodyum asetat kullanılırsa molariteyi ayarlayın.
Sodyum klorürSIGMAS9888-2.5KG
Sodyum fosfat (Sodyum fosfat dibazik dodekahidrat)SIGMA71649-500G

Kaynaklar

  1. Melo Dos Santos, L., et al. Cellular senescence in brain aging and neurodegeneration. Ageing Res Rev. 93, 102141(2024).
  2. Chinta, S. J., et al. Cellular senescence and the aging brain. Exp Gerontol. 68, 3-7 (2015).
  3. Baker, D. J., Petersen, R. C. Cellular senescence in brain aging and neurodegenerative diseases: evidence and perspectives. J Clin Invest. 128 (4), 1208-1216 (2018).
  4. Kuźniar, J., et al. Connections between cellular senescence and Alzheimer’s disease—a narrative review. Int J Mol Sci. 26 (17), 8638(2025).
  5. Martínez-Cué, C., Rueda, N. Cellular senescence in neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 14, 16(2020).
  6. Wang, Y., et al. The role of cellular senescence in neurodegenerative diseases. Arch Toxicol. 98 (8), 2393-2408 (2024).
  7. Piechota, M., et al. Is senescence-associated β-galactosidase a marker of neuronal senescence? Oncotarget. 7 (49), 81099-81109 (2016).
  8. Zhang, H., et al. Mangiferin alleviated poststroke cognitive impairment by modulating lipid metabolism in rats with cerebral ischemia/reperfusion. Eur J Pharmacol. 977, 176724(2024).
  9. Hussain, M. S., et al. Autophagy and cellular senescence in Alzheimer’s disease: key drivers of neurodegeneration. CNS Neurosci Ther. 31 (7), e70503(2025).
  10. Si, Z., Sun, L., Wang, X. Evidence and perspectives of cell senescence in neurodegenerative diseases. Biomed Pharmacother. 137, 111327(2021).
  11. Meystre, J., et al. Cell density quantification of high resolution Nissl images of the juvenile rat brain. Front Neuroanat. 18, 1463632(2024).
  12. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), (2021).
  13. Lozano-Gerona, J., García-Otín, Á-L. ImageJ-based semiautomatic method to analyze senescence in cell culture. Anal Biochem. 543, 30-32 (2018).
  14. Huang, W., et al. Cellular senescence: the good, the bad and the unknown. Nat Rev Nephrol. 18 (10), 611-627 (2022).
  15. Zeng, W. -J., et al. A novel inflammation-related lncRNAs prognostic signature identifies LINC00346 in promoting proliferation, migration, and immune infiltration of glioma. Front Immunol. 13, 810572(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

SinirbilimSay 233Say 233Bu Ay JoVE deSayYa lanmaN rodejeneratif hastal kbeta galaktosidaz
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.