Pseudomonas aeruginosa agregaları, antibiyotiklere ve bağışıklık hücrelerine karşı artan tolerans gösterir. Zar bütünlüğünün toplam hayatta kalmadaki rolü şu anda yeterince araştırılmamıştır. Bu çalışma, P. aeruginosa agregalarında hücre zarı dinamiklerindeki değişiklikleri nicelendirmek için bir yöntem göstererek hücresel bütünlüğün genel agrega canlılığını nasıl etkileyebileceğini anlamaya yardımcı olmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Pseudomonas aeruginosa agregalarında konak kaynaklı strese yanıtın gerçek zamanlı görüntülemesi
Bu makalede
Özet
Özet
Kistik fibroz (KF) gibi kronik enfeksiyonlar, bağışıklık ve terapötik baskılara rağmen devam eden küçük, yüksek toleranslı Pseudomonas aeruginosa agregaları tarafından sürdürülür. Klasik biyofilmlerin aksine, bu agregalar belirgin bir patojenik birim temsil eder - mikro ölçekli, mekansal olarak organize edilmiş topluluklar; konak kaynaklı stres altında yapısal bütünlüğü ve fizyolojik homeostazı korur. Ancak, bu koşullar altında agregaların sağlam kalmasını sağlayan mekanizmalar ve bu homeostatik süreçlerin seçici olarak bozulup bozulmayacağı hâlâ belirsiz olarak belirlenmiştir. Bu boşluğu kapatmanın önündeki temel engellerden biri, fizyolojik gerilmeyi yapısal stabilitere ve çöküşle gerçek zamanlı ilişkilendiren dinamik, mekânsal çözümlü süreçleri yakalayabilen araçların eksikliğidir. Bu çalışma, konak ile ilgili stresörlere karşı toplam yanıtları niceliklendirmek için entegre görüntüleme ve analitik iş akışı sunmaktadır. Voltaja duyarlı boya DiBAC4(5) kullanılarak, sentetik kistik fibroz balgam ortamında (SCFM2) oluşan agregatlarda fizyolojik bozulmanın erken bir göstergesi olarak membran depolarizasyonu izlendi. Yüksek çözünürlüklü zaman geçişli konfokal mikroskopi, hem kararlı hem de stres kaynaklı durumlarda agregaların görselleştirilmesini sağlarken, görüntü segmentasyonu ve voxel tabanlı analiz, tek hücre çözünürlükte membran bütünlüğünde ve agdek sökümde mekânsal heterojenliğin nicel haritalanmasını sağlar. Bu iş akışı, çok hücreli bakteriyel agregalarda fizyolojik stresi yapısal sonuçlarla ilişkilendirmek için tekrarlanabilir ve uyarlanabilir bir platform oluşturur. Toplam bütünlüğünü koruyan veya tehlikeye atan süreçlerin nicel olarak diseksiyonunu mümkün kılarak, bu yaklaşım, toplam dayanıklılığı destekleyen homeostatik mekanizmaların belirlenmesi ve hedeflenmesi için kritik bir temel sağlar ve bu klinik açıdan önemli bakteriyel kalıcılık biçimini bozmak için yeni stratejiler geliştirir.
Giriş
Kronik bakteriyel enfeksiyonlar genellikle büyük, yüzeye bağlı biyofilmlerle değil, konakla ilişkili ortamlarda oluşan küçük, çok hücreli agregalarla sürdürülür. Kistik fibroz (KF) ve diğer kronik hava yolu hastalıklarında, Pseudomonas aeruginosa genellikle epitel yüzeylerine yapışmış klasik biyofilmler yerine mukus veya balgam içinde asılı kalmış agregalar olarak bulunur. Bu agregalar, mikro ölçekli mekânsal organizasyon, belirgin fizyolojik heterojenlik ve bağışıklık ile antimikrobiyal stresörlere olağanüstü toleransla karakterize edilen belirgin bir büyümebiçimini temsil eder 1,2,3,4. Klinik önemlerine rağmen, bu protokolde zar bütünlüğünü ve mekansal organizasyonu koruma yeteneği olarak tanımlanan toplam stabiliteyi yöneten mekanizmalar hâlâ yeterince anlaşılmamıştır; önceki çalışmalar daha çok yüzeye bağlı biyofilm oluşumunu destekleyen matris bileşenlerineodaklanmıştır 5,6 .
Zar depolarizasyonu ve agregat mimarisindeki değişiklikler gibi toplam istikrarsızlığa katkıda bulunan olayların incelenmesindeki büyük engellerden biri, dinamik fizyolojik ve yapısal değişiklikleri gerçek zamanlı olarak yakalayan deneysel iş akışlarınıneksikliğidir 7,8. Geleneksel toplu testler ve son nokta görüntüleme yaklaşımları, stres yanıtlarının agregalarda nasıl ortaya çıktığını, bu yanıtların mekânsal dağılımı veya membran depolarizasyonu ve iyon homeostazının kaybı gibi fizyolojik zayıflamaların hücresel stresin erken işaretlerine ve nihayetinde fiziksel çöküşe nasıl dönüştüğünü çözemez. Konfokal mikroskopi yüzeye bağlı biyofilmlerde yaygın olarak uygulanmış olsa da, daha az yaklaşım zamanla çözülen görüntülemeyi hücresel fizyolojiyi agregat mimarisi ve membran aktivitesine doğrudan bağlayan nicel analizle birleştirir.
Bakteriyel zar potansiyelindeki değişiklikler, hücresel stres ve homeostaz kaybının erken ve hassas bir göstergesini sağlar. Bis-(1,3-dibutilbarbitürik asit) pentametin oksonol (DiBAC4(5)) gibi gerilime duyarlı boyalar depolarize hücrelerde birikir ve zar bütünlüğünün yıkıcı olmayan, floresans tabanlı bir okumasını sağlar. DiBAC boyaları, planktonik kültürlerde ve yüzeye bağlı biyofilmlerde membran depolarizasyonunudeğerlendirmek için kullanılmış olsa da, özellikle fizyolojik olarak ilgili büyüme koşulları ve zaman geçişli görüntüleme altında çok hücreli agregalara uygulanmaları sınırlı olmuştur.
Burada, P. aeruginosa agregalarında membran depolarizasyonu ve yapısal arızanın gerçek zamanlı görselleştirilmesi ve nicelendirilmesini sağlayan entegre görüntüleme ve analitik iş akışını sunuyoruz. Agregalar, kimyasal olarak tanımlanmış bir ortam olan ve CF hava yolunun temel besin ve iyonik özelliklerini tekrarlayan ve yüzey veya akış olmadan kendiliğinden agregat oluşumunu destekleyen kimyasal olarak tanımlanmış bir ortamda (SCFM2) oluşur11,12. Bu koşullar altında, P. aeruginosa, CF balgam ve hava yolu örneklerinde gözlemlenenlerle karşılaştırılabilir boyutlarda ve yapısal heterojenlikte asılı agregalar oluşturur ve agregat davranışını incelemek için fizyolojik olarak ilgili bir platform sağlar.
Kontrollü sıcaklık ve nem altında zaman geçişli konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak, bu iş akışı hem stabil agregal durumları hem de uzun görüntüleme sürelerinde artan membran depolarizasyonu ve hücresel homeostazın kaybı ile işaretlenen stres kaynaklı durumları yakalar. DiBAC tabanlı zar potansiyel raporlaması yüksek çözünürlüklü z-yığın görüntüleme ile birleştirerek, bu yöntem tek hücre düzeyinde DiBAC₄(5) floresansının nicelendirilmesini sağlar; değerler bireysel agregaların mekansal bağlamında haritalanıp analiz edilir. Aşağı akış görüntü segmentasyonu ve voxel tabanlı yüzey analizi, agregat mimarisi ve membran depolarizasyonundaki değişikliklerin paralel olarak nicelendirilmesine olanak tanır.
Önemli olarak, bu protokol SCFM2'de oluşturulan P. aeruginosa agregaları kullanılarak gösterilse de, iş akışı genel olarak genelleştirilebilir. Görüntüleme stratejisi, boya tabanlı fizyolojik okuma ve analitik çerçeve, diğer bakteri türlerine, agregasyon teşvik edici ortamlara ve antimikrobiyal ajanlar, bağışıklık efektörleri veya çevresel bozulmalar gibi stres faktörlerine kolayca uyarlanabilir. Bu nedenle, bu yaklaşım, çeşitli deneysel bağlamlarda bakteri topluluklarının istikrarını sorgulamak için aktarılabilir ve tekrarlanabilir bir platform sağlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
P. aeruginosa ile yapılan tüm çalışmalar, uygun BSL-2 tutma koşulları ve kurumsal biyogüvenlik onayları altında yapılmalıdır. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.
1. Sentetik kistik fibrozis balgam ortamında (SCFM2) Pseudomonas aeruginosa agregalarının oluşumu
NOT: Bu adım, P. aeruginosa kültürlerinin hazırlanmasını ve CF hava yolu ortamını taklit eden fizyolojik olarak ilgili koşullar altında asılı çok hücreli agregaların oluşumunu tanımlar.
- Bakteriyel kültürlerin hazırlanması
- Deneyden bir gün önce, dondurulmuş gliserol stoklarından pMRP9-1 (GFP)14 taşıyan vahşi tip Pseudomonas aeruginosa PAO1'i 5 mL lizojen çorbasına (LB) aşılayın.
- Plazmid seçimini sürdürmek için karbenisilin (300 μg/mL) ekleyin.
- Kültürleri gece boyunca 37 °C'de yetiştirin, 200 rpm'de sallanarak yapın.
- Geri seyreltme ve agrega oluşumuna hazırlık
- Deney gününde, gece boyunca 1:5 (gece boyunca 1 mL: 4 mL LB) geri seyreltiltilmiştir. Bu aşamada antibiyotik tekrar eklenmez; kalıntı taşıma minimumdur ve büyümeyi etkilemez).
- Kültürleri 37 °C'de ~2 saat boyunca sallayarak (200 rpm) logaritmik faza ulaşın.
NOT: Bu koşullarda hücreler genellikle ~2 saat sonra erken üstel fazdadır. Ayrıca, hücreler aşılamadan önce SCFM2'ye yıkanarak kalıntı antibiyotik transferini en aza indirir.
- SCFM2'nin hazırlanması ve dengelenmesi
- Geri seyreltme süresinin bitiminden yaklaşık 30 dakika önce, aliquot önceden hazırlanmış SCFM2'yi steril tüplere aldı ve 37 °C'ye kadar ısıttı.
- 4 kuyu cam tabanlı optik çanakta görüntüleme için, her kuyu başına 500 μL SCFM2 tahsis edilir. Pipetleme hatasını hesaba katacak fazla hacmi hazırlayın.
NOT: SCFM2 4 °C'de saklanır. Ön ısıtma, sıcaklık şokunu en aza indirir ve agrega oluşumunun tekrarlanabilirliğini artırır.
- Aşıların yıkımı ve standartlaştırılması
- Pellet kültürleri 4200 x g sıcaklığında oda sıcaklığında 4 dakika boyunca santrifüjle yapılır.
NOT: Eğer devir hesaplamaları gerekirse, sallanan kovalı rotorun rotor yarıçapı 172 mm'dir. - Süpernatantı çıkarın ve pelletleri 3 mL steril PBS (pH 7.0) içinde yeniden süspansiyona alın.
- Yıkama adımlarını iki kez daha tekrarlayın (toplamda üç yıkama).
- OD₆₀₀ ölçün ve SCFM2'yi 0.05 başlangıç OD₆₀₀ seviyesine aşılamak için gereken hacmi hesaplayın.
- Hücreleri homojenleştirmek ve 500 μL SCFM2 içeren her kuyuyu aşılamak için kısa bir süre vortex ile yapılır.
- Pellet kültürleri 4200 x g sıcaklığında oda sıcaklığında 4 dakika boyunca santrifüjle yapılır.
- Statik koşullarda agregat oluşumu
- Aşılanmış SCFM2'yi 37 °C'de statik olarak 4 saat boyunca inkülyasyon yapın ki agrega oluşumu sağlansın.
NOT: 4 saatlik kuluçka, CF balgam ve hava yolu örneklerinde gözlemlenenlerle karşılaştırılabilir boyut ve heterojenliğe sahip askıda kalmış agregalar üretirken, sonraki aşama biyofilmolgunlaşma 1,15 en aza indirilir.
- Aşılanmış SCFM2'yi 37 °C'de statik olarak 4 saat boyunca inkülyasyon yapın ki agrega oluşumu sağlansın.
2. Bağışıklık ilişkili stres faktörünün (insan nötrofil elastazı) hazırlanması
NOT: Bu adım, hücresel stresi tetiklemek ve bakteriyel agregaların dengesizleşmesi için kullanılan konaktan köklü bir stres faktörünün hazırlanmasını tanımlar.
- İnsan nötrofil elastazının (HNE) yeniden oluşturulması ve depolanması
- Üreticinin önerilerine göre insan nötrofil elastazını 50 mM sodyum asetat, 200 mM NaCl ve steril su kullanarak yeniden yapılandırın.
- 50 μg/L stok çözeltisi hazırlayın ve 0,2 μm filtreyle filtre sterilize edin.
- Aliquot 50 mL hacimlere alın ve −20 °C'de depolan.
- Kullanmadan önceki gece, bir aliquot 4 °C'de çözülür.
NOT: Aliquote, donma–erime döngülerini en aza indirir, bu da enzimatik aktiviteyi azaltabilir ve değişkenlik yaratabilir. Aliquotlar yaklaşık 1 ay boyunca 4 °C'de stabildir.
3. Membran depolarizasyonunu raporlamak için DiBAC4(5)'in hazırlanması ve uygulanması
NOT: Bu adım, agregalar içinde membran depolarizasyonunu görselleştirmek için voltaja duyarlı bir boyanın hazırlanmasını ve kullanımını açıklar.
- DiBAC4(5)'in hazırlanması ve depolanması
- DiBAC4(5)'in stok çözeltisini hazırlamakla başlayın. DiBAC4(5) tozunu susuz DMSO'da 1 mg/mL olarak yeniden yapılandırın.
NOT: DMSO'da DiBAC4(5) yeniden yapılandırılması standart üretici önerilerini takip eder. - Aliquot 100 μL hacimlere alınır ve ışıktan korunarak −20 °C'de depolanır.
- Her aliquot'u en fazla iki kez kullanmayın.
NOT: DiBAC4(5), fonksiyonel olarak DiBAC4(3) ile eşdeğerdir ancak burada GFP uyarılma/emisyon spektrumlarını eşleştirmek için seçilmiştir. Bu protokolde, DiBAC4(3) yalnızca sonuçlar bölümünde tartışılan ek bir leke için kullanılır. Bu protokol boyunca kullanılan birincil boya DiBAC4(5)'tir.
- DiBAC4(5)'in stok çözeltisini hazırlamakla başlayın. DiBAC4(5) tozunu susuz DMSO'da 1 mg/mL olarak yeniden yapılandırın.
4. P. aeruginosa agregalarında membran depolarizasyonunun zaman geçişli konfokal görüntülemesi
NOT: Bu adım, agregalarda dinamik fizyolojik ve yapısal değişiklikleri yakalamak için yüksek çözünürlüklü, zaman çözünürcesiyle çözülen konfokal görüntülerin elde edilmesini açıklar.
- Mikroskop ve çevresel oda hazırlığı
- Konfokal mikroskop aşamasına ısıtılmış bir mikroplaka insert veya çevresel oda takın.
- Görüntülemeden en az 1 saat önce sıcaklık ve nem kontrolünü açın ve 37 °C'ye ayarlayın.
- Acquisition sekmesinde Laser sekmesini bulun ve kullanımdan yaklaşık 1 saat önce, yeterli ısınma için gerekli lazerleri açın (GFP için argon lazeri; DiBAC4(5) için DPSS 561-10) (Ek Şekil 1A).
NOT: Kararlı çevresel kontrol, odak kaymasını azaltır ve uzun zaman geçişli deneylerde toplam bütünlüğünü korur.
- Bağışıklık stressorunun uygulanması
- 4 saat boyunca agrega oluşumundan sonra, deneysel kuyulara HNE ekleyerek nihai konsantrasyon 20 μg/L 16 olur.
- Kontrol kuyularını tedavi edilmeden bırakın.
- 4 kuyruklu çanağı mikroskop aşamasına aktarın.
NOT: HNE, yoğunlaştırılmış bir stok olarak değil, indüklenmiş balgamdaki bildirilen seviyelere dayanarak fizyolojik olarak ilgili konsantrasyonlarda (μg/L) hazırlanmıştır. Bu çalışmada kullanılan konsantrasyonlar McGarvey ve ark.16'da IS (indüklenmiş balgam), NE-AAT (NE/a1-anti-tripsin kompleksi), HV (sağlıklı gönüllü) başlıklarında bulunabilir.
- İlgi alanlarının toplam tanımlanması
- Locate sekmesi ve 20× hedefi kullanarak, parlak alan görüntüleme kullanarak toplam zengin bölgeleri belirlemek için İletilen Işığı açın (Ek Şekil 1B).
- Parlak alan görüntüleme kullanmaya devam ederken, Yakalama sekmesine gidin ve Pozisyon modülünü kullanarak x-, y- ve z-koordinatlarını kaydedin (Ek Şekil 1C).
- Her kuyu başına birden fazla teknik kopya için tekrarlayın.
- Yüksek çözünürlüklü z-stack ve zaman serisi edinimi
- Kaydedilmiş bir pozisyona geçin ve 63× yağ batırıcı bir hedefe geçin.
- Tabağı yerleştirmeden önce daldırma yağı uygulayın.
- Acquisition sekmesinde, kanalları Smart Setup ile yapılandırın (Ek Şekil 1D): GFP (488/509 nm) – yeşil ata, DiBAC4(5) (591/615 nm) – kırmızı ata.
- Canlı görünüme gidin, ardından Z-stack modülünü kullanarak ince odak ayarlayarak coverslip'in altını belirleyin ve ardından Set First'e tıklayarak (Ek Şekil 1E) tıklayarak bunu ilk z-konumu olarak ayarlayın.
- Aralık 60 μm gösterene kadar yukarı hareket edin ve son z-konumunu Set Last (Ek Şekil 1E) tuşuna tıklayarak ayarlayın.
- Canlı görünümü kapatın ve Definite Focus'u etkinleştirin. Find Surface seçeneğini seçin ve ardından durum Refleks Bulundu (Ek Şekil 1F) belirttiğinde Yalnızca Mağaza Okulu'nu seçin.
- Her kaydedilen konum için odak kalibrasyonunu Z-stack ve Definite Focus modüllerini kullanarak tekrarlayın.
- Zaman Serisi edinimini her konumu her 3 dakikada bir 6 saat boyunca görecek şekilde yapılandırın (Ek Şekil 1G).
NOT: Protokol burada DiBAC4(5) boyasını eritmek, eklemek ve kuluçka yapmak için duraklatılabilir ve kuluçka döneminden sonra devam ettirilebilir. - Deneyi Başlat'ı seçin.
NOT: Üç dakikalık aralıklar, zamansal çözünürlük ile fototoksisite ve fotobeyazlama değerlendirmelerini dengeler.
- DiBAC4(5) ekleme ve kuluçka
- Her kuyuya DiBAC4(5) ekleyin ve nihai konsantrasyon 5 μg/mL 9 olur.
- Zaman geçişli görüntülemeye başlamadan önce karanlıkta 30 dakika kuluçka yapın.
NOT: Bu kuluçka, arka plan floresansını en aza indirirken boya dengesini sağlar.
5. Agregat yapısının ve DiBAC4(5) ortak lokalizasyonunun nicel görüntü analizi
NOT: Bu adım, membran depolarizasyonunu agregat mimarisi ve istikrarsızlaştırma ile ilişkilendirmek için nicel bir iş akışını tanımlar.
- Görüntü içe aktarma ve kanal ayrımı
- Imaris x64 yazılım sürümü 10.2.0 veya üzerindekilere resim dosyalarını (.czi veya eşdeğeri) yükleyin.
- Voxel kalibrasyonunu, görüntü metaverisindeki x, y ve z piksel boyutlarının (voxel boyutu) konfokal alma parametrelerini (hedef, yakınlaştırma, z-adım boyutu) doğru yansıttığını kontrol ederek doğrulayın. Yanlış kalibrasyon, mekânsal ve hacimsel ölçümlerde hatalara yol açar.
- Bakteriyel agregaların yüzey renderı ve DiBAC4(5) sinyalinin
- P. aeruginosa agregalarını render etmek için Yüzeyler modülünü kullanın:
- Segmentasyon Kurulumu altında, GFP kanalını seçin (Ek Şekil 2A).
- Bölünmüş Dokunma Nesnelerini (Bölge Büyüyen) etkinleştir seçeneğini seçin ve agregaları tam yakalamak için yoğunluk eşiğini ayarlayın (Ek Şekil 2B).
- Filtre Tohum Noktaları modülünde, filtre türünü Voxel Sayısı Img = 1 olarak değiştirin ve %90'a ayarlayın (Ek Şekil 2C).
- Render işlendikten sonra yüzeyleri %100 olarak ayarlayın (Ek Şekil 2D).
- Render işlemini tamamlayın ve bakteri yüzeylerine yeşil renk atayın (Ek Şekil 2E).
- DiBAC4(5) kanalı için render işlemi tekrarlayın ve kırmızı renk atayın.
- P. aeruginosa agregalarını render etmek için Yüzeyler modülünü kullanın:
- Ortak lokalizasyon ve hacim tabanlı niceliklendirme
- DiBAC4(5) yüzey renderlemesini (Ek Şekil 3A) seçin ve hangi zaman noktasında birlikte lokalizasyon analizinin yapılacağını belirleyin.
- İstatistik > Detaylı sekme'ye (Özel Değerler > Ek Şekil 3B'ye gidin.
- En kısa Mikro Yüzeylere Mesafesi 0.00 olan nesneleri seçerek birlikte lokalizasyonu tanımlayın (Ek Şekil 3B).
- Düzenle, ardından bu nesneleri Çoğaltarak hücrelerle örtüşen bir DiBAC yüzeyi oluşturun (Ek Şekil 3C). Bu yüzeyin örtüşme özelliklerini göstermek için yeniden adlandırdığınızdan emin olun.
- Ortalama Değerler altındaki Detaylı sekmede, her seçilen zaman noktasında toplamlanmış hacim değerlerini kaydedin: (1) Toplam DiBAC4(5) sinyali (Ek Şekil 3D); (2) Ortak lokalize DiBAC4(5) sinyali (Ek Şekil 3E).
- Yüzde örtüşme olarak hesaplayın:
NOT: Yüzde örtüşme, agregalar içindeki hücreyle ilişkili DiBAC₄(5) sinyalinin oranını yansıtır ve belirli bir zaman noktasında membran depolarizasyonunu yansıtır.
NOT: SCFM2'de P. aeruginosa agregaları kullanılarak gösterilmiş ve HNE ile streslendirilmiş olsa da, bu iş akışı diğer bakteri türlerine, agregasyon teşvik edici ortamlara, floresan raporlayıcılara ve antimikrobiyal ajanlar veya çevresel bozulmalar dahil olmak üzere stres faktörlerine geniş şekilde uyarlanabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yukarıda açıklanan protokolde, kistik fibrozis akciğer ortamında modellenmiş P. aeruginosa agregalarının membran dinamiklerindeki değişiklikleri izlemek için bir yöntem sunulmaktadır (Şekil 1). pMRP9-1 (GFP) plazmidi taşıyan vahşi tip PAO1 suşu (Şekil 1A), bağışıklık stresini simüle etmek için HNE ve DiBAC4(5) membran boyası (Şekil 1C) kullanılarak, membran depol...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Membran potansiyeli, hücresel stresin ve bozulmuş homeostazın hassas ve erken bir gösterisi olarak hizmet eder. Çok hücreli bakteriyel agregalarda bu fizyolojik değişiklikler, ardından yapısal istikrarsızlaşmadan önce gerçekleşir ve buna yol açabilir. Burada, konak kaynaklı strese maruz kalan Pseudomonas aeruginosa agregalarında depolarizasyonu izlemek için yavaş yanıtlı, potansiyel duyarlı boya bis-(1,3-dibutilbarbiturik asit) pentametin oksonolünü (DiBAC4(5)) kullan...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.
Teşekkürler
S.E.D, Güney Florida Üniversitesi Moleküler Tıp Bölümü tarafından sağlanan başlangıç fonları ile Kistik Fibroz Vakfı (CFF) araştırma hibeleriyle desteklenmektedir (DARCH19G0, DARCH22P0, DARCH25G0).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1,3-dibütilbarbiturik asit) pentametin oksonol (DiBAC4(3)) | AAT Bioquest | 21411 | lipofil, anyonik molekül ve NBSP; |
| 1,3-dibütilbarbiturik asit) pentametin oksonol (DiBAC4(5)) | AAT Bioquest | 21410 | lipofil, anyonik molekül ve NBSP; |
| Karbenisilin | Uluslararası araştırma ürünleri | C46000-5.0 | PAO1'in GFP suşlarını ifade etmek için kullanılır |
| Cellvis 4 odalı 35mm cam taban çanaklı | Fisher | NC0600518 | Cam alt odalı çanak, büyüme ortamında askı agregaların bakım sağlanmasına olanak tanır ve görüntüleme |
| Santrifüj | Beckman Coulter Yaşam Bilimleri | B06320 | Beckman Coulter Life Sciences SX4400 sallanan kovalı rotorla eşleştirildi (parça no. B01425) |
| Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) | Zeiss | LSM 880 | bu protokolde tanımlanan deneyler için kullanılan CLSM modeli artık mevcut değildir, ancak LSM 900 güncellenmiş eşdeğer bir seçenek |
| Kültür Tüpleri | Genesee | 21-130 | steril; polipropilen & nbsp; |
| DAPI | Thermo Fisher | 62248 | DiBAC4(5) ile nötrofilleri boyamak için önerilen gelecekteki uygulamalarda kullanılır |
| Tek kullanımlık küvetler | Marka Teknolojisi | 759086D | 1.5mL, yarı mikro |
| DMSO | Millipore-Sigma | 276855-100ML | DiBAC4(3,5) yeniden yapılandırılması için kullanılmıştır |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 65-0880-92 | DiBAC4(3) ile nötrofillerin boyanması önerilen gelecekteki uygulamalarda kullanılır |
| CLSM için Çevre Odası | PECON | LSM 880 | bu sistem yalnızca Zeiss ürünleri için üretilmiştir ve genellikle "Kuluçka Sistemi S" olarak adlandırılır; tüm bileşenler LSM 880 (veya benzer) sistemine ek olarak Zeiss aracılığıyla sipariş edilebilir |
| Gentamisin sülfat | Fisher | BP918-1 | PA1633'ün RFP suşlarını ifade etmek için kullanılır |
| Gliserol | Genesee | 18-205 | uzun süreli depolama için suşları -80 ile dondurmak için kullanılır; & derece; C |
| İnsan Nötrofil Elastazı (HNE) | Millipore-Sigma | 324681-50UG | Yeniden kurulduktan sonra 4&NBSP ile 1 ay boyunca stabil kalır; & derece; C veya 1 yıl 20 & derece; C |
| Imaris x64 yazılımı | Oxford Instruments | Sürüm 10.2.0 | |
| Daldırma Yağı | Elektron Mikroskopisi Scienes | 16919-12 | kurutmayan; 37&NBSP'de standartlaştırılmıştır; & derece; C |
| Kuluçka makinesi | Benchmark Scientific | H1001-M | Titreme yeteneği |
| Lizojeni Suyu (LB) | Genesee | 11-118 | Miller Mix |
| mKiraz plazmidi | bir collaboorator 'den elde edilen; | ||
| PA1633 transpozon mutant suş | bir collaboorator 'den elde edilen; | ||
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) | Thermo Fisher | 3002 | pH 7.0 |
| Sodyum Asetat | Thermo Fisher | AM9740 | 3M; pH 5.5; RNase-serbest |
| Sodyum Klorür | Fisher | S271-500 | HNE'nin yeniden yapılandırılması için kullanılmıştır |
| Spektrofotometre & nbsp; | VWR | 634-0882 | PAO1/PA1633'ün SCFM2'ye aşılanması için hücre yoğunluğunu ölçmek için kullanılır |
| Steril .22µ m Filtre | Genesee | 25-244 | Yeniden oluşturulmuş HNE'yi arıtmak için kullanılır |
| Steril Mikrosantrifüj Tüpleri | Genesee | 24-272LR | 0.6mL |
| Steril Şırınge | Fisher | 14955459 | Yeniden oluşturulmuş HNE'yi arıtmak için kullanılır |
| SX4400 sallanan kovalı rotor | Beckman Coulter Yaşam Bilimleri | B01425 | Beckman Coulter Life Sciences santrifüjü ile eşleştirilmiş (parça no. B06320) |
| Sentetik Kistik Fibroz Balgam Ortamı (SCFM2) | SyntheBiome | 10002-500 | Parti #: 001-CF2-0724 |
| Ultra Saf Su | Genesee | 18-195 | HNE'nin yeniden yapılandırılması için kullanıldı |
| Vahşi tip Pseudomonas aeruginosa PAO1 pMRP9-1 plazmid ile; | Bu pMRP9-1 plazmidi GFP içerir ve karbenisilin direnci ve nbsp gösterir; | ||
| ZEN Black Edition 2.3 Zeiss Görüntüleme yazılımı | Zeiss | LSM 880 ile uyumlu |
Kaynaklar
- Darch, S. E., et al. Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model. mBio. 8 (2), e00240-17(2017).
- Rada, B. Interactions between neutrophils and Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis. Pathogens. 6 (1), 10(2017).
- Kragh, K. N., Tolker-Nielsen, T., Lichtenberg, M. The non-attached biofilm aggregate. Commun Biol. 6 (1), 898(2023).
- Gannon, A. D., Matlack, J., Darch, S. E. Exploring aggregation genes in a P. aeruginosa chronic infection model. J Bacteriol. 207 (1), e00429-24(2025).
- Melaugh, G., et al. Distinct types of multicellular aggregates in Pseudomonas aeruginosa liquid cultures. npj Biofilms Microbiomes. 9 (1), 52(2023).
- Letizia, M., Diggle, S. P., Whiteley, M. Pseudomonas aeruginosa: Ecology, evolution, pathogenesis and antimicrobial susceptibility. Nat Rev Microbiol. 23, 701-717 (2025).
- Andersen, J. B., et al. Identification of small molecules that interfere with c-di-GMP signaling and induce dispersal of Pseudomonas aeruginosa biofilms. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 59(2021).
- Andersen, J. B., et al. Induction of native c-di-GMP phosphodiesterases leads to dispersal of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 65 (4), e02431-20(2021).
- Lee, W., Woo, E. R., Lee, D. G. Phytol exhibits antibacterial activity by inducing oxidative stress in Pseudomonas aeruginosa. Free Radic Res. 50 (12), 1309-1318 (2016).
- Shirazi, F., et al. Biofilm filtrates of Pseudomonas aeruginosa inhibit preformed Aspergillus fumigatus biofilms via apoptosis. PLoS One. 11 (3), e0150155(2016).
- Palmer, K. L., Mashburn, L. M., Singh, P. K., Whiteley, M. Cystic fibrosis sputum supports growth and key physiological traits of Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187 (15), 5267-5277 (2005).
- Turner, K. H., et al. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (13), 4110-4115 (2015).
- Gannon, A. D., Darch, S. E. Tools for real-time assessment of a Pseudomonas aeruginosa infection model. J Vis Exp. (170), e62420(2021).
- Davies, D. G., et al. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science. 280 (5361), 295-298 (1998).
- Darch, S. E., et al. Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (18), 4779-4784 (2018).
- McGarvey, L. P. A., et al. Cytokine concentrations and neutrophil elastase activity in bronchoalveolar lavage and sputum in cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 1 (4), 269-275 (2002).
- Adams, D. S., Levin, M. Measuring resting membrane potential using fluorescent voltage reporters. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 459-464 (2012).
- Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14339-14344 (2003).
- Lagendijk, E. L., et al. Genetic tools for tagging Gram-negative bacteria with mCherry for visualization. FEMS Microbiol Lett. 305 (1), 81-90 (2010).
- Meylan, S., et al. Carbon sources tune antibiotic susceptibility in Pseudomonas aeruginosa via TCA cycle control. Cell Chem Biol. 24 (2), 195-206 (2017).
- Wickremasinghe, H., et al. Polymyxin B and meropenem synergistically kill multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and reduce biofilm formation. Antibiotics (Basel). 10 (4), 405(2021).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.